Sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thư ruột kết không polyp di truyền ở người việt nam

1
Sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai
MLH1 liên quan đến ung thư ruột kết không
polyp di truyền ở người Việt Nam

Lê Thị Lan Anh

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn ThS chuyên ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70
Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
Năm bảo vệ: 2012


Abstract: Thu thập các mẫu bệnh phẩm (máu và mô) của các bệnh nhân đã được xác
định ung thư đại trực tràng và dạ dày. Nhân bản một số exon quan tâm của gen MLH1
bằng kỹ thuật (phản ứng chuỗi nhờ polymeraza) PCR. Phân tích và xác định các đột biến
ở một số exon nghiên cứu bằng (phân tích đa hình cấu hình sợi đơn) SSCP và (tính đa
hình độ dài đoạn giới hạn) RFLP. Giải trình tự ADN một số mẫu đã được xác định đột
biến bằng sàng lọc ở bước trên.

Keywords: Di truyền học; Di truyền học phân tử; Đột biến gen; Ung thư ruột kết


Content
MỞ ĐẦU
Trong hơn 20 năm qua, những phát minh to lớn của di truyền học phân tử đã góp phần
thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử khác
ngày càng được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong việc phát hiện, chẩn đoán và điều trị
bệnh, trong đó có bệnh ung thư.
Theo Tổ chức Y tế Thế giới, ước tính hàng năm trên thế giới có khoảng 10,1 triệu

trường hợp mắc ung thư và có khoảng trên 6,7 triệu người chết do ung thư. Riêng tại Việt
Nam, mỗi năm phát hiện mới khoảng 200.000 người và khoảng 75.000 người chết vì bệnh
ung thư [47].
Ung thư ruột kết không polyp di truyền (HNPCC - Hereditary Nonpolyposis Colorectal
Cancer), còn được gọi là hội chứng Lynch chiếm 15% các trường hợp ung thư đại trực tràng.

2
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về gen MLH1 được thực hiện ở rất nhiều quần thể người
khác nhau. Tại Việt Nam, xét nghiệm di truyền trong chẩn đoán ung thư nói chung và ung thu
đại trực tràng nói riêng hầu như chưa được thực hiện. Việc phát hiện những biến đổi di truyền
trong các gen MMR liên quan đến ung thư đại trực tràng có khuynh hướng di truyền, nhằm
đưa ra những kết quả nghiên cứu bước đầu về gen MLH1 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng
tại Việt Nam góp phần cung cấp dữ liệu về đột biến ở gen này và mở ra hướng nghiên cứu về
các gen MMR khác, ứng dụng trong chẩn đoán sớm ung thư ruột kết không polyp di truyền
tại Việt Nam là rất cần thiết.
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Sàng lọc đột
biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thƣ ruột kết không polyp di
truyền ở ngƣời Việt Nam”.
Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Phân tích di truyền thuộc Trung tâm nghiên
cứu Khoa học sự sống, Khoa Sinh học và Phòng Sinh học thụ thể và phát triển thuốc thuộc
phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên.
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Di truyền ung thƣ
1.1.1. Khái niệm ung thư
Ung thư không phải là bệnh mà là một tên chung cho một nhóm các bệnh phát sinh từ
các tế bào có tốc độ tăng trưởng không kiểm soát được, có được sự bất tử, xâm lấn và khả năng
di căn. Thuật ngữ “ung thư” theo nghĩa hẹp được dùng để chỉ những khối u có khả năng xâm
lấn các mô xung quanh gồm các tế bào bình thường [17].
1.1.2. Gen ung thư và gen ức chế khối u

Gen ung thư (oncogenes) có thể định nghĩa là dạng gen đột biến làm tăng nguy cơ ung
thư hoặc làm thúc đẩy sự phát sinh ung thư. Các gen ung thư cũng có thể được coi như các
dạng alen đặc biệt của các gen bình thường xuất hiện do kết quả của đột biến [3].
Gen ức chế khối u là những gen khi bị bất hoạt không còn ức chế sự sinh sản của tế bào
có thể gây tổn thương ADN và do đó cung cấp cho các khối u một lợi thế tăng trưởng.

3
1.2. Hội chứng ung thƣ ruột kết
Ung thư đại trực tràng (Colorectal cancer – CRC) được chia thành 3 dạng chính là rải rác,
gia đình và di truyền.
Ung thư đại trực tràng di truyền lại được chia thành 3 nhóm chính: Sinh polyp u tuyến
theo dòng họ (FAP), Ung thư ruột kết không polyp di truyền (HNPCC - Hội chứng Lynch) và
Hội chứng giống Lynch. Hội chứng Lynch được lấy theo tên nhà khoa học đầu tiên công bố về
căn bệnh này.
1.3. Hội chứng ung thƣ ruột kết không polyp di truyền (Hội chứng Lynch)
1.3.1. Đặc điểm di truyền của HNPCC
HNPCC là một hội chứng di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường, gây nên bởi những
đột biến dòng mầm gây bất hoạt ở những gen tham gia vào hệ thống sửa chữa bắt cặp sai
(MMR): MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2, trong đó chủ yếu là gen MLH1 và MSH2 [14].
1.3.2. Đặc điểm lâm sàng và phổ khối u
Không giống với FAP, HNPCC không được đặc trưng bởi số lượng tăng lên của các
polyp. Ở các bệnh nhân HNPCC, thường thì số các u tuyến giống với tỉ lệ chung của quần
thể. Tuy vậy, các u tuyến xuất hiện ở các bệnh nhân HNPCC có nguy cơ tiến triển thành ung
thư cao hơn nhiều. [17, 36]
.
1.3.3. Chẩn đoán lâm sàng
Những bệnh nhân mắc HNPCC thường hình thành ung thư khi còn khá trẻ, tuổi trung
bình của chẩn đoán ung thư dạ dày là 56 tuổi, với ung thư u biểu mô đường ruột là loại bệnh lý
phổ biến nhất được báo cáo. HNPCC kết hợp với ung thư buồng trứng có độ tuổi chẩn đoán
trung bình là 42,5, khoảng 30% được chẩn đoán trước tuổi 40 [33].

