Định vị miễn dịch hiển vi điện tử các kháng nguyên mặt ngoài bằng kỹ thuật Gins potx

TCNCYH 27 (1) - 2004
Định vị miễn dịch hiển vi điện tử các kháng nguyên
mặt ngoài bằng kỹ thuật GINs

Nguyễn Kim Giao
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng

GINS là kỹ thuật miễn dịch hiển vi điện tử, kết hợp kỹ thuật đánh dấu miễn dịch gián
tiếp với kỹ thuật nhuộm âm để nghiên cứu kháng nguyên mặt ngoài của các mẫu hạt vi
sinh vật nh vi rút, vi khuẩn, các mảnh vỡ tế bào.v.v. Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật này
trên vắc xin viêm não Nhật Bản, vắc xin viêm gan B và vi khuẩn salmonella. Những kết
quả chứng tỏ rằng các mẫu trên không những có cấu trúc hoàn chỉnh mà kháng nguyên
mặt ngoài có tính đặc hiệu cao

I. Đặt vấn đề
Miễn dịch hiển vi điện tử (IEM) là sự kết
hợp kỹ thuật miễn dịch với kỹ thuật hiển vi
điện tử để định vị các thành phần miễn
dịch đặc hiệu, các đại phân tử sinh vật. Khi
mà hoá mô miễn dịch sử dụng hiển vi
quang học để nghiên cứu phản ứng miễn
dịch xẩy ra ở mức mô và tế bào thì hoá
miễn dịch tế bào sử dụng EM để nghiên
cứu phản ứng miễn dịch xẩy ra ở mức các
đại phân tử và siêu cấu trúc tế bào.
Nhờ kỹ thuật miễn dịch hiển vi điện tử
có thể xác định vị trí của các chất nh định
vị các protein đặc hiệu trong hoặc trên mặt
vi khuẩn, tế bào, bào quan; dò tìm các
kháng nguyên mặt ngoài của vi rút; định vị
các chuỗi DNA hoặc RNA đặc hiệu trong

các tế bào.v.v.
Hiện nay phơng pháp miễn dịch hiển
vi điện tử bao gồm nhiều kỹ thuật, sử dụng
những thiết bị và hoá chất chuyên dụng
khác nhau đã đợc ứng dụng rộng rãi.
Kỹ thuật miễn dịch hiển vi điện tử đợc
ứng dụng tại phòng thí nghiệm hiển vi điện
tử của Viện Vệ sinh dịch tễ trung ơng
(VSDTTU) là kết hợp kỹ thuật miễn dịch
với kỹ thuật nhuộm âm và kỹ thuật lát cắt
siêu mỏng sau đúc.
Trong bài này chúng tôi trình bầy việc
ứng dụng kỹ thuật đánh dấu miễn dịch gắn
vàng gián tiếp với kỹ thuật nhuộm âm bản
và gọi tắt là kỹ thuật GINS.
II. Vật liệu, thiết bị và phong
pháp
1. Vật liệu và mẫu
- Vật liệu: gồm lới niken với màng đỡ
phủ các bon và các hoá chất là
glutaraldehyde, đệm PBS, BSA,
ammonium acetate, uranyl acetate, uranyl
formate
- Mẫu: Mẫu nghiên cứu thờng là mẫu
bệnh phẩm dạng lỏng có chứa virut, vi
khuẩn, các văc xin vi rút v.v. Sau khi xử lý
theo những phơng pháp riêng (loại bỏ bất
kỳ những dung dịch, hóa chất hoặc những
phụ gia nào bao quanh mà có thể làm thay
đổi hoặc ngăn cản thuốc nhuộm âm thâm

nhập vào mẫu) mẫu cần phải có ít nhất về
nồng độ là 5.0x10
7
hạt/ ml và thể tích là
50àl.
Ba loại mẫu sau dùng trong nghiên
cứu:
- Mẫu vi rút vắc xin viêm não Nhật Bản
loạt số L24/1999 và kháng thể dặc hiệu,
- Mẫu kháng nguyên bề mặt vi rút vắc

