Nghiên cứu tính đa hình di truyền và vai trò truyền bệnh của các thành viên trong nhóm loài Anopheles maculatus ở Việt Nam

Đại học quốc gia H Nội
Trờng Đại học khoa học tự nhiên


Nguyễn Thị Hơng Bình


Nghiên cứu tính đa hình di truyền
v vai trò truyền bệnh
của các thnh viên trong nhóm loi
Anopheles maculatus ở việt Nam

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62.42.70.01


Tóm tắt Luận án tiến sỹ sinh học





Hà Nội 2009


- 0 -

Công trình đợc hoàn thành tại:
Bộ môn Di truyền học, khoa Sinh học

Trờng Đại học khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội



Ngời hớng dẫn khoa học:
PGS.TS. Trịnh Đình Đạt
TS. Trần Đức Hinh

Phản biện 1:
GS.TSKH. Vũ Quang Côn

Phản biện 2:
PGS.TS. Phan Văn Chi


Phản biện 3:
PGS.TS. Lê Khánh Thuận


Lụân án sẽ đợc bảo vệ trớc Hội đồng chấm luận án cấp Nhà
nớc họp tại Trờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học quốc
gia Hà Nội.
Vào hồi 9 giờ 00 ngày 17 tháng 8 năm 2009



Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Th viện Quốc gia
- Th viện Trờng Đại học khoa học Tự nhiên
- Trung tâm thông tin - th viện Đại học Quốc gia Hà Nội

- Th viện Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng-Trung ơng




-1 -
Đặt vấn đề
Những nghiên cứu về các côn trùng truyền bệnh, trong đó có muỗi
Anopheles, trung gian truyền bệnh sốt rét ngày càng đợc đẩy mạnh trên
mọi phơng diện: phân loại, phân bố, vai trò truyền bệnh, sinh học, tập tính
và biện pháp phòng chống. Nhiều phơng pháp kỹ thuật, nghiên cứu mới
nhằm phân loại và xác định nguồn gốc phát sinh đợc ứng dụng rất mạnh.
Việc kết hợp giữa các phơng pháp nghiên cứu truyền thống với những
phơng pháp sinh học phân tử là rất cần thiết để nghiên cứu các quần thể
muỗi truyền bệnh. Nhiều loài muỗi lúc đầu đợc xác định nh một loài đơn,
nhng trong quá trình nghiên cứu sâu về vai trò dịch tễ, đặc tính sinh học và
bằng việc sử dụng các kỹ thuật mới, áp dụng các dấu hiệu nhận biết về di
truyền, hoá sinh đã xác định chúng là những nhóm loài đồng hình (sibling
species complex, cryptic species complex), v chúng có thể có vai trò
truyền bệnh khác nhau. Loài muỗi Anopheles (Cellia) maculatus đợc
Theobald phát hiện ở Hồng Kông, Trung Quốc vào năm 1901. Đây là loài
muỗi phân bố rộng rãi ở vùng Đông phơng. Cho đến nay, phức hợp An.
maculatus gồm ít nhất 12 loài thành viên. Nhiều thành viên trong nhóm này
đã đợc xác định có vai trò truyền bệnh ở Malaysia, Thái Lan, Nepal,
Trung Quốc, Singapore. ở Việt Nam, trớc đây, muỗi Anopheles maculatus
đợc xác định là một loài đơn, phân bố rộng rãi ở vùng rừng núi toàn quốc.
Những nghiên cứu gần đây về hình thái, tế bào cho thấy phức hợp loài này
gồm ít nhất 6 loài đã đợc định tên và một số dạng cha xác định rõ vị trí
phân loại. Đến nay loài An. maculatus vẫn đợc coi là vectơ truyền bệnh
thứ yếu ở nớc ta. Nhiều vấn đề mang tính hệ thống liên quan đến phân

loại, vai trò truyền bệnh của loài muỗi này ở Việt Nam cần đợc giải
quyết.
Với những lý do nêu trên chúng tôi tiến hành đề tài :Nghiên cứu tính
đa hình di truyền và vai trò truyền bệnh của các thành viên trong
nhóm loài Anopheles maculatus ở Việt Nam nhằm mục đích :
1. Xác định thành phần loài và phân bố của các thành viên trong phức
hợp loài An. maculatus ở Việt Nam.
2. Xác định tính đa hình di truyền và mối quan hệ di truyền của các
thành viên trong phức hợp loài.
3. Xác định vai trò truyền bệnh của chúng nhằm góp phần vào việc
phòng chống vectơ sốt rét ở n
ớc ta.

-2 -
Những đóng góp mới về mặt khoa học
v ý nghĩa thực tiễn của luận án
1
- Lần đầu tiên đã phối hợp nhiều kiểu dấu hiệu từ dấu hiệu hình thái kiểu
hình đến dấu hiệu di truyền tế bào, điện di enzym và phân tích phân tử
ADN để nghiên cứu một nhóm loài đồng hình có vai trò truyền sốt rét ở
Việt Nam và xác định mối quan hệ di truyền của các thành viên trong nhóm
loài An. maculatus.
2- Lần đầu tiên đã xây dựng đợc bảng định loại hình thái đầy đủ các pha
phát triển của các thành viên, đã định tên trong nhóm loài An. maculatus và
lập bản đồ phân bố của chúng ở Việt Nam.
3- Đã bổ sung thêm về những đặc điểm đa hình sinh học, sinh thái học của
muỗi và bọ gậy các thành viên trong nhóm loài An. maculatus ở Việt Nam
4- Đã xác định đợc khả năng truyền cả hai loài KST P.falciparum và
P.vivax của muỗi An. maculatus.
Cấu trúc của luận án

Luận án có 188 trang (không kể phụ lục) bao gồm các phần: Đặt
vấn đề (3 trang); chơng 1: Tổng quan tài liệu (40 trang); chơng 2: Đối
tợng và phơng pháp nghiên cứu (17 trang); chơng 3: Kết quả nghiên cứu
(83 trang); chơng 4: Bàn luận (20 trang); Kết luận và đề nghị (3 trang); các
công trình đã công bố của tác giả có liên quan đến nội dung luận án (1
trang); những đóng góp mới của luận án (1 trang); tài liệu tham khảo (20
trang, gồm 27 tài liệu tiếng việt, 192 tài liệu tiếng Anh, 2 tài liệu tiếng
Pháp) và phụ lục (32 trang). Luận án đợc trình bày với 33 bảng, 72 hình.
Chơng 1 (3 hình), chơng 2 (8 bảng, 6 hình), chơng 3 (25 bảng, 63 hình).
Phụ lục (10 bảng).
Chơng 1: tổng quan ti liệu
1.1. Đại cơng về vấn đề nghiên cứu các loài đồng hình
Nhiều loài muỗi là vectơ truyền bệnh sốt rét tồn tại nh thành viên của
các phức hợp loài, trong đó có những loài truyền bệnh và những loài không
có vai trò này (Torres và cs, 2000; Van Bostel và cs, 2001). Để nghiên cứu
các phức hợp loài đồng hình đòi hỏi phải áp dụng nhiều phơng pháp khác
nhau từ đơn giản đến phức tạp để kết hợp đợc u điểm của từng phơng
pháp (Cockburn, 1997).
1.2. Đa hình di truyền và nghiên cứu đa hình di truyền ở muỗi
Tính đa hình di truyền có thể đợc xác định tại mọi cấp độ tổ chức bao
gồm từ số lợng nucleotit đến cấu trúc của ADN trong mỗi tế bào cũng nh
số lợng, cấu trúc của nhiễm sắc thể, protein, hay hình thái cơ thể của mỗi
loài trong các điều kiện tự nhiên khác nhau





