Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học cây diếp cá suối Gymnotheca Chinensis Decne và lá thành ngạnh trơn Cratoxylum cochinchinense (Lour.) Blume ở Việt Nam

Bộ giáo dục và đào tạo

Viện khoa học
và công nghệ việt nam

Viện hoá học các hợp chất thiên nhiên



H
HH
Hà
à à
à V
VV
Việt
iệt iệt
iệt Sơn
SơnSơn
Sơn






Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học cây
diếp cá suối
Gymnotheca chinensis
Decne. và lá Thành

ngạnh trơn
Cratoxylum cochinchinense
(Lour.) Blume
ở việt nam


Chuyên ngành: Hoá học các hợp chất thiên nhiên
Mã số: 62.44.27.02




Tóm tắt Luận án tiến sĩ hoá học

Hà Nội 2008


Công trình đợc hoàn thành tại: Viện hoá học các hợp chất thiên
nhiên, Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam


Ngời hớng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Hoàng Thanh Hơng
2. PGS.TS. Nguyễn Hữu Khôi

Phản biện 1: GS. TSKH Phạm Trơng Thị Thọ, Viện Dợc liệu
Phản biện 2: PGS. TS Nguyễn Văn Đậu, ĐH KHTN - ĐHQG Hà Nội
Phản biện 3: GS. TSKH Trần Công Khánh, ĐH Dợc Hà Nội



Luận án sẽ đợc bảo vệ trớc Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nớc
họp tại Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt
Vào 9 giờ 00 ngày 22 tháng 1 năm 2009



Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Th viện Quốc Gia Hà Nội
- Th viện Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên,

Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam

Danh mục các công trình khoa học đã công bố

1. Hà Việt Sơn, Hoàng Thanh Hơng, Cầm Thị ính, Hà Việt Hải, Ametava Das (2005),
Thăm dò ảnh hởng của phân đoạn polyphenol chiết xuất từ lá Thành ngạnh trơn
(Cratoxylon cochinchinense) lên sự đáp ứng chuyển dạng lympho bào, Tạp chí Khoa
học và Công nghệ, Tập 43, số 6A, tr. 110-113
2. Hoàng Thanh Hơng, Cầm Thị ính, Hà Việt Sơn (2006), Khảo sát phần dịch chiết etyl
axetat của lá Thành ngạnh trơn Cratoxylon cochinchinense (Lour.) Blume, Tạp chí Hoá
học, T44, số 1, tr. 71-75
3. Hà Việt Sơn, Hoàng Thanh Hơng, Nguyễn Hữu Khôi (2007), Các hợp chất phenolic từ
cây diếp cá suối Gymnotheca chinensis Decne, Tạp chí Dợc học, số 379, tr. 25-28.
4. Hoàng Thanh Hơng, Hà Việt Sơn, Nguyễn Hữu Khôi (2007), Một số hợp chất glycozit
phân lập đợc từ cây diếp cá Suối Gymnotheca chinensis Decne. (Saururaceae), Tuyển
tập công trình Hội nghị hoá học hữu cơ toàn quốc năm 2007, tr. 391-396
5. Hà Việt Sơn, Hoàng Thanh Hơng, Nguyễn Hữu Khôi, Trần Thị Hiếu (2007), Một số
chất triterpen phân lập đợc trong phần chiết có hoạt tính chống viêm điều chế từ cây
diếp cá suối (Gymnotheca chinensis Decne.), Tuyển tập công trình Hội nghị hoá sinh y
dợc năm 2007, tr.191-195
6. Hà Việt Sơn, Hoàng Thanh Hơng, Nguyễn Hữu Khôi (2007), Khảo sát hoạt tính kháng
viêm trên thực nghiệm và ảnh hởng lên hoạt động cathepsin máu ngời của phần chiết
ethylacetate từ cây thành ngạnh trơn Cratoxylon cochinchinense (Lour.) Blume, Tuyển
tập công trình Hội nghị hoá sinh y dợc năm 2007, 187-190.
7. Ha Viet Son, Hoang Thanh Huong, Nguyen Huu Khoi (2007), Xanthone derivatives
from Cratoxylon cochinchinense, International Workshop on Herbal Medicinal Plants
and Traditional Herb Remedies, Hanoi, 20-21 September 2007.
8. Hà Việt Sơn, Hoàng Thanh Hơng, Nguyễn Hữu Khôi (2008), Nghiên cứu hoá học và
hoạt tính sinh học cây diếp cá suối Gymnotheca chinensis Decne (Saururaceae), Tạp chí
Hoá học, Tập 46, số 2, tr. 138-141.

9. Hà Việt Sơn, Hoàng Thanh Hơng, Nguyễn Hữu Khôi, Cầm Thị ính (2008), Hợp chất
biflavonoid từ lá thành ngạnh trơn Cratoxylon cochinchinense (Lour.) Blume, Tạp chí
Dợc học, số 387, tr.35-37.