17
TCNCYH 27 (1) - 2004
xin viên gan B loạt số L44/2000 và kháng
thể đặc hiệu. Cả hai loại mẫu trên và các
kháng thể đặc hiệu tơng ứng nhận từ
Công ty văc xin và sinh vật phẩm số 1.
- Mẫu vi khuẩn salmonella và kháng thể
đặc hiệu H (nhận từ Khoa vi khuẩn, Viện
Vệ sinh dịch tễ trung ơng).
2. Thiết bị
- Kính hiển vi điện tử truyền qua:
JEM 1010 (JEOL, Japan) với điện áp
gia tốc chùm điện tử 30-100KV, độ phóng
đại 50-600.000x, độ phân giải 3A
0.
Các ảnh đợc chụp trên phim FUJI-FG,
in trên giấy ảnh Sterlin và lu trên đĩa cứng
của hệ Digital camera-Computer đi kèm
với JEM1010.

3. Phơng pháp
3.1. Kỹ thuật đánh dấu kháng nguyên
gián tiếp:
Nguyên tắc của kỹ thuật là trớc tiên
kháng nguyên kết hợp với kháng thể đặc
hiệu trong một thời gian nhất định. Sau khi
rửa để loại các kháng thể đặc hiệu thừa
không kết hợp, cho kháng kháng thể phát
hiện và liên kết với phức hợp kháng
nguyên - kháng thể kể trên. Do Protein A
có thể liên kết với phần Fc của một số
Immunoglobulin (đặc biệt là IgG) của vài
loài lại có thể cộng hợp với các chất đánh
dấu siêu cấu trúc-các đích điện tử là các
hạt vàng có đờng kính từ 5 tới 10nm, nên
thay vì sử dụng kháng kháng thể (kháng
thể thứ hai) là dùng ProteinA có gắn vàng.
Dới kính hiển vi điên tử có thể thấy đợc
các hạt vàng, tức là thấy đợc vi trí kháng
nguyên trong mẫu. Hình 1 minh hoạ kỹ
thuật đánh dấu gián tiếp kháng nguyên.

KN I
g
G đặc hiệu KN - I
g
G đặc
hiệu
ProteinA-Au KN - I
g

G đặc hiệu -
Protein A-Au
Hình 1. Kỹ thuật đánh dấu kháng nguyên gián tiếp
3.2. Kỹ thuật nhuộm âm:
Đây là kỹ thuật làm mẫu hiển vi điện tử
đơn giản nhanh và có độ phân giải cao.
Mẫu dạng dịch treo của những hạt nh vi
rút, vi khuẩn đợc đa lên lới và sau đó
trải đều một lớp thuốc nhuộm bao quanh
những hạt mẫu. Thuốc nhuộm cản chùm
tia điện tử còn hạt mẫu cho chùm tia điện
tử đi qua và hoạ lên cấu trúc của hạt mẫu
nghiên cứu trên màn quan sát.
3.3. Kỹ thuật đánh dấu miễn dịch gắn
vàng với nhuộm âm - Kỹ thuật GINS
Kỹ thuật đánh dấu miễn dịch gắn vàng
và nhuộm âm (kỹ thuật GINS) xuất phát từ
kỹ thuật đơn giọt (Hayat và Miller 1990) và
đợc tiến hành nh sau:
1. Các giọt 20àl mẫu vi rút đặt trên bề
mặt một miếng parafilm sạch.
2. Lới có màng collodium phủ các bon
ngậm nớc còn ớt (làm bằng cách ngâm

18
TCNCYH 27 (1) - 2004
trong dung dịch bacitracin 0,01%) đợc đặt
lên giọt mẫu để thu lấy các vi rút trong 5-
10 phút.
3. Rửa lới bằng cách đặt liên tiếp trên

