tóm tắt luận án phân lập và tuyển chon vi khuẩn cố định đạm pseudomonas spp bón cho cây lúa cao sản vùng đồng bằng sông cửu long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ



BÁO CÁO TÓM TẮT
LUẬN ÁN TIẾN SĨ




PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN
CỐ ĐỊNH ĐẠM PSEUDOMONAS SPP.
BÓN CHO CÂY LÚA CAO SẢN
VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG


Chuyên ngành VI SINH VẬT HỌC
Mã số 62 42 40 01




NGÔ THANH PHONG




Cần Thơ, 6/2012
1

MỤC LỤC
Tóm lược 2
Summary 3
Chương I: Mở đầu – Tổng quan về đề tài 4
1.1. Tính cấp thiết của đề tài 4
1.2. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu 4
1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 5
1.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 5
1.5. Những đóng góp của luận án 6
1.6. Cơ sở lý luận và giả thuyết khoa học 6
Chương II: Tổng quan tài liệu 7
2.1. Cố định đạm sinh học 7
2.2. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas 7
2.3. Cơ chế cố định đạm của Pseudomonas 9
2.4. Ứng dụng cố định đạm của Pseudomonas 10
2.5. Vai trò của đạm đối với cây lúa 10
Chương III: Nội dung, phương tiện và phương pháp nghiên cứu 11
3.1. Nội dung nghiên cứu 11
3.2. Phương tiện nghiên cứu 11
3.3. Phương pháp nghiên cứ
u 12
Chương IV: Kết quả và thảo luận 13
4.1 Kết quả thu mẫu đất vùng rễ lúa 13
4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn cố định đạm 13
4.3. Kết quả đánh giá khả năng cố định đạm của vi khuẩn 15
4.4. Kiểm tra vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử 17
4.5. Hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn với cây lúa cao sản 21
Chương V: Kết lu
ận và đề nghị 27

5.1. Kết luận 27
5.2. Đề nghị 27
Danh mục các công trình đã công bố có liên quan đến luận án 28
2


TÓM LƯỢC
Những nội dung của đề tài đã được thực hiện nhằm đạt đến mục tiêu
tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn Pseudomonas spp. có khả năng cố định
đạm hữu hiệu với cây lúa cao sản. Kết quả nghiên cứu của đề tài đã đạt được
như sau:
Phân lập được 150 dòng vi khuẩn cố định đạm từ 130 mẫu đất
vùng r
ễ lúa của 13 tỉnh thành ở đồng bằng sông Cửu Long trên môi trường
Pseudomonas Isolation Agar (Difco). Tất cả 150 dòng vi khuẩn đều có khả
năng tổng hợp NH
4
+
trong đó có 86/150 dòng có khả năng tổng hợp NH
4
+

cao hơn 5 mg/l.
Các dòng tổng hợp NH
4
+
cao được phân tích PCR-16S rRNA với
cặp mồi đặc hiệu FGPS4-281bis và FGPS1509’-153 để nhận diện
Pseudomonas. Kết quả có 55/86 dòng vi khuẩn có băng ở vị trí 1500 bp so
với thang chuẩn. Tiếp tục phân tích PCR-nifH rRNA với cặp mồi đặc hiệu

PolF-115 và PolR-476 để nhận diện Pseudomonas có đoạn gen nifH , đã
phát hiện 32/55 dòng vi khuẩn có băng tương ứng 361 bp so với thang
chuẩn.
Chọn 20 trong số 32 dòng vi khuẩn có đoạn gen nifH
để kiểm
chứng lại khả năng cố định nitơ và cả 20 dòng vi khuẩn đều biểu hiện hoạt
tính của nitrogenase thông qua phương pháp khử acetylene (ARA). Đánh
giá hiệu quả của 20 dòng vi khuẩn này lên chiều cao và trọng lượng khô
của cây lúa cao sản trồng trong dung dịch khoáng (không sử dụng đạm)
trong 20 ngày.
Kết quả giải trình tự DNA và so sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI
cho thấy cả 4 dòng này đều tương đồng di truyền 98-99% so với
Pseudomonas stutzeri, 7 dòng này đều tương đồng di truyền 97-100% so
với các loài thuộc giống Burkholderia.
Thí nghiệm ngoài đồng được thực hiện để đánh giá khả năng cố
định đạm của 4 dòng vi khuẩn P. stutzeri PS1 (TG1), P. stutzeri PS4 (BT1),
B. vietnamiensis BV3 (KG1) và B. vietnamiensis BV5 (CT1). Kết quả cho
thấy từng dòng vi khuẩn P. stutzeri PS4 và B. vietnamiensis BV3 đều cung
cấp đến 50% đạm sinh học trong khi dòng P. stutzeri PS1 và B.
vietnamiensis BV5 chỉ cung cấp được 25% nhu cầu đạm sinh học cho sự
phát triển của cây lúa cao sản.
Từ khóa: Burkholderia vietnamiensis, cố định đạm sinh học, đất phù sa,
đất vùng rễ, gen nif, lúa cao sản, Pseudomonas stutzeri
3

SUMMARY
The aim of this study was isolation and selection Pseudomonas spp.
strains with the high biological nitrogen fixation (BNF) ability to apply to
high-yielding rice cultivated on the soil of the Mekong Delta. The results
achieved as follows:

One hundred and fifty isolates were isolated from 130 soil samples
(rice rhizosphere soils of 13 provinces in Mekong Delta). All of them were
able to synthesize NH
4
+
, 86/150 isolates synthesized NH
4
+
higher than 5
mg/l.
The effective isolates (high NH
4
+
biosynthesis) were analysed by PCR-
16S rRNA technique with primers FGPS4-281bis and FGPS1509'-153 to
identify Pseudomonas spp. The results showed that 55/86 isolates having
band at 1500 bp in comparision to standard ladder; 32/55 isolates were
determined nifH gene with PCR technique with specific primer PolF-115
and PolR-476 which had band at 361 bp in electrophoresis gel.
Twenty isolates in 32 isolates had high nitrogenase activity through
ARA method. Screening of 20 isolates by evaluation of 20 isolates’s
effectiveness on rice cultivated mineral solution free N in 20 days (in-
vitro), the results showed that six isolates having high BNF ability
manifested on height and dry weight of high-yielding rice.
The results showed that four isolates were similarity of 98-99% with P.
stutzeri. Besides that, seven isolates were further sequenced with DNA
from PCR-16S rRNA products, the results showed that all of them were 97-
100% similarity with species of the genus Burkholderia.
The results of a field experiment showed that PS4 strain and/or BV3
strain had biological nitrogen fixation ability equivalent to 50% inorganic

fertilizer while two strains (PS1 and/or BV5) only provided 25% nitrogen
requirement for rice growth.

