Sàng lọc và kiểm tra cây ngô chuyển gen

SÀNG LỌC VÀ KIỂM TRA
SÀNG LỌC VÀ KIỂM TRA
CÂY NGÔ CHUYỂN GEN
CÂY NGÔ CHUYỂN GEN
TS. Phạm Thị Lý Thu
Viện Di truyền nông nghiệp

Lây nhiễm vi khuẩn với phôi và
nuôi cộng sinh
Nuôi phục hồi phôi biến nạp
Chuẩn bị dịch vi khuẩn




QUY TRÌNH TẠO CÂY NGÔ CHUYỂN GEN
QUY TRÌNH TẠO CÂY NGÔ CHUYỂN GEN
Tạo và chọn lọc mô sẹo chuyển gen
Tạo chồi và Chọn lọc chồi chuyển gen
Tái sinh và Chọn lọc
cây chuyển gen hoàn chỉnh
Chuyển
gen
Kiểm tra, phân tích cây chuyển gen
Sàng lọc

0 AS0 AS
200uM AS200uM AS
Quá trình Chuyển
Gen đã được thực hiện chưa?

Tạo và chọn lọc mô sẹo chuyển gen


Tác nhân chọn lọc:
kháng sinh / PPT /
mannose

Tạo và chọn lọc mô sẹo chuyển gen



NGUYÊN TẮC
•
So với các tế bào Eukaryot khác, tế bào thực vật có thêm lớp thành
xenlulose vững chắc ở bên ngoài. Do đó, việc tách ADN tổng số từ thực
vật gặp phải những phức tạp và khó khăn. Có rất nhiều phương pháp tách
chiết, tinh sạch ADN khác nhau và cũng thành công trên nhiều đối tượng
thực vật. Nguyên tắc chung của các phương pháp này là:
•
Sử dụng các biện pháp cơ học (nghiền mô trong đá khô, nitơ lỏng,... bằng
chày cối sứ) để phá vỡ thành tế bào thực vật, giải phóng các thành phần
bên trong.
•
Sử dụng chất tẩy (CTAB) để phá vỡ màng tế bào, giải phóng ADN.
•
Sử dụng các hoá chất (phổ biến là EDTA) để bảo vệ ADN khỏi các
nuclease nội bào.
•
Sử dụng các hoá chất (chloroform, isoamyl alcohol, phenol,...) để loại

protein và các tạp chất ra khỏi dung dịch chứa ADN.
•
Thu hồi ADN bằng tủa (trong cồn hay isopropanol) và ly tâm.
PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ

QUY TRÌNH
•
Bước 1: Ủ sẵn 5ml đệm chiết ở 600C trong bình ổn nhiệt (30 phút).
Thành phần đệm chiết:
•
CTAB 2% (W/V)
•
Mercaptoetanol 0,2% (V/V)
•
EDTA 0,5M pH8.
•
Tris HCl, 1M pH7,5.
•
NaCl 5M.
•
Bước 2: Nghiền 0,75 (g) mô lá thực vật bằng Nitơ lỏng (bằng chày thuỷ tinh
hoặc sứ...) cho đến khi thành dạng bột mịn.
•
Bước 3: Hoà tan mẫu đang nghiền trong đệm chiết, nghiền thêm một chút
để tạo dạng đồng chất.
•
Bước 4: Ủ mẫu ở 650C trong 30 phút (lắc đều, đảo nhẹ 3-5 lần) trong quá
trình ủ.
•
Bước 5: Thêm một thể tích dung dịch bao gồm chloroform và isoamyl

alcohol (C:I) theo tỷ lệ 24:1, lắc đều.
•
Bước 6: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút.


•
Bước 7: Chuyển pha trên sang ống sạch và thêm một thể tích dung
dịch C:I, lắc đều.
•
Bước 8: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút.
•
Bước 9: Chuyển pha trên sang ống sạch. Thêm 2/3 thể tích EtOH
100% có bổ sung CH3COONa, 3M (pH = 5,2) hoặc tốt hợp là thêm 2/3
thể tích isopropanol.
•
Bước 10: Để mẫu ở -200C từ 3 giờ trở lên và ly tâm 13.000 vòng/phút,
trong 10 phút ở 40C thu tủa.
•
Bước 11: Rửa tủa bằng EtOH 80%, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5
phút ở 40C.
•
Bước 12: Để khô không khí, hoà tan trong dung dịch TE 0,1X.
•
Bước 13: Thêm RNase A để đạt nồng độ cuối cùng là 100mg/ml, ủ
370C trong 1 giờ.