-3 -
1.2.1. Đa hình enzym và ứng dụng để nghiên cứu đa hình di truyền ở

muỗi: Hiện tợng đa hình izozym trong tự nhiên là kết quả của đột biến gen
cấu trúc của các locut kiểm soát việc tổng hợp các sản phẩm của gen, có
tính ứng dụng cao, cung cấp những số liệu có giá trị cho những nghiên cứu
về Anopheles. Những dấu hiệu về sự đa hình di truyền đã đợc phát hiện ở
hầu hết các loài Anopheles nhất là ở các loài đồng hình. Có nhiều nhóm
loài, phức hợp loài đã đợc nghiên cứu bằng phơng pháp này nh: An.
minimus, An. dirus ở Châu á, An. quandrimaculatus ở Nam Mỹ, An.
gambiae, An. funestus ở châu Phi( Coluzzi và cs, 1977; Narang và cs,
1989; Sylvie Marguin và cs, 1998)
1.2.2. Di truyền tế bào và ứng dụng trong nghiên cứu đa hình di
truyền: Phơng pháp di truyền tế bào tập trung vào nghiên cứu nhiễm sắc
thể của tế bào: nhiễm sắc thể khổng lồ (polytene chromosome) và bộ nhiễm
sắc thể ở kỳ giữa nguyên phân (karyotype). Di truyền tế bào rất hữu ích
trong việc phân biệt các loài đồng hình trong phức hợp loài An. gambiae
(Coluzzi 1968, Green 1972), An. culicifacies (Green & Miles 1980;
Subbarao và cs 1983) và An. maculatus (Green và cs 1985). Tần số của
những đảo đoạn nhiễm sắc thể đợc sử dụng để nghiên cứu cấu trúc quần
thể (Taylor và cs., 1993; Petrarca và cs, 2000; Kamau và cs, 2002).

1.2.3. Đại cơng về PCR và ứng dụng trong nghiên cứu đa hình di
truyền ở muỗi.
- Phản ứng PCR: Phản ứng PCR có ứng dụng rất hiệu quả để nghiên cứu
sự khác nhau ở mức độ phân tử, xác định chính xác quan hệ tiến hoá của
các loài. Các nhóm loài muỗi truyền bệnh quan trọng đều đã đợc sử dụng
phản ứng PCR để định loại nh: An. gambiae (Scott, 1993); An.
quandrimaculatus (Collins và cs 1996), An. dirus (Jian và Feng, 1997); An.
sinensis (Ma Yajunvà cs, 1998), An. funestus (Kaumau, 2002; Anna Cohuet
và cs, 2003).
- Kỹ thuật RAPD-PCR và ứng dụng RAPD- PCR trong nghiên cứu đa
hình ở muỗi : Kỹ thuật RAPD sử dụng mồi ngẫu nhiên tạo ra các đoạn

nhân bản đa hình. Chỉ thị RAPD đợc dùng để phân tích và xác định mối
quan hệ giữa các quần thể, loài sinh vật.
Wilkerson và cs (1993) đã sử dụng RAPD-PCR để phân biệt 2 loài muỗi
trong phức hợp Anopheles gambiae là An. gambiae và An. arabiensis. Phức
hợp loài An. dirus cũng đợc Sylvie Manguin và cs (2002) phân biệt nhờ sử
dụng kỹ thuật RAPD.

-4 -
- Đại cơng về PCR- RFLP vàứng dụng PCR- RFLP trong nghiên cứu
đa hình muỗi:Phân tích PCR- RFLP dựa trên nguyên tắc là sự khác nhau
về kích thớc của các phân đoạn đợc tạo ra do xử lý enzym giới hạn đối
với các đoạn ADN đích đã đợc nhân bản.
RFLP-PCR đợc sử dụng để phân biệt 2 loài trong phức hợp
An.maculipennis ở Anh. An. maculatus có thể nhận biết đợc khi dùng
enzym HaeII cắt đoạn ITS2 (Torress và cs, 2000). Favia và cs (1997) phân
biệt 3 dạng An. gambiae bằng PCR-RFLP.
- Kỹ thuật sử dụng mẫu dò ADN (DNA - probe): Sử dụng mẫu dò ADN
dùng phân loại các loài vectơ sốt rét dựa trên đặc tính bắt cặp bổ sung của
nucleotit. Các dòng mẫu dò ADN để có thể phân biệt đợc 5 trong 6 loài
thuộc phức hợp Anopheles gambiae (Collins và cs, 1987).
- Kỹ thuật đa hình cấu tạo sợi đơn (Single strand conformational
polymorphism-SSCP): Kỹ thuật này phát hiện điểm đột biến trong các sản
phẩm của phản ứng PCR. Sharpe và cs (1999) dùng SSCP để phân loại các
loài thuộc series Myzomyia là An. aconitus, An. varuna và An. minimus.
- Kỹ thuật khuếch đại một allen đặc biệt (Allene-specific amplification-
ASA) Dựa vào thiết kế những mồi chỉ bắt cặp với một allen nhất định và
allen đó đặc trng cho loài. Walton và cs (1999), Manguin và cs (2002)
nghiên cứu phức hợp loài An. dirus bằng ASA. Năm 1999, Sharp và cs đã
phân biệt các loài trong series Myzomyia bằng ASA.
- Microsattellite ADN-SSR: Microsattellite đã đợc chứng minh là đặc

biệt hữu ích cho việc nghiên cứu di truyền quần thể và lập bản đồ di truyền.
ở châu á , Rongnoparus và cs (1996, 1999) đã phân tích các locut ở An.
maculatus. ở Nam Mỹ, Conn và cs (2001) đã mô tả tính chất của 8 locut
đa hình ở muỗi An.darlingi và ở châu Phi, Sharakhov và cs (2001) đã mô tả
tính chất của 31 locut ở An.funestus.
- Phơng pháp giải trình tự: Giải trình tự ADN là quá trình xác định trật
tự nucleotit của một đoạn ADN nhất định. Các đoạn gen đợc giải trình tự
nhiều ở muỗi là IST1, IST2, COI và COII cũng nh D3. Việc giải mã toàn
bộ hệ gen An. gambiae, vectơ truyền bệnh sốt rét chính ở Châu Phi đã đợc
bắt đầu vào năm 2001. Tháng 5/2007 các nhà khoa học đã phác thảo xong
trình tự bộ gen của muỗi Aedes aegypti, vectơ truyền bệnh sốt dengue,
dengue xuất huyết, sốt vàng.
1.3. Những nghiên cứu về vai trò truyền bệnh và tính a vật chủ của
các vectơ

1.3.1. Những nghiên cứu về vai trò truyền bệnh sốt rét của muỗi
Để chứng minh vai trò truyền bệnh của một vectơ ngời ta phải
chứng minh đợc chúng có mang vật gây bệnh. Có nhiều phơng pháp để
chứng minh điều này nh: mổ muỗi phát hiện thoa trùng (Ronal Ross,
1901). Kỹ thuật miễn dịch liên kết enzym (ELISA) và kỹ thuật PCR.