Keywords: alluvial soil, biological nitrogen fixation, Burkholderia
vietnamiensis, high-yielding rice, nif gene, Pseudomonas stutzeri,
rhizosphere soil


4

CHƯƠNG I
MỞ ĐẦU - TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Đồng bằng sông Cửu Long có diện tích gần 4 triệu ha, trong đó có
1,7 triệu ha đất nông nghiệp được sử dụng để trồng lúa với diện tích canh
tác lúa hàng năm lên đến 3,9 triệu ha. Phân bón nói chung và phân đạm hoá
học nói riêng đã góp phần quan trọng trong việc gia tăng năng suất cây
trồng. Để đảm bảo năng suất, nông dân đã s
ử dụng rất nhiều phân bón
nhưng hiện nay giá cả phân bón hóa học ngày càng tăng cao làm tăng giá
thành sản xuất và giảm hiệu quả kinh tế trong nông nghiệp, đồng thời không
đảm bảo cho một hệ sinh thái phát triển bền vững.
Việc nghiên cứu ứng dụng các chủng vi khuẩn có khả năng cố định
đạm hữu hiệu bón cho cây lúa ở đồng bằng sông Cửu Long mang tính cấp
thiết nhằm góp phần giảm sử
dụng phân đạm hóa học cho cây lúa nhưng
vẫn giữ vững năng suất, bảo vệ môi trường và góp phần đảm bảo cho sự
phát triển nông nghiệp bền vững trong khu vực. Do đó, đề tài của nghiên
cứu sinh được thực hiện nhằm nhận diện và xác định được những dòng
Pseudomonas spp. có khả năng cố định đạm hữu hiệu trên cây lúa cao sản.

1.2. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu
1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu
- Mục tiêu chính: Chọn lọc được một số dòng vi khuẩn
Pseudomonas spp. mang gen nif có khả năng cố định đạm hữu
hiệu, cung cấp 25-50% nhu cầu đạm cho quá trình sinh trưởng
và phát triển của cây lúa cao sản.
- Mục tiêu cụ thể: (1) Phân lập và tách ròng các dòng
Pseudomonas bản địa có trong đất vùng rễ lúa ở đồng bằng
sông Cửu Long làm nguồn vi khuẩn cố định đạm với cây lúa
cao sả
n; (2) Khảo sát đặc điểm, khả năng cố định đạm sinh học
và nhận diện vi khuẩn Pseudomonas trên các mức độ hình thái,
hóa sinh và sinh học phân tử (DNA); (3) Đánh giá hiệu quả cố
định đạm của các dòng vi khuẩn với cây lúa cao sản ở mức độ
in-vitro cho đến nhà lưới và ngoài đồng ruộng.
1.2.2. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Phân lập vi khuẩn Pseudomonas spp. từ đất vùng rễ lúa ở đồng
b
ằng sông Cửu Long dựa trên môi trường chuyên biệt, đồng
5

thời kiểm tra và nhận diện các dòng vi khuẩn bằng các phương
pháp hóa sinh và phương pháp sinh học phân tử.
- Xác định sự hiện diện gen nif và đánh giá khả năng cố định
đạm của các dòng vi khuẩn Pseudomonas spp. đã phân lập
được.
- Chọn lọc các dòng vi khuẩn Pseudomonas spp. dựa trên cơ sở
các thí nghiệm in-vitro và trong nhà lưới để tiến hành xác định
hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩ
n trên cây lúa cao

sản trồng ở ngoài đồng.
1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của đề tài: các dòng vi khuẩn Pseudomonas
spp. có khả năng cố định đạm với cây lúa cao sản.
Phạm vi nghiên cứu: các dòng vi khuẩn Pseudomonas spp. bản địa
được phân lập từ đất vùng rễ lúa trồng ở 13 tỉnh thành đồng bằng sông Cửu
Long, có mang gen nif và có khả năng cố định đạm hữu hiệ
u với cây lúa
cao sản trồng ở trên đất phù sa Nông trường Sông Hậu, huyện Cờ Đỏ, Cần
Thơ.
1.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
1.4.1. Thời gian nghiên cứu
- Quyết định công nhận Nghiên cứu sinh số 6919/QĐ-BGDĐT ngày
15/10/2008 của Bộ trưởng Bộ Giáo dục và Đào tạo.
- Thời gian đào tạo theo hệ không tập trung là 4 năm (11/2008 –
11/2012), theo Quyết định giao đề tài và người h
ướng dẫn Nghiên
cứu sinh số 468/QĐ-ĐHCT ngày 13/11/2008 của Hiệu Trưởng
trường Đại Học Cần Thơ. Thời gian nghiên cứu của nghiên cứu
sinh cho đến khi hoàn thành các nội dung nghiên cứu theo đề
cương của đề tài: 11/2008 – 9/2011.
1.4.2. Địa điểm nghiên cứu
- Các ruộng lúa được thu mẫu đất vùng rễ ở 13 tỉnh thành đồng bằng
sông Cửu Long.
- Các phòng thí nghiệm Sinh học tế bào, Vi sinh vật đất, Sinh họ
c
phân tử, Chuyên sâu và Nhà lưới thuộc một số Khoa, Viện của
trường Đại Học Cần Thơ.
6

- Ruộng lúa của ông Đào Văn Sơn, nông dân ở ấp 3, xã Thới Hưng
(Nông trường Sông Hậu), huyện Cờ Đỏ, TP. Cần Thơ.
1.5. Những đóng góp của luận án
- Phân lập được 150 dòng vi khuẩn từ đất vùng rễ lúa ở đồng bằng
sông Cửu Long. Tất cả 150 dòng vi khuẩn này đều có khả năng
tổng hợp NH
4
+
, góp phần tìm ra nguồn vi sinh vật cố định đạm sinh
học cung cấp cho cây lúa cao sản.
- Xác định được sự hiện diện của gen nifH ở 32 dòng vi khuẩn, trong
đó có 11 dòng vi khuẩn triển vọng được giải trình tự DNA, gồm có
4 dòng vi khuẩn được xác định tương đồng 98-99% với
Pseudomonas stutzeri, 5 dòng vi khuẩn được xác định tương đồng
98-100% với Burkholderia vietnamiensis và 2 dòng được xác định
tương đồng 97% với Burkholderia kururiensis, trong đ
ó có 1 dòng
còn tương đồng 97% với Burkholderia brasilense
- Có 4/6 dòng vi khuẩn triển vọng trong chậu được thí nghiệm chủng
cho cây lúa cao sản. Kết quả cho thấy từng dòng vi khuẩn P.
stutzeri PS4 (TG1) và B. vietnamiensis BV3 (KG1) đều có khả
năng cung cấp đến 50%N trong khi dòng P. stutzeri PS1 (BT1) và
B. vietnamiensis BV5 (CT1) đảm bảo được 25% nhu cầu đạm cho
sự phát triển của cây lúa cao sản.
1.6. Cơ sở lý luận và giả thuyết khoa học
- Đồng bằng sông Cử
u Long hiện đang trồng nhiều giống lúa cao sản
và những nghiên cứu gần đây cũng cho thấy có sự hiện diện của
Pseudomonas spp. ở vùng rễ của nhiều loại cây trồng trong đó có
cây lúa cao sản. Vì vậy, nghiên cứu về vi khuẩn Pseudomonas spp.

đang được quan tâm, đặc biệt là tìm hiểu về khả năng cố định đạm
với sự hiện diện của gen nifH ở các dòng vi khuẩ
n này.
- Giá thành phân hóa học trên thị trường hiện đang tăng cao là gánh
nặng cho nông dân, đồng thời việc sử dụng nhiều phân hóa học sẽ
dẫn đến ô nhiễm môi trường, không đảm bảo sự phát triển bền
vững, ảnh hưởng đến sự phát triển kinh tế xã hội. Do đó, nghiên
cứu và tuyển chọn các dòng vi khuẩn Pseudomonas spp. có khả
năng cố định đạm hữu hiệu, dễ nhân nuôi v
ới giá thành rẻ bón cho
cây lúa cao sản là hướng nghiên cứu cần thiết.