1

A. Khái quát chung về luận án
1. Đặt vấn đề
Giá trị của các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học không chỉ
ở công dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh, mà còn vì chúng có thể dùng làm
các nguyên mẫu hoặc các cấu trúc dẫn đờng cho sự phát hiện và phát triển
nhiều dợc phẩm mới. Thực vật bậc cao luôn là nhóm đối tợng đặc biệt
quan trọng trong nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học cao do sự đa
dạng sinh học và hoá học của chúng. Điều này đặc biệt có ý nghĩa với Việt
Nam, một nớc có nguồn tài nguyên dợc liệu phong phú và nhiều kinh
nghiệm trong việc dùng thuốc thảo mộc. Nghiên cứu hoá học theo định
hớng hoạt tính sinh học là con đờng ngắn và hiệu quả nhất để tìm kiếm các
hoạt chất từ nguồn tài nguyên tái tạo này. Những năm gần đây, yếu tố phiên
mã NF-B thu hút đợc sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học do vai trò
sinh lý quan trọng của nó trong tế bào, do sự đa dạng trong các nhân tố kích
thích hoạt động của nó và sự liên quan trực tiếp tới cơ chế bệnh sinh của
nhiều loại bệnh bao gồm cả tim mạch, hô hấp, các bệnh tự miễn, các bệnh
viêm nhiễm và ung th. Các dợc liệu và các chất có khả năng ức chế hoạt
động của NF-B đã và đang trở thành một trong những đích quan trọng của
việc tìm kiếm thuốc điều trị nhiều loại bệnh, đặc biệt là các thuốc chống
viêm nhiễm, thuốc điều trị các bệnh tự miễn, thuốc sử dụng trong phòng và
điều trị ung th.
Dựa trên kết quả sàng lọc các cây thuốc có hoạt tính ức chế hoạt
động của NF-B và kinh nghiệm dân gian chúng tôi đã chọn hai cây diếp cá
suối Gymnotheca chinensis Decne. và thành ngạnh trơn (thành ngạnh nam)

Cratoxylum cochinchinense (Lour.) Blume là hai cây thuốc mọc hoang dại
có hoạt tính ức chế NFB và đợc sử dụng nhiều trong dân gian để điều trị
các bệnh nhiễm khuẩn, viêm cấp và mãn tính là đối tợng nghiên cứu nhằm
phát hiện hoạt chất và làm sáng tỏ cơ chế chống viêm của dợc liệu.
2. Nhiệm vụ của luận án bao gồm:
Điều chế và nghiên cứu hoá học các phần chiết chọn lọc của cây diếp cá
suối Gymnotheca chinensis Decne. và lá thành ngạnh trơn (thành ngạnh
nam) Cratoxylum cochinchinense (Lour.) Blume
Đánh giá hoạt tính ức chế NF-B in vitro của các phần chiết chọn lọc và
một số chất tinh khiết phân lập đợc.

2

Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của các phần chiết liên quan đến
hoạt tính ức chế NF-B nh tác dụng đáp ứng chuyển dạng lympho bào
in vitro và tác dụng kháng viêm in vivo
3. ý nghĩa khoa học, thực tiễn và những đóng góp mới của luận án
3.1 ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Góp phần giải thích tác dụng chữa bệnh trong dân gian của cây diếp cá suối
Gymnotheca chinensis Decne. và lá thành ngạnh trơn (thành ngạnh
nam) Cratoxylum cochinchinense Blume. Ngoài ra còn tạo cơ sở khoa học để
sử dụng chúng có hiệu quả và đóng góp vào hớng nghiên cứu thuốc gắn liền với
tác dụng ức chế hoạt động của yếu tố phiên mã NF-B.
3.2 Những đóng góp mới của luận án
Là công trình nghiên cứu đầu tiên về hoá học và hoạt tính sinh học của
cây diếp cá suối. Đã phân lập và xác định đợc cấu trúc của 14 chất,
trong đó có một chất mới là gymnothezit (GT3, 14) và một chất đã đợc
phát hiện từ sinh vật biển nhng lần đầu tiên tìm thấy ở thực vật trên đất
liền là curcudiol (GE7, 7).
Từ lá cây thành ngạnh trơn (thành ngạnh nam) đã tách và xác định đợc