-5 -
1.3.2. Xác định tính a vật chủ của vectơ
Một biện pháp cơ bản để chứng minh đợc một loài muỗi có truyền
bệnh hay không là xem muỗi có hút máu ngời hay không. Nếu xác định
đợc một loài muỗi có tính a thích vật chủ là con ngời thì chúng ta có
bằng chứng để nghĩ tới loài muỗi này có khả năng truyền bệnh cho ngời

nhiều hơn loài khác không thích đốt máu ngời.
Phơng pháp miễn dịch, xác định máu vật chủ trên thạch; năm 1986,
Bukort và cs, đã áp dụng phơng pháp ELISA; và gần đây là sử dụng kỹ
thuật PCR để xác định máu vật chủ.
1.4. Những nghiên cứu về nhóm loài An. maculatus
1.4.1. Nghiên cứu về An. maculatus ngoài nớc
- Từ loài muỗi Anopheles maculatus đến nhóm loài An. maculatus: Loài
muỗi Anopheles maculatus đợc Theobald phát hiện năm 1901 tại Hồng
Kông. Hiện nay, tổng số loài đã đợc định tên là 12 loài, ngoài ra còn có
một số dạng cha đợc định tên.
- Vấn đề xác định các thành viên trong nhóm loài An. maculatus
Các thành viên trong nhóm loài An. maculatus đợc định loại bằng
nhiều phơng pháp nh: hình thái (thờng chỉ dựa vào dấu hiệu muỗi
trởng thành, Rattanarithikul và Green [1986] cũng chỉ mô tả muỗi trởng
thành và trứng của An. notanandai và An. sawadwongporni. Hai loài mới
An. dispar và An. greeni ở Philippine của Rattanarithikul và Harbach
(1990) có thể nói là bản mô tả đầy đủ nhất); dấu hiệu di truyền tế bào (Năm
1993, Baimai và cs đã mô tả bộ NST (Karyotype) của các thành viên trong
nhóm loài An. maculatus ở vùng Đông Nam á, điện di enzym và phân tích
ADN (những nghiên cứu điển hình là của Torres, 1999; C.Walton, 2007 và
Ma Ya Jun 2002, 2006).
- Phân bố: Nhóm loài An. maculatus phân bố rộng trong vùng Đông
Phơng từ ấ
n Độ, qua Miến Điện, Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam,
Nam Trung Quốc; phía Đông Bắc đến Đài Loan, Trung Quốc; phía Tây
Nam đến bán đảo Mã Lai, phía Đông đến quần đảo Philippine.
- Đặc điểm sinh học: Tuỳ từng vùng phân bố, các thành viên trong nhóm
loài có đặc điểm sinh học và sinh thái học khác nhau. Bọ gậy của chúng
thờng thấy ở các mạch nớc, suối nhỏ có ánh sáng rọi trực tiếp hoặc không
trực tiếp. Muỗi thích sống gần chuồng gia súc, ở những vùng muỗi a đốt

máu ngời và là vectơ truyền bệnh chính, còn đại đa số các thành viên trong
nhóm loài a đốt máu súc vật hơn và không có vai trò truyền bệnh.

-6 -
-Vai trò truyền bệnh: Anopheles maculatus s.l đợc coi là vectơ sốt rét
quan trọng ở bán đảo Malaysia, Thái Lan, ấn Độ, Nepal, Miến Điện (Rao,
1984).
1.4.2. Nghiên cứu về An. maculatus trong nớc
- Những nghiên cứu về sinh học, sinh thái học của muỗi An. maculatus:
An. maculatus là loài muỗi hoang dại phân bố khá rộng, trú ẩn tiêu máu
ngoài nhà là chủ yếu. An. maculatus phát triển mạnh vào mùa ma. Bọ gậy
bắt đợc ở các suối ven rừng, có ánh sáng nhiều, đôi khi bắt đợc ở các
ruộng lúa, giếng, vũng nớc ven suối.
- Về vai trò truyền bệnh của An. maculatus: An. maculatus s.l đợc xác
định là một vectơ truyền sốt rét thứ yếu ở Việt Nam, Toumanoff (1936) đã
mổ thấy loài muỗi này mang thoa trùng và oocysts, Đặng Văn Ngữ (1966)
cũng xác định tỷ lệ mang KST của loài muỗi này khoảng 1,9%.
Chơng 2: Đối tợng v phơng pháp nghiên cứu
2.1. Đối tợng nghiên cứu:
Các loài muỗi thuộc nhóm loài Anopheles maculatus ở Việt Nam.

2.2. Thời gian nghiên cứu, địa điểm nghiên cứu
- Tháng 10-2001 đến tháng 12-2006
- Địa điểm thu mẫu trên toàn quốc
2.3. Phơng pháp nghiên cứu: Mô tả thực địa và phòng thí nghiệm.
2.3.1. Phơng pháp thu thập và xử lý mẫu vật tại thực địa
Muỗi đợc thu thập và bảo quản theo phơng pháp chuẩn của Tổ chức Y
tế Thế giới và Viện Sốt rét, Ký sinh trùng, Côn trùng (1975, 1987).
2.3.2. Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
-Nuôi muỗi: Theo dòng gia đình để làm tiêu bản đồng bộ và phân tích các

dấu hiệu di truyền theo dòng gia đình.
- Phân loại muỗi dựa trên các dấu hiệu hình thái: theo R.Rattanarithikul
và C. A. Green, 1986, R.Rattanarithikul và R.E. Harbach, 1990,
Rattanarithikul và cs, 2006, J. A. Reid, 1968 , Lục Bảo Lân, 1997.
- Phân tích đặc điểm di truyền tế bào: Làm tiêu bản bộ NST từ tế bào não
bọ gậy tuổi 4 theo 2 phơng pháp: Phơng pháp của V.Baimai (1997) có
sửa đổi và phơng pháp của Frank (1962) có cải tiến.
Phân tích kết quả theo Baimai và cs (1993), xác định các đặc điểm cấu
trúc, cân tâm, lệch tâm, cận tâm mút
- Điện di enzym và phân tích kết quả điện di: Điện di trên gel cellullose
acetate (Itan II, Helana Laboratories, U.K) theo phơng pháp của Smith và
cs, 1996 với 11 hệ enzym: ODH, LDH, MDH, GPI, PGM, MPI, IDH, 6-
PGD, -GPD, GOT, HAD.
Phân tích kết quả theo Futuyma, D.J. 1986, sử dụng phần mềm TFPGA
version 1.3 (Mark P. Miller, 1997): tính tần số alen, tính phù hợp với định




-7 -
luật cân bằng Hardy Weinberg, hệ số tơng đồng di truyền và khoảng cách
di truyền.
- Tách chiết ADN của muỗi: theo Collin và cs (1987) tủa ADN bằng
ethanol.
- Phơng pháp PCR-RFLP
: Cắt sản phẩm nhân bản đoạn ITS2 của các
loài trong nhóm An. maculatus bằng 10 enzym cắt giới hạn AluI, EcoRI,
BamHI, HindIII, XbaI, MspI, Cfr131, HaeII, HindII, HeaIII.
- Phơng pháp RAPD-PCR: tiến hành PCR với 7 mồi A1, A5, F2, F4,
OPL1, OPA4, OPA10.

Phân tích số liệu bằng phần mềm TFPGA 1.3, tính hệ số tơng đồng di
truyền, khoảng cách di truyền và lập cây chủng loại phát sinh.
- Phơng pháp giải trình tự: giải trình tự đoạn ITS2 trên máy AB3730. Xử
lý và phân tích kết quả bằng phần mềm MEGA version 3.1.
- Xác định ký sinh trùng trong muỗi bằng phơng pháp ELISA: Theo
phơng pháp của Wirtz và cs (1987) với 3 loại kháng thể đơn dòng là
P.falciparum, P.vivax 210 và P.vivax 247.
- Kiểm tra lại mẫu ELISA dơng tính: bằng phơng pháp PCR lồng theo
G.Snounou và cs (1992).
Chơng 3: Kết quả nghiên cứu
3.1. Đa hình dấu hiệu kiểu hình của các thành viên trong nhóm loài An.
maculatus
3.1.1. Đa hình các dấu hiệu hình thái của các thành viên trong nhóm
loài An. maculatus
Tổng số mẫu vật có thể sử dụng để nghiên cứu là 9583 mẫu bao
gồm các mẫu vật nuôi theo dòng gia đình, muỗi trởng thành và bọ gậy thu
thập từ tự nhiên (bảng 3.2).
Bảng 3.1: Số lợng mẫu vật đã thu thập trong giai đoạn 2001-2005
Stt Tên muỗi Muỗi
bắt TN
Muỗi nuôi
theo GĐ
Bọ
gậy
Tổng
cộng
1 An. maculatus 1161 483 1450 3544
2 An. dravidicus 18 26 19 63
3 An. notanandai 28 52 595 675
4 An. pseudowillmori 104 247 247 598

5 An. sawadwongporni 1950 386 1187 3523
6 An. willmori 36 104 249 389
7 Các dạng khác 324 189 278 791
Tổng cộng 4071 1487 4025 9583
Ghi chú: TN: tự nhiên GĐ: gia đình

-8 -
- Đa hình hình thái muỗi trởng thành của các thành viên trong nhóm
loài An. maculatus
Các thành viên của nhóm loài An. maculatus ở Việt Nam rất đa dạng
về dẫn liệu hình thái.
- An. maculatus: Tấm lng các đốt bụng II-IV không có vẩy trắng.
Đốt bụng V-VIII đặc biệt là các đốt bụng VII-VIII tập trung nhiều vẩy
trắng hình thìa. Không có vẩy đen chỗ chia nhánh gân cánh L
2
.