•
ADN tích điện âm. Trong điện trường sẽ di chuyển về
cực dương.
•

Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thước và độ tích điện.
Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thước và độ tích điện.
•


ADN thường được điện di trên hai loại gel: agarose và
ADN thường được điện di trên hai loại gel: agarose và
acrylamid (gel acrylamid có độ phân giải cao hơn).
acrylamid (gel acrylamid có độ phân giải cao hơn).
ĐIỆN DI ADN

Nồng độ agarose thường dùng phụ thuộc vào kích thước sản phẩm ADN
cần phân giải (dao động từ 0,5% - 3%).
0,1 - 32,07
0,2 - 41,56
0,4 - 61,25
0,5 - 70,94
0,8 - 100,73
1 - 200,62
5 - 600,31
Kích thước mảnh ADN (kb)% agaroseStt

•
Chuẩn bị: Agarose dạng bột hoà trong dung dịch điện di
TBE (Tris Borat EDTA) hoặc TAE (Tris Acetat EDTA).
Đun nóng, đổ vào khuôn.
Đệm điện di:
•
TAE thường gây kiềm hoá cực dương, axit hoá cực âm
sau mỗi lần điện di cần trộn.

•
Điện thế và thời gian điện di:
•
Là hai yếu tố liên quan lẫn nhau (điện di ở điện thế thấp
thì thời gian dài hơn).
•
Tuỳ thuộc chiều dài 2 điện cực để tính hiệu điện thế.
Không nên chạy quá 5V/cm (chiều dài 2 điện cực 30cm
thì điện thế ≤ 150V).
•
Độ phân giải kém khi hiệu điện thế cao.
•
Băng ADN < 600bp chạy trong gel 12 – 20cm khoảng 3-4
giờ, điện thế 80 - 100 V là tốt.

Đệm nhuộm ADN (loading buffer)
•
Dùng nhuộm mẫu ADN trước khi điện di.
•
Thành phần: Bromophenol blue, Xylencyanol FF và glycerol
(hoặc đường saccarose).
•
Bromophenol blue, Xylencyanol FF: mầu xanh, tím xẫm.
•
Giúp tra mẫu ADN vào giếng điện di và theo dõi hướng,
khoảng cách di chuyển của ADN trong gel.
•
Các chất mầu di chuyển tương đương đoạn ADN 0,5kb nên có
thể quan sát để dừng điện di ở thời gian thích hợp.
•

Glycerol, đường có trọng lượng riêng lớn, chìm trong dung dịch
đệm điện di làm ADN bị dìm và giữ trong giếng cho tới khi điện
di.
Điện di gel polyacrylamide
•
Gel acrylamide có độ phân giải cao. ở nồng độ 5 - 6% có thể
phân tách được mảnh ADN chỉ hơn kém nhau 1 nucleotid. Còn
gọi là gel phân tích trình tự ADN (Sequencing gel).
•
Dùng điện di sản phẩm AFLP, SSR (microsatellite)

Phát hiện ADN trong gel
•
Trong gel agarose: ADN trong gel được nhuộm bằng
Ethydium bromide.
•
Ethydium bromide chứa nhóm Plariar xen vào giữa các base của
ADN tạo liên kết nhuộm.
•
Chiếu tia cực tím vào gel ==> ADN hấp phụ tia 260nm, liên
kết nhuộm hấp phụ 300 - 360 nm ==> huỳnh quang tia 590nm
(đỏ da cam) ==> nhìn và chụp ảnh được.
•
Trong gel polyacrilamide: gel được ngâm trong dung dịch
nitrat bạc, ADN sẽ tương tác khi bổ sung formaldehyt ở pH
kiềm, ion bạc chuyển thành nguyên tử bạc (Ag) tạo kết tụ ==>
hạt bạc mầu xám ==> phát hiện băng ADN.
•
Bổ sung chất phụ gia Potassium permanganet, potassium
frrriayamid ==> tăng độ nét.

Phương pháp định tính, định lượng ADN
•
Phương pháp đo quang phổ (OD
260nm
)
–
A
260nm
=1,0 OD=50 microg/ml ADN sợi đôi
–
A
260nm
=1,0 OD=33 microg/ml ADN sợi đơn
–
A
260nm
=1,0 OD=40 microg/ml ARN
•
Phương pháp điện di