cấu trúc 15 chất trong đó có hai chất mới là cratoxanton A (CE6, 20) và
cratoxanton B (CE7, 21). Ngoại trừ mangiferin (CT5, 29), các hợp chất
còn lại cũng lần đầu tiên đợc phân lập từ lá thành ngạnh trơn.
Đã sàng lọc các phần chiết theo định hớng kháng viêm trên cơ sở khảo
sát hoạt tính ức chế sự hoạt hoá NF- B in vitro của các phần chiết và
một số chất phân lập đợc từ hai cây dợc liệu.
Kết quả khảo sát một số tác dụng sinh học liên quan chặt chẽ đến hoạt
tính ức chế NF-B nh tác dụng ức chế chuyển dạng lympho bào in
vitro, tác dụng chống viêm cấp (viêm cơ đùi chuột bằng dextran), viêm
mãn (viêm gan do nhiễm độc CCl
4
) in vivo không chỉ lý giải tác dụng
chữa bệnh trong dân gian của dợc liệu mà còn làm sáng tỏ cơ chế
chống viêm của các phần chiết etylaxetat (GE & CE) đồng thời khẳng
định vai trò của NFB trong đáp ứng miễn dịch và đáp ứng viêm.
4. Bố cục của luận án
Luận án gồm 130 trang, có 17 bảng và 28 hình minh họa. Phần mở
đầu (2 trang), chơng 1: tổng quan tài liệu (30 trang), chơng 2: nguyên liệu
và phơng pháp nghiên cứu (4 trang), chơng 3: thực nghiệm (25 trang),

3

chơng 4: kết quả và thảo luận (55 trang), kết luận (2 trang). Danh mục các
công trình công bố liên quan đến luận án (1 trang). Tài liệu tham khảo 11
trang với 128 tài liệu trong và ngoài nớc. Phần phụ lục với 84 hình phổ.
B. nội dung của luận án
Mở đầu
Phần mở đầu trình bày lý do chọn đề tài, đối tợng nghiên cứu và ý nghĩa
khoa học và thực tiễn của luận án
Chơng 1. Tổng quan tài liệu

Phần tổng quan tài liệu tổng hợp các nghiên cứu trong nớc và quốc tế về:
Nghiên cứu phát triển thuốc chống viêm
Yếu tố phiên mã NF-B
Những nghiên cứu trớc đây về đối tợng nghiên cứu
Các hợp chất flavonoit
Các xanton
Chơng 2. Nguyên liệu và Phơng pháp nghiên cứu
2.1. Nguyên liệu nghiên cứu: toàn bộ phần trên mặt đất của cây
Gymnotheca chinensis Decne. đợc thu ở rừng Cúc Phơng, Ninh Bình
(tháng 1/2005). Lá thành ngạnh trơn (thành ngạnh nam) Cratoxylum
cochinchinense (Lour.) Blume thu hái ở xã Thạch Lâm, huyện Thạch Thành
(Thanh Hoá) tháng 6 năm 2005. Mẫu tiêu bản đợc kỹ s Vũ Văn Cần (trạm
nghiên cứu vờn Quốc gia Cúc Phơng) giám định tên khoa học và lu giữ
tại Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên.
2.2. Phơng pháp phân lập các hợp chất: Phần này trình bày các phơng pháp
áp dụng để phân lập các chất tinh khiết nh phân bố dung môi, sắc ký cột
2.3. Phơng pháp xác định cấu trúc các hợp chất: đã sử dụng các phơng
pháp phân tích hiện đại nh MS, UV, IR, 1D-NMR, 2D-NMR
2.4. Phơng pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học:
Nghiên cứu tác dụng ức chế NF-B in vitro theo phơng pháp Seap-
assay trên dòng tế bào RAW 264.7
Nghiên cứu ảnh hởng của các phần chiết lên sự đáp ứng chuyển
dạng lympho bào in vitro theo phơng pháp của Mancini
Nghiên cứu tác dụng chống viêm trên động vật thực nghiệm: tác
dụng chống viêm cơ, tác dụng chống viêm gan trên chuột bị nhiễm

4

độc CCl
4

, ảnh hởng của các phần chiết tới sự phát sinh lipit lạ ở thỏ
viêm gan
Phơng pháp xử lý số liệu
Chơng 3. Thực nghiệm
Mô tả chi tiết các quá trình:
Điều chế các phần chiết từ nguyên liệu thực vật
Nghiên cứu hoá học các phần chiết chọn lọc từ cây diếp cá suối
Nghiên cứu hoá học các phần chiết chọn lọc từ lá thành ngạnh trơn
Nghiên cứu hoạt tính sinh học
Chơng 4: Kết quả và thảo luận
4.1. Điều chế các phần chiết từ nguyên liệu thực vật
Nguyên liệu lá đợc rửa sạch, xử lý diệt men, sấy khô ở 60-70
o
C và xay
nhỏ. Bột khô nguyên liệu thực vật đợc tiến hành ngâm chiết ở nhiệt độ
phòng 5 lần với MeOH (mỗi lần 3 ngày). Tổng dịch chiết đợc cất loại
MeOH ở 50
0
C. Thêm nớc vào dịch cô và sau đó chiết lần lợt với n-hexan,
EtOAc và n-butanol. Cất loại dung môi các dịch chiết và đông cô phần nớc
thu đợc các phần chiết n-hexan, etylaxetat, n-butanol, nớc ký hiệu là GH,
GE, GB, GN từ cây diếp cá suối (G. chinensis) và CH, CE, CB, CN từ lá
thành ngạnh trơn (thành ngạnh nam - C. cochinchinense). Kết quả thử TLC
cho thấy thành phần phần chiết n-butanol và nớc khá giống nhau. Bởi vậy
nghiên cứu tiếp theo sẽ đợc tiến hành với các cặn tổng GB + GN ký hiệu là
GT và CB + CN ký hiệu là CT
4.2 Nghiên cứu thành phần hoá học các phần chiết chọn lọc từ diếp cá
suối
4.2.1 Nghiên cứu thành phần hoá học phần chiết etylaxetat GE
4.2.1.1 Phân lập các hợp chất