1.4. Cơ sở phân tử của HNPCC
1.4.1. Tính bất ổn định vi vệ tinh
Các vi vệ tinh được lặp lại đơn giản, thường là hai nucleotit, trên vùng không mã hóa của
ADN, cũng có thể nằm trong gen hoặc ở giữa gen. Các trình tự vi vệ tinh ở các tế bào sai hỏng
MMR dễ bị ảnh hưởng và có xu hướng mở rộng hoặc thu hẹp chiều dài của trình tự vi vệ tinh từ
thế hệ này sang thế hệ khác. Dạng siêu đột biến dễ phát hiện này được gọi là tính bất ổn vi vệ
tinh (microsatellite instability - MSI) [25, 55].

4
1.4.2. Cơ chế sửa chữa ADN bắt cặp sai (MMR - Mismatch Repair)
Cơ chế sửa chữa bắt cặp sai được phát hiện đầu tiên ở vi khuẩn E. coli được gọi là con
đường MutHLS. Giai đoạn đầu của MMR liên quan đến 3 gen là mutS, mutL và mutH mã hóa
cho 3 protein tương ứng là MutS, MutL, MutH (H[3].
Cơ chế MMR ở eukaryota cũng hoạt động tương tự như cơ chế hoạt động ở vi khuẩn (E.
coli). Ở người đã xác định được các gen có liên quan đến hoạt động của MMR gồm có các gen
human mutL homolog 1 (hMLH1), human mutL homolog 3 (hMLH3), human mutS homolog 2
(hMSH2), human mutS homolog 3 (hMSH3), human mutS homolog 6 (hMSH6), human
postmeiotic segregation increased 2 (hPMS2), human postmeiotic segregation increased 1
(hPMS1) [13]. Trong đó phức hợp chứa gen hMSH2 có chức năng tương đương với mutS ở E.
coli, phức hợp chứa gen hMLH1 có chức năng tương ứng với mutL ở E. coli.
1.4.3. Đột biến gen MMR và nguy cơ ung thư
Phân tích di truyền các gen MMR ở người cho thấy rằng trên 90% bệnh nhân mắc
HNPCC là do đột biến ở hai gen MLH1 và MSH2. Riêng gen MLH1 có tần số đạt đến 1/400 và
gen MSH2 là 1/500 ở nhiều quần thể [41]. Trong số tất cả các đột biến dòng mầm được báo cáo
trong hội chứng Lynch, gen MLH1 có ảnh hưởng lớn nhất, ước tính chiếm khoảng 50% tổng số
trường hợp, sau đó là đến MSH2 (40%), MSH6 (10%) và PMS2 (<5%). Như vậy, gen MLH1 là
gen quan trọng nhất trong nghiên cứu ung thư ruột kết không polyp di truyền (HNPCC).
1.4.4. Gen MLH1
Gen MLH1 nằm trên NST số 3p21, tương ứng với vùng gen MutL ở E. coli, nằm giữa các
gen TRANK1 và LRRFIP2 với 19 exon, có kích thước khoảng 57,36 kb, mARN dài 2524 bp và

protein được tổng hợp từ gen MLH1 gồm 756 axit amin.
1.5. Một số kỹ thuật di truyền sử dụng trong nghiên cứu HNPCC
1.5.1. Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP: Restriction Fragment Length
Polymorphism)
Kỹ thuật RFLP là một kỹ thuật phổ biến được sử dụng trong sinh học phân tử. Sản phẩm
PCR sau khi được nhân lên sẽ được tiến hành cắt bằng enzym giới hạn phù hợp thành các đoạn
ngắn hơn, dựa vào số lượng và kích thước của các đoạn ADN thu được mà có thể phát hiện ra
những sai khác di truyền xuất hiện trong đoạn gen đó.
1.5.2. Kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn (SSCP: Single Strand Conformation Polymorphism)

5
Nguyên tắc: Trong điều kiện điện di không biến tính, các mạch đơn ADN sẽ có một cấu
hình nhất định tùy theo trình tự của nó. Cấu hình này được xác định bởi các liên kết nội phân tử.
Các cấu hình sẽ khác ngay cả khi chỉ khác một nucleotit. Sự khác biệt này dẫn đến sự khác về
khả năng di chuyển trong gel polyacrylamide.
1.5.4. Phương pháp giải trình tự ADN
Nguyên tắc của phương pháp dideoxy dựa trên việc bổ sung các dẫn xuất tương ứng của
các dNTP là 2’, 3’ – dideoxynucleotit (viết tắt là ddNTP) vào thành phần phản ứng tổng hợp
ADN trong ống nghiệm. Do ddNTP thiếu nhóm C3’- OH nên một khi nó được gắn vào mạch
ADN đang tổng hợp thì quá trình tổng hợp sẽ dừng lại. Do đó, thu được một hỗn hợp nhiều phân
tử ADN được sao chép không hoàn chỉnh giống nhau ở đầu 5’ được đánh dấu và khác nhau ở
đầu 3’ về chiều dài và loại nucleotit kết thúc chuỗi. Sau đó, các sản phẩm này được phân tách
trên bản điện di [4].
1.6. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài
1.6.1. Mục tiêu nghiên cứu
Sàng lọc các đột biến ở một số exon trên gen MLH1 bằng các kĩ thuật PCR-RFLP và
PCR-SSCP, góp phần cung cấp dữ liệu về đột biến ở gen này và mở ra hướng nghiên cứu tiếp
theo cho các gen MMR khác nhằm ứng dụng trong chẩn đoán sớm ung thư đại trực tràng không
polyp di truyền tại Việt Nam.
1.6.2. Nội dung nghiên cứu của đề tài

