Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam

1
PHẦN MỞ ĐẦU
1.Tính cấp thiết của đề tài
Hàng năm, trên thế giới các vi nấm gây bệnh thực vật như đạo ôn, khô vằn,
thối cổ rễ, mốc sương… chiếm 83% trong số các bệnh ở cây trồng[173,174,175].
Theo thống kê của Tổ chức Nông Lương Liên hiệp Quốc (FAO), thiệt hại trong
nông nghiệp do các bệnh vi nấm lên tới 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp thế
giới [49,152,187,189]. Vi
ệc sử dụng hoá chất trong bảo vệ thực vật nhằm tăng sản
lượng nông nghiệp từ lâu đã phổ biến ở Việt Nam với các chủng loại thuốc bảo vệ
thực vật rất đa dạng. Mỗi năm Việt Nam sử dụng khoảng 25.000 tấn thuốc hóa học
diệt sâu bệnh. Theo thống kê năm 2004, ở Việt Nam có tới 436 loại hoá chất với
1231 tên thương phẩm [61]. Song việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật thường rất
độc và khi tồn dư trong đất, nước và nông sản sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức
khỏe con người, gây ô nhiễm môi trường và làm mất cân bằng sinh thái.
Việt Nam là nước nông nghiệp, diện tích đất canh tác 10,126 triệu ha với sản
phẩm nông nghiệp chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân. Khí hậu
nhiệt
đới nóng ẩm, mưa nhiều là điều kiện thuận lợi cho vi nấm phát triển gây tổn
thất nặng nề đến năng suất cây trồng. Năm 2003, Việt Nam phải nhập tới 166 triệu
USD thuốc bảo vệ thực vật, trong đó các chất chống nấm chiếm tỷ lệ 28,0%[61].
Những năm vừa qua, nông dân Việt Nam cũng đã sử dụng một số chế phẩm kháng
sinh chống nấm gây bệnh cho cây trồng như: validamyxin, jingangmixin, polioxin,
blastixidin S, kasugamyxin…nhưng đây đều là các chế phẩm nhập ngoại.
Xuất phát từ những yêu cầu đó, xu hướng nghiên cứu trên thế giới hiện nay,
cũng như để góp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô cùng phong phú của nước
ta, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: ”Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất
kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam. Đề tài t
ập trung nghiên
cứu các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm mạnh, tiến hành lên men, chiết

xuất, tinh chế và xác định cấu trúc hóa học của chất kháng sinh có tiềm năng nhất;
đưa ra quy trình sản xuất và ứng dụng trong nông nghiệp.Việc tiến hành đề tài này
là cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn, đáp ứng nhu cầu nâng cao hiệu quả phòng

2
chống các bệnh thực vật từ các chất có hoạt tính sinh học, góp phần xâydựng một
nền nông nghiệp sạch, an toàn và bền vững ở Việt Nam.
2. Nội dung nghiên cứu của đề tài
• Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn của Việt Nam có khả năng sinh
chất kháng sinh dùng làm nguyên liệu nghiên cứu đồng thời đóng góp vào sự
tìm hiểu tính đa dạng sinh học cũng như phát hiện nguồ
n gen quý hiếm từ xạ
khuẩn của Việt Nam.
• Phân loại một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh chống nấm mạnh
nhất theo phương pháp sinh học phân tử
• Tách chiết và phân lập chất kháng sinh
• Xác định cấu trúc hoá học của chất kháng sinh
• Thăm dò khả năng ứng dụng
3. Những điểm mới và thành công của đề tài
• Đây là công trình
đầu tiên về một chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực
vật có nguồn gốc từ xạ khuẩn được nghiên cứu đến mức độ cấu trúc phân tử
ở Việt Nam.
• Đây là chủng xạ khuẩn mới phân lập ở Việt Nam có khả năng sinh chất
kháng sinh chống nấm và được xây dựng cây phát sinh chủng loại.
• Đã tách chiết và phân lập một chất kháng sinh TC-54, chất này được nhậ
n
dạng là validamyxin A.
• Đã ứng dụng chế phẩm bào tử xạ khuẩn và dịch nuôi cấy xạ khuẩn phân lập
được để thí nghiệm trên đồng ruộng chống lại một số bệnh phổ biến như

mốc trắng do Sclerotium rolfsii, khô vằn do Rhizoctonia solani gây ra có
được những kết quả rất khả quan.
4. Bố cục luận án
Luận án gồm 149 trang, 23 bảng số liệ
u, 25 hình vẽ, 189 tài liệu tham khảo
tiếng Việt và tiếng Anh. Bố cục luận án gồm: mở đầu (2 trang), tổng quan (46
trang), phương pháp nghiên cứu (24 trang), kết quả và thảo luận (56 trang), kết
luận (2 trang), tài liệu tham khảo (19 trang).

3
PHẦN NỘI DUNG CHÍNH
Chương 1. Tổng quan
1.1.Giới thiệu về chất kháng sinh
Thị trường CKS trên thế giới, theo thống kê năm 2002 đã đạt doanh số 26
tỷ đôla [174], và sẽ vẫn còn tăng khoảng 0,6% từ năm 2002-2008. Con số này cho
thấy tiềm năng to lớn của ngành công nghệ kháng sinh trong nền kinh tế quốc dân.
Sự xuất hiện ngày càng nhiều các vi khuẩn đa kháng thuốc và sự thiếu hụt các
nhóm kháng sinh mới, làm cho chúng ta đ
ang phải đối mặt với “kỷ nguyên hậu
kháng sinh” (post antibiotic era). Chính vì thế nhiệm vụ đặt ra của ngành công
nghiệp sản xuất kháng sinh là: một mặt cải biến các CKS cũ để tránh tình trạng
kháng thuốc, mặt khác phải thúc đẩy nghiên cứu và phát triển (R&D) để tìm ra các
chất kháng sinh mới với các cơ chế tác động mới hoàn toàn. Công nghiệp CKS đã
thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau
trên thế giớ
i.[113].
Vào khoảng những năm 1993 đến 2002, số lượng các tác nhân kháng khuẩn
đã tăng lên từ 90 đến 120 (Công bố tại Hội nghị Khoa học về tác nhân kháng
khuẩn và hoá trị liệu). Tại hội nghị này 21 công ty dược phẩm lớn đã trình bày các
phương pháp để khám phá ra các CKS mới [45,129]. Như vậy, sau hơn 70 năm kể

từ khi khám phá ra CKS, đến nay, số lượng CKS được phát hiện lên tới trên
17.000 chất [46]. Tuy nhiên chỉ có 1-2 % CKS đủ tiêu chuẩn để sử
dụng rộng rãi
trong thực tiễn y học.
1.2. Cơ chế tác dụng của chất kháng sinh
Cơ chế tác dụng của CKS là những cách thức mà CKS tác động lên những
vị trí đích khác nhau trong tế bào, qua đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi
sinh vật. Cơ chế này phụ thuộc vào bản chất hoá học, nồng độ chất kháng sinh và
cấu trúc hiển vi của tế bào. Các CKS có bản chất hóa học khác nhau thì thường có
cơ chế tác dụng khác nhau, còn các chất có bản chất hoá học gần giống nhau thì có
hoạt phổ tương tự như nhau.

