THỰC HÀNH VI SINH ỨNG DỤNG

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM
KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BÀI GIẢNG
THỰC HÀNH
VI SINH ỨNG DỤNG
Biên soạn: TS. Nguyễn Hoài Hương
1
- 2009 -
2
Giới thiệu môn học
Môn thực hành vi sinh ứng dụng nhằm giúp sinh viên làm quen với các phương pháp phân lập, khảo
sát các vi sinh vật được ứng dụng trong xử lý môi trường, công nghệ lên men . Các vi sinh ứng dụng
thường được phân lập từ môi trường tự nhiên, chúng có khả năng sử dụng các cơ chất khác nhau,
chuyển hóa vật chất trong tự nhiên. Nguồn phân lập chúng có thể từ đất, nước, động vật, thực vật hay
thực phẩm. Phân lập, xác định chức năng, định danh chúng là bước đầu đưa chúng vào ứng dụng.
Trong khuôn khổ bài thực hành môn vi sinh ứng dụng sinh viên phân lập vi sinh vật chủ yếu từ môi
trường đất. Đất là một trong những cơ chất thuận lợi nhất đối với sự phát triển của các loại vi sinh vật
khác nhau. Số lượng vi sinh trong 1 g đất có tới hàng trăm triệu, thậm chí hàng tỉ tế bào. Hoạt động
sống của vi sinh vật đất có liên quan đến nhiều quá trình xảy ra trong đất, trước hết là các vòng tuần
hoàn của vật chất trong tự nhiên như chu trình carbon, chu trình nitơ, phospho và lưu huỳnh.
Các bước chung của bài thực hành là
1. Phát hiện các nhóm vi sinh vật trong mẫu đất bao gồm đại diện của một số nhóm phân loại
2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh trưởng và hình thái tế bào học tế bào của các đại diện thuộc
vi sinh vật phân lập được.
NỘI DUNG THỰC HÀNH
BÀI 1: VI KHUẨN AMÔN HÓA
BÀI 2: VI KHUẨN NITRAT HÓA
BÀI 3: VI KHUẨN PHẢN NITRAT HÓA
BÀI 4: VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ
BÀI 5: VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE

3
BÀI 1: VI KHUẨN AMÔN HÓA
I. Lý thuyết
Quá trình amôn hóa là quá trình phân giải protein và các hợp chất hữu cơ khác có chứa nitơ tạo
thành amoniac. Các vi sinh vật có khả năng amôn hóa bao gồm nhiều loài sinh bào tử hoặc không
sinh bào tử, có khả năng sử dụng nhiều nguồn vật chất khác nhau. Ngoài ra còn nhiều loại xạ khuẩn
và nấm khuẩn ty. Tuy vậy, những vi sinh vật chỉ sử dụng riêng một loại protein thì không nhiều.
Các vi sinh vật này có khả năng tiết men phân giải protein vào môi trường, thủy phân thành các
amino acid. Khi đó, chúng sử dụng các amino acid này trong quá trình dị hóa và đổng hóa. Các sản
phẩm đặc trưng của quá trình phân giải protein là NH
3
và H
2
S.
Quá trình phân giải protein có thể xảy ra trong các điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Trong điều kiện
hiếu khí, các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được phân giải bởi các loài trong giống Bacillus và
Pseudomonas, các đại diện trong họ Enterobacteriaceae, các xạ khuẩn và nấm khuẩn ty. Trong đó,
vai trò quan trọng và chủ yếu nhất là giống Bacillus. Trong điều kiện kỵ khí thì các loài trong giống
Clostridium tham gia quá trình chuyển hóa này. Còn trong điều kiện thông khí hạn chế, quá trình
amôn hóa được thực hiện bới các loài vi khuẩn và trực khuẩn kỵ khí tùy nghi.
II. Thực hành
Việc phát hiện và xác định số lượng các vi sinh vật amôn hóa được thực hiện bằng cách cấy các
mẫu phân tích vào môi trường lỏng và rắn canh thịt-peptone.
Việc cấy lên môi trường thạch được tiến hành bằng dịch huyền phù đã thanh trùng Pasteur nhằm
tiêu diệt các tế bào sinh dưỡng và chỉ còn giữ lại bào tử của các đại diện thuộc giống Bacillus – giống
đặc trưng nhất cho quá trình amôn hóa.
Ngoài ra, việc cấy lên môi trường thạch cho phép nhận định được các đặc tính khác nhau của
khuẩn lạc các vi khuẩn khác nhau này.
1. Môi trường - hóa chất
Môi trường canh thịt- peptone:

Cao thịt 5g
Peptone 10g
Nước 1000ml
Môi trường thạch:
Trộn vào môi trường lỏng 2% thạch.
4
Dung dịch pha loãng mẫu: dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng.
Giấy lọc loại thấm acetate chì
Giấy quỳ đỏ
Các loại thuốc nhuộm quan sát vi sinh vật: thuốc nhuộm Gram và thuốc nhuộm bào tử,
Thuốc thử Nessler
2. Dụng cụ
Các dụng cụ pha chế môi trường
Các dụng cụ cấy, khử trùng
Kinh hiển vi
3. Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị môi trường:
Môi trường canh thịt-peptone được phân vào khoảng 1/3 chiều cao ống nghiệm, khử trùng ở 1
atm, 15 min.
Các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetat chì được cho vào đĩa petri, hấp khử trùng ở 0,5 atm.
Môi trường thạch canh thịt-peptone: sau khi hấp khử trùng được phân vào các đĩa petri, giữ ở
30
O
C
Chuẩn bị mẫu:
Mẫu đất được pha với nước để thu dịch huyền phù
• Ủ vi sinh vật trên môi trường lỏng:
Cấy từ các dịch pha loãng nồng độ 10
5
– 10

10

Lấy 1ml dịch pha loãng cấy vào ống nghiệm có chứa môi trường canh thịt-peptone đã khử
trùng ở trên
Dùng kẹp lấy các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetatechì gài vào giữa nút bông và ống
nghiệm
Ủ ở nhiệt độ 28-30
O
C trong 3 ngày đêm.
• Ủ vi sinh vật trên môi trường thạch:
Cấy từ các dịch pha loãng nồng độ 10
2
– 10
5
Lấy 0,5ml dịch pha loãng cho vào các đĩa petri có chứa môi trường đã khử trùng ở trên
Dùng que trang trải đều lên bề mặt thạch
Ủ ở nhiệt độ 28-30
O
C trong 3 ngày đêm.
Mỗi môi trường tiến hành thêm 1 mẫu đối chứng
4. Quan sát và ghi nhận kết quả
5
Đối với môi trường lỏng, quan sát:
Sự đục môi trường
Sự tạo bông, kết cạn
Nổi váng trên bề mặt
Phản ứng sinh hóa:
Màu kết tủa với thuốc thử Nessler: Nhỏ một giọt thuốc thử Nessler lên đĩa sứ trắng, thêm một
que cấy đầy đất vườn ủ trong peptone broth. Quan sát màu kết tủa:
Màu vàng nhạt – ít ammoniac

Vàng sậm – nhiều ammoniac
Nâu – rất nhiều ammoniac
Sự sinh NH
3
làm giấy quỳ hóa xanh
Sự sinh H
2
S làm giấy lọc thấm acetate chì hóa đen.
So sánh đối chứng và thí nghiệm.
Độ pha
loãng
Đục môi
trường
Tạo bông Tạo cặn Sinh NH
3
Sinh H
2
S
Nhận xét mức độ, tỷ lệ xuất hiện cao nhất trong 1g mẫu
Chọn một độ pha loãng có tỷ lệ vi sinh vật cao nhất làm tiêu bản và soi kính hiển vi
Trên môi trường thạch, ghi nhận:
Số lượng khuẩn lạc trên 1 đĩa ở mỗi độ pha loãng
Số khuẩn lạc đặc trưng
Quan sát hình thái khuẩn lạc, mô tả, ghi nhận vào bảng
Độ pha
loãng
Số khuẩn lạc Số khuẩn lạc
đặc trưng
Hình thái
khuẩn lạc

Xuất hiện
bào tử
Khả năng di
động
Chọn một đĩa có nhiều khuẩn lạc đặc trưng nhất làm tiêu bản và soi kính hiển vi
So sánh hình thái quan sát được giữa tiêu bản từ môi trường lỏng và môi trường thạch
6