7

CHƯƠNG II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Cố định đạm sinh học
2.1.1. Khái quát về cố định đạm sinh học
Cố định đạm sinh học là quá trình khử N
2
thành NH
3
dưới sự xúc
tác của enzyme nitrogenase. Sau đó, NH
3
có thể kết hợp với các acid hữu
cơ để tạo thành các acid amin và protein. Vi khuẩn cố định đạm có thể cộng
sinh hoặc sống tự do nhưng cũng có thể nội sinh (Mattos và ctv., 2008).
2.1.2. Chu trình nitơ
Chu trình nitơ là quá trình biến đổi của nitơ trong sinh quyển, trong

đó nitơ xuất hiện dưới nhiều dạng tự do hay kết hợp (nitơ phân tử trong khí
quyển, các nitrit, nitrat, amoni, protein, acid amin ).
2.1.3. Vi khuẩn cố định đạm sống t
ự do
Vi khuẩn cố định đạm sống tự do ở vùng rễ lúa và những cây thuộc
họ hòa bản đã giúp cây trồng phát triển tốt cũng như hạn chế đến mức thấp
nhất lượng đạm hóa học trong nền sản xuất nông nghiệp (Kannaiyan,
1999).

Hình 2.1. Một số nguồn nitơ cung cấp cho cây
2.2. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas
2.2.1. Đặc điểm của Pseudomonas
Vi khuẩn Pseudomonas thường là vi khuẩn Gram âm, hình que. Có
chiên mao ở cực nên có khả năng lội tốt trong nước, không có khả năng tạo
8

bào tử. Pseudomonas là vi khuẩn sống tự do, chúng hiện diện khắp nơi như
trong đất, trong nước, thực vật, động vật, một số làm hư thực phẩm. Chúng
có khả năng hô hấp hiếu khí hay kỵ khí trong môi trường không có ôxi.
Nhiệt độ thuận lợi để chúng phát triển là 30 – 37
o
c.

Hình 2.2. Pseudomonas dưới kính hiển vi điện tử
(http:www.texbookofbacteriology.net/Pseudomonas.ect.html, ngày 19-9-
2009)
2.2.2. Phân loại Pseudomonas
Giống (chi) vi khuẩn Pseudomonas có hơn 140 loài, hầu hết thuộc
nhóm hoại sinh (Iglewski và Woods, 1983).
Yabuuchi và ctv. (1992) lần đầu tiên đã tìm ra giống Burkholderia

dựa vào việc phân tích di truyền rRNA nhóm II, trên cơ sở phân loại lại 2
loài Pseudomonas pickettii và Pseudomonas solanacearum được chuyển
đổi từ giống Ralstonia. Việc phân loại lại một số loài Pseudomonas và đ
ã
đặt lại tên những loài này là Burkholderia (Yabuuchi và ctv., 1995).
2.2.3. Những loài Pseudomonas có khả năng cố định đạm
Vi khuẩn Pseudomonas sp. phân bố rộng rãi và đa dạng nhiều
chủng loài (Rangarajan và ctv., 2001; 2002). Một số loài thuộc giống
Pseudomonas có khả năng cố định đạm đã được khẳng định từ lâu
(Krotzky và Werner, 1987; Chan và ctv., 1994), trong đó có Pseudomonas
stutzeri (Vermeiren, 1999).
Ngoài ra, Burkholderia vietnamiensis đã được xác định là loài có
khả năng cố
định đạm cho cây trồng nhờ hệ thống gen nif có khả năng tổng
hợp enzyme nitrogennase (Menard và ctv., 2007).
9

2.2.4. Phân lập và xác định Pseudomonas
Sử dụng môi trường đặc chủng Pseudomonas Isolation Agar
46,4g/l (Difco). Đồng thời, bằng kỹ thuật di truyền phân tích trình tự rRNA
ribô thể - Kỹ thuật PCR-16S-rRNA gen, Mirza và ctv. (2006) đã xây dựng
được cây di truyền của các nhóm loài Pseudomonas.
2.3. Cơ chế cố định đạm của Pseudomonas
2.3.1. Enzyme nitrogenase
Nitrogenase là một đa enzyme (phức hệ enzyme) xúc tác cho phản
ứng cố định N
2
, khử N
2
thành NH

3
. Enzyme nitrogenase được điều khiển
tổng hợp bởi một hệ thống gen nif có trong bộ genome của tế bào vi khuẩn.
2.3.2. Bộ gen (genome) của Pseudomonas và sự điều khiển tổng
hợp nitrogenase
Genome và hệ thống gen nif của Pseudomonas
Thông tin di truyền chuyên biệt về sự cố định đạm đã được xác
định trong bộ genome của Pseudomonas stutzeri A1501. Đó là “vùng cố
định đạm” (nitrogen fixation region) có kích thước 49kb, gồm 59 gen có
liên quan.
Thứ
tự của các gen nif trong cấu trúc của “vùng cố định đạm” ở
Pseudomonas stutzeri A1501 được khởi đầu là vùng PST1301, vùng giữa
lần lượt bao gồm các gen nifQ – nifB – nifA – nifL - nifY2 – nifHDKTY –
nifENX – nifUSV – nifWZM – nifF và vùng PST1360 ở đầu còn lại (Klipp
và ctv., 2004)
Sự điều khiển tổng hợp enzyme nitrogenase

Theo nghiên cứu của Yan và ctv. (2008), hệ thống của gen nif ở
Pseudomonas stutzeri A1501 là một hệ thống hoàn chỉnh gồm các loại gen
nif quy định tổng hợp các thành phần cấu tạo nên phức nitrogenase.

Hình 2.3. “Vùng cố định đạm” (nitrogen fixation region) của Pseudomonas
stutzeri A1501 (Yan và ctv., 2008)
10

2.3.3. Cơ chế cố định đạm
Trong thành phần cấu tạo nitrogenase, số nguyên tử Fe và nguyên
tử S có thể không ổn định với acid. Phân tử protein nhỏ hơn có chức năng
vận chuyển e–, trong đó e– của ferredoxin hoặc flavodoxin vận chuyển lên

phức hệ Mo-Fe.
2.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định đạm
Sự tổng hợp enzyme nitrogenase được điều khiển bởi enzyme
glutamate synthetase, xúc tác cho tổng hợ
p glutamin từ NH
3
. Nếu trong hệ
thống có ít NH
3
thì glutamate synthetase kích thích tổng hợp nitrogenase,
nồng độ NH
3
cao thì ức chế sự tổng hợp nitrogenase (Van và Sloger, 1981).
Phức hệ enzyme nitrogenase không bền khi có mặt oxy. Vi khuẩn
tự do cố định đạm chỉ thể hiện hoạt tính ở điều kiện yếm khí nhờ sử dụng
điện tử xuất hiện trong quá trình tổng hợp ATP để ngăn ngừa oxy xâm
nhập.
2.4. Ứng dụng cố định đạm của Pseudomonas
Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giớ
i đã phát hiện các nhóm vi
khuẩn có khả năng cố định đạm cho cây lúa giúp tăng năng suất cây trồng
từ 15-54% (Favilli và ctv., 1987; Omar và ctv., 1989). Ở Hy Lạp (mùa hè
1990) đã sử dụng phân đạm sinh học làm cho năng suất lúa tăng 15%-20%,
sản lượng của bắp, lúa mì, lúa mạch tăng 3%-54% so với những vụ đối
chứng không bón phân. Với những nghiên cứu chủng vi khuẩn cố định đạm
trên lúa mì ở Mexico làm cho năng suất t
ăng từ 23%-63% và 24%-43%
(Okon và Labandera-Gonzalez, 1994).
2.5. Vai trò của đạm đối với cây lúa
Cây trồng nói chung và cây lúa nói riêng đều sử dụng đạm dưới hai