Gân L
3

không có điểm đen dài ở giữa.
- An. dravidicus: Các đốt bụng II-VIII đều có phủ vẩy trắng hình thìa. Gân
L
3
ngoài 2 điểm đen ở gốc và ngọn, ở giữa còn có một băng đen dài hoặc
một vài băng đen nhỏ ít nhất là ở một bên cánh.
- An. notanandai: Tất cả các tấm lng đốt bụng II- VIII đều phủ vảy trắng,
chỗ chia nhánh gân L
2

cánh có đám vảy đen. Phần cuối các tấm lng đốt
bụng IV-VII có một hàng vẩy đen.
- An. pseudowillmori: Tấm lng đốt bụng II- VII không có vảy trắng, chỉ có
vảy trắng ở đốt bụng VIII. Thân L
2

ngắn, ô trớc cánh dài.
- An. sawadwongporni: Tấm lng đốt bụng II- VIII phủ đầy vảy trắng hình
thìa, đôi khi còn có một vài vảy đen ở 2 bên mép. Chỗ chia nhánh gân L
2


thờng có đám vảy đen ít nhất ở một bên cánh. Cuối các tấm lng đốt bụng
chỉ có một chùm vẩy đen ở hai bên.
- An. willmori: Các tấm lng trên các đốt đốt bụng II- VII phủ đầy vảy
trắng, chỗ chia nhánh gân L
2
không có chùm vẩy đen.

An. maculatus
An. pseudowillmori An. sawadwongporni
An. willmori An. notanandai An. dravidicus
Hình 3.1: Đa hình hình thái muỗi trởng thành của các thành viên thuộc
nhóm loài An. maculatus

-9 -
- Đa hình hình thái cơ quan sinh dục đực
Đặc điểm cơ quan sinh dục đực các
thành viên trong nhóm loài An. maculatus cũng
rất đa hình dựa vào cấu trúc của thuỳ lng, thuỳ
bụng và lá phụ gai giao cấu.

- Đa hình hình thái quăng
Phiến đỉnh Gai bên đốt bụng 4
Các dấu hiệu hình thái
chủ yếu dùng để phân tích
tính đa hình giai đoạn
quăng gồm các chỉ số bánh
lái (chiều dài bánh lái/chiều
rộng), độ dài của gai bên
đốt bụng IV, phân bố các
gai cứng ở bờ cong ngoài
bánh lái. (Hình 3.3)
Bánh lái con đực Bánh lái con cái
Hình 3.3. Dấu hiệu hình thái bọ gậy
của An. maculatus
- Đa hình hình thái bọ gậy

Đầu
Lông số 4
ngực giữa

Lông lá cọ đốt
bụng 2
Tấm kitin trên các

đốt bụng
Bọ gậy các thành viên trong
nhóm loài rất đa hình và có
nhiều dấu hiệu gối nhau. Một
số dấu hiệu thờng dùng để
phân tích đa hình hình thái
giai đoạn bọ gậy là: cấu trúc
lông lá cọ (lông số 1) và hình
thể các tấm kitin của các đốt
bụng, số lợng các nhánh của
lông số 4 đốt ngực giữa.(Hình
3.4)
Hình 3.4. Dấu hiệu hình thái quăng
của An. maculatus

Thuỳ lng
Thuỳ bụng
Lá phụ gai
giao cấu
Hình3.2. Cơ quan sinh dục
đực của An.maculatus

- 10 -

- Đa hình hình thái trứng
Các dấu hiệu dễ nhận biết tính
đa hình hình thái của pha trứng
các thành viên trong nhóm loài là
cấu trúc khoang trứng, cấu trúc,
số lợng các rẻ phao nổi.

Hình 3.25. Dấu hiệu hình thái
trứng của An.sawadwongporrni

3.1.2. Đa hình các dấu hiệu sinh học, sinh thái học của các thành viên
trong nhóm loài An. maculatus.
- Đa hình dấu hiệu sinh học, sinh thái học giai đoạn trớc trởng
thành: Nghiên cứu các ổ bọ gậy của thành viên nhóm loài.
ổ nớc đứng có lu thông nhiều bọ gậy hơn: 62,26% (2506/4025).
Nhiều nhất là các vũng nớc mạch: 45,69%, tiếp theo là các hố đào vàng,
các đáy suối cạn.
Có thể bắt đợc bọ gậy của
tất cả các loài muỗi ở ổ nớc
chảy nhng thấp hơn (37,74%).
Hai loài muỗi An.
sawadwongporni và An.
notanandai chiếm tỷ lệ cao nhất
ở ổ nớc chảy (40,68% và
28,53%).

Hình 3.26: ổ bọ gậy của An.
notanandai và An. sawadwongporni ở
suối lớn
- Đa hình dấu hiệu sinh học, sinh thái học giai đoạn trởng thành: Các
loài muỗi chủ yếu bắt đợc ở chuồng trâu (83,5% - 95,21%). Tỷ lệ muỗi bắt
đợc bằng phơng pháp mồi ngời rất thấp (mồi ngời trong nhà 0,7 -
1,32%; mồi ngời ngoài nhà 0,94- 4,49%). Nh vậy, muỗi An. maculatus
chủ yếu trú ẩn ngoài nhà và a đốt máu súc vật.
3.2. Đa hình kiểu gen của các thành viên trong nhóm loài An.

maculatus
3.2.1. Đa hình di truyền các dấu hiệu di truyền tế bào của các thành
viên trong nhóm loài An. maculatus: Bộ NST 2n = 6, NST giới tính X, Y
có hình thái khác nhau (Hình 3.30).
- An. maculatus: Các dạng có NST thờng giống nhau, khác nhau ở NST
giới tính, có ba kiểu NST X: X1, X2, X3 và hai kiểu NST Y: Y1, Y2.
Khoang trứng
Phao nổi




- 11 -
- An. sawadwongporni: NST X tâm cận mút gồm có một khối dị NS ở tâm
động. NST Y cận tâm mút và xấp xỉ bằng độ lớn khối dị nhiễm sắc ở NST
X. Những khối dị nhiễm sắc ở quanh tâm động rất rõ.
- An. dravidicus: Bộ NST giống với của An. sawadwongporni nhng khối
dị nhiễm sắc trung tâm lớn hơn.
- An. notanandai: NST X tâm cận giữa. Vai ngắn hầu hết là đồng nhiễm
sắc trong khi đó vai dài toàn bộ dị nhiễm sắc.
- An. willmori: NST giới tính lớn bất thờng. NST X tâm cận giữa và vai
ngắn có phần đồng nhiễm sắc bằng phần dị nhiễm sắc, vai dài toàn dị
nhiễm sắc.
- An. pseudowillmori: Cả NST X và Y của loài này cận tâm giữa lớn; NST
X hơi lớn hơn NST Y.


NST An. maculatus cái dạng 5 NST An. maculatus đực dạng 5

NST An. pseudowillmori cái NST An. pseudowillmori đực
Hình 3.30. Bộ NST của thành viên nhóm loài An. maculatus
3.2.2. Đa hình di truyền các đặc điểm điện di enzym của các thành
viên trong nhóm loài An. maculatus.