4
1.3. Xạ khuẩn và sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn
Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật đơn bào, phân bố rộng rãi và đóng vai trò
quan trọng trong tự nhiên [139]. Chúng tham gia tích cực vào các quá trình chuyển
hoá hợp chất trong đất, trong nước. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí
hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật. Đặc tính quan trọng nhất
của xạ khuẩn là khả năng hình thành CKS, 60-70% xạ khuẩn đượ
c phân lập từ đất
có khả năng sinh chất kháng sinh.
1.4. Sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn
Sản xuất CKS thường được tiến hành theo phương pháp lên men chìm trong
nồi lên men có khuấy liên tục và sục khí. Có hai hình thức lên men theo mẻ và lên
men liên tục, được mô tả trong tài liệu [46]. Hai yếu tố quan trọng nhất trong quá
trình xử lý sau lên men là: đặc tính hóa lý của phân tử cần được tách chiết và tinh
sạch (đó là trọng lượng phân tử (MW), sự phân cực củ
a phân tử, sự tích điện của
các ion) và nồng độ của chất cần tinh sạch có trong dịch nuôi cấy. Nhìn chung, đặc
tính sinh lý của phân tử có thể xác định nhờ một số phương pháp sắc ký như: trao

đổi ion, lọc gel, tách phân lớp hay phương pháp hấp phụ. Nồng độ của phân tử cần
xác định có trong dịch lên men thường rất ít, đối với một chủng hoang dại khi lên
men thì nồng độ CKS thường từ 0,1-10
μg/ml. Còn đối với một quá trình lên men
chuẩn thì nồng độ là 300-600μg/ml. Tùy theo khả năng sinh kháng sinh của từng
chủng sản, nhưng khoảng 5-10 L dịch lên men là có thể đủ cho việc xác định phổ
hấp phụ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR) và sắc ký lỏng cao áp (HPLC), phổ
cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và các dữ liệu về cấu trúc phân tử trong
database.[46,48]
1.5. Tách chiết và tinh chế chất kháng sinh
Tinh sạch các chất trao đổi t
ừ vi sinh vật là một quá trình phức tạp, đòi hỏi
rất nhiều kỹ thuật, do các chất này rất đa dạng về cấu trúc hoá học nên trọng lượng
phân tử rất khác nhau. Chúng có thể tan trong nước hay tan trong các dung môi
hữu cơ tuỳ theo đặc tính của từng chất. Thường những chất tan trong dung môi
hữu cơ dễ tinh sạch hơn tan trong nước. Những chất khó tinh sạch nhất là những
chất dễ tan trong nước, trung tính ho
ặc lưỡng tính. Phương pháp trao đổi ion rất
hiệu quả đối với những chất tan trong axit hoặc kiềm và không hiệu quả đối với

5
những chất tan trong dung môi hữu cơ. Sắc ký lỏng cao áp là phương pháp rất hữu
dụng trong việc tách chiết các chất trao đổi từ vi sinh vật.
1.6.Các bệnh thực vật do vi nấm gây ra và các chất kháng sinh được sử dụng
trong nông nghiệp
Hàng năm thế giới thiệt hại do bệnh cây khoảng 537,3 triệu tấn các loại nông
sản chủ yếu (chiếm 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp của thế giới), trong đó
b
ệnh do nấm gây ra chiếm khoảng 83% [15,105, 111,116,121,180].
Vi nấm là vi sinh vật có nhân điển hình, phát triển nhanh chóng do quá trình

phát tán bào tử nhờ gió hoặc nước, do đó dễ dàng xâm nhập vào cây trồng hoặc
hạt giống. Ngoài ra nó còn tồn tại ngay trong đất và xâm nhập vào cây trồng thông
qua bộ rễ. Cây có thể bị nhiễm bởi một hoặc vài loại nấm, bao gồm cả những loại
nấm ký sinh không gây hại đến cây, nhưng phần lớn là các loại nấm gây hại cho
cây trồng. Sự nhiễm bệnh do nấm có thể xẩy ra ở một giai đoạn phát triển nào đó
của cây và tuỳ theo chủng nấm gây bệnh mà triệu chứng bệnh có thể được biểu
hiện ở các mức độ khác nhau [18,51,66].
Các nhà bệnh học thực vật trên toàn Thế giới đã bỏ ra nhiều năm để điều
tra tình hình sử dụng chất kháng sinh trong việc ngăn ch
ặn các bệnh ở thực vật.
Mặc dù rất nhiều chất được tìm kiếm và phát hiện ra nhưng chỉ một số ít được sử
dụng trong thực tiễn.
Những thành tựu to lớn thu được trong việc sử dụng CKS chống bệnh
truyền nhiễm vào những năm 40 của thế kỷ 20 đã mở ra xu hướng đầy triển vọng
trong sử dụng CKS bảo vệ thực v
ật. CKS là một trong các hợp chất thiên nhiên lý
tưởng có nhiều ưu việt trong việc phòng chống các bệnh cho cây trồng. Vì vậy,
việc phân lập xạ khuẩn để tìm kiếm các CKS mới trong bảo vệ thực vật đã, đang
và sẽ vẫn là một vấn đề thời sự hấp dẫn cho các nhà khoa học ở nhiều chuyên
ngành khác nhau.

6
Chương 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Nguyên liệu
Các mẫu cây bị bệnh dùng để phân lập nấm gây bệnh, một số mẫu đất phân
bố ở một số vùng trên cả nước để phân lập xạ khuẩn sinh kháng sinh.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
 Các phương pháp cơ bản dùng trong nghiên cứu vi sinh vật sinh kháng sinh
 Phương pháp phân loại xạ khuẩn theo Bergey và ISP
 Phương pháp tách chiết ADN theo Saito và Mura