dạng chủ yếu là ammonium (NH
4
+
) và nitrat (NO
3
-
) nhưng phổ biến là dạng
ammonium (NH
4
+
) (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008).
Tùy theo giai đoạn sinh trưởng của cây lúa mà cây có nhu cầu đạm
khác nhau. Ở các giai đoạn tăng trưởng thì đạm giúp cây tăng trưởng về
chiều cao, tạo chồi, đẻ nhánh, tăng số lá trên cây và tăng diện tích lá. Trong
cây lúa, đạm được tích lũy chủ yếu trong thân, lá và khi lúa trổ sẽ có
khoảng 48 – 71% đạm được đưa lên bông. Trong giai đoạn sinh sản, đạm
có vai trò trong việc tạo mầm hoa, tăng số hạt trên gié, t
ăng số gié trên
bông và còn giúp tăng số chồi hữu hiệu. Nếu thiếu đạm, cây sẽ thành lập
bông ngắn, ít hạt, hạt nhỏ hoặc hạt bị thoái hóa (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008).
11

CHƯƠNG III
NỘI DUNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục tiêu “Phân lập và xác định vi khuẩn
Pseudomonas spp. có mang gen nif cố định đạm hiện diện trong đất vùng rễ
lúa ở đồng bằng sông Cửu Long và chọn lọc các dòng Pseudomonas spp.
có độ hữu hiệu cao trên lúa cao sản”, các vấn đề đã được xây dựng cho quá
trình thực hiện đề tài bao gồm những nội dung nghiên cứu như

sau:
- Phân lập vi khuẩn Pseudomonas spp. từ đất quanh vùng rễ lúa
bằng môi trường nuôi cấy đặc hiệu và nhận diện chúng bằng
cặp mồi chuyên biệt dựa theo PCR-16S-rRNA.
- Đánh giá khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn để làm
cơ sở chọn lọc các dòng vi khuẩn hữu hiệu, đồng thời xác định
gen nif của các dòng vi khuẩn Pseudomonas spp. đã phân lập
được.
- Ch
ọn lọc các dòng vi khuẩn hữu hiệu dựa trên các kết quả thí
nghiệm về khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn trong
phòng thí nghiệm và nhà lưới, tiến hành kiểm tra và đánh giá
hiệu quả cố định đạm các dòng vi khuẩn Pseudomonas spp.
trên cây lúa cao sản trồng ngoài đồng.
3.2. Phương tiện nghiên cứu
3.2.1. Vật liệu
Mẫu đất vùng rễ lúa được thu ở 13 tỉnh, thành thuộc đồng bằng
sông Cử
u Long và giống lúa OM2517.
3.2.2 Dụng cụ và thiết bị: ở phòng thí nghiệm vi sinh vật đất và sinh học
phân tử
3.2.4. Các loại hóa chất và môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Môi trường Pseudomonas Isolation Agar 46.4g/l (Difco) (Mirza và
ctv., 2006); Môi trường Burk lỏng không đạm (Park và ctv., 2005)
Hóa chất trích DNA: Môi trường LB (Bennasar và ctv., 1998)
Các hóa chất trong phản ứng PCR
- Primer FGPS4-281bis Primer FGPS1509’-153 (Mirza và ctv., 2006)
12

- Cặp mồi xác định gen nifH là của Pseudomonas: PolF và PolR

(Mirza và ctv., 2006)
- Thiết kế cặp mồi nhận diện đoạn gen nifH của Pseudomonas
stutzeri A1501
Hóa chất dùng để điện di sản phẩm PCR

3.3. Phương pháp nghiên cứu
Thu mẫu đất vùng rễ lúa Thu mẫu đất vùng rễ lúa ở 13 tỉnh và thành
phố thuộc đồng bằng sông Cửu Long, (thu 10 mẫu đất ở 10 ruộng lúa khác
nhau ở mỗi tỉnh hoặc thành phố).
Phân lập vi khuẩn cố định đạm từ đất vùng rễ lúa: Trải mẫu; Làm
thuần, quan sát, mô tả đặc điểm khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn; Trữ m
ẫu ròng
Xác định khả năng cố định đạm (in-vitro) của vi khuẩn: Nuôi cấy
vi khuẩn trong môi trường Burk không đạm; Đo hàm lượng NH
4
+
bằng
phương pháp Phenol – Nitroprusside; Thử hoạt tính nitrogenase bằng
phương pháp khử acetylen (ARA)
Kiểm tra vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử: Tách
chiết DNA (Neumann và ctv., 1992); Khuếch đại DNA với các cặp mồi
nhận diện đoạn 16S rDNA, đoạn gen nifH của Pseudomonas và
Pseudomonas stutzeri A1501; Điện di các sản phẩm PCR; Chụp hình gel
điện di chứa sản phẩm phản ứng PCR ; Giải trình tự DNA và so sánh v
ới
ngân hàng dữ liệu NCBI
Đánh giá hiệu quả cố định đạm sinh học của các dòng vi khuẩn
với cây lúa cao sản: Ảnh hưởng của vi khuẩn lên cây lúa trồng trong ống
nghiệm với việc sử dụng dung dịch khoáng dành cho cây lúa (Kronzucker
và ctv., 1999); Hiệu quả của vi khuẩn cố định đạm với cây lúa cao sản

trồng trong chậu ở nhà lưới; Hiệu quả cố định đạm c
ủa vi khuẩn với cây
lúa ngoài đồng
Khảo sát mật số vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường lỏng
Thống kê, xử ký và phân tích số liệu: Sử dụng phần mềm
Microsoft office Excel 2003 và Minitab để thống kê, phân tích số liệu thu
được từ các kết quả thí nghiệm. Sử dụng phần mềm Blast N có trong ngân
hàng dữ liệu NCBI để so sánh tương đồng di truyền giữa các dòng vi
khuẩn. Dùng phần mềm BioEdit để so sánh trình tự DNA giữa các dòng vi
khuẩn và s
ử dụng phần mềm Mega 5.0 để xây dựng cây phả hệ.
13