Phần này trình bày phơng pháp và quy trình phân lập các hợp chất

5











Hình 4.2 Sơ đồ phân tách phần chiết GE
1a
2a
3a
4a
4a1
4a2
5a
5a1
5a2
1b, 2b, 3b
3b1, 3b2
4b
5b
CC, SiO
2

, n-hexan/CHCl
3
/Me
2
CO (35/40/40)
CC, SiO
2
, n-hexan/ Me
2
CO (9/2)
CC, SiO
2
, n-hexan/ Me
2
CO (5/1)
CC, RP-18, MeOH/H
2
O (9/1)
Kết tinh lại trong Me
2
CO
TLC, SiO
2
, Me
2
CO
CC, SiO
2
,n-hexan/ Me
2

CO (5/1).
Kết tinh lại trong CHCl
3

Kết tinh lại trong CHCl
3

CC, SiO
2
, n-hexan/CHCl
3
/ Me
2
CO (25/40/40)
TLC, SiO
2
, CHCl
3
/MeOH (6/1)
TLC, SiO
2
, CHCl
3
/MeOH (6/1) và kết tinh lại trong axeton
CC, RP-18, MeOH/H
2
O (98/2), TLC, SiO
2
, Me
2

CO/ EtOAc (1/1)
4.2.1.2 Xác định cấu trúc các hợp chất
Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và xác định cấu
trúc của 11 hợp chất đợc tách ra từ GE, các hợp chất này lần đầu tiên đợc
phân lập từ cây diếp cá suối.

(1)
O
CHO
HO
1
2
3
4
5


GE1( 5-hydroxymetyl-2-furancarboxaldehit)
(2)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
25

11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
27
28
29
30
HO
H
H

GE2 (-amyrin)
(3)
HO
COOH
1
2
3
4

5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
29
30

GE3 (axit ursolic)
(4)
O
COOH
C
O

H
3
C
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
29
30

GE4 (axit -axetoxy ursolic)
B1

B2

B3

B4

(1b)

GE7

GE8

GE9

GE10

GE11

(2b)

(3b)

(3b1)

(3b2)

(4b)

(5b)

GE

Nớc cái (loại)

CHCl
3
/ H
2
O
(1/1)

B

EtOAc, cô đuổi dm

A

CHCl
3
,
Cô đuổi dm

A1

A2

A3

A4

(1a)

GE1

GE2

GE3

GE4

GE5

GE6

(2a)

(3a)

(4a)

(4a1)

(4a2)

(5a)

(5a1)

(5a2)


6

NH
O
O
HN
OCH
3
C
O
(5)

GE5 (asperglaucide)
29
28
27
25
24
23
22
20
21
17
16
15

14
13
18
12
11
19
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
GlcO
(6)

GE6 (daucosterol)
OH
OH
1
2
3
4
5
6
7
8

9
10
11
15
14
13
12
(7)

GE7 (Curcudiol)
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'
R
3
O
OOH
R

2
H
3
CO
R
1
(8)

GE8 (5-hydroxy-3, 7, 4-trimetoxy flavon)
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'
OCH
3
O
OOH
H
3

CO
(9)

GE9 (5-hydroxy-7, 4-dimetoxy flavon)
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'
O
OOH
H
3
CO
HO
(10)

GE10 (5,6- dihydroxy-7-metoxy flavon)
1
2

3
4
5
6
7
8
9
10
2
3
1'
2'
3'
4'
5'
6'
H
OH
OH
H
H
H
3
CO
HO
OCH
3
OH
OCH
3

H
3
CO
(11)

GE11 ((-) lyoniresinol )
4.2.2 Nghiên cứu thành phần hoá học phần chiết phân cực GT
4.2.2.1 Quy trình phân lập
Phần này trình bày phơng pháp và quy trình phân lập các hợp chất











Hình 4.7 Sơ đồ phân tách phần chiết GT
GT
-
3

CC, RP-18, metanol (100%)
CC, SiO
2
, CHCl
3

/Me
2
CO/MeOH (5/4/1).