 Các nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm:
1. Thu thập các mẫu bệnh phẩm (máu và mô) của các bệnh nhân đã được xác định ung thư đại
trực tràng và dạ dày.
2. Nhân bản một số exon quan tâm của gen MLH1 bằng kỹ thuật PCR.
3. Phân tích và xác định các đột biến ở một số exon nghiên cứu bằng SSCP và RFLP.
4. Giải trình tự ADN một số mẫu đã được xác định đột biến bằng sàng lọc ở bước trên.

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng

6
Mẫu mô và mẫu máu được thu thập từ các bệnh nhân ung thư đại trực tràng, dạ dày đến
khám và điều trị tại Bệnh viện K và Bệnh viện Đại học Y Hà Nội. Mẫu đối chứng được lấy từ
người không mắc bệnh được cung cấp bởi Bệnh viện Đại học Y Hà Nội.
2.1.2. Hóa chất
 Nhóm hóa chất dùng cho tách ADN tổng số
 Nhóm hóa chất dùng cho PCR
 Nhóm enzym giới hạn dùng cho phản ứng cắt: MspI, CviQI.
 Nhóm hóa chất dùng cho điện di gel agarose, nhóm hóa chất SSCP
 Nhóm hóa chất nhuộm và một số hóa chất khác
Các hóa chất đảm bảo độ tinh sạch sử dụng trong sinh học phân tử và được cung cấp bởi
các hãng có uy tín trên thế giới.
2.1.3. Thiết bị
Các loại máy móc thiết bị, dụng cụ chính được sử dụng: ống eppendorf, các loại đầu côn,
pipet. Máy li tâm thường, máy li tâm lạnh, máy vortex, máy Spin down, bể ổn nhiệt, cân phân
tích, tủ lạnh -20
0
C, tủ hút, máy làm đá, máy PCR AmpGen 9700 (Perkin – Elmet), bộ điện di
nhỏ, bộ điện di đứng, máy soi gel…

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Thu thập và bảo quản mẫu
2.2.2. Phương pháp tách chiết ADN tổng số
2.2.3. Xác định độ tinh sạch và hàm lượng ADN tổng số
2.2.4. Kỹ thuật PCR
2.2.5. Phân tích đa hình sợi đơn (SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism)
2.2.6. Phản ứng cắt bằng enzym giới hạn
2.2.7. Giải trình tự gen

7
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách chiết ADN tổng số

(A)

(B)
Hình 1. (A) Kết quả tách ADN tổng số từ mẫu mô. (B) Kết quả tách ADN tổng số từ mẫu máu.
Kết quả điện di cho thấy, ADN tổng số được tách chiết từ các mẫu khác nhau đều chỉ cho
1 băng duy nhất, đậm nét với kích thước xấp xỉ băng 23,1 kb của thang chuẩn λ/ Hind III. Các
mẫu ADN tổng số đảm bảo yêu cầu chất lượng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2. Phản ứng PCR
3.2.1. Kết quả tối ưu phản ứng PCR
Chúng tôi đã thu được nhiệt độ gắn mồi cho kết quả tốt nhất và ổn định nhất cho mỗi
exon như sau: exon 19 T
m
= 58
0
C, exon 18 T
m
= 52

0
C, exon 17 T
m
= 60
0
C, exon 16 T
m
= 61
0
C,
exon 14 T
m
= 51
0
C, exon 13 T
m
= 57
0
C, exon 8 T
m
= 61
0
C
3.2.2. Nhân bản các exon quan tâm bằng kỹ thuật PCR

(A)

(B)
Hình 2. (A) Sản phẩm PCR exon 8 gen MLH1. (B) Sản phẩm PCR exon 13 gen MLH1

8

(A)
(B)
Hình 3. (A) Sản phẩm PCR exon 14 gen MLH1. (B) Sản phẩm PCR exon 16 gen MLH1


(A)

(B)
Hình 4. (A) Sản phẩm PCR exon 17 gen MLH1. (B) Sản phẩm PCR exon 18 gen MLH1


(A)

(B)
Hình 5. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 19 gen MLH1
Từ các kết quả thu được, có thể kết luận chúng tôi đã tiến hành nhân bản thành công 7
exon của gen MLH1: exon 8, exon 13, exon 14, exon 16, exon 17, exon 18 và exon 19 đúng kích

9
thước và rất đặc hiệu. Sản phẩm PCR nhân bản các exon có thể sử dụng được cho các bước sàng
lọc đột biến gen MLH1 tiếp theo.
3.3. Kết quả phân tích SSCP

(A)

(B)
Hình 6. (A) Kết quả phân tích SSCP exon 8 gen MLH1. (B) Kết quả phân tích
SSCP exon 13 gen MLH1. Hình chữ nhật màu đỏ chỉ vị trí đột biến

(A)
(B)
Hình 7. (A) Kết quả phân tích SSCP exon 16 gen MLH1. (B) Kết quả phân tích SSCP
exon 14 gen MLH1. Hình chữ nhật màu đỏ chỉ vị trí đột biến


10

(A)

(B)
Hình 8. (A) Kết quả phân tích SSCP exon 17 gen MLH1. (B) Kết quả phân tích SSCP exon
18 gen MLH1.