- Hệ izozym ODH: Hệ izozym này có 4 alen đồng trội trong một locut,
cấu trúc dimer. Các alen gồm: Odh
a
, Odh
b
,

Odh
c
,Odh
d
; với Rf tơng ứng:
96, 100, 109, 116.
- Hệ izozym LDH: Tần số alen và sự phân bố tần số alen của hệ izozym
LDH phù hợp với định luật Hardy Weinberg.

- 12 -
- Hệ izozym MDH: MDH có tính đa hình cao, hai phần ba các quần thể
nghiên cứu có tính đa hình. Phân thành 2 vùng là Mdh1 và Mdh2, mỗi
vùng do một gen riêng biệt kiểm soát.
-Hệ izozym GOT: ở hai locut của hệ enzym GOT, alen chiếm u thế là
Got1
b
với Rf = 100 và Got2
c

với Rf = 160.
- Hệ izozym 6PGD
Hệ izozym 6PGD thể hiện tính đa
hình cao và là một hệ enzym có
khả năng phân biệt giữa các thành
viên của nhóm loài An. maculatus
một cách rõ ràng nhất. An.
notanandai alen 6Gpd
a
(Rf = 83),
alen 6Gpd (Rf = 86) đặc trng
cho An. pseudowillmori. Các
dạng An. sawadwongporni có
alen 6Gpd
f
(Rf = 114), An.
dravidicus có alen 6Gpd
d
(Rf =
100) chiếm u thế (Hình 3.34).


-Hệ izozym IDH: IDH cũng thể hiện tính đa hình cao và có khả năng phân
biệt các thành viên trong nhóm loài An. maculatus ở Việt Nam.
- Hệ izozym PGM: PGM đợc kiểm soát bởi 3 alen đồng trội Pgm
a
(Rf =
85), Pgm
b
(Rf = 100), Pgm

c
(Rf = 120). Cấu trúc của enzym là monomer.
- Hệ izozym GPI: Đây là enzym có cấu trúc dimer các alen tơng ứng với
Rf bằng 91, 100 và 109. An. willmori phân biệt với các loài khác dựa vào
alen Gpi
c
.
- Hệ izozym - GPD: Enzym này có tính đa hình rất cao, 100% các quần
thể nghiên cứu đều thể hiện tính đa hình. Cấu trúc monomer, do 5 alen đồng
trội thuộc cùng một locut kiểm soát.

- Hệ izozym MPI: ở các loài đã đợc đặt tên thì alen Mpi
d
chiếm tần số
cao, trong khi đó ở các dạng cha đợc đặt tên chính thức thì tần số lại cao
ở alen Mpi
a
.
- Hệ izozym HAD: HAD là hệ enzym ít đa hình nhất do 2 alen đồng trội
quy định là Had
a
(Rf = 89) và Had
b
(Rf = 100).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Hình 3.34: Hình ảnh điện di enzym
6PGD của các thành viên trong nhóm
loài An.maculatus.

Giếng 1, 2, 3, 6, 10, 11: An. sawadwongporni

Giếng 4,7: An.maculatus
dạng 3
Giếng 5: An.maculatus
dạng 4
Giếng 8: An. willmori
Giếng 12: An. pseudowillmori
Giếng 9: An.maculatus




- 13 -
Mối quan hệ di truyền (Hệ số tơng đồng di truyền: I và khoảng
cách di truyền: D) giữa các thành viên trong phức hợp An. maculatus đợc
tổng kết ở bảng 3.18, hình 3.38, 3.39.
Bảng 3.18: Hệ số tơng đồng di truyền (I) và khoảng cách di truyền (D) giữa các thành
viên đã định tên trong nhóm loài An. maculatus dựa trên số liệu phân tích izozym
Hệ số tơng đồng di truyền (I)

An. maculatus An. notanandai An. sawadwongporni An. pseudowillmori An. willmori
An. dravidicus
An. maculatus
**** 0,70 0,76 0,55 0,57
0,80
An. notanandai
0,35 **** 0,85 0,60 0,50
0,54
An.
sawadwongporni
0,28 0,17 **** 0,72 0,52

0,56
An. pseudowillmori
0,64 0,50 0,33 **** 0,50
0,46
An. willmori
0,57 0,70 0,65 0,70 ****
0,52
An. dravidicus
0,23 0,61 0,58 0,78 0,66
****
Khoảng cách di truyền (D)


Hình 3.38: Sơ đồ hình cây biểu thị mối quan hệ di truyền của các thành viên đã
định tên trong nhóm loài An. maculatus dựa trên số liệu phân tích izozym
Sáu loài này là những loài độc lập nhng thể hiện trên sơ đồ hình cây
gồm 4 nhánh khá rõ: (1) An. sawadwongporni và An. notanandai, (2) An.
pseudowillmori, (3) An. maculatus và An. dravidicus, (4) An. willmori trong
đó nhánh An. willmori tách xa nhất

A
n. sawadwongporni
A
n. notanandai
A
n. speudowillmori
A
n. maculatus
A
n. dravidicus

A
n. willmori
D

- 14 -
Khoảng cách di truyền giữa An. maculatus với các dạng An.
pseudowillmori là xa nhất (D = 0,65 và 0,67); tiếp theo là nhóm An.
willmori (D = 0,64 và 0,57), gần hơn là An. sawadwongporni (D = 0,31;
0,28). An. maculatus có quan hệ gần gũi với An. notanandai (D = 0,35) và
An. dravidicus (D = 0,23). Đối với các dạng An. maculatus, An. maculatus
dạng 5 gần gũi nhất (D = 0,01), An. maculatus dạng 3 xa nhất giống nh
một loài tách biệt (D = 0,53).
3.2.3. Kết quả phân tích sự đa hình dựa vào chỉ thị PCR-RFLP ở nhóm
loài An. maculatus: Đoạn ITS2 có kích thớc 500bp đợc cắt với 10
enzym.
- Enzym HaeIII: Enzym HeaIII cắt các sản phẩm PCR đoạn ITS2 của
nhóm loài An. maculatus thành 3 nhóm: nhóm 1 gồm An. sawadwongporni,
An. maculatus và An. pseudowillmori; nhóm 2: An. notanandai, An.
willmori dạng 2 và An. maculatus dạng 5. Nhóm 3 cắt thành 2 băng rõ rệt
350 bp và 150 bp là An. sawadwongporni dạng 2 và An. dravidicus.
- Enzym HindII: Chỉ cắt đoạn ITS2 của An. dravidicus.
- Enzym Cfr131: Cfr131 chỉ có thể phân biệt An. notanandai.
- Enzym HindIII: phân biệt đợc An. notanandai.
- Enzym HeaIII: phân biệt đợc An. willmori dạng 2.
- Enzym MspI: đoạn ITS2 của An. sawadwongporni đợc MspI cắt thành
hai băng 330 bp và 170 bp, ITS2 của An. maculatus cắt thành 4 băng 330
bp, 200 bp, 170 bp và 100 bp. Đoạn ITS2 của An. willmori cắt thành 3 băng
có kích th
ớc 300 bp, 150 và 150bp.