GT
-
2

CC, RP-18, MeOH (100%)
CC, SiO
2
, Me
2
CO/H
2
O(10:1)
GT
-
1

CC, RP-18, MeOH/H
2
O (gradient)
CC, SiO
2
, Me
2
CO(100%)
GT

N1 (
100% H
2
O)
N2(
75% H
2
O)


N3(
50% H
2
O)


N4(
25% H
2
O)


N5(
100% MeOH)


CC, Dianion HP-20 , MeOH/ H
2
O (gradient)

7

4.2.2.2 Xác định cấu trúc các hợp chất
Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và xác định cấu
trúc của 3 hợp chất đợc tách ra từ GT, trong đó GT3 là chất mới. Dới đây
là cấu trúc hoá học của các hợp chất đã tách đợc
(12)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2
3
1'
2'
3'
4'
5'
6'
H

O
OH
H
H
H
3
CO
HO
OCH
3
OH
OCH
3
H
3
CO
O
CH
3
OH
OH OH
1''
2''
3''
4''
5''
6''

GT1 (lyoniresinol-3--L-rhamnopyranozit)
1''

O
CH
3
OH
OH OH
O
1
'
3
'
4
'
5
'
6
'
b
O
O
OH
OH
CH
2
C
OH
OH
O
O
OH
OH

2
'
a
1
2
3
4
5
6


2''
3''
4''
5''
1'''
2'''3'''
4'''
5'''
(13)

GT2 (Isoacteoside)
1
2
3
4
5
6
7
8

9
O
O
O
CH
2
OH
OH
OH
O
H
H
OH
OH
OH
1'
1''
(14)
2'
3'
4'
5'
2''
3''
4''
5''

GT3 (1-(O-- L-arabinopyranozyl (1-6) -D-glucopyranozyl)- 4-(2-propenyl)benzen)
Chất mới đặt tên là gymnothezit

Xác định cấu trúc hoá học của chất mới GT3 (14)
Hợp chất GT3 có dạng vô định hình, màu trắng, đ.n.c 189-190
o
C,
độ quay cực []
D
22
+58.3
o
(c 0.3 MeOH). Phổ ESI-MS có các pic ở m/z 451
[M+Na]
+
và 427 [M-H]
+
chứng tỏ chất có khối lợng phân tử là 428.


Hình 4.6.a Phổ
1
H -NMR của GT3

Hình 4.6.b Phổ DEPT của GT3


8

Bảng 4.4 Dữ liệu phổ
1
H và
13

C-NMR của hợp chất GT3
Vị
trí



H
(ppm)
J (Hz)



C

(ppm)

Vị
trí



H
(ppm)
J (Hz)



C

(ppm)

1 - 157.3
1-O-D-Glucopyranozyl
2 7.06(d,9.0) 117.8 1 4.88(d,7.0) 102.3
3 7.13(d,9.0) 130.6 2 3.47* 74.9
4 - 135.3 3 3.49* 77.8
5 7.13(d,9.0) 130.6 4 3.41* 71.5
6 7.06(d,9.0) 117.8 5 3.65(ddd,2.0,6.5,7.0) 77.2
7 3.34* 40.3 6 3.78(dd, 6.5,11.5)
4.12(dd,2.0,11.5)
69.3
8 5.96(m) 139.2
L-arabinopyranozyl
9 5.02(d,13.0)
5.06(d,13.0)
115.7 1 4.32(d,7.0) 104.8
2 3.60(dd,7.0,8.5) 72.4
3 3.51(dd,3.5,8.5) 74.1
4 3.79* 69.4

5 3.44*
3.84(dd,3.5,12.5)
66.6
Sự xuất hiện 2 doublet ứng với 2 cặp proton aromatic ở
H
7.06(2H, d,
J=9.0Hz, H-2 & H-6) và 7.13 ppm (2H, d, J=9.0Hz, H-3 & H-5) cho biết có
mặt vòng thơm đối xứng với hai nhóm thế ở vị trí C-1 và C-4. Điều này đợc
khẳng định qua phổ DEPT cũng nh tơng tác giữa H-2 & H-3, H-5 & H-6
trên phổ COSY và các tơng tác giữa H-2 & H-6 với C-4 và H-3 & H-5 với

C-1 trên phổ HMBC.
Các tín hiệu ứng với một nối đôi bị thế 1 lần (-CH=CH
2
) ở
H

5.96(1H, m, H-8)/
C
139.2 ppm,
H
5.02(1H, d, J=13.0 Hz, Ha-9) và
5,06(1H, d, J=13.0 Hz, Hb-9)/
C
115.7 ppm cùng với các tín hiệu của một
nhóm metilen (-CH
2
-) ở
H
3.34 (2H, m, Ha&Hb-7)/
C
40.3 ppm chứng tỏ
một trong hai nhóm thế của vòng thơm có cấu tạo CH
2
-CH=CH
2
(2-
propenyl). Các tơng tác giữa H-8 & H-7, H-8 & H-9 trên phổ COSY cũng
nh tơng tác của các proton H-7 với C-9, C-3, C-5 và C-4 trên phổ HMBC
đã khẳng định cấu tạo của nhóm thế trên cũng nh cho biết vị trí gắn kết với
vòng thơm là C-4.