2-3 giọt PBS.
4. Đặt nổi lới trên giọt PBS-BSA 2%
để phóng bế các vị trị kháng nguyên
không đặc hiệu, trong 20 phút .
5. Đặt nổi lới trên giọt kháng thể đặc
hiệu thứ nhất pha loãng trong PBS-BSA
0,5%, trong 20 phút.
6. Rửa lới thận trọng bằng PBS - BSA
0,2%.
7. ủ lới trong protein-A gắn vàng (5
hoặc 10nm) trong 20 phút.
8. Rửa lới bằng cách đặt liên tiếp trên
2-3 giọt PBS.
9. Cố định nhanh trong glutaraldehyde
0,1% trong 1 phút.
10. Rửa kỹ lới với ammonium acetate
0,1%
11. Nhuộm âm với uranyl acetate hoặc
uranyl formate 1%, pH 5,4.
12. Các lới đợc làm khô dần trớc
khi quan sát.
Trong quá trình tiến hành, các lới
không đợc để khô và thận trọng giữ cho l-
ới nổi trên mặt giọt. Hình 2 là qui trình làm
mẫu kể trên.


19

Hình 2: Đánh dấu miễn dịch gắn vàng và nhuộm âm tiêu bản.

III. Kết quả
1. Vi rút vắc xin viêm no Nhật Bản
và kháng nguyên bề mặt HBsAg.
Hình 3 và hình 4 là các ảnh của vi rút
vắc xin viêm não Nhật Bản và HBsAg.
Chúng tôi nhận thấy quanh những hạt vi
rút của cả hai loại đều đợc bám bởi
Vi rút
Lới
BSA
2 % PBS

5-10 phút
Phón
g

b
ế

20 phút
Lới
Khán
g
thể
kháng virút

20 phút
Parafilm
Rửa 3 lần
5 phút
BSA
0.2%
Lới
A
A- Au
Protein
20 phút

Parafilm


Glu 0,1% PBS
A
mmonium
acetate 0,1%

PBS
1 % UA
H
2O
Quan sát
trên kính
HVĐTTQ
Rửa 3 lần
5 phút

Rửa 3 lần
5 phút
Rửa 3 lần
5 phút

Cố đ
ị
nh

Nhu
ộ
m 5 phút
Parafilm
Parafilm
TCNCYH 27 (1) - 2004
những hạt vàng (hạt đen tròn với đờng
kính dAu=5nm dùng cho VXVNNB () và
dAu=10nm dùng cho HBsAg (). Những
kết quả thu đợc trên ảnh xác nhận rằng
cả hai loại mẫu không những có cấu trúc

hoàn chỉnh mà còn mang đặc tính kháng
nguyên cao.
2. Mẫu vi khuẩn samonella
Hình 5 là ảnh của vi khuẩn salmonella.
Thân vi khuẩn dầy nên nhận đợc ảnh tối
không rõ siêu cấu trúc. Trên những lông
của vi khuẩn () bám đầy những hạt vàng
xác nhận rằng trên lông vi khuẩn mang
kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể H.

Hình 3. ảnh vi rút vắc xin viêm não Nhật Bản đánh dấu MDHVĐT theo kỹ thuật GINS

Hình 4. ảnh của HBsAg đánh dấu MDHVĐT theo kỹ thuật GINS

20
TCNCYH 27 (1) - 2004



Hình 5. ảnh của vi khuẩn salmonella đánh dấu MDHVĐT theo kỹ thuật GINS

IV. Bàn luận
Kỹ thuật đánh dấu miễn dịch gắn vàng
nhuộm âm đợc sử dụng để phát hiện ra
sự có mặt hoặc sự vắng mặt của những
protein, những kháng nguyên và những đại
phân tử khác ở trên bề mặt những mẫu
sinh vật trong dịch treo. Những hạt virút,
những mảnh tế bào, vi khuẩn, những mẫu
lipoprotein và những mẫu sinh vật nhỏ