CHƯƠNG IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả thu mẫu đất vùng rễ lúa
Mẫu đất vùng rễ lúa được thu nhiều đợt ở 13 tỉnh, thành thuộc
đồng bằng sông Cửu Long, mỗi tỉnh, thành thu 10 mẫu đất ở 10 ruộng lúa
khác nhau. Kết quả thu được 130 mẫu đất vùng rễ lúa ở 130 ruộng lúa phân
bố đều trong mỗi điểm.
4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn cố định
đạm
4.2.1. Các dòng vi khuẩn đã được phân lập
Có tất cả 150 dòng vi khuẩn được phân lập trong đất vùng rễ lúa
trên môi trường đặc hiệu Pseudomonas Isolation Agar (Difco) (Bảng 4.1).
Từ một mẫu đất có thể phân lập được từ 1 đến 2 dòng vi khuẩn dựa
vào màu sắc và hình dạng của khuẩn lạc.
Bảng 4.1. Các dòng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ lúa ở đồng bằng
sông Cửu Long
STT T

ỉnh/Thành phố Số lượng
mẫu đất
Số dòng
vi khuẩn
Ký hiệu
dòng vi khuẩn
1 Vĩnh Long 10 18 VL1 – VL18
2 Trà Vinh 10 10 TV1 – TV10
3 Bến Tre 10 10 BT1 – BT10
4 Tiền Giang 10 12 TG1 – TG12
5 Long An 10 11 LA1 – LA11
6 Sóc trăng 10 12 ST1 – ST12
7 Bạc Liêu 10 10 BL1 – BL10
8 Cà Mau 10 9 CM1 – CM9
9 Cần Thơ 10 10 CT1 – CT10
10 Đồng Tháp 10 9 ĐT1 – ĐT9
11 An Giang 10 12 AG1 – AG12
12 Kiên Giang 10 17 KG1 – KG17
13 Hậu Giang 10 10 HG1 – HG10
Tổng cộng 130 150
4.2.2. Đặc điểm của khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn
Thời gian trung bình để các dòng vi khuẩn phát triển thành khuẩn
lạc trên môi trường phân lập là 24 - 48 giờ. Đa số các dòng vi khuẩn phân
14

lập được có khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, có độ nổi mô, bìa nguyên;
một số khuẩn lạc có màu vàng, bìa răng cưa; kích thước khuẩn lạc từ 0,5-
1,5 mm. Về tế bào vi khuẩn, đa số chúng có dạng hình que ngắn (dài 1,5 –
2,4 μm), một số rất ít có hình que dài (dài 2,5 – 3,4 μm) (Bảng 4.2).
Bảng 4.2. Tỉ lệ phần trăm về các đặc điểm khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn

Đặc đ
iểm
khuẩn lạc
Các loại
Số lượng
Tỉ lệ
(%)
Có 20 13,3 Bao nhày
Không có 130 86,7
Trắng đục 80 53,3
Trắng trong 28 18,7
Vàng nhạt 24 16,0
Vàng đậm 17 11,3


Màu sắc
Xanh nhạt 1 0,7
Nguyên 147 98

Dạng bìa
Răng cưa 3 2
Mô 142 94,7
Độ nổi
Lài 8 5,3
Đặc điểm tế bào
vi khuẩn

Que ngắn 145 96,7 Hình dạng
Que dài 5 3,3
Khả năng

chuyển động
Có 150 100

* Một số hình dạng khuẩn lạc


Hình 4.1. Hình ảnh một số khuẩn lạc (Theo thứ tự từ trái qua phải là
các dòng vi khuẩn TG7, BL4 và LA7)
15

Những đặc điểm nổi bật về đặc điểm của khuẩn lạc và tế bào vi
khuẩn có chiên mao ở một cực phù hợp với những đặc điểm của nhóm vi
khuẩn Pseudomonas theo mô tả của Sikorski và ctv., (1999) và Lalucat và
ctv., (2006).



4.3. Kết quả đánh giá khả năng cố định đạm của vi khuẩn
4.3.1. Khả năng tổng hợp NH
4
+

Tất cả 150 dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp NH
4
+
, trong đó có
86/150 dòng có khả năng tổng hợp NH
4
+
tốt (trung bình từ 5 mg/l trở lên),

18/150 dòng có khả năng tổng hợp lượng NH
4
+
trung bình trên 10mg/l. Đặc
biệt, có 4 dòng có khả năng tổng hợp hàm lượng NH
4
+
trung bình rất cao
(trên 27mg/l) như 3 dòng từ Kiên Giang là KG8 (62,09 mg/l), KG1 (42,52
ml/l), KG14 (29,37 mg/l) và 1 dòng ở Cần Thơ là CT1 (27,12 mg/l).
Bảng 4.3. Bảng tổng hợp sự phát triển và khả năng tổng hợp NH
4
+
của các
dòng vi khuẩn trong môi trường Burk lỏng không đạm
Vi khuẩn phát triển trong
môi trường Burk lỏng
không đạm
Số dòng vi khuẩn tương ứng với mức
tổng hợp NH
4
+

Mật số Số dòng Mức <5 mg/l Mức >5 mg/l
(+)
<10
7
tế
bào/ml

88
(58,7%)

Có 49 dòng
Có 39 dòng
(có 5 dòng >10 mg/l và
không có dòng >25 mg/l)
(++), (+++)
≥10
7
tế
bào/ml
62
(41,3%)

Có 15 dòng
Có 47 dòng
(có 13 dòng >10 mg/l và
4 dòng >25 mg/l)

Tổng cộng

150

Có 64 dòng
(42,7%)
Có 86 dòng (57,3%)
(có 18 dòng >10 mg/l và
4 dòng >25 mg/l)
Chiên mao

Hình 4.2. Dòng VL2 được chụp
dưới kính hiển vi điện tử quét
JSM 5500 ở độ phóng đại 10000
lần
16

Qua kết quả về sự phát triển của các dòng vi khuẩn trong môi
tường Burk lỏng không đạm và khả năng tổng hợp NH
4
+
, có thể kết luận:
(1) Hầu hết những dòng vi khuẩn có khả năng phát triển trong môi
trường Burk lỏng không đạm đều có khả năng tổng hợp NH
4
+
;
(2) Những dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp NH
4
+
cao thường
phát triển tốt trong môi trường Burk lỏng không đạm, nhưng
cũng có những dòng phát triển tốt trong môi trường Burk lỏng
không đạm nhưng khả năng tổng hợp NH
4
+
cao không ổn định;
(3) Có một số ít dòng vi khuẩn phát triển phát triển không cao
(<10
7
tế bào/ml) trong môi trường Burk lỏng không đạm sau 2

ngày nuôi cấy nhưng lại có khả năng tổng hợp NH
4
+
hữu hiệu;
(4) Những dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp NH
4
+
cao hơn 25
mg/l đều là những dòng phát triển nhanh mật số trong 2 ngày
nuôi cấy (++ và +++) trong môi trường Burk lỏng không đạm.
4.3.2. Hoạt tính nitrogenase
Kết quả bảng 4.4 cũng cho thấy 2 dòng vi khuẩn có hoạt tính
nitrogenase cao nhất (TV5 và VL8) thì cũng có khả năng tổng hợp NH
4
+
cao
nhất sau 2 ngày nuôi cấy (TV5: 43,78 mg NH
4
+
/l; VL8: 37,86 mg NH
4
+
/l).
Bảng 4.4. Hàm lượng NH
4
+
(mg/l) và hàm lượng nitrogenase (mM) (đợt 1)
Hàm lượng NH
4
+

và nitrogenase sau 2 ngày nuôi cấy trong
môi trường Burk lỏng không đạm
Các dòng vi
khuẩn
Hàm lượng NH
4
+
(mg/l)
Hàm lượng nitrogenase
(mM)
LA4 6,32 e 0,236 bc
LA9 17,40 cd 0,238 ab
TG1 12,63 d 0,237 b
TG8 6,42 e 0,219 e
BT1 15,28 cd 0,237 b
BT2 3,41 e 0,195 f
TV5 43,78 a 0,239 a
VL2 5,97 e 0,226 d
VL3 20,59 c 0,236 bc
VL8 37,86 b 0,239 a
Đối chứng 0,02 f 0,001 g
Ghi chú: Các số liệu có cùng mẫu tự theo sau ở từng cột thì không khác biệt nhau
ở mức độ ý nghĩa 1%
17