 Phương pháp phân tích trình tự ADNr 16S theo Sanger
 Lên men, tách chiết CKS theo Donald B. Borders
 Xác định cấu trúc hoá học của CKS. Phân tích bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân
(NMR) và khối phổ (MS).
Chương 3. Kết quả nghiên cứu
3.1. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn
3.1.1. Sự phân bố và hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn
Từ 71 mẫu đất lấy ở nhiều vùng khác nhau trong cả nước, chúng tôi đã phân
lập và thuần khiết được 508 chủng xạ khuẩn. Số lượng và sự phân b
ố xạ khuẩn
trong đất được trình bày ở bảng 3.1. Mặc dù ở đây chúng tôi không đi sâu vào
nghiên cứu sự phân bố của xạ khuẩn trong đất, tuy nhiên có thể thấy số lượng xạ
khuẩn trong các mẫu đất là khá phong phú. Tuỳ thuộc vào tính chất đất và ở các
địa điểm khác nhau, số lượng xạ khuẩn (Streptomyces) có thể dao động từ 1,5.104
đến 5,6.108 CFU/ g đất.
Tỷ lệ các chủng xạ khuẩ
n thuộc chi Streptomyces phân chia theo nhóm màu
của Shirling và Gottlieb (hình 3.1). Số lượng xạ khuẩn nhiều nhất vẫn là nhóm
xám chiếm 39% tổng số các chủng phân lập, sau đó là đến nhóm trắng chiếm
22,8% và nhóm hồng 20,2%, nhóm xanh da trời 5,3% cuối cùng ít nhất vẫn là
nhóm xanh lục chiếm 2,9%. Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu trước đây

7
Tỷ lệ xạ khuẩn phân theo nhóm màu
0
10
20
30
40
50

Nhóm màu
Tỷ lệ (%)
Trắng (W) Xám (Gr)

(R) Vàng (Y) Lục (Gn) Xanh da trời (B)
[7]. t than bựn, s lng x khun nhúm xỏm chim 61,8% trong tng cỏc
nhúm, t podsol (t axit) chim 59,64% cũn t kim (carbonat) chim 35,4%.








Hỡnh 3.1. T l cỏc chng x khun thuc Chi Streptomyces theo nhúm mu
T l khỏng vi khun Gram (+) bao gi cng cao nht, chim 23,2%, sau ú
mi n vi khun Gram (-) (8,0%). Da trờn hot tớnh khỏng nm ca cỏc chng, 3
chng x khun c chn ti
p tc nghiờn cu l chng TC-54, D-41 v D-42.







Hỡnh 3.2. T l phn trm cỏc chng cú hot tớnh khỏng sinh
Mc tiờu ca chỳng tụi l tuyn chn c chng x khun chng nm gõy
bnh thc vt, trc ht l F. oxysporum gõy bnh thi c r. By chng cú hot

tớnh chng nm mnh nht ó c la chn v c ký hiu l TC-54, C-5, TC-
37, BC-54, BC-87, T-41, D-42. Cỏc ch
ng ny thuc 5 nhúm mu khỏc nhau.
Chng ký hiu TC-54, T-41 v D-42 u thuc nhúm xỏm, chng C-5 thuc nhúm
hng, chng TC-37 thuc nhúm xanh da tri, chng BC-86 thuc nhúm trng v
Tỷ lệ phân trăm các chủng có hoạt tính kháng sinh
0
5
10
15
20
25
30
Nhóm các vi sinh vật kiểm dịnh
Tỷ lệ phân trăm (%)
B.subtilis E. coli P. solanacearum T.utilis F.oxysporum A.niger

8
chng BC-87 thuc nhúm vng. Da trờn hot tớnh khỏng nm ca cỏc chng, 3
chng x khun c chn tip tc nghiờn cu l chng cú ký hiu TC-54, D-
41 v D-42. Chỳng tụi tin hnh nghiờn cu cỏc c im phõn loi ca 3 chng
ny.

Hỡnh 3.3. Hot tớnh khỏng sinh ca 47 chng x khun.
3.2. Nghiờn cu c im sinh hc v c im phõn loi ca cỏc chng x
khun.
Chng T-41
Chng T-41 cú b mt bo t cú dng xự xỡ (W) v cung sinh bo t xon (S),
s lng bo t trờn mt chui t 10-50.
Hỡnh 3. 4. B mt bo t
chng T-41(SEMx15.000)
Hỡnh 3.5. B mt bo t
chng D-42 (SEMx10.000)
0
10
20
30
40
50
60
70
B. subtilis E.coli T. utilis F.oxysporum A.niger
Vi sinh vật kiểm định
Tỷ lệ các chủng xạ khuản có khả năng
kháng vi sinh vật kiểm định (%)
Dịch lọc Dịch lọc chiết trong butanol Sinh khối chiết trong axeton

9
♦ Chủng D-42: có bề mặt bào tử nhẵn (Sm) và cuống sinh bào tử thẳng
(RF). Số lượng bào tử trên một chuỗi từ 10 ÷ 50.

Hình 3.6. Bề mặt bào tử chủng TC-54
(SEMx15.000)

Hình 3.7. Cuống sinh bào tử chủng
TC-54 ( SEMx5000)
♦ Chủng TC-54: có bề mặt bào tử dạng xù xì (W) và cuống sinh bào tử
dạng xoắn kép (S). Số lượng bào tử trên một chuỗi 10-50.
3.2.2. Đặc điểm sinh lý sinh hoá
♦ Chủng T-41
Chủng T-41 có thể sinh trưởng ở 37
0
C, dải pH cho sinh trưởng có hể từ 5-9,
không có khả năng hình thành sắc tố melanin trên môi trường có chứa sắt. T-41 có
khả năng tạo thành một số enzym ngoại bào như amylaza, proteaza và xenlulaza,
có khả năng chịu muối đến 5%. Thành tế bào chứa LL-DAP nên thuộc typ I.
Chủng T-41 không có khả năng sử dụng lactoza, các nguồn đường khác đều có thể
sử dụng được tuy nhiên, mức độ sử dụng mỗi loại đường không giống nhau, trong
đó sử
dụng tốt nhất là fructoza và mantoza.
♦ Chủng D-42: sinh trưởng tốt ở được ở dải pH từ 6,5 đến 8. Tuy nhiên pH
tối ưu cho sự sản sinh CKS là: 7,0 ÷7,5 và không có khả năng hình thành sắc tố
melanin trên môi trường thạch hữu cơ chứa sắt. D-42 có khả năng hình thành một số
enzim ngoại bào như amylaza, xenluloza, kitinaza và proteaza, có khả năng sinh
trưởng được ở nồng độ muối 8%. Chủng này cũng có thành tế bào thuộ
c typ I.

10
♦ Chủng TC-54: sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 28 - 30
0
và không sinh
trưởng ở 45
0
C. Thành tế bào chứa LL-DAP thuộc typ I. pH thích hợp cho sinh

trưởng là 6-8. Chủng này không có khả năng hình thành sắc tố melanin trên môi
trường thạch hữu cơ có chứa sắt.
3.2.4. Hoạt tính kháng sinh
♦ Chủng T-41: có phổ kháng khuẩn khá rộng, không những có khả năng
kháng nấm mà còn có khả năng chống vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Tuy nhiên,
có thể thấy rằng chủng T41 chủ yếu chống lại được các vi nấm gây bệnh đặc biệt
là F.oxysporum với vòng ứ
c chế là 50mm, còn Rhizoctonia solani là 42 mm,
Penicillium sp. là 30mm.
♦ Chủng D-42: chỉ có hoạt tính chống một số nấm gây bệnh như
F.oxysporum, Rhizoctonia solani, Penicillium, mà không có hoạt tính kháng các
vi khuẩn kiểm định khác.
♦ Chủng TC-54: ức chế được 11 trong số 14 vi sinh vật kiểm định. Phổ
kháng nấm của chủng này khá mạnh. Vòng kháng F. oxysporum đạt đến 35mm,
kháng T. mentagrophytes đạt 44 mm.