Hình 9. Kết quả phân tích SSCP exon 19 gen MLH1
Qua các kết quả phân tích SSCP thu được cho thấy, chúng tôi không phát hiện được sự
sai khác nào từ các mẫu nghiên cứu của các exon 8, exon 16, exon 17, exon 18 và exon 19 gen
MLH1. Tuy nhiên, ở các exon 13 (mẫu 13T6) và exon 14 (mẫu 14T19, 14T20) chúng tôi đã phát
hiện được sự sai khác về số lượng băng sợi đơn so với các mẫu khác và mẫu đối chứng của
người bình thường tương ứng
3.4. Kết quả phân tích đột biến bằng PCR – RFLP
3.4.1. Kết quả xử lý exon 16 bằng enzym MspI
Ảnh điện di Hinh 10 cho thấy trong 50 mẫu chúng tôi nghiên cứu không có mẫu nào mang
gen đột biến ở vị trí bộ ba mã hóa 582 của exon 16 gen MLH1. Tất cả các mẫu đều mang kiểu
gen đồng hợp về alen kiểu dại C/C.


11

Hình 10. Sản phẩm cắt exon 16 và sản phẩm PCR exon 16 điện di trên gel agarose 2%
3.4.2. Kết quả xử lý exon 19 bằng enzym CviQI

Hình 11. Sản phẩm cắt exon 19 bằng enzym CviQI điện di trên gel polyacrylamide 12%
Kết quả trên tương ứng với dự đoán là tất cả các đối tượng nghiên cứu đều mang kiểu gen
đồng hợp tử C/C, tức là không có cá thể nào mang gen đột biến ở vị trí bộ ba mã hóa 718 của
exon 19.
3.4.3. Kết quả xử lý exon 18 bằng enzym CviQI

Hình 12. Sản phẩm cắt exon 18 bằng enzym CviQI điện di trên gel polyacrylamide
12%, Hình chữ nhật màu đỏ chỉ vị trí đột biến.

12
Kết quả chúng tôi thu được khi tiến hành phản ứng cắt với mẫu T19 và T20 có số lượng
băng giống với kết quả chúng tôi dự đoán nếu có đột biến xảy ra tại vị trí nucleotit 2104 (G A)
với kiểu gen dị hợp G/A. Để khẳng định kết quả thu được, chúng tôi tiến hành phân tích trình tự
ADN exon 18 từ hai bệnh nhân này.
3.5. Kết quả giải trình tự ADN và so sánh trình tự
3.5.1. Phân tích trình tự exon 13 của mẫu mô từ bệnh nhân số 6
Ở mẫu mô bệnh phẩm của người số 6, từ kết quả giải trình tự exon 13 (ký hiệu mẫu:
13T6-R), chúng tôi đã phát hiện thấy có sự thay đổi nucleotit G>A ở vị trí 203. Đây là đột biến ở
thể dị hợp tử thay thế nucleotit dạng đồng hoán dẫn tới đột biến nhầm nghĩa: sự thay đổi
nucleotit có thể dẫn tới sự thay thế axit amin tương ứng Threonin thành Isoleucine (hoặc Leu
thành Phe) – Hình 13. Tuy nhiên, chúng tôi không phát hiện được đột biến dịch khung ở trình tự
này.
5

34



94



154
GAGGCCCT ATGCATCCCA GGCAGGCCAC
******** ********** **********
GAGGCCCT ATGCATCCCA GGCAGGCCAC

AGCGTTTACG TACCCTCATG TCCCTGCTCA TTAATTTCTT CCTGGAGACT
CAAAACACTA
********** ********** ********** ********** ********** **********
AGCGTTTACG TACCCTCATG TCCCTGCTCA TTAATTTCTT CCTGGAGACT
CAAAACACTA

GTGAGGTTAA TGATCCTTCT CCGGGGGGTA CAAGCTGCAG TCATTTCCTT
TCGGGAATCA
********** ********** ********** ********** ********** **********
GTGAGGTTAA TGATCCTTCT CCGGGGGGTA CAAGCTGCAG TCATTTCCTT
TCGGGAATCA

TCTTCCACCA TTTCCACATC AGAATCTTCC CGATGTCTCT TTCTGCAATG
AAGAAA
********** ********** ********** ********** ********* *****
TCTTCCACCA TTTCCACATC AGAATCTTCC CGATGTCTCT TTCTGCAATA
AAGAA

ĐC

13T6-R

ĐC

13T6-R

ĐC

13T6-R

ĐC

13T6-R
(A)