Xét sự tương quan của dòng vi khuẩn CM1 có hoạt tính nitrogenase
thấp nhất với khả năng tổng hợp NH
4
+
ở ngày thứ hai thì dòng vi khuẩn này là

1 trong 5 dòng có khả năng tổng hợp NH
4
+
thấp nhất (HG4, CM1, ST7, BL5 và
ĐT9). Kết quả bảng 4.5 cũng cho thấy trong 9 dòng vi khuẩn có hoạt tính
nitrogenase cao (AG9, KG8, KG14, HG4, KG1, ST7, BL5, ĐT9 và CT1) chỉ
có 5 dòng có khả năng tổng hợp NH
4
+
cao (KG1, AG9, KG8, KG14 và CT1).
Bảng 4.5. Hàm lượng NH
4
+
(mg/l) và hàm lượng nitrogenase (mM) được
tổng hợp ở 10 dòng vi khuẩn sau 2 ngày nuôi cấy (đợt 2)
Hàm lượng NH
4
+
và nitrogenase sau 2 ngày nuôi cấy trong
môi trường Burk lỏng không đạm


Các dòng vi
khuẩn
Hàm lượng NH
4
+
(mg/l)
Hàm lượng nitrogenase
(mM)

ĐT9 6,34 d 0,237 ab
AG9 37,86 a 0,239 a
KG1 41,19 a 0,238 a
KG8 29,68 b 0,239 a
KG14 26,59 bc 0,239 a
HG4 8,94 d 0,239 a
ST7 8,40 d 0,238 a
BL5 7,93 d 0,238 a
CM1 8,94 d 0,234 b
CT1 19,80 c 0,237 ab
Đối chứng 0,02 e 0,001 c
Ghi chú: Các số liệu có cùng mẫu tự theo sau ở từng cột thì không khác biệt nhau
ở mức độ ý nghĩa 1%
Tóm lại, từ kết quả bảng 4.4 và 4.5 cho thấy cả 20 dòng vi khuẩn tổng
hợp NH
4
+
cao đều có khả năng khử acetylen theo phương pháp ARA, cho thấy
20/20 dòng vi khuẩn đều thể hiện hoạt tính nitrogenase. Điều này cũng phù
hợp với kết quả tổng hợp NH
4
+
cao của 20 dòng vi khuẩn trên. Vi khuẩn cố
định đạm là những dòng vi khuẩn có gen nifH quy định tổng hợp nitrogenase
và hoạt tính của enzyme này. Tuy nhiên, sự cố định đạm sinh học có hiệu quả
hay không còn tùy thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, bao gồm cả những yếu tố
di truyền bên trong tế bào (hệ thống gen nif và các gen hỗ trợ) (Xie, 2006;
Lalucat và ctv., 2006; Yan và ctv., 2008) và các yếu tố môi trường (Van và
Sloger, 1981).
4.4. Kiểm tra vi khuẩn bằng phương pháp sinh họ

c phân tử
4.4.1. Nhận diện các dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR
18

Chọn 86 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp NH
4
+
cao (>5 mg/l)
khuếch đại đoạn 1500 bp của vùng 16S rDNA của Pseudomonas. Kết quả
điện di được thể hiện trên gel agarose 1%, có 55/86 dòng vi khuẩn có băng
ở vị trí 1500bp so với thang chuẩn. Vậy có 55/86 dòng phân lập thuộc
nhóm Pseudomonas qua sự thể hiện băng ở vị trí 1500 bp. (Hình 4.3).

Hình 4.3. Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của các dòng vi khuẩn
Pseudomonas với cặp mồi FGPS4-281bis và FGPS1509’-153 (M: thang chuẩn 100bp plus)
Khuếch đại đoạn từ 115 đến 476 của gen nifH ở Pseudomonas
bằng cặp mồi đặc chủng PolF-115 và PolR-476. Kết quả đại diện ở hình 4.4
cho thấy 32 dòng có băng ở vị trí khoảng 360 bp theo thang chuẩn, tương
ứng với đoạn gen nifH thuộc nhóm Pseudomonas, phù hợp với kết quả
nghiên cứu mà Mirza và ctv. (2006) và Poly và ctv. (2001) đã báo cáo. Kết
quả trên đã chứng minh rằng 32 dòng vi khu
ẩn có băng ở 360 bp đều thuộc
nhóm Pseudomonas có mang gen nifH.


Hình 4.4. Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của các dòng
vi khuẩn với cặp mồi PolF và PolR xác định đoạn gen nifH ỏ vi trí 115-476
(Thang chuẩn 100bp)

Sau đó, tiếp tục chọn 11 dòng vi khuẩn (bao gồm 6 dòng hiệu quả

với cây lúa trồng trong chậu và 5 dòng khác cũng có triển vọng cố định
đạm cao) để khuếch đại đoạn ở vị trí 5-580 của gen nifH ở Pseudomonas
stutzeri A1501 b
ằng cặp mồi đặc chủng PST3422-5 và PST3422-580. Kết
quả hình 4.7 cho thấy 4 dòng TG1, BT1, BT2 và AG9 có băng tương ứng ở
M LA1 LA2 LA9 TG1 TG8 TG9 TG12 BT1 BT2 BT10 TV2 TV4 TV5 TV10 VL2
1000bp
500bp
1500bp
M LA9 TG1 BT1 VL2 ĐT9 AG9 KG1 KG14 ST7 CM1 CT1
500bp
19

vị trí 575 bp so với thang chuẩn và tương đồng với băng của dòng đối
chứng Pseudomonas stutzeri A1501.