Hình 3.8 Hoạt tính kháng
F.oxysporum của 3 chủng T-41, D-42, TC-54

11
3.2.5. Giải trình tự ADNr 16S của 3 chủng xạ khuẩn

Để có thể phân loại chính xác đến loài, chúng tôi đã tiến hành xác định trình
tự ADNr 16S của 3 chủng nghiên cứu.
Các chủng xạ khuẩn được nuôi trên môi trường ISP4 thạch nghiêng, lấy hai
vòng que cấy và tách chiết qua nhiều bước (theo phương pháp tách chiết ADN
tổng số như đã nêu). Kiểm tra sản phẩm điện di trên gel agaroza 1% cho thấy trên
bản gel thu được băng ADN duy nhất không bị lẫn ARN.
Trong ADN tổ
ng số được tách chiết có gen mã hoá ARNr 16S của các
chủng nghiên cứu. ADN này được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR để nhân
gen ARNr 16S lên nhiều lần bằng các cặp mồi đã thiết kế. Với cặp mồi được thiết
kế dựa trên trình tự bảo thủ của gen ARNr 16S của E. coli thì theo lý thuyết sản
phẩm PCR thu được phải có độ dài xấp xỉ 1500bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR
cho thấy các băng có kích thướ
c khoảng 1500bp đúng như lý thuyết. Băng ADN
rất rõ, không bị đứt gãy, có độ tinh sạch cao, có thể sử dụng trong các phản ứng
tiếp theo. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit vivapure theo hướng dẫn của
nhà sản xuất. Sản phẩm PCR được kiểm tra hàm lượng ADN và độ tinh sạch. Sau
đó sản phẩm này được khuếch đại tiếp với các mồi và các hóa chất của bộ kit
Cycle sequencing để chuẩn b
ị xác định trình tự. Sau đó mẫu được đưa vào máy
đọc trình tự tự động ABI 3100 Avant .








1.5 kb

Hình 3. 9: Kết quả điện di sản
phẩm PCR
1) Marker 2) Chủng T-41
1 2 3 4

12
Trình tự nucleotit của đoạn gen mã hoá cho ARNr 16S được giải bằng máy giải
trình tự tự động ABI 3100 Avant của hãng Perkin-Elmer (Mỹ). Sau đó chuỗi trình tự
này được so sánh với tất cả các chuỗi nucleotit ADNr 16S đã được công bố trên ngân
hàng gen quốc tế (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov) bằng chương trình BLAST.
Việc phân loại chính xác cần phải xác định thêm một số đặc tính khác nữa
như phân tích trình tự ADNr 16S, lai ADN-ADN, và xây dựng cây phát sinh chủng
loại. Dựa vào kết quả đã được gi
ải trình tự ADNr 16S, vào phần mềm CLUSTAL
1.83 và vào các trình tự đã có sẵn thuộc chi Streptomyces trong ngân hàng gen
(GeneBank), chúng tôi đã xây dựng được cây phát sinh chủng loại (Hình 3.10).
Nhìn vào cây phát sinh chủng loại, có thể thấy chủng T-41 rất gần gũi với
chủng Streptomyces antimycoticus AY99983 với độ tương đồng 99.9%. Hơn nữa,
dựa vào các đặc điểm truyền thống đã được nghiên cứu ở trên, chủng này được
xác định là S. antimycoticus và ký hiệu là S. antimycoticus T41.
Chủng này lần
đầu tiên được Waksman phát hiện vào năm 1957.[113].
Riêng đối với chủng D-42, dựa vào việc phân tích trình tự ADNr 16S thì
thấy: Chủng này giống với chủng Streptomyces diastatochromogenes D63867
nhưng khi phân tích các đặc điểm truyền thống thì chủng D-42 lại có nhiều đặc
điểm giống với chủng S.viridogenes tuy chỉ khác về khả năng đồng hoá đường.
Điều này càng chứng tỏ tầm quan trọng củ
a việc phân tích trình tự ADNr 16S, vì
chỉ dựa vào các đặc điểm sinh lý sinh hoá thôi, chúng ta chưa thể khẳng định
được chính xác tên của loài đó. Nhờ vào kết quả phân tích này chúng tôi so sánh

ngược trở lại giữa chủng D-42 và S.diastatochromogenes cho thấy có các đặc
điểm giống và khác nhau như sau: [ 36,113].
Giống nhau: cả 2 chủng này đều thuộc nhóm xám (Gr), bề mặt bào tử nhẵn
(sm), cuống sinh bào tử dạng xoắn, đều có khả năng sử dụng các lo
ại đường giống
nhau và đều có khả năng chống nấm tốt.
Khác nhau: chủng D-42 có hình thành sắc tố hòa tan, còn chủng
S.diastatochromogenes thì không hình thành, chủng D-42 không hình thành sắc tố

13
melanin khi nuôi cấy trên môi trường ISP 6 còn chủng S.diastatochromogenes lại
hình thành melanin. Sự khác nhau về khả năng hình thành sắc tố và sự tạo melanin có
thể do tác động của nhiều yếu tố khác nhau, tuy nhiên ở đây chúng tôi chưa thể khẳng
định được là do nguyên nhân cụ thể nào, nhưng nằm trong phạm vi biến dị loài.
Hình 3.10. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên trình
tự ADNr 16S, thể hiện mối quan hệ giữa 3 chủng xạ khuẩn T-41, D-42, TC-
54 và các
đại diện có quan hệ gần gũi thuộc chi Streptomyces.
Các nghiên cứu trên thế giới về loài Streptomyces diastatochromogenes cho
thấy chủng này có khả năng sinh CKS oligomyxin. Oligomyxin là CKS thuộc
PHYLIP_1
0.01
Streptomyces thermovulgaris Z68098
Streptomyces griseus AB045867
Streptomyces violascens AY999737
100
Streptomyces sannurensis AY331685
Streptomyces kasugaensis AY99920
Streptomyces morookaensis AJ781349
Streptomyces kashimirensis AJ781337

Streptomyces griseoverticillat AY999892
Streptomyces sapporonensis AJ781378
100
98
66
D42
99
Streptomyces bottropensis AF397892
Streptomyces europaeiscabiei AY207595
Streptomyces scabiei AB026211
100
99
93
Streptomyces roseolilacinus AY999879
Streptomyces somaliensis AJ007401
98
48
Streptomyces lavendofoliae AJ781336
Streptomyces gobitricini AJ781335
100
100
82
41
Streptomyces platensis AB045882
Streptomyces daliensis AY785161
Streptomyces sclerotialus AJ621608
Streptomyces rimosus AB045883
Streptomyces erumpens AJ621603
78
54