9




Hình 4.6.c Phổ COSY của GT3


Hình 4.6.d Phổ HMBC của GT3
Trên phổ
13
C-NMR, DEPT và HSQC có các tín hiệu của 12 nguyên tử
C liên kết với oxy bao gồm 1 cacbon của vòng thơm ở
C
157.3 ppm (C-1) và
11 cacbon của mạch đờng đôi pentozylhexozơ. Thuỷ phân axit GT3 và kiểm
tra bằng TLC với các đờng chuẩn đã xác định đợc các hợp phần của mạch
đờng là D-glucozơ và L-arabinozơ. Vấn đề đặt ra là phải xác định các vị trí,
cấu hình liên kết glycozit cũng nh dạng tồn tại của các đờng đơn. Tơng
tác HMBC giữa proton anome của D-glucozơ H-1 ở
H
4.88 ppm với C-1
của vòng thơm ở
C
157.3 ppm, các proton H-6 ở
H
3.78 và 4.12 ppm với
cacbon anome của L-arabinozơ C-1 ở
C

104.8 ppm ứng với liên kết của
nhóm thế thứ hai là 1-O-[L-arabinozyl-(1-6)] D-glucozyl.
Cấu hình liên kết (- hoặc -) và dạng tồn tại của các đờng đơn
(pyranozit hoặc furanozit) đợc xác định thông qua hình dạng và hằng số
tơng tác của tín hiệu ứng với các proton anome. Vì tín hiệu cộng hởng của
H-1 và H-1 đều ở dạng doublet với hằng số tơng tác lớn (J~7.0Hz) nên
nhóm thế gắn vào C-1 sẽ là 1-O-[ -L-arabinopyranozyl - (1-6)] D--
glucopyranozyl. Nh vậy cấu trúc của GT3 sẽ là 1-O-([-L-arabinopyranozyl
- (1-6)] D--glucopyranozyl)-4-(2-propenyl) benzen. Hợp chất này lần đầu
tiên đợc phân lập từ tự nhiên và đợc đặt tên là Gymnothezit (14).

10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
O
O
O
CH
2
OH
OH
OH
O

H
H
OH
OH
OH
1'
1''
(14)
2'
3'
4'
5'
2''
3''
4''
5''
Tơng tác H-C trên phổ HMBC

4.3 Nghiên cứu thành phần hoá học các phần chiết chọn lọc từ lá thành
ngạnh trơn (thành ngạnh nam)
4.3.1 Nghiên cứu thành phần hoá học phần chiết etylaxetat CE
4.3.1.1 Phân lập các hợp chất

Hình 4.7 Sơ đồ phân tách phần chiết CE
1a Hoà trong CHCl
3
2a CC, SiO
2
, CHCl
3
/ MeOH (25/1); kết tinh lại trong CHCl
3

3a CC, SiO
2
, CHCl
3
/ MeOH (25/1); TLC, YMC Rp-8
1b CC, SiO
2
, CHCl
3
/ Me
2
CO /H
2
O (85/15/1)
2b CC, Sephadex LH-20, MeOH khan; CC, SiO

2
, Me
2
CO
3b CC, SiO
2
, CHCl
3
/ Me
2
CO (4/1); TLC, SiO
2
, CHCl
3
/EtOAc/ MeCOMe (4:1:1)
1c CC, SiO
2
, CHCl
3
/ MeOH (100/6)
2c CC, SiO
2
, CHCl
3
/ MeOH (100/8); TLC, SiO
2
, CHCl
3
/ MeOH (9/1)
3c CC, SiO

2
, CHCl
3
/ MeOH (10/3); TLC, SiO
2
, Me
2
CO
1d CC, SiO
2
, CHCl
3
/ Me
2
CO /H
2
O (85/15/1)
2d Kết tinh lại trong CHCl
3
/ Me
2
CO (1/1)
3d CC, Sephadex LH-20, MeOH khan
1e CC, Sephadex LH-20, MeOH khan
2e TLC, SiO
2
, EtOAc/ MeOH /H
2
O (50/5/3)
1f CC, Sephadex LH-20, MeOH khan; TLC, SiO

2
, EtOAc/ MeOH /H
2
O (50/5/3)
3.1.2 Xác định cấu trúc các hợp chất
Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và xác định cấu
E4B