13

(B)
Hình 13. (A) Kết quả so sánh trình tự exon 13 của đối chứng và bệnh nhân số 6 (mẫu 13T6-R).
(B) Trình tự ngược của exon 13 gen MLH1 cho thấy có đột biến ở thể dị hợp tử thay thế tại vị trí
203 G>A (vị trí mũi tên)
3.5.2. Kết quả phân tích trình tự exon 14 từ mẫu T19
Khi so sánh với trình tự ADN đối chứng, chúng tôi nhận thấy có hai biến đổi ở trình tự
gen của bệnh nhân 19 so với đối chứng. Chúng tôi đã phát hiện thấy có sự thay đổi nucleotit
C>G ở vị trí 176 (mũi tên thứ nhất Hình 14B), ở vị trí 185 trên exon này, nucleotit T cũng bị thay
bởi nucleotit A (vị trí mũi tên thứ hai Hình 14B).
18

68



128
TTTGTTTTGC AGTTCTCCGG GAGATGTTGC ATAACCACTC
CTTCGTGGGC
********** ********** ********** ********** **********
TTTGTTTTGC AGTTCTCCGG GAGATGTTGC ATAACCACTC
CTTCGTGGGC

TGTGTGAATC CTCAGTGGGC CTTGGCACAG CATCAAACCA
AGTTATACCT TCTCAACACC
********** ********** ********** ********** ********** **********
TGTGTGAATC CTCAGTGGGC CTTGGCACAG CATCAAACCA
AGTTATACCT TCTCAACACC

ACCAAGCTTA GGTAAATCAG CTAAGTGTGT GAACAAGCAG
AGCTACTACA ACAATGGTAC
********** ********** ********** ********** ******** * ******* *
ACCAAGCTTA GGTAAATCAG CTGAGTGTGT GAACAAGCAG
AGCTACTAGA ACAATGGAA
(A)
ĐC

14T19-
F

ĐC

14T19-
F

ĐC

14T19-
F

(B)

14
Hình 14. (A) Kết quả so sánh trình tự exon 14 của đối chứng và bệnh nhân số 19 (mẫu 14T19).
(B) Trình tự xuôi của exon 14 gen MLH1 cho thấy có đột biến thay thế tại vị trí 176C>G và một
đột biến thay thế ở vị trí 185T>A
3.5.3. Phân tích trình tự exon 18 từ mẫu T20
Chúng tôi nhận thấy có sự tương đồng 100% giữa ADN của exon 18 ở hai mô này. Kết
quả cho thấy sự phát sinh khối u tại mô đại trực tràng của bệnh nhân này chưa thấy có mối liên
quan với sự biến đổi của exon 18 gen MLH1. Để có kết luận chắc chắn hơn về điều này, cần giải
trình tự của các phân đoạn khác của gen MLH1.




10

18



78




138



198
GTGTGCAT
********
GTGTGCAT

CACCACTGTA CCTGCTGGCC TGAGAGGGTC GACTCCTCAG
ATATGTACTG CTTCCGGATG ********** ********** **********
********** ********** **********
CACCACTGTA CCTGCTGGCC TGAGAGGGTC GACTCCTCAG
ATATGTACTG CTTCCGGATG

GAATAGAACA TAGCGCATTC TTTACTGAGG CTTTCAAAAC
ATTCCTTTTC TTCGTCCCAA
********** ********** ********** ********** ********** **********
GAATAGAACA TAGCGCATTC TTTACTGAGG CTTTCAAAAC
ATTCCTTTTC TTCGTCCCAA

TTCACCTGGT CCAAAGAAAT TCAATACCTC AAAATAGGTA
CGAATTTAAA CATTCTCATT
********** ********** ********** ********** ********** **********
TTCACCTGGT CCAAAGAAAT TCAATACCTC AAAATAGGTA
CGAATTTAAA CATTCTCATT

CTAAACGGAG ATCACAGACT AC
********** ********** **
CTAAACGGAG ATCACAGACT AC
ĐC

18T20-
R

ĐC

18T20-
R

ĐC

18T20-
R

ĐC

18T20-
R

ĐC

18T20-
R
Hình 15. So sánh trình tự exon 18 của mẫu mô ung thư của bệnh nhân 20 và mô người bình
thường
10
GCATC ACCACTGTAC CTGCTGGCCT GAGAGGGTCG
18T19-

15

16

57

61

117

121

177

181

ACTCCTCAGA
***** ********** ********** ********** **********
GCATC ACCACTGTAC CTGCTGGCCT GAGAGGGTCG
ACTCCTCAGA

TATGTACTGC TTCCGGATGG AATAGAACAT AGCGCATTCT
TTACTGAGGC TTTCAAAACA
********** ********** ********** ********** ********** **********
TATGTACTGC TTCCGGATGG AATAGAACAT AGCGCATTCT
TTACTGAGGC TTTCAAAACA

TTCCTTTTCT TCGTCCCAAT TCACCTGGTC CAAAGAAATT
CAATACCTCA AAATAGGTAC
********** ********** ********** ********** ********** **********
TTCCTTTTCT TCGTCCCAAT TCACCTGGTC CAAAGAAATT
CAATACCTCA AAATAGGTAC

GAATTTAAAC ATTCTCATTC TAAACGGAGA TCACACGACT ACTTTT
********** ********** ********** ********** ******
GAATTTAAAC ATTCTCATTC TAAACGGAGA TCACACGACT ACCTTT
R

18B19-
R

18T19-
R

18B19-
R

18T19-
R

18B19-

R

18T19-
R

18B19-
R

Hình 16. Kết quả so sánh trình tự exon 18 của mẫu máu và mẫu mô từ bệnh nhân số 19
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
I. KẾT LUẬN
Từ những kết quả thu được với việc ứng dụng kỹ thuật PCR-SSCP và PCR-RFLP trong
phân tích đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thư đại trực tràng không
polyp di truyền, chúng tôi đưa ra kết luận như sau:

16
1. Đã tách chiết thành công ADN tổng số từ 50 mẫu mô và 20 mẫu máu bệnh phẩm.
2. Đã nhân bản thành công 7 exon quan tâm của gen MLH1, bao gồm việc thiết kế các cặp
mồi đặc hiệu và tối ưu hóa phản ứng PCR.
3. Đã phát hiện được các mẫu phân đoạn gen MLH1 từ những bệnh nhân có mô hình phân
tích băng điện di khác biệt ở các exon 13 (mẫu 13T6) và exon 14 (mẫu 14T18 và 14T19)
gen MLH1 khi so sánh với đối chứng, sử dụng kỹ thuật PCR-SSCP.
4. Đã phát hiện được các mẫu phân đoạn gen MLH1 từ những bệnh nhân có mô hình phân
tích băng điện di khác biệt ở exon 18 gen MLH1 từ các bệnh nhân số 19 và bệnh nhân số
20 khi so sánh với đối chứng, sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP.
5. Đã phát hiện được một đột biến ở thể dị hợp tử thay thế nucleotit G>A tại vị trí 203 trên
exon 13 từ mẫu mô bệnh phẩm của bệnh nhân số 6 (mẫu 13T6), một đột biến thay thế
nucleotit C>G tại vị trí 176 và một đột biến thay thế T>A ở vị trí 185 thuộc exon 14 gen
MLH1 từ mẫu mô bệnh phẩm người số 19 (mẫu 14T19) bằng giải trình tự gen.
6. Những sai khác về mô hình điện di SSCP và RLFP cũng như những thay đổi trình tự

nucleotit đều được phát hiện ở các mẫu mô, không phát hiện được ở các mẫu máu tương
ứng. Điều này chứng tỏ những đột biến mà chúng tôi xác định được đều là các đột biến
soma.
II. KIẾN NGHỊ
Trên cơ sở kết quả nghiên cứu này, chúng tôi có một số kiến nghị như sau:
1. Tiếp tục tiến hành phân tích đột biến ở các exon còn lại của gen MLH1 bằng kỹ thuật
PCR-SSCP và các kỹ thuật di truyền khác (SSR, HET, DGGE ) để xác định các dạng
đột biến thuộc gen MLH1 có thể có ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam.
2. Mở rộng nghiên cứu các gen MMR khác (MSH2, MSH6…) nhằm xây dựng một cơ sở dữ
liệu về đột biến gen MMR ở người Việt Nam.


References
Tiếng Việt
1. Trịnh Đình Đạt (2009), Công nghệ sinh học, Tập 4, NXB Giáo Dục, Hà Nội.
2. Võ Thị Thương Lan (2007), Một số vấn đề cơ bản của sinh học phân tử, NXB Đại Học Quốc
Gia Hà Nội.

17
3. Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2009), Cơ sở Di truyền học Phân tử và Tế bào, NXB Đại
học Quốc gia Hà Nội.
4. Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý và ứng dụng, NXB Khoa Học Kỹ Thuật.
Tiếng Anh
5. Aaltonen L, Peltomaki P, Leach FS, Sistonen P, Pylkkanen L, Mecklin J-P, Jarvinen H, et al.
(1993), “Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer”, Science, 260: 812-816.
6. Aarnio M, Mecklin JP, Aaltonen LA, Nystrom-Lahti M, Jarvinen HJ. (1995), “Life-time
risk of different cancers in hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC) syndrome
”,
Int J Cancer, 20: 430-43.
7. Aarnio M, Sankila R, Pukkala E, Salovaara R, Aaltonen L, de la Chapelle A, Peltomaki P,

Mecklin J-P, Jarvinen H. (1999), “Cancer risk in mutation carriers of DNA mismatch repair
genes”, Int J Cance, 81: 214–218.
8. Annie Yu H-J, Lin K.M, Lynch H.T. (2003), “Hereditary non-polyposis colorectal cancer:
preventive management”, Cancer Treat Rev, 29: 461-470.
9. An ZW, Xie LL, Cheng H, Zhou Y, Zhang Q, He XG, Huang HS (2009), “A silver
staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and
pretreatment”, Anal Biochem, 391(1): 77-9, Epub 2009 May 12, PubMed PMID:
19442642.
10. Boland CR, Thibodeau SN, Hamilton SR, et al. (1998), “National Cancer Institute workshop
on microsatellite instability for cancer detection ang familial predisposition: Development of
international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer”,
Cancer Res, 58: 5248-5257.
11. Burt RW et al. (1996), Prevention and early detection of CRC,
London: Saunders, 171–194.
12. Cecily P. Vaughn, Elaine Lyon, Wade S. Samowitz (2008), “Confirmation of Single Exon
Deletions in MLH1 and MSH2 Using Quantitative Polymerase Chain Reaction”, Journal of
Molecular Diagnostics, Vol.10, No.4.