Hình 4.5. Phổ điện di của sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của 5
dòng P. stutzeri A1501, TG1, AG9, BT2 và BT1
Ghi chú: 1: dòng P. stutzeri A1501; 2: dòng TG1; 3: dòng AG9; 4:
dòng BT2; 5: dòng BT1; 6: thang chuẩn 100 bp plus
4.4.2. Giải trình tự DNA và so sánh với ngân hàng dữ liệu
NCBI
Sản phẩm PCR (với cặp mồi PST3422-5 và PST3422-580) của 4
dòng vi khuẩn TG1, BT1, BT2 và AG9 cùng với dòng đối chứng
Pseudomonas stutzeri A1501 được sử dụng để giải trình tự DNA và sử
dụng phần mềm Blast N để so sánh với trình t
ự DNA của các dòng vi
khuẩn có trong ngân hàng dữ liệu NCBI. Kết quả cho thấy dòng TG1 và
BT1 tương đồng di truyền 98%, dòng AG9 và BT2 tương đồng di truyền
99% so với Pseudomonas stutzeri A1501 (CP000304.1) và Pseudomonas

stutzeri ATCC 17588 (CP002881.1) có trong ngân hàng dữ liệu NCBI. Vì
vậy, đề nghị đặt tên cho 4 dòng vi khuẩn này như sau:
Dòng TG1: Pseudomonas stutzeri PS1;
Dòng AG9: Pseudomonas stutzeri PS2
Dòng BT2: Pseudomonas stutzeri PS3;
Dòng BT1: Pseudomonas stutzeri PS4
Ngoài ra, dòng đối chứng P. stutzeri A1501 được ký hiệu là PS5
So sánh trình tự DNA cũng cho thấy trong số 575 base nucleotide
của gen nifH của 5 dòng P. stutzeri, hai dòng PS1 (TG1) và PS3 (BT2) chỉ
khác nhau ở
3 vị trí nên có tương quan di truyền gần nhau và hình thành
một nhánh. Trong khi đó, PS4 (BT1) chỉ khác PS2 (AG9) và PS5
575 b
p

1000 b
p
1 2 3 4 5 6
500 b
p
20

(Pseudomonas stutzeri A1501) ở 8 vị trí nên cũng có tương quan di truyền
gần nhau và cùng chung trong một nhánh của cây phả hệ (hình 4.6).

PS2_DH2c
PS5_A1501
PS4_N2c_CAM
PS1_18f
PS3_17i

88
73
0.001

Hình 4.6. Cây phả hệ (phylogenetic tree) trình bày mối quan hệ về mặt di
truyền giữa 4 dòng vi khuẩn với dòng chuẩn P. stutzeri A1501
Tiếp tục sử dụng sản phẩm PCR từ cặp mồi FGPS4-281bis và
FGPS1509’-153 để giải trình tự DNA của 7 dòng vi khuẩn có triển
vọng và so sánh với các dòng vi khuẩn có trong GenBank. Kết quả
cho thấy cả 7 dòng vi khuẩn này đều tương đồng di truyền 97-100%
so với các loài thuộc giống Burkholderia, trong đó có dòng VL2,
VL8, CT1, KG1 và KG14 tương đồng di truyền 98-100% với
Burkholderia vietnamiensis, dòng CM1 và KG8 tương đồng di
truyền 97% với Burkholderia kururiensis. Ngoài ra, dòng KG8 còn
tương đồng di truyề
n 97% với Burkholderia brasilensis.
Căn cứ vào sự tương đồng di truyền, đề nghị đặt tên cho các dòng
vi khuẩn như sau:
- Dòng vi khuẩn VL2: Burkholderia vietnamiensis BV1
- Dòng vi khuẩn VL8: Burkholderia vietnamiensis BV2
- Dòng vi khuẩn KG1: Burkholderia vietnamiensis BV3
- Dòng KG14: Burkholderia vietnamiensis BV4
- Dòng vi khuẩn CT1: Burkholderia vietnamiensis BV5
- Dòng vi khuẩn KG8: Burkholderia kururiensis BK1
- Dòng vi khuẩn CM1: Burkholderia kururiensis BK2
21

4.5. Hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn với cây lúa cao sản
4.5.1. Ảnh hưởng của vi khuẩn với cây lúa trồng trong ống
nghiệm

Xem xét kết hợp các kết quả về khả năng tổng hợp NH
4
+
, ARA,
ảnh hưởng lên chiều cao và trọng lượng cây lúa thì các dòng vi khuẩn P.
stutzeri PS4, B. vietnamiensis BV3, B. vietnamiensis BV5, P. stutzeri PS1,
B. vietnamiensis BV1 và P. stutzeri PS2 có độ hữu hiệu cao hơn các dòng
vi khuẩn khác.
Bảng 4.6. Hiệu quả của 20 dòng vi khuẩn lên chiều cao và trọng lượng khô cây lúa
ở giai đoạn 20 ngày tuổi
Cây lúa 20 ngày trong ống nghiệm

Dòng vi khuẩn
Chiều cao cây lúa
(cm)
Trọng lượng khô cây lúa
(g/cây)
LA4 10,3 hi 0,10 gh
LA9 7,7 l 0,09 h
PS1 (TG1) 13,0 cde 0,19 ab
TG8 9,3 ijkl 0,11 fgh
PS4 (BT1) 15,1 ab 0,15 de
PS3 (BT2) 11,3 fgh 0,14 ef
TV5 9,3 ijkl 0,09 h
BV1 (VL2) 13,5 bcd 0,15 de
VL3 8,6 jkl 0,09 h
BV2 (VL8) 12,1 def 0,16 abcd
ĐT9 10,4 ghi 0,10 h
PS2 (AG9) 12,0 defg 0,15 cde
BV3 (KG1) 14,8 ab 0,18 abcd

BK1 (KG8) 10,3 hi 0,10 gh
BV4 (KG14) 13,9 bc 0,13 efg
HG4 11,4 efgh 0,15 de
ST7 7,9 kl 0,10 gh
BL5 9,4 ijk 0,14 de
BK2 (CM1) 10,1 hij 0,16 abcd
BV5 (CT1) 14,3 abc 0,19 a
ĐC âm
8,1 kl 0,08 h
ĐC dương 15,8 a 0,17 abcd
CV(%) 5,61 9,16
Ghi chú: Các số liệu có cùng mẫu tự theo sau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa
1%
22

4.5.2. Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn với cây lúa thí
nghiệm trong chậu
Theo bảng 4.7, căn cứ vào các thành phần năng suất và năng suất
lúa trồng trong chậu, có thể thấy rằng dòng vi khuẩn BV3 có khả năng cung
cấp 75% nhu cầu đạm cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa
trồng trong chậu, dòng vi khuẩn PS1, PS4, BV5 có thể đảm bảo 50% nhu
cầu đạm cho cây lúa, trong khi dòng BV1 và PS2 chỉ đảm bảo 25%N.
Bảng 4.7. Hiệu quả của 6 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học trên chiều cao cây,
số bông/chậu, trọng lượng 1000 hột và năng suất lúa cao sản (trọng lượng hột –
g/chậu) ở thí nghiệm trong chậu
STT Nghiệm
thức
Chiều cao cây
(cm)
Số

bông/chậu
TL 1000 hột
(gam)
TL hột
(g/chậu)
PS1-0%N 72,6 defghi 11,7 abc 22,20 b 6,95 gh
PS1-25%N 70,8 efghi 10,6 cd 22,33 ab 9,70 ef
PS1-50%N
76,7 abcd 10,0 cd 23,26 ab 13,01 bc
1
2
3
4
PS1-75%N
75,0 bcdef 13,0 ab 23,37 ab 13,65 abc
PS4-0%N 65,0 kl 10,0 cd 23,81 a 6,05 h
PS4-25%N 71,1 efghi 10,0 cd 23,61 ab 10,29 de
PS4-50%N
67,7 ijkl 11,0 bcd 23,64 ab 13,73 abc
5
6
7
8
PS4-75%N
70,9 efghi 11,3 abc 23,47 ab 14,06 abc
BV1-0%N 68,8 hijkl 11,0 bcd 22,23 b 6,41 gh
BV1-25%N 69,4 ghijk 12,0 bcd 22,33 ab 9,36 ef
BV1-50%N 78,8 ab 10,0 cd 23,23 ab 12,10 cd
9
10