84
62
48
Streptomyces yatensis AF336800
Streptomyces rutgersensis AY508511
Streptomyces viridogennes
100
92
TC54
Streptomyces hygroscopicus AB217603
100
Streptomyces violaceusniger AJ391823
Streptomyces sporocinereus AJ781368
Streptomyces endus AY999
Streptomyces antimycoticus AY999831
100
T41
88
100
87
94
75
79
87
Streptomyces diastatochromogenes D63867

14
nhóm macrolit có khả năng kháng nấm gây bệnh trên cây trồng rất tốt. Chất này đã
được một số hãng sản xuất lớn trên thế rất quan tâm. Chủng xạ khuẩn này lần đầu
tiên đã được Krainsky phát hiện từ những năm 1914, sau đó đến năm 1948 được

Waksman và Henrici phân loại lại. Như vậy, dựa vào tất cả các đặc điểm về hình
thái, sinh lý sinh hóa và đắc điểm về sinh học phan tử
, có thể phân loại chủng D-
42 thuộc loài Streptomyces diastatochromogenes.
Dựa vào cả đặc điểm sinh lý, sinh hoá và phân tích trình tự ADNr 16S thì
chủng TC-54 có độ tương đồng với chủng Streptomyces hygroscopicus là 100%.
Như vậy chủng này được định danh là S. hygroscopicus TC-54. Theo bộ sưu tập
của Bảo tàng giống Nhật Bản (JCM) thì Streptomyces hygroscopicus có tới 20
dưới loài khác nhau và tổng hợp được khoảng hơn 20 các chất kháng sinh khác
nhau. Do diều kiện chưa cho phép nên chúng tôi vẫn chưa phân loại
được dưới
loài của chủng này. Các chất kháng sinh do Streptomyces hygroscopicus sinh ra
bao gồm: abomyxin, angustmyxin, ascomyxin, decoyinin, psicofuranin, nigerixin,
geldanamyxin, scopafungin, glebomyxin, hialomyxin A, B, endomyxin A, B,
helixin A, B, tylosin, minimyxin, hygromyxin, vulgamyxin, validamyxin,
ossamyxin. [36].
3.3. Khả năng tổng hợp CKS của 3 chủng xạ khuẩn đã lựa chọn
3.3.1. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp
Trong công nghệ kháng sinh môi trường đóng vai trò quan trọng hàng đầu. Một
môi trường lên men tốt phải là môi trường vừa thuận lợi cho chủng sinh trưởng tốt
vừa cho hiệu suất kháng sinh cao. Ở đây chúng tôi dùng 5 loại môi tr
ường lên men
cơ sở là A- 4, A- 4H, A- 9, A- 12 và Gauze I.
♦ Chủng T41: trên môi trường A-12 thì chủng này cho hoạt tính kháng sinh
mạnh nhất (22mm đối với F.oxysporum).
♦ Chủng D42: cũng trên môi trường A-12 chủng này cũng cho hoạt tính
kháng sinh mạnh nhất (32,67mm đối với F.oxysporum).
♦ Chủng TC-54: môi trường A-4 là môi trường thích hợp cho quá trình tổng
hợp CKS (34,33mm đối với F.oxysporum ). Các môi trường này được sử dụng cho
các nghiên cứu tiếp theo.

15
3.3.2. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy
3.3.2.1 Ảnh hưởng của pH ban đầu và nhiệt độ tới khả năng hình thành CKS
của chủng T-41, D-42 và TC-54.
Cả ba chủng đều có khả năng sinh trưởng và cho hoạt tính kháng sinh mạnh
nhất ở nhiệt độ khoảng 30
0
C, pH trung tính hoặc hơi kiềm.
3.3.2.2. Ảnh hưởng của các nguồn cơ chất lên quá trình sinh tổng hợp CKS
của các chủng T-41, D-42, và TC-54.
Ảnh hưởng của nguồn cacbon: Chủng T-41, D-42 và TC-54 có khả năng sử
dụng nhiều loại đường khác nhau. Lượng sinh khối được tạo thành trong môi
trường có nguồn cacbon là tinh bột tan hoặc maltoza là cao nhất nhưng lại không
cho hoạt tính kháng sinh cao. Trong khi đó, trên môi trường có nguồn cacbon là
lactoza, rỉ đường, lượng sinh khối thu được ít h
ơn so với các nguồn cacbon khác
nhưng lại cho hoạt tính kháng sinh cao hơn. Điều này chứng tỏ rằng trong rỉ
đường, ngoài đường còn có một số thành phần chất hữu cơ khác cũng có khả năng
ảnh hưởng tới quá trình tổng hợp CKS của chủng này.
Ảnh hưởng của nguồn nitơ: Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh tổng hợp
CKS của các chủng nghiên cứu đã khẳng định ư
u thế của bột đậu tương lên khả
năng sinh tổng hợp CKS của chủng T-41 và TC-54. Khả năng sinh tổng hợp CKS
cao khi dùng bột đậu tương không những do bột đậu tương có chứa 40% protein
mà còn có thể do nó có chứa cả các chất khác cần cho sinh tổng hợp CKS. Đối với
chủng D-42, hoạt tính kháng sinh đạt mạnh nhất trên nguồn nitơ là cao nấm men,
tiếp đó là bột đậu tương. Lượng bột đậ
u tương thích hợp cho lên men của các
chủng này là 1%.

3.3.3. Động học quá trình lên men của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu
Động thái sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS của các chủng T-41, D-42 và
TC-54 trong môi trường lên men đã chọn được biểu hiện ở hình 3.11.Lượng sinh
khối tăng dần cùng với thời gian và đạt trạng thái cực đại sau 96 giờ nuôi (pha cân
bằng).

16
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
3710
pH
Ho¹t tÝnh kh¸ng sinh chiÕt trong
c¸c pH kh¸c nhau (D-d,mm)
SK.T-41 SK. D- 42 SK. TC-54 DL. T- 41 DL.D- 42 DL.TC- 54
3.4. Tách chiết và tinh chế CKS TC-54
3.4.1. Tách chiết CKS bằng dung môi hữu cơ
Chúng tôi đã sử dụng 8 loại dung môi để chiết rút CKS, kết quả ở bảng 3.16
cho thấy cả 8 loại dung môi đều có thể dùng để chiết CKS TC-54.