E5B

E4A

E5A

CE4

CE1

CE2

CE3

CE5

CE6

CE10

CE7

CE8

CE9

CE11

CE12

CE13

E25

E11

E12

E23

E3C

E3D

CC, SiO
2
, gradient, CHCl
3
/ MeOH (25/1


0/100)

CE

E1

E2

E3

E4

E5

E6

(1a)

(1b)

(1c)

(1e)

(1d)

(1f)

(3d)

(2b)

(2a)

(3a)

(3b)

(2c)

(3c)

(2d)

(2e)


11
trúc của 13 hợp chất đợc tách ra từ CE, các hợp chất này lần đầu tiên đợc
phân lập từ lá thành ngạnh trơn, hợp chất CE6 và CE7 là các chất mới.
(15)
HO
28
1
2
3
4
5
6
7
8

9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
29
30
CE1 (-amyrin)
OH
OH
O
O
OH
HO
2
3
4
5

6
7
8
9
10
1'
6'
5'
4'
3'
2'
(16)

CE2
((+)- dihydro kaempferol)
OH
OH
OH
O
O
OH
HO
2
3
4
5
6
7
8
9

10
1'
6'
5'
4'
3'
2'
(17)

CE3 (taxifolin)
(18)
OH
OH
O
O
OH
HO
2'
3'
4'
5'
6'
1'
10
9
8
7
6
5
4

3
2

CE4 (kaempferol)
5a
8a
4a
9a
8
7
6
5
4
3
2
1
2'
3'
5'
9
(19)
O
O OH
OH
O
6'
4'

CE5
1,5 dihydroxy-3,4 [2,3,3-trimetyl dihydro

furano] xanton
5a
8a
4a
9a
8
7
6
5
4
3
2
1
2'
3'
5''
4'
9
(20)
O
O OH
OH
O
6'
OH

CE6
1,5 dihydroxy-3,4 [2-hydroxymetyl-3,3-
dimetyl dihydro furano] xanton
Chất mới, đặt tên là cratoxanton A

2'
3'
4'
5'
6'
9
(21)
1
2
3
4
5
6
7
8
9a
4a
8a
5a
O OHO
OH OH
O

CE7 (4,5-dihydroxy-2,3 [2-hydroxy-4,4-
dimetyl dihydro pyrano] xanton )
Chất mới, đặt tên là cratoxanton B


OHO
OH O

OH
OH
OH
(22)
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'

CE8 (quercetin)

7
2''
3''
4''
1'''
2'''
3'''
4'''

5'''
6'''
O
OCH
3
CH
3
O
OH O
O
OCH
3
O
HO OH
2
3
4
5''
6''
7''
8''
9''
10''
(23)
5
6
8
9
10
3'

1'
2'
4'
5'
6'

CE9
7,4,4-trimetoxy-5, 5, 7-trihydroxy (3, 8)
biflavon (sciadopitysin)
7
O
OH
HO
OH
O
OH
O
HO
OH
OH
OH
O
H
5
6
8
9
10
2
3

4
3'
1'
2'
4'
5'
6'
(24)
2''
3''
4''
1'''
2'''
3'''
4'''
5'''
6'''
5''
6''
7''
8''
9''
10''


CE10
(pancibiflavonol )

12
(25)

2
3
4
5
6
7
8
9
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1''
2''
3''
4''
5''
OH
OH
OH
O
O
O
O
OH OH
OH
CH

3
HO

CE11
quercetin-3-O--rhamnopyranozit (quercitrin)
(26)
OH
OH
O
O
O
O
OH
OH
OH
HO
2
3
4
9
10
5
6
7
8
1'
2'
3'
4'
5'

6'
1''
2''
3''
4''
5''

CE12
kaempferol-3-O--L- arabinofuranozit
(juglanin)
(27)
OH
OH
O
O
HO
O
O
OH
OH
OH
CH
2
OH
2
3
4
10
9
5

6
7
8
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1'' 2''
3''
4''
5''

CE13 (kaempferol-3-O--D- glucopyranozit)
Xác định cấu trúc hoá học của các chất mới CE6 (20) và CE7 (21)
Hợp chất CE6 (20)
Hp cht CE6 cú dng tinh th hỡnh kim, mu vng, .n.c 278.9
o
C,
[]
D
25
+ 5.1
o
(c=0.3, CHCl
3
). Cỏc ph IR. UV v NMR cú dng rt ging
ph ca cht CE5 chng t õy cng l mt dn xut th xanton cú cha
vũng furan. Ph