11
12
BV1-75%N
81,5 a 13,0 ab 23,37 ab 13,66 abc
BV5-0%N 74,0 bcdefg 10,3 cd 22,23 b 6,12 h
BV5-25%N 77,7 abc 12,0 abc 22,33 ab 10,18 def
BV5-50%N
75,6 bcde 11,0 bcd 23,26 ab 13,16 bc
13
14
15
16
BV5-75%N
73,4 cdefgh 11,3 abc 23,40 ab 13,28 abc
BV3-0%N 65,7 jkl 9,0 de 23,40 ab 8,22 fg
BV3-25%N
71,3 efghi 12,0 abc 23,81 a 12,90 bc
BV3-50%N
67,8 ijkl 12,0 abc 23,16 ab 14,69 ab
17
18
19
20
BV3-75%N
78,5 ab 13,3 a 23,76 a 15,21 ab
PS2-0%N 68,4 hijkl 10,3 cd 23,26 ab 5,26 h
PS2-25%N 71,9 defghi 9,0 de 23,26 ab 9,60 ef
PS2-50%N 70,1 fghij 12,0 abc 23,46 ab 10,84 de
21
22

23
24
PS2-75%N
75,2 bcdef 13,0 ab 23,17 ab 13,31 abc
25 ĐC âm 64,2 l 7,3 e 23,08 ab 5,06 h
26 ĐC dương 73,2 cdefgh 13,3 a 23,37 ab 13,17 bc
CV (%) 2,30 5,76 1,49 6,09
Ghi chú: Các số liệu có cùng mẫu tự theo sau (ở cùng 1 cột) thì không khác biệt
nhau ở mức ý nghĩa 1%
23

4.5.3. Hiệu quả cố định đạm với cây lúa thí nghiệm ngoài đồng
Kết quả từ bảng 4.8 cho thấy nghiệm thức BV3-50%N và 75%N
(chủng B. vietmaniensis BV3 kết hợp bón 50%N và 75%N) đều có chiều cao
cây, số bông/m
2
, số hột chắc/bông và trọng lượng 1000 hột cao tương đương
và khác biệt không có ý nghĩa so với đối chứng dương; ý nghĩa này cũng thể
hiện ở nghiệm thức PS4-75%N và PS1-75%N.
Bảng 4.8. Hiệu quả của 4 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học trên chiều cao cây và
thành phần năng suất lúa cao sản (OM2517) trồng trên đất phù sa Nông trường Sông
Hậu, huyện Cờ Đỏ, Cần Thơ (vụ Hè Thu 2011)
Nghiệm thức Chiều cao
cây lúa
(cm)
Số bông/m
2
Số hột
chắc/bông
Trọng lượng

1000 hột
(g)
BV5-0%N 81,8 e 400,0 bcde 61,3 d 23,4 ab
BV5-50%N 87,0 cd 426,7 abc 62,7 d 23,6 ab
BV5-75%N 89,7 abc 456,7 a 62,7 d 23,3 ab
BV3-0%N 90,9 abc 356,7 f 69,3 ab 23,5 ab
BV3-50%N 93,5 a 420,0 abcd 69,4 ab 23,3 ab
BV3-75%N 93,7 a 456,7 a 71,3 ab 23,9 a
PS4-0%N 84,5 de 380,0 ef 63,7 cd 23,9 a
PS4-50%N 90,0 abc 430,0 ab 63,3 d 23,8 ab
PS4-75%N 92,0 ab 420,0 abcd 69,3 ab 23,6 ab
PS1-0%N 88,0 bcd 353,3 f 67,7 bc 22,4 b
PS1-50%N 90,2 abc 386,7 def 72,3 a 23,4 ab
PS1-75%N 87,6 bcd 390,0 cdef 72,2 a 23,5 ab
NT-0%N
80,2 e 313,3 g 54,7 e 23,2 ab
NT-100%N
90,2 abc 390,0 cdef 72,6 a 23,4 ab
CV (%) 2,86
5,93 3,70
2,81

Ghi chú:
NT-0: Nghiệm thức đối chứng âm, không chủng vi khuẩn và không N
NT100: đối chứng dương, không chủng vi khuẩn nhưng có bón 100%N
BV5: vi khuẩn B. vietnamiensis BV5; BV3: vi khuẩn B. vietnamiensis BV3
PS1: vi khuẩn P. stutzeri PS1; PS4: vi khuẩn P. stutzeri PS4
100%N = 90 kgN/ha
Số liệu có cùng mẫu tự theo sau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa 1%
24

Hình 4.7. Ruộng lúa thí nghiệm tại Nông trường Sông Hậu (trái) và các bụi lúa ở
các nghiệm thức chủng P. stutzeri PS4 (phải) được 89 ngày sau khi gieo sạ (trước
khi thu hoạch 1 ngày).
Ghi chú:
NT-0: đối chứng âm, không chủng vi khuẩn và không bón phân đạm
NT100: đối chứng dương, không chủng vi khuẩn, bón 100% phân đạm
PS4-0: nghiệm thức chủng P. stutzeri PS4, không bón đạm
PS4-50: nghiệm thức chủng P. stutzeri PS4, bón 50% đạm
PS4-75: nghiệm thức chủng P. stutzeri PS4, bón 75% đạm
Nhìn chung, kết quả các yếu tố chiều cao cây lúa, số bông/m
2
, số hột
chắc/bông và hàm lượng protein trong gạo của hầu hết các nghiệm thức đều
cao hơn và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng âm (NT-0: không chủng vi
khuẩn, 0%N). Như vậy, 4 dòng vi khuẩn B. vietnamiensis BV3, B.
vietnamiensis BV5, P. stutzeri PS1 và P. stutzeri PS4 đều có khả năng cố định
đạm sinh học cung cấp cho nhu cầu đạm trong quá trình sinh trưởng và phát
triển của cây lúa cao sản (OM2517) trồng trên đất phù sa Nông trường Sông
Hậu.
Hiệu quả củ
a các dòng vi khuẩn cố định đạm lên năng suất lúa
Kết quả ở hình 4.8 cho thấy năng suất lúa ở các nghiệm thức BV3-
50%N và 75%N, PS4-50%N và 75%N, BV5-75%N và PS1-75%N tương
đương và khác biệt không có ý nghĩa so với đối chứng dương (8,883 tấn/ha).
Như vậy, dòng vi khuẩn BV3 và PS4 có thể cung cấp 50% nhu cầu đạm sinh
học cho quá trình trình trưởng và phát triển của cây lúa (giảm chi phí mua
22,5-45 kg N/ha, tương đương 48,9-97,8 kg urea/ha), trong khi dòng vi khuẩn
BV5 và PS1 chỉ đảm bảo được 25% cho nhu cầu

đạm của cây lúa (giảm chi
chí cho 22,5 kgN/ha, tương đương 48,9 kg urea/ha) để đạt năng suất như đối
chứng dương (NT-100: bón 90 kgN/ha, tương đương 195,6 kg urea/ha).

NT-0 PS4-0 PS4-50 PS4-75 NT100
Các nghiệm thức thí nghiệm với cây lúa
cao sản OM2517, sạ ngày 18/3/2011