Hình 3.13. Hoạt tính kháng sinh của 3 chủng nghiên cứu
chiết ở các pH khác nhau
Chiết CKS từ sinh khối bằng metanol cho hoạt lực mạnh nhất. Tuy nhiên, do
etanol cho kết quả chỉ sau metanol nên để thuận lợ
i và kinh tế, chúng tôi dùng
etanol.
3.4.5. Tách chiết bằng trao đổi ion ( CKS TC-54)
Quy trình phân lập CKS TC-54-1 được mô tả như sau:
Dịch nuôi cấy chủng S. hygroscopicus TC-54 sau 5 ngày lên men được axit hóa
bằng cách bổ sung axit oxalic tới pH=3, sau đó ly tâm loại bỏ sinh khối và thu
dịch lọc.
Dịch lọc được chạy qua cột trao đổi ion Amberlit IR-120 (dạng H) và IR-45
(OH) để loại bỏ các cation và anion. Sau đó lại được nhồi vào cột Dowex-50 X-2,
lúc này CKS được hấp thụ trong nhựa và được rửa giải bằng NH
4
OH 0,5N trong
đệm pyridin- axit axetic pH 7,5. Chất hấp thụ trong cột và được rửa giải gọi là
CKS TC-54-1 ở dạng tinh khiết hơn. Còn chất qua cột được gọi là CKS TC-54-2.

17
Kiểm tra độ tinh khiết của TC-54-1: Bằng sắc ký lớp mỏng, triển khai
với 3 hệ dung môi khác nhau:
1. n-butanol-axit axetic-nước ( 4:1:5) có Rf= 0,55
2. n-propanol: axit axetic: H
2

0 (4:1:1) có Rf=0,3
3. n-butanol bão hòa nước có Rf=0,75

Hình 3.16. Sơ đồ tách chiết chất kháng sinh TC-54
Kết quả cho thấy với các hệ dung môi khác nhau, chất TC-54-1 đều cho một
vết trên bản sắc ký lớp mỏng. Chúng tôi kết luận sơ bộ chất TC-54-1 là tinh khiết.
Trên sắc ký lớp mỏng, chất TC-54-1 có màu tím đỏ khi hiện màu với thuốc thử
ninhydrin. Với thuốc thử vanilin/H
2
SO
4
đặc chất TC-54 cho màu tím sẫm. Từ
những đặc điểm trên, chúng tôi dự đoán sơ bộ chất này có chứa nhóm amin và
hydroxyl. Mặt khác, chất TC-54-1 dễ tan trong nước, trong các CKS được phân
lập từ loài S. hygroscopicus cho đến nay chỉ có validamyxin có tính chất này (cấu
- chỉnh pH 4,5 (bằng axit oxalic)
- ly tâm



- chạy qua cột nhồi nhựa trao đổi ion Ambelit
IR-120 (dạng H).
- chạy qua cột nhồi nhựa trao đổi ion Ambelit
IR-45 (dạng OH).



- chạy qua cột Dowex-50 WX-2, CKS hấp phụ
trong nhựa.
- giải hấp thụ bằng NH

4
OH 0,5N
- thu hồi, cô đặc.

Dịch nuôi cấ
y
TC-54
(
10L, 1210 đv/ml
)
D
ị
ch l
ọ
c
Dịch lọc đã loại bỏ các cation và anion
TC-54-1 (610 μg/ml)

18
trúc hóa học của valydamyxin thuộc nhóm giả đường, có nhiều nhóm hydroxyl
nên chất này dễ tan trong nước và có nhóm amin), do vậy chúng tôi nghĩ đến chất
TC-54-1 có thể là CKS thuộc nhóm validamyxin.
Đối chiếu với kháng sinh chuẩn validamyxin A do Viện Bảo vệ Thực vật
cung cấp, chúng tôi đã tiến hành định tính bằng sắc ký lớp mỏng, phân tích dữ liệu
các phổ UV, IR và
1
HNMR để nhận dạng chất TC-54-1.
3.4.6. Nhận dạng CKS TC-54
Cảm quan: Đây là dạng bột không màu, tan trong nước, tan trong metanol,
DMF và DMSO, tan vừa trong etanol và axeton, ít tan trong etylaxetat .

Định tính bằng sắc ký lớp mỏng (chấm chồng với validamyxin) trên bản
SKLM với hệ dung môi n-propanol- axit axetic -nước (4:1:1) cho thấy chất TC-
54-1 trùng với valydamyxin A chuẩn.
Phổ tử ngoại của CKS TC-54-1 trong nước không có đỉnh hấp phụ.
Phổ hồng ngoại có các pic đặc trưng cho nhóm hydroxyl (OH) υ = 3420cm
-1

và những liên kết ete ( C-O-C) υ = 1000-1100cm
-1
.
Phổ cộng hưởng từ proton
1
HNMR (400MHz, DMSO – D
6
) cho một pic kép
(d) có độ dịch chuyển hóa học là 5,77 ppm, đây là proton H. Vùng có độ dịch
chuyển hóa học từ 3 – 5 ppm tương ứng với các proton của nhóm metyl liên kết
với các nhóm hydroxyl (CH-OH).
Dựa theo tài liệu nghiên cứu validamyxin của Iwasa (phân lập và xác định
cấu trúc) [69], kết quả phân tích phổ UV, IR,
1
HNMR chất TC-54-1và so sánh với
mẫu chuẩn validamyxin A, chúng tôi sơ bộ nhận dạng chất TC-54-1 là
validamyxin.
Định lượng CKS TC-54-1 bằng HPLC dựa vào mẫu validamyxin A chuẩn
theo phương pháp mô tả trong mục 2.2.8.4 kết quả cho thấy hàm lượng
validamyxin A thu được sau quá trình tách chiết và làm sạch là 610μg/ml. Hàm
lượng CKS ở một chủng hoang dại đạt được nồng độ này là khá cao. Điều này hết
sức quan trọng trong việc tinh chế một hàm lượng CKS lớn.

19
y = 67,024x - 710,8
R
2
= 0,9869
0
500
1000
1500
2000
2500
10 15 20 25 30 35 40 45
Đương kinh vòng vô khuân (D-d,mm)
Nông đô CKS (mcg/ml)





Hình 3. 17. Công thức cấu tạo củavalidamyxin
3.4.7. Mối tương quan giữa nồng độ CKS và đường kính vòng vô khuẩn
Thí nghiệm tiếp theo, phân tích mối tương quan giữa nồng độ CKS (đv/ml) và
đường kính vòng vô khuẩn (D-d, mm) theo phương pháp của Dmitrieva, kết quả
được minh họa ở hình 3.18.

Hình 3.18. Mối tương quan giữa đường kính vòng vô khuẩn và nồng độ chất
kháng sinh. VSV kiểm định F.oxysporum
Có thể thấ
y rằng nồng độ chất kháng sinh và độ lớn vòng vô khuẩn tỷ lệ
thuận trong một giới hạn nồng độ nhất định, nếu quá giới hạn này thì dù nồng độ
có tăng, vòng vô khuẩn cũng không tăng. Như vậy có thể thấy được mối tương
quan bậc nhất giữa nồng độ CKS và đường kính vòng vô khuẩn.
Ở đây sử dụng VSV kiểm định là F.oxysporum có đường kính vòng vô
khuẩn là 40mm thì nồng độ CKS tương ứng là 1210đv/ml. So với các chủng
hoang dại sinh kháng sinh đã được công bố thì chủng xạ khuẩn này là chủng có
hoạt tính khá cao.