A
n. maculatus s.s
A
n. macula
t
us dạng 5
A
n. dravidicus
A
n. willmori
A
n. willmori dạng 2
A
n. sawadwongporni dạng 2
A
n. sawadwongporni dạng 3
A
n. sawadwongporni
A
n. notanandai
A
n. maculatus dạng 4
A
n. maculatus dạng 6
A
n. maculatus dạng 3
A
n.
p
seudowillmori dạng 3

A
n.
p
seudowillmori
D
Hình 3.39:
S
ơ đồ hình cây biểu thị mối quan hệ di truyền của các thành viên
trong toàn bộ nhóm loài An.maculatus dựa trên số liệu phân tích izozym





- 15 -







Hình 3.43. Sản phẩm cắt đoạn ITS2 của các thành viên trong
nhóm loài An. maculatus bằng enzym MspI
Làn 1: Thang chuẩn 50 bp Làn 2: An. sawadwongporni
Làn 3: An. maculatus Làn 4: An. sawadwongporni dạng 2
Làn 5: An. notanandai Làn 6: An. maculatus dạng 3
Làn 7: An. willmori dạng 2 Làn 8: An. willmori
Làn 9: Đối chứng âm Làn 10: An. pseudowillmori
Làn 11: An. dravidicus Làn 12: An. maculatus dạng 4

- Enzym XbaI: phân biệt đợc một số thành viên.
- Enzym AluI: Enzym AluI cắt An. sawadwongporni và An. willmori giống
nhau, cắt An. maculatus thành 3 băng còn không cắt sản phẩm PCR đoạn
ITS2 của các dạng và loài khác.
Trong số 10 enzym sử dụng, hai enzym EcoRI, BamHI không cắt
đoạn ITS2. Các enzym còn lại là Cfr13l, MspI, Alul, HindII, HindIII, HaeII,
HaeIII và XbaI đều có khả năng cắt đoạn ITS2 và tạo các băng đa hình giữa
các thành viên trong nhóm loài An. maculatus ở các mức độ khác nhau.
3.2.4. Kết quả đánh giá sự đa hình di truyền của các thành viên trong
nhóm loài An. maculatus dựa vào chỉ thị RAPD.
- Mồi A1: Các băng rõ nét và đa hình cao, tạo ra 26 băng có kích thớc từ
0,15 đến 1,5 kb. Vùng có kích thớc là 0, 15 đến 0,4 kb chứa 12 băng đa
hình có khả năng phân biệt các loài trong nhóm loài An. maculatus rõ rệt
nhất.
- Mồi A5: khuếch đại 23 băng đa hình có kích thớc 0,12 đến 1,4 Kb, trong
đó 17 băng có kích thớc 0,25 đến 0,9 Kb cho phép phân biệt các loài trong
nhóm loài An. maculatus.
- Mồi F2: Đây là mồi tạo ra nhiều băng đa hình nhất 26 băng, trong đó có
tới 20 băng nằm trong khoảng từ 0,1 đến 1,1 Kb thể hiện sự khác biệt giữa
các loài trong nhóm loài An. maculatus.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

- 16 -

Hình 3.47: Sản phẩm của phản ứng RAPD- PCR sử dụng mồi F2
Làn 1: Thang chuẩn 50 bp Làn 2: Đối chứng âm
Làn 3, 16: An. maculatus Làn 4: An. maculatus dạng 5
Làn 5: An. notanandai Làn 6: An. sawadwongporni
Làn 7: An. sawadwongporni dạng 2 Làn 8: An. sawadwongporni dạng 3
Làn 9: An. maculatus dạng 4 Làn 10: An. pseudowillmori dạng 1
Làn 11: An. pseudowillmori dạng 2 Làn 12: An. willmori
Làn 13: An. willmori dạng 2 Làn 14: An. dravidicus
Làn 15: An. maculatus dạng 3 Làn 17: Thang chuẩn 100 bp
- Mồi OPL1: Phân biệt các thành viên bởi 12 băng đa hình nằm trong
khoảng kích thớc từ 0,1 đến 0,6 Kb.
- Mồi OPA10: 25 băng đa hình kích thớc từ 0,2 đến 1,5 kb. chỉ có 9 băng
kích thớc từ 0,2 đến 0,5 kb phân biệt đợc các loài.
- Mồi F4 và mồi OPA4: Các băng rõ nét, tính đa hình thấp khó phân biệt
các thành viên trong nhóm loài An. maculatus.
Năm mồi có mức độ đa hình cao có thể phân biệt các loài là A1, A5, F2,
OPL1, OPA10; hai mồi F2 và OPA4 có mức độ đa hình thấp và khó có thể
phân biệt đợc các loài với nhau. áp dụng phần mềm TFPGA 3.1 để xử lý
kết quả đa ra bảng ma trận tơng đồng di truyền và cây quan hệ di truyền
giữa các thành viên trong nhóm loài An. maculatus (Bảng 3-20; Hình 3-59).

Bảng 3.20: Hệ số tơng đồng di truyền(I) và khoảng cách di truyền (D) giữa các
thành viên đã định tên trong nhóm loài An. maculatus dựa trên số liệu RAPD-PCR
Hệ số tơng đồng di truyền (I)
An. maculatus An. notanandai An. sawadwongporni An. pseudowillmori An. willmori An. dravidicus
An. maculatus **** 0,67 0,69 0,53 0,64 0,72
An. notanandai 0,40 **** 0,72 0,64 0,72 0,61
An. sawadwongporni 0,37 0,32 **** 0,67 0,70 0,56

An. pseudowillmori 0,62 0,45 0,40 **** 0,62 0,60
An. willmori 0,44 0,33 0,37 0,47 **** 0,57
An. dravidicus 0,32 0,49 0,57 0,52 0,56 ****
Khoảng cách di truyền (D)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17




- 17 -










Hình 3.50: Sơ đồ hình cây biểu thị mối quan hệ di truyền của các thành
viên đã định tên trong nhóm loài An. maculatus dựa vào số liệu RAPD-PCR
Khoảng cách di truyền biến động trong khoảng từ 0,12 đến 0,62. An.
pseudowillmori và An. maculatus dạng 3 có khoảng cách di truyền lớn nhất
(D = 0,62) . Các thành viên có quan hệ gần gũi nhau là An. willmori và An.
willmori dạng 2 (D = 0,12); An. maculatus dạng 4 và An. maculatus dạng 6
(D = 0,14). Khoảng cách di truyền giữa 3 dạng An. sawadwongporni dao
động từ 0,25 và 0,28. Khoảng cách di truyền giữa 2 dạng An.
pseudowillmori là 0,26.
Sơ đồ hình cây dựa trên kết quả phân tích RAPD-PCR cũng tơng tự

nh sơ đồ hình cây dựa trên kết quả phân tích điện di enzym.
3.2.5. Định loại các thành viên của nhóm loài An. maculatus bằng PCR
đa mồi
Trong 6 loài muỗi thử nghiệm với các mồi của C.Walton có 4 loài
bắt đúng vị trí thiết kế là An. maculatus, An. sawadwongporni, An.
dravidicus và An. pseudowillmori. Muỗi An. notanandai bắt mồi vào vị trí
của An. maculatus dạng K. An. willmori bắt vào vị trí của An.
sawadwongporni hoặc bắt vào vị trí của An. maculatus.
Hệ thống mồi của Ma Ya Jun có 4 loài bắt đúng vị trí là An.
maculatus, An. dravidicus, An. pseudowillmori và An. willmori. Trong khi
đó An. sawadwongporni của chúng tôi không bắt vào vị trí mồi của Ma Ya
Jun thiết kế cho An. sawadwongporni ở Trung Quốc.
3.2.6. Kết quả đánh giá sự đa hình di truyền của các thành viên trong
nhóm loài An. maculatus dựa vào kết quả giải trình tự đoạn ITS2
A
n .dravidicus
A
n. notanandai
A
n.
p
seudowillomri
A
n. willmori
A
n. maculatus
A
n. sawadwongporni
D

- 18 -
Trình tự đoạn ITS2 của các thành viên trong nhóm loài có kích
thớc từ 507 đến 519 bp. Các đỉnh đồ thị thu đợc rõ ràng, sắc nét, không
có sự chồng chéo, chứng tỏ các kết quả thu đợc là đáng tin cậy.