khác đều có thể đánh dấu miễn dịch khi sử
dụng kỹ thuật này.
Về mặt kỹ thuật các kháng nguyên mặt
ngoài của vi sinh vật hay kháng nguyên
nằm mặt ngoài tế bào là các kháng
nguyên có thể quan sát dễ dàng nhất, vì
các kháng thể và các phần tử đánh dấu có
thể đi đến một cách tự do. Trong nghiên
cứu ứng dụng này chúng tôi sử dụng chất
đánh dấu là keo vàng gắn trớc với Protein
A nên tính ổn định của nó rất cao đồng
thời lại có thể lựa chọn Protein A gắn hạt
vàng có các đờng kính khác nhau (5-
10nm) cho phù hợp với từng mẫu nghiên
cứu
Kỹ thuật miễn dịch gắn vàng thực hiện
trên mẫu sinh vật trớc khi cố định hóa học
nên có nhiều lợi thế hơn những kỹ thuật
đánh dấu miễn dịch chuẩn khác. Kỹ thuật
cho thấy đợc siêu cấu trúc của mẫu bao
gồm những chi tiết trên mặt, các thành
phần bên trong, cung cấp những thông tin
trực tiếp và đầy đủ về mặt hình thái và
nguyên tắc cấu tạo của các vi rút và xác
định đợc vị trí các kháng nguyên protein
hoặc đại phân tử nhờ những hạt vàng định
vị.
Thực tế cho thấy những lợng nhỏ các
immunoglobulin không bị phát hiện bằng
các phơng pháp phân tích sinh hoá hoặc

miễn dịch, nhng một lợng rất nhỏ IgG
của ngời cũng có thể nhận ra đợc trong
các mẫu HBsAg bằng phơng pháp GINS.
Điều đó chứng tỏ rằng phơng pháp này là
thích hợp để kiểm tra chất lợng các mẫu
văc xin trong quá trình tinh chế.
Những điều lập luận trên cũng hoàn
toàn có giá trị với vi khuẩn kích thớc nhỏ
cỡ hơn àm mà ở đây là tiêm mao của

21
TCNCYH 27 (1) - 2004
Salmonella. Kỹ thuật GINS cho phép
quan sát trực tiếp vi khuẩn không những
hình thái cấu trúc mà còn xác định đợc
chính xác vị trí kháng nguyên trên vi khuẩn
góp phần định loại.
III. Kết luận
Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật GINS
trên vắc xin viêm não Nhật Bản, vắc xin
viêm gan B và vi khuẩn salmonella. Những
kết quả chứng tỏ rằng các mẫu trên không
những có cấu trúc hoàn chỉnh mà kháng
nguyên mặt ngoài có tính đặc hiệu cao.
Tài liệu tham khảo
1. Dawes, C. J. 1971. Biological
Techniques in Electron Microscopy.
Barnes and Noble Inc., New York. 233 pp.

2. Doane, F. W., and N. Anderson.

1987. Electron Microscopy and Diagnostic
Virology. Cambridge University Press,
Cambridge. 194 pp.
3. Hayat, M. A. 1989. Principles and
Techniques of Electron Microscopy:
Biological Applications. CRC Press, Boca
Raton, FL 469 pp.
4. Hayat, M. A., and S. E. Miller.
1990. Negative Staining. McGraw Hill,
New York. 345 pp.
5. Miller SE. Diagnostic virology by
electron microscopy. ASM News 1988;
54:475.

Summary
Immunoelectronmicroscopic localization of
surface Antigens by GINS technique

GINS is immunoelectronmicroscopic technique combinated indirect immunolabelling
technique and negative stainning technique in order to investigate surface antigens of
particle specimens, such as virus, bacteria, debris of cell. This applicant investigation
carry out on virus of JEV, HBsAg and salmonella. The results proved that samples not
only have complete structure but also surface antigens with high specifity.


22