20
3.5. Tìm hiểu khả năng ứng dụng của các CKS thô T41, D42 và TC-54
3.5.2. Ảnh hưởng của CKS T-4l và TC-54 đến khả năng sinh trưởng của cây
Dịch nuôi cấy chủng T-41 được pha loãng đến các nồng độ 1, 2, 10, 50,
100%. Thử ảnh hưởng của CKS đến khả năng sinh trưởng của cây sau 10 ngày
nảy mầm. Trong thí nghiệm này, một lần nữa lại khẳng định khả năng kích thích
sự nảy mầm của hạt đối v
ới CKS ở nồng độ 1%. Hơn nữa, chiều dài thân cây mạ ở
nồng độ 1% và 2% cũng cao hơn hẳn so với đối chứng.
Thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi sử dụng CKS TC-54 thô pha trong nước cất
để có nồng độ 20mg/ml, sau đó pha loãng tiếp bằng nước cất đến các nồng độ 10;
5; 1; 0,5; 0,1 ; 0,01; 0,005; 0,001 (mg/ml). Kết quả cho thấy ở nồng độ 5; 10mg/ml

CKS này ức chế hoàn toàn quá trình nảy mầm. Ở nồng độ 1mg/ml tỷ l
ệ nảy mầm
đã giảm so với đối chứng. Ở nồng độ 0,001mg/ml CKS không những không ảnh
hưởng đến tỷ lệ nảy mầm mà còn kích thích quá trình nảy mầm của hạt. Tỷ lệ này
tương đương với nồng độ 1% dịch nuôi cấy. Những kết quả nghiên cứu này rất
quan trọng trong việc sử dụng CKS ở các nồng độ khác nhau ứng dụng trong thực
tiễn theo từ
ng mục đích và đối tượng khác nhau. Nhìn chung, nồng độ đủ ức chế
nấm gây bệnh F.oxysporum không ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây.
3.6. Sản xuất chế phẩm
3.6.3. Bước đầu thử nghiệm chế phẩm trên đồng ruộng
3.6.3.1. Chế phẩm T-41 và D-42
Trong các thí nghiệm này, chúng tôi có sử dụng 2 loại thuốc hoá học có tên
thương phẩm là: mexyl (metalaxyl 18% và mancozeb 64%), rovral (iprodione
96%), đã được phép sử dụng tại Việt Nam và validacin 3DD. Đ
ây là các chất
chống nấm gây bệnh thực vật rất tốt và thường được sử dụng nhiều ở Việt Nam.
Có thể thấy rằng với 2 loại thuốc hoá học dùng để diệt nấm rất phổ biến hiện
nay thì khi dùng mexyl, rovral tỷ lệ cây bị bệnh sau 31 ngày thí nghiệm tương ứng
là 28,57% và 31,43 %. Trong khi đó chế phẩm T-41 có tỷ lệ bệnh là 28,57% tương

21
đương với khi dùng mexyl và hiệu lực còn cao hơn cả rovral. Còn chế phẩm D-42
thì tỷ lệ cây bị bệnh chiếm 39,05%.
Bảng 3.18. Kết quả thử nghiệm trên cà chua
( nấm gây bệnh: Sclerotium rolfsii)
1 2 3 4 5 6
Đối chứng
Mexyl
MZ72

Rovral
50WP
D42 T41
CP.
T. viride
Công thức

Ngày

Tỷ lệ cây bị bệnh tại các thời điểm thí nghiệm(%)
Ngày thứ 7 39,05±3,79
8,57±3 9,52±2,52 17,14±1,73 20,95±4,04 20,95±5,13
Ngày thứ 17
55,95±1,53 17,14±4,36 16,19±2,52 28,57±1 25,71±4,36 24,76±5,51
Ngày thứ 24
63,43±2,65 21,9±4,16 25,71±2,65 33,33±2,08 25,71±4,36 26,67±5,03
Ngày thứ 31 89,05±3,79 28,57±3,46
31,43±2,65
39,05±1,15 28,57±4,36
29,52±5,69

Thí nghiệm tiếp theo chúng tôi thử nghiệm trên bắp cải. Đất trồng bắp cải
được nhiễm Rhizoctonia solani, sau 7 ngày lây nhiễm thì trồng bắp cải vào đất đó.
Loại nấm này có thể gây hại cho cây trồng quanh năm và đặc biệt gây hại nặng
vào vụ xuân.
Bảng 3.19. Kết quả thử nghiệm trên bắp cải
( Nấm gây bệnh Rhizoctonia solani)
1 2 3 4 5 6
Đối chứng
Validacin

3DD
Rovral
50WP
Mexyl
MZ72
D42 T41
Công thức


Ngày
Tỷ lệ cây bị bệnh tại các thời điểm thí nghiệm(%)
Ngày thứ
15
73,3±5,51
10±1
18,66±4,52 18±1,15
16,3±3,58
26,6±4,16
Ngày thứ
30
100±5,67
10±1,15
18±5,36 20±2,67
17,3±3,33
33,3±4,04

22
Bệnh gây hại nặng trên cây cải bắp với triệu chứng lở và thắt cổ rễ cây con và
triệu chứng thối bắp cây trưởng thành. Tỉ lệ bệnh do nấm bệnh gây ra trên cây cải
bắp ở vụ xuân vào giai đoạn chuẩn bị thu hoạch dao động từ 9 - 99% ở các vùng