Hình 0.53: Hình ảnh giải trình tự đoạn gen ITS2 của An. maculatus dạng 5

Dựa trên sự sai khác về trình tự nucleotit chúng tôi lập cây quan hệ
di truyền của các thành viên trong nhóm loài này. Kết quả ở hình 3.67









Hình 3.58: Sơ đồ hình cây biểu thị mối quan hệ di truyền của các thành viên đã
định tên trong nhóm loài An. maculatus dựa vào số liệu giải trình tự đoạn ITS2

Sự sai khác về trình tự nucleotit của đoạn ITS2 giữa các loài thành
viên của nhóm loài An. maculatus là khá nhỏ dới 15%. Trình tự của các
loài thu thập từ Việt Nam trùng khớp với trình tự của các loài này đợc lu
giữ trên Genebank. Trờng hợp của An. sawadwongporni do Y.J. Ma
(2002) thu thập tại Vân Nam Trung Quốc, trình tự trùng khớp với An.
maculatus, còn An. maculatus dạng K theo C.Walton và cộng sự (2006) thì
có trình tự giống với An. notanandai trong nghiên cứu của chúng tôi.
sawadwongporni VNQBP12-16
maculatus NA126

maculatus QN80
dravidicus Vietnam
willmori Vietnam
pseudowillmori Vietnam
100
99
54
36
0.000.020.040.060.080.10
An.notanandai
D




- 19 -
3.3. Thành phần loài và phân bố của các thành viên trong nhóm loài
An. maculatus
ở Việt Nam nhóm loài An. maculatus có 14 thành viên, trong đó có 6
loài đã đợc định tên là: An. maculatus Theoblad, 1901; An. dravidicus
Christophers, 1924; An. notanandai Rattanarithikul and Green, 1986; An.
pseudowillmori (Theobald, 1910), An. sawadwongporni Rattanarithikul and
Green, 1986; và An. willmori (James, 1903). Tám thành viên cha đợc
định tên : An. maculatus dạng 3, An. maculatus dạng 4, An. maculatus
dạng 5, An. maculatus dạng 6, An. pseudowillmori dạng 2, An.
sawadwongporni dạng 2, An. sawadwongporni dạng 3, An. willmori dạng
2.
3.3.1. Bảng định loại các thành viên đã xác định tên trong nhóm loài
An. maculatus: Dựa trên các số liệu phân tích hình thái đã lập các bảng
định loại bao gồm:

- Bảng định loại muỗi trởng thành nhóm loài An. maculatus
- Bảng định loại quăng nhóm loài An. maculatus
- Bảng định loại bọ gậy nhóm loài An. maculatus
- Bảng định loại trứng của nhóm An. maculatus
3.3.2. Phân bố của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus
Muỗi An. maculatus là loài phân bố rộng, tìm thấy ở tất cả các điểm
điều tra. Muỗi An. sawadwongporni chiếm u thế ở miền rừng núi từ tỉnh
Quảng Bình trở vào phía Nam. Muỗi An. willmori và An. pseudowillmori
thì ngợc lại. Muỗi An. notanandai và An. dravidicus chỉ mới thấy ở một
vài địa điểm.
3.4. Vai trò truyền bệnh của các thành viên trong nhóm loài An.
maculatus
Tại Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà, muỗi thử nghiệm nhiễm KST
P.vivax chiếm tỷ lệ 0,57%. Tại Đắc Ơ, Phớc Long, Bình Ph
ớc An.
maculatus nhiễm KST P.falciparum với tỷ lệ 0,58%. Nh vậy tính chung
cho cả hai điểm, loài An. maculatus nhiễm KST với tỷ lệ là 0,58%, (0,29%
P.falciparum và 0,29% P.vivax).
Chơng 4: Bn luận
4.1. Đa hình di truyền và mối quan hệ di truyền của các thành viên
trong nhóm loài An. maculatus

- 20 -
4.1.1.Đa hình các dấu hiệu kiểu hình của các thành viên trong nhóm
loài An. maculatus
- Đa hình các dấu hiệu hình thái.
- Đa hình hình thái muỗi trởng thành: Kết quả nghiên cứu của chúng tôi
cho thấy tính đa hình dấu hiệu hình thái giai đoạn muỗi trởng thành của
các thành viên trong nhóm loài An. maculatus ở Việt Nam có nhiều điểm
giống với muỗi ở Thái Lan.

- Về hình thái cơ quan sinh dục đực của các thành viên trong nhóm loài An.
maculatus: cơ quan sinh dục đực của các thành viên trong nhóm loài An.
maculatus rất đa hình và có những dấu hiệu gối nhau nhng vẫn đợc di
truyền và có thể tách biệt giữa các loài với nhau dựa vào phân tích chi tiết
các cấu tạo của nắp gai giao cấu (cấu tạo thuỳ lng, thuỳ bụng), của gai
giao cấu (hình dạng gai giao cấu, số lợng và cấu tạo lá phụ gai giao cấu),
tấm hậu môn v.v.
- Về hình thái giai đoạn nhộng: Dấu hiệu hình thái ở nhộng của các thành
viên trong nhóm loài An. maculatus cũng rất đa hình và biến đổi. Trong
nghiên cứu của chúng tôi, có một điều khác rõ nét so với nghiên cứu của
Rattanarithikul và Harbach (1990) là: muỗi An. pseudowillmori (dạng 1 và
dạng 2) của chúng tôi có gai bên đốt bụng IV dài và nhọn giống nh của
An. greeni và An.dispar phân bố ở Philippine. Theo hai tác giả trên, An.
pseudowillmori phân bố ở đất liền Thái Lan có gai bên đốt bụng IV của
nhộng ngắn và tù.
- Về hình thái giai đoạn bọ gậy: Theo nghiên cứu của chúng tôi, muỗi An.
willmori (dạng 1 và 2) là loài muỗi có lông lá cọ các đốt bụng phát triển
nhất, nó phát triển từ đốt bụng II đến đốt bụng VII với các ngọn lá cọ rất rõ
ràng. Khác với Rattanarithikul và Green (1986) cho rằng loài An.
pseudowillmori có lông lá cọ các đốt bụng phát triển nhất.
- Về đa hình hình thái trứng của các thành viên nhóm loài An. maculatus:
Kết quả tơng tự với kết quả của Rattanarithikul và Green (1986) ở Thái
Lan và thấy rằng có những biến đổi trong nội bộ loài nhng dấu hiệu kiểu
hình thái của khoang trứng là đặc điểm nổi bật nhất để nhận dạng các
thành viên nhóm loài An. maculatus.
- Tổng kết đa hình các dấu hiệu hình thái liên quan đến phân loại các
thành viên nhóm loài An. maculatus: Kết quả của chúng tôi cũng ủng hộ ý
kiến của các nghiên cứu của Rattanarithikul và Green (1986);
Rattanarithikul và Harbach (1990); Lục Bảo Lân (1997) rằng: tuy các dấu
hiệu hình thái có đa hình và biến đổi, có nhiều dấu hiệu gối nhau nhng