18
13. Cunningham JM, Kim CY, Christensen ER, Tester DJ, Parc Y, Burgart LJ, Halling
KC, McDonnell SK, Schaid DJ, Walsh Vockley C, Kubly V, Nelson H, Michels VV,
Thibodeau SN (2001), “The frequency of hereditary defective mismatch repair in a
prospective series of unselected colorectal carcinoma”, Am J Hum Genet, 69: 780-790.
14. De la Chapelle A (2004), “Genetic predisposition to colorectal cancer”, Nat Rev Cancer,
769-780.
15. De la Chapelle A (2005), “The incidence of Lynch syndrome”, Fam Cancer, 4(3), 233-237.
16. Dietmaier W, Wallinger, Bocker T, Kullmann F, Fishel R, Ruschoff J (1997), “Diagnostic
microsatellite instabillity: definition and corelation with mismatch repair protein expression”,
Cancer Res, 57: 4749-4756.
17. Fred Burz (2008), Principles of cancer genetics, Springer, 1

st
ed.
18. Griffiths AJF, Miller JH, Suzuki DT, et al. (2000), An Introduction to Genetic Analysis, 7th
edition, W. H. Freeman, New York.
19. Girado A, Gomez A, Salguero G, Garcia H, Aristizabal F, Gutierrez O, Angel L.A, Padron J,
Martinez H, Malaver O, Florez L, Barvo R (2005), “MLH1 and MSH2 mutations in
Colombian families with hereditary non-polyposis colorectal cancer (Lynch syndrome)
description of four novel mutations”, Fam Cancer, 4: 285-290.
20. Han HJ, Maruyama M, Baba S, Park JG, Nakamura Y (1995), “Genomic structure of human
mismatch repair gene hMLH1, and its mutation analysis patients with hereditary non-
polyposis colorectal cancer (HNPCC)”, Hum Mol Genet, 4: 237-242.
21. Hendriks YM, de Jong AE, Morreau H, et al (2006), “Diagnostic approach and management
of Lynch syndrome (hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma): a guide for clinicians”,
CA Cancer J Clin, 56(4): 213-238.
22. Herman JG, Umar A, Polyak K, et al. (1998), “Incidence and functional consequence of
hMLH1 promotor hypermethylation in colorectal carcinoma”, Proc Nalt Acad Sci USA, 95:
6870-6875.
23. Huang J, Kuismanen SA, Liu T, et al. (2001), “MSH6 and MSH3 are rarely involved in
genetic predisposition to nonpolypotic colon cancer”, Cancer Res, 61(4): 1619-1623.

19
24. Iaccarino I, Marra G, Palombo F, Jiricny J (1998), “hMSH2 and hMSH6 play distinct roles in
mismatch binding and contribute differently to the ATPase activity of hMutSalpha”, EMBO
J, 17(9): 2677-2686.
25. Ionov Y, Peinado MA, Malkhosyan S, Shibata D, and Perucho M (1993), “Ubiquitous
somatic mutations in simple repeated sequence reveal a new mechanism for colonic
carcinogenesis”, Nature (Lond), 363: 558-561.
26. Jiricny J (2000), “Mediating mismatch repair”, Nat Genet, 24(1): 6-8.
27. Kane MF, Massimo L, Giada GM, Lipman J, Mishra R, Goldman H, Jessup J. M, and
Kolodner R (1997), “Methylation of the hMLH1 promoter correlates with lack of expression

of hMLH1 in sporadic colon tumors and mismatch repair-defective human tumor cell lines”,
Cancer Res, 57: 808-811.
28. Knudson AG (1996), “Hereditary cancer: two hits revisited”, J Cancer Res Clin Oncol, 122:
135-140.
29. Kolodner RD, Marsischky GT (1999), “Eukaryotic DNA mismatch repair”, Curr Opin
Genet Dev, 9(1): 89-96.
30. Liu B, Parsons R, Papadopoulos N, Nicolaides NC, Lynch HT, Watson P, Jass LR, Dunlop
M, Wyllie A, Peltomaki P, de la Chapelle A, Hamilton SR, Vogelstein B, and Kinzler KW
(1996), “Analysis of mismatch repair genes in hereditary non-polyposis colorectal cancer
patients” Nat Med, 2:169-174. 1996.
31. Loukola A, Vilkki S, Singh J, Launonen V, Aaltonen LA (2000), “Germline and somatic
mutation analysis of MLH3 in MSI-positive colorectal cancer”, Am J Pathol, 157(2): 347-
352.
32. Lynch HT, de la Chapelle A. (2003) “Hereditary colorectal cancer”, N Engl Med, 348: 919-
932.
33. Lynch HT, Smyrk T, Watson P, Lanspa SJ, Boman BM, Lynch PM, Lynch JF, Cavalieri
(1991), “Hereditary colorectal cancer”. Semin. Oncol, 18: 337 – 366.
34. Lynch HT, de la Chapelle A (1999), “Genetic susceptibility to nonpolyposis colorectal
cancer”, J Med Genet; 36: 801-818.

20
35. Manuel Perucho, (2000), “Genetic and Epigenetic Modification of MLH1”, American
Journal of Pathology, 157: 1052-1053.
36. Marra G, Boland CR (1995), “Hereditary nonpolyposis colorectal cancer: the syndrome,
the genes and historical perspectives”,
J
Natl Cancer Inst 87: 1114-112.
37. Minna Nystrom-Lahti, Ramon Parsons, Pertti Sistonen, Lea Pylkkanen, Lauri A. Aaltonen,
Fredrick S. Leach, Stanley R. Hamilton, Patrice Watson, Earlene Bronson, Ramon Fusaro,
Jennifer Cavalieri, Jane Lynch, Stephen Lanspa, Tom Smyrk, Patrick Lynch, Thomas