trồng rau xung quanh Hà Nội. Những kết quả trên bảng 3.19 cho thấy chế phẩm
D-42 lại có tác dụng diệt R. solani trên bắp c
ải với hiệu lực tương đối cao, hơn cả
rovral và T-41, nhưng kém hơn hẳn so với validacin. Vì validacin là kháng sinh
đặc hiệu dùng để trị bệnh này.
3.6.3.2. Khảo nghiệm chế phẩm TC-54 tại xã Trần Lãm, Thái Bình.
3 công thức được dùng để thí nghiệm đối với giống lúa Q5. Công thức thứ 1
dùng chế phẩm TC-54, công thức thứ 2 dùng validacin 3DD thương phẩm - đây là
loại thuốc đang đựơc dùng phổ biến trong phòng chống bệnh khô vằ
n hại lúa hiện
nay. Công thức thứ 3 là đối chứng. Thí nghiệm đựơc bắt đầu tiến hành vào lúc lúa
làm đòng, là thời kỳ lúa bị bệnh nặng nhất.
Chế phẩm TC-54 có khả năng phòng trừ bệnh khô vằn hại lúa, hiệu lực của
chế phẩm đạt cao nhất sau 5-10 ngày. Điều tra sau phun thuốc 5-10 ngày không
thấy vết bệnh mới xuất hiện, sau 15-20 ngày vết bệnh mới bắt đầu xuấ
t hiện. So
với validacin thương phẩm thì tỷ lệ bệnh cao hơn từ 2-5,3%, chỉ số bệnh cao hơn
khoảng 2%. Nếu so sánh với đối chứng thì dùng TC-54 tỷ lệ bệnh sẽ giảm đi 10-
19%, chí số bệnh giảm đi 9-20%. Điều đáng chú ý là validamyxin là CKS đã được
nghiên cứu hoàn thiện về công nghệ lên men, chiết rút và công thức chế phẩm,
trong khi TC-54 mới dừng ở dịch lên men tự nhiên.
Từ nh
ững kết quả thực nghiệm đồng ruộng có thể rút ra nhận xét sau:
validamyxin lần đầu tiên được phát hiện ở Trung Quốc sau đó được triển khai
nghiên cứu toàn diện ở Nhật Bản và không lâu sau, cả hai nước đều tung ra thị
trường chế phẩm validacin như là thuốc chủ lực chống nấm gây bệnh khô vằn.
Khác với sản xuất kháng sinh dùng trong y tế và thú y luôn phải tinh khiết để
tránh các phản ứng phụ, nên th
ường có giá thành cao.

23
Bảng 3.23. Tổng hợp số liệu khảo nghiệm sau 20 ngày
Sau phun thuốc ( ngày)
Côn
g

thức
Chỉ
tiêu
(%)
0 5 10 15 20
Tỷ lệ
bệnh
18,67±6,11 21,33
±4,62 22,67±4,04 24,0±3,46 25,33±7,57
1
Chỉ
số
bệnh
6,67±1,89 8,83
±2,47 10,33±1,53 12,5±3,97 14,5±6,14
Tỷ lệ
bệnh
19,33±3,06 19,33±3,06 20,67±8,08 20,33±6,66 20,0±6,11
2
Chỉ
số
bệnh
6,67±1,89 7,0±1,32 8,5±3,61 11,0±6,61 12,8±6,11

Tỷ lệ
bệnh
18,00±5,29 18,00±5,29 34,0±9,17 41,33±7,57 44,66±9,45
3
Chỉ
số
bệnh
6,5±1,8 6,5±1,8 19,0±6,24 28,16±6,37 34,17±8,43
Đã có nhiều ý kiến tranh luận về mặt trái của việc sử dụng CKS trong nông
nghiệp, nhất là trong chăn nuôi và thú y. Việc lạm dụng CKS có thể làm xuất hiện
các vi khuẩn kháng thuốc để rồi các vi khuẩn này lại truyền các gen kháng thuốc
cho các vi khuẩn gây bệnh ở người, làm mất đi cơ hội sử dụng có hiệu quả vũ khí
kháng sinh trị bệnh cho người. Tương tự như vậy, trong nuôi trồng th
ủy sản người
ta cũng nghiêm cấm sử dụng một số CKS để chữa bệnh và xử lý ô nhiễm môi
trường nuôi tôm cá.
Chính vì những lý lẽ trên, nhiệm vụ của chúng tôi là đưa ra một loại chế
phẩm kháng sinh thô hoặc chế phẩm chứa bào tử xạ khuẩn sinh kháng sinh chỉ
dành riêng cho bảo vệ thực vật. Loại thứ nhất dùng để trị bệnh, tức là phun trực
tiếp vào cây bị bệ
nh nhằm diệt các tác nhân gây bệnh. Loại thứ 2 dùng để phòng
chống. Khi đưa bào tử xạ khuẩn vào đất (khoảng 10
9
bào tử/m2), chúng sẽ nảy
mầm tạo ổ sinh thái và ức chế các nấm gây bệnh. Mặc dù ở trong đất, lượng chất
kháng sinh sinh ra không nhiều và dễ bị phân hủy bởi các vi sinh vật đất, tuy nhiên
chúng được tạo ra liên tục và trên diện rộng nên khả năng ức chế các nấm bệnh
khác là rất lớn.

24

KẾT LUẬN
Từ những kết quả thu được chúng tôi rút ra được những kết luận sau:
1. Từ 71 mẫu đất, đã phân lập được 508 chủng xạ khuẩn và chọn được 3 chủng có
hoạt tính kháng nấm gây bệnh thực vật cao nhất được ký hiệu là: T-41, D-42,
TC-54 để nghiên cứu sâu hơn.
2. Đã tiến hành xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và phân tích
trình tự gen ADNr 16S để khẳng định:
- Chủ
ng T41 là Streptomyces antimycoticus Waksman, 1957.
- Chủng D-42 là Streptomyces diastatochromogenes (Krainsky 1914) Waksman và
Henrici, 1948.
- Chủng TC-54 là Streptomyces hygroscopicus (Jensen 1931) Waksman và
Henrici, 1948.
3. Đã xác định được điều kiện lên men thích hợp cho 3 chủng xạ khuẩn:
- Môi trường A-12 thích hợp cho các chủng T-41 và D-42 sinh tổng hợp
kháng sinh, trong đó khả năng sinh kháng sinh của T-41 trên môi trường
xốp mạnh hơn trên môi trường dịch thể. Môi trường A-4 thích hợp nhất cho
chủng TC-54 sinh kháng sinh.
- T-41 và D-42 đều cho hoạt tính kháng sinh mạnh nhất ở nhiệ
t độ khoảng
30
0
C, pH trung tính hoặc hơi kiềm. Nguồn cacbon thích hợp nhất cho để
tổng hợp chất kháng sinh của chủng T-41 là tinh bột tan (1%) và D-42 là rỉ
đường. Bột đậu tương (1%) là nguồn nitơ hữu cơ thích hợp cho lên men của
các chủng này. Ở cả hai chủng, lượng sinh khối tích luỹ và hoạt tính kháng
sinh đạt cực đại sau khoảng 96-120 giờ nuôi.
- Trên môi trường lên men xốp, hoạt tính kháng sinh của chủng T-41 đạt cao
nhất vào ngày thứ 12.
4. Dự

a vào phổ UV, IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, CKS TC-54 sơ bộ định dạng
là validamyxin.
5. Đã bước đầu ứng dụng 3 loại chế phẩm sản xuất từ 3 chủng xạ khuẩn nghiên cứu.
- Chế phẩm bào tử T-41, rất có hiệu quả trong việc chống nấm Sclerotium
rolfsii gây bệnh mốc trắng ở cà chua.
- Chế phẩm D-42 có hiệu quả tốt trong phòng chống b
ệnh lở cổ rễ và thối bắp
do Rhizoctonia solani gây ra trên bắp cải.
- Chế phẩm dạng dịch TC-54 có hiệu quả tốt đối với việc phòng chống bệnh
khô vằn (Rhizoctonia solani) ở lúa với hiệu lực gần xấp xỉ validacin.