- 21 -
vẫn có thể xác định đợc đặc điểm của các loài riêng biệt của nhóm loài
qua dấu hiệu của các giai đoạn phát triển.
- Tính đa dạng các dấu hiệu sinh học, sinh thái học của các thành viên
trong nhóm loài An. maculatus
- Đa dạng các kiểu ổ bọ gậy: Các kiểu ổ bọ gậy của các thành viên trong
nhóm loài này đều có những đặc điểm chung: nguồn nớc thờng trong, có
ánh sáng, các ổ nớc ngầm, đứng nhng có lu thông phù hợp cho tất cả
các loài giống nh các nghiên cứu của Rattanarithikul v Lục Bảo Lân.
Riêng An. notanandai và An. sawadwongporni có mật độ cao ở các thuỷ
vực nớc chảy.
- Đa dạng sinh học, sinh thái học giai đoạn muỗi trởng thành: Muỗi thuộc
nhóm An. maculatus là muỗi trú ẩn tiêu máu ngoài nhà. Rất hiếm gặp muỗi
trú ẩn tiêu máu trong nhà ban ngày. Điều này cũng phù hợp với những kết
quả nghiên cứu của Nguyễn Đức Mạnh (1988), Reid (1968), Lục Bảo Lân
(1997), Toumanoff (1936), Lindsay và cs (2004).
4.1.2. Đa hình di truyền các dấu hiệu kiểu gen của các thành viên trong
nhóm loài An. maculatus ở Việt nam
- Đa hình các dấu hiệu di truyền tế bào ở các thành viên trong nhóm loài
An. maculatus
Có thể dựa trên sự sai khác về cấu trúc phần nguyên nhiễm và dị
nhiễm trên NST giới tính để phân biệt giữa các loài. giữa các dạng An.
maculatus với nhau, có sự khác biệt về tổ hợp NST giới tính X và Y. Sự
khác biệt giữ các kiểu tổ hợp này cho thấy có thể đây là những biến đổi
trong loài, hoặc giữa các loài với nhau.
- Đa hình di truyền các dấu hiệu điện di enzym của các thành viên trong

nhóm loài An. maculatus
Kết quả điện di 11 hệ izozym thấy hầu hết các locut gen của các
thành viên trong nhóm loài An. maculatus là đa hình, có giá trị để phân biệt
các thành viên trong nhóm. Tuy nhiên, sự đa hình của enzym 6GPD là có
giá trị nhất trong việc phân loại các loài đồng hình.
- Phân tích đa hình dựa vào chỉ thị PCR-RFLP
Mời enzym giới hạn đợc sử dụng cắt đoạn ITS2 của các thành
viên trong nhóm loài An. maculatus ở Việt Nam, hai enzym EcoRI và
BamHI không cắt. Các enzym Cfr131, MspI, AluI, HindI, HindIII, HeaII,
HeaIII và XbaI đều có khả năng cắt đoạn ITS2 và tạo ra các băng đa hình
khác biệt giữa các thành viên trong nhóm loài ở các mức độ khác nhau.
- Phân tích đa hình di truyền dựa vào chỉ thị RAPD-PCR

- 22 -
Sử dụng 7 mồi đơn ngẫu nhiên và có 5 mồi cho mức độ đa hình cao
có thể phân biệt khá rõ ràng các loài đó là các mồi A1, A5, F2, OPL1 và
OPA10. Kết quả phù hợp với kết quả điện di izozym, tuy nhiên hệ số tơng
đồng di truyền không cách biệt rõ ràng nh ở kết quả điện di izozym.
- Kiểm định phân biệt các loài trong nhóm bằng PCR đa mồi
Hệ thống mồi của Walton, các loài An. maculatus, An.
sawadwongporni, An. dravidicus là chuẩn. Riêng với mẫu An. notanandai
của Việt Nam thì lại bắt mồi tơng ứng với vị trí của An. maculatus dạng K
của Thái Lan. Mẫu vật của An. willmori lúc thì bắt mồi của An. maculatus,
lúc bắt mồi của An. sawadwongporni.
Với hệ thống mồi của Ma Ya Jun và cs (2002) các loài An.
maculatus, An. willmori, An. dravidicus và An. pseudowillmori đều bắt cặp
đúng vị trí thiết kế, chỉ có An.sawadwongporrni không bắt cặp mồi.

- Phân tích đa hình di truyền bằng giải trình tự ADN
Tất cả các loài và dạng của nhóm loài An. maculatus đã đợc giải

trình tự đoạn ITS2. Đối chiếu với Genebank thấy rằng những loài đã đợc
định tên thì đều trùng khớp với trình tự đã đợc lu giữ trừ trờng hợp của
An. notanandai lại giống với An. maculatus dạng K ở Thái Lan. Riêng muỗi
An. sawadwongporni thu thập tại Vân Nam Trung Quốc thì trình tự không
trùng khớp với trình tự của An. sawadwongporni ở Thái Lan và Việt Nam.
4.2. Thành phần loài và phân bố của các thành viên trong nhóm loài
An. maculatus
Nghiên cứu của chúng tôi đã khẳng định sáu loài muỗi đã định tên
ở Việt Nam là: An. maculatus, An. notanandai, An. dravidicus, An.
pseudowillmori, An. sawadwongporni và An. willmori. Tám dạng cha
định tên gồm: An. maculatus dạng 3, An. maculatus dạng 4, An. maculatus
dạng 5, An. maculatus dạng 6, An. pseudowillmori dạng 2, An. willmori
dạng 2, An. sawadwongporni dạng 2, An. sawadwongporni dạng 3.
- Công bố đầy đủ nhất các bảng định loại cả bốn giai đoạn phát
triển cho sáu thành viên đã định tên của nhóm loài này.
- Lần đầu tiên, các thành viên đã đợc định tên của nhóm loài An.
maculatus đợc lập bản đồ phân bố trên toàn quốc.
4.3. Vai trò truyền bệnh của các thành viên trong nhóm loài An.
maculatus: Kết quả thử nghiệm ELISA và kiểm tra PCR khẳng định loài
An. maculatus tại hai điểm Khánh Phú, Khánh Vĩnh, tỉnh Khánh Hoà và
Đắc Ơ, Phớc Long, tỉnh Bình Phớc nhiễm ký sinh trùng sốt rét P.vivax
và P.falciparum với tỷ lệ 0,57 và 0,58%.





- 23 -
Kết luận v đề nghị
I. Kết luận

1. Tất cả các thành viên trong nhóm loài An. maculatus đều biểu hiện đa
hình cao về các dấu hiệu hình thái, và đa dạng các đặc điểm sinh học, sinh
thái học. Tuy có những đặc điểm hình thái đa hình gối nhau nhng vẫn có
thể sử dụng các dấu hiệu này trong phân loại các thành viên trong nhóm
loài. Đa hình di truyền tế bào của nhóm loài An. maculatus đợc thể hiện ở
sự khác biệt về hình dạng và cấu trúc nhiễm sắc thể, đặc biệt là các nhiễm
sắc thể giới tính.
2. Các locut của các hệ izozym trong nghiên cứu này thể hiện tính đa hình
cao, trong đó hệ enzym 6GPD có giá trị nhất trong việc phân loại các thành
viên trong nhóm loài. Số liệu điện di isozym của 6 loài đã định tên thể hiện
chúng là những loài đồng hình các dạng nằm trong mối quan hệ các quần
thể địa lý - bán loài - phân loài. Riêng An. maculatus dạng 3 có thể là một
loài đồng hình độc lập trong nhóm.
3. RFLP-PCR cũng cho thấy tính đa hình di truyền cao của nhóm loài
nhng cha có một enzym thử nghiệm nào có thể phân biệt đợc tất cả các
thành viên trong nhóm, enzym có u thế cao nhất là MspI. Tất cả 7 mồi
đơn ngẫu nhiên trong phản ứng RAPD-PCR đều cho băng nhân bản rõ nét
và biểu hiện mức độ đa hình khác nhau, trong đó 5 mồi cho tính đa hình
cao là A1, A5, F2, OPL1, OPA10 và hai mồi cho tính đa hình thấp là F4 và
OPA4. Thử nghiệm PCR đa mồi khẳng định sự tồn tại của các loài đã đợc
định tên ở Việt Nam. Số liệu giải trình tự ADN khẳng định tính đa hình và
vị trí phân loại của 6 thành viên đã xác định tên. Sự sai khác giữa các dạng
không rõ nét trừ An. maculatus dạng 3.
4. Muỗi An. maculatus ở Việt Nam là một nhóm loài đồng hình. Cho đến
nay, nhóm loài này gồm 14 thành viên, trong đó có 6 loài đã xác định tên là
An. maculatus Theobald, 1901; An. dravidicus Christophers, 1924; An.
notanandai Rattanarithikul et Green, 1986, An. pseudowillmori (Theobald,
1910), An. sawadwongporni Rattanarithikul et Green, 1986 và An. willmori