Drouhard, Kenneth W. Kinzler, Bert Vogelstein, Henry T. Lynch, Albert de la Chapelle, and
Paivi Peltomaki (1994), “Mismatch Repair Genes on Chromosomes 2p and 3p Account for a
Major Share of Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer Families Evaluable by Linkage”,
Am J Hum Genet, 55(4): 659–665.
38. Modrich P (2006), “Mechanisms in eukaryotic mismatch repair”, J Biol Chem, 281(41):
30305-30309.
39. Ohmiya N, Matsumoto S, Yamamoto H, Baranovskaya S, Malkhosyan SR, Perucho M
(2001), “Germline and somatic mutations in hMSH6 and hMSH3 in gastrointestinal cancers
of the microsatellite mutator phonotype”, Gene, 272(1-2): 301-313.
40. Orita M, Iwahana H, Kanazawa H, Hayashi K, Sekiya T, (1989), “Detection of
polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single strand conformation
polymorphism”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2766-2770.
41. Papp J, Kovacs ME, Olah E (2007), “Germline MLH1 and MSH2 mutational spectrum
including frequent large genomic aberrations in Hungarian hereditary non-polyposis
colorectal cancer families: implications for genetic testing”, World J Gastroenterol,13(19):
2727-2732.
42. Peltomaki P (2001), “Deficient DNA mismatch repair: a common etiologic factor for colon
cancer”, Hum Mol Genet, 10: 735-740.
43. Peltomaki P (2005), “Lynch syndrome genes”, Fam Cancer, 4(3): 227-232.
44. Peltomaki P, Vasen H (2004), “Mutations associated with HNPCC predisposition-update of
ICG-HNPCC/INSIGHT mutation databases”, Dis Markers, 20: 269-276.

21
45. Sambrook J, Russell DW (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3
rd
Ed, Cold
Spring Harbor Laboratoty Press, Cold Spring Harbor, New York.
46. Shin KH, Ku JL, Park JG. (2002), “Mutational analysis of promoters of mismatch repair
genes hMSH2 and hMLH1 in hereditary nonpolyposis colorectal cancer and early onset
colorectal cancer patients: identification of three novel germ-line mutations in promoter of

the hMSH2 gene”, Cancer Res, 62: 38-42.
47. Stewart B. W. ADN Kleihues P (2003), “World Cancer Report”, IARC Press, Lyon.
48. Sunnucks P, et al. (2000), “SSCP Is Not So Difficult: The Application and Utility of Single-
Stranded Conformation Polymorphism in Evolutionary Biology and Molecular Ecology”,
Molecular Ecology, 9: 1699-710.
49. Thibodeau Sn, Bren G, Schaid D (1993), “Microsattellite instability in cancer of the
proximal colon”, Science, 260: 816-819.
50. Umar A, Boland CR, Terdiman JP, Syngal S, de la Chapelle A, Ruschoff J, et al. (2004),
“Revised Bethesda Guideline for heteitary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch Syndrome)
and microsatellite instability”, J Natl Cancer Inst, 96: 261-268.
51. Umar A, Rinsinger JI, Hawk ET, Barrett JC (2004), “Testing guidelines for hereditary non-
polyposis colorectal cancer”, Nat Rev Cancer, 153-158.
52. Vasen HF, Mecklin JP, Khan PM, Lynch HT (1991), “The International Collaborative
Group on Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer (ICG-HNPCC)”, Dis Colon Rectum,
34(5): 424-425.
53. Vasen HF, Watson P, Mecklin JP, Lynch HT. (1999), “New clinical criteria for hereditary
colorectal cancer (HNPCC, Lynch syndrome) proposed by the International collaborative
group on HNPCC”, Gastroenterology, 116: 1453-1456.
54. Warthin AS (1925), “The further of study of a cancer family”, J. Cancer Res, 279 – 286.
55. Watson P, Lynch HT (1993), “Extracolonic cancer in hereditary nonpolyposis colorectal
Cancer”, Cancer, 71: 677-685.
56. Weber T (1996), “Clinical surveillance recommendations for HNPCC”, Cancer, 348-465.

22
57. Weijnen J, Khan PM, Vasen H, van der Klift H, et al. (1997), “Hereditary nonpolyposis
colorectal cancer families not complying with the Amsterdam criteria show extremely low
frequency of mismatch –repair –gene mutations”, Am J Hum Genet, 61: 329-335.
58. Wijnen J, Khan PM, Vasen H, Menko F, vander Klift H, van den Broek M, van Leuuwen-
Cornelisse I, Nagengast F, Meijers-Heijboer EJ, Linhout D, Griffioen G, Cats A, Kleibeuker
J, Varesco L, Bertario L, Bisgaard ML, Morh J, Kolodner R, Fodde. (1996), “Majority of

hMLH1 mutations responsible for hereditary nonpolyposis colorectal cancer cluster at the
exonic region 15-16”, Am J Ham genet, 58: 300-307.
59. Yamashita K, Dai TY, Yamamoto F, Perucho (2003), “Genetics supersedes epigenetics in
colon cancer phenotype”, Cancer cell, 4: 121-131.
60. Young KS, Seung CH, Joo HS, Sung HH, Ja LK, Byong CY, Il JK, Jae GP, (2004),
“Germline mutations in MLH1, MSH2 and MSH6 in Korean HNPCC families”, Human
mutation, Mutation in brief, 748.
61. Zhang J, Lindroos A, Ollila S, et al. (2006), “Gene conversion is a frequent mechanism of
inactivation of the wild-type allele in cancers from MLH1/MSH2 deletion carriers”, Cancer
Res, 66(2): 659-664.
Trang web
62.
63.
64. Polymorphism
SSCP Analysis-by-Nondenaturing-PAGE-3468.html
65.
66.