13
C-NMR (bng 2, hỡnh 2.b) cho bit phõn t cng cha 18
nguyờn t C nhng ph khi EI-MS li cú pic ion phõn t m/z 328. So vi
cht CE5, ph
1
H-NMR ca CE6 vng mt dublet
H
1.42 ppm ca nhúm
2-CH
3
v xut hin mt multiplet
H
3.91 ppm ng vi hai proton. Ngoi
ra trờn ph DEPT tớn hiu ca cacbon metylen
C
14.5ppm ó c thay
th bng tớn hiu ca cacbon oximetilen (-CH
2
OH)
C
61.7 ppm. Kt hp
cỏc d liu ph NMR v MS cú th suy ra cụng thc phõn t ca hp cht
CE6 l C
18
H
16
O
6
. iu ny hon ton phự hp vi s chờnh lch v s khi
gia cỏc pic ion phõn t ca hai cht. Nh vy (CE6) chớnh l dn xut

hydroxy mch nhỏnh vũng furan ca cht CE5. S thay th mt nguyờn t
hydro bng nhúm OH lm cho tớn hiu cng hng ca C-2 dch chuyn v
phớa trng thp (
C
=96.1ppm).

13

Hình 4.8.a Phổ
1
H-NMR của CE6

Hình 4.8.b Phổ DEPT của CE6
Trờn ph HMBC cú cỏc tng tỏc ca proton nhúm gem-dimetyl
H
1.71
v 1.46 ppm vi C-2
C
96.05ppm, C-4 c 114.3 ppm v cacbon bc
bn C-3
C
44.4 ppm tng t nh CE5. Kt hp vi tng tỏc gia 2
proton ca nhúm oximetilen
H
3.91 ppm vi C-2 v C-3 ó khng nh
c hp cht phõn lp c l dn xut 4-hydroxy ca CE5 v cú cu trỳc
1,5 dihydroxy-3,4 [2-hydroxymetyl-3,3-dimetyl dihydro furano] xanton.
Cht ny ln u tiờn c phõn lp t tự nhiên v c t tờn l
cratoxanton A (20).
Hợp chất CE7 (21)

Hợp chất CE7 có dạng chất rắn bột màu trắng, điểm nóng chảy 274-
275
o
C. Trên phổ IR thấy xuất hiện dải hấp thụ ở
max
(cm
-1
) 3318 (chân rộng)
tơng ứng với dao động của nhóm OH và ở 1658 tơng ứng với dao động của
nhóm C=O. Phổ ESI-MS cho các tín hiệu (m/z): 327 và 351 ứng với ion [M-
H]
+
và ion [M+Na]
+
, chứng tỏ CE7 có khối lợng phân tử là 328. Kết hợp với
phổ NMR có thể suy ra công thức phân tử của CE7 là C
18
H
16
O
6
. Phổ
13
C
NMR xuất hiện tín hiệu riêng biệt của 18 cacbon, kết hợp với phổ DEPT xác
định đợc sự có mặt của 5 nhóm CH, 2 nhóm CH
3
, 1 nhóm CH
2
và 10 cacbon

không liên kết với hidro. Tín hiệu
C
tơng ứng với cacbon cacbonyl xuất hiện
ở 182.8 (ppm).

Hình 4.9.a: Phổ DEPT của CE7

14
Phổ
1
H NMR xuất hiện tín hiệu
H
(ppm) của 4 proton aromatic ở
6.22(1H, s, H-1); 7.27 (1H, dd, J=8.0 Hz, 1.5 Hz, H-6); 7.23 (1H, dd, J=8.0
Hz, 8.0 Hz, H-7); 7.63 (1H, dd, J=1.5 Hz, 8.0 Hz, H-8) tơng ứng với các
proton của nhân xanthone. Sự xuất hiện hai tín hiệu 3H-singlet (

1.73 and


1.62), một tín hiệu 2H-doublet (

1.92-1.97) và một tín hiệu 1H-quartet
(
H
5.44, dd, J=5.5 Hz, 5.5 Hz) cùng với các dữ kiện phổ
13
C-NMR và DEPT
chứng tỏ sự có mặt vòng gemdimetylpyran. Các tơng tác trên phổ HMBC
giữa các proton của nhóm gemdimetyl với cacbon aromatic C-2 (

C
110.9
ppm), C-2 (
C
94.2 ppm), C-3 (
C
47.3 ppm) và C-4 (
C
33.3 ppm) cũng
nh tơng tác của proton aromatic ở
H
6.62 ppm (1H, s) với cacbon C-2, C-3
(
C
162.1 ppm), C-9 (
C
182.8 ppm), C-9a (
C
105.4 ppm) và C-4 đã khẳng
định vòng gem-dimetyl pyran gắn kết vào khung xanton ở vị trí 2 và 3, nhóm
hydroxy ở C-2 và hợp chất phân lập đợc là một dẫn xuất pyranoxanton có
cấu trúc 4,5-dihydroxy-2,3 [2-hydroxy-4,4-dimetyl pyrano] xanton.
Cấu trúc này một lần nữa đợc kiểm chứng và khẳng định qua những
thông tin thu đợc trên các phổ 2D-NMR. Phổ COSY xuất hiện tín hiệu đặc
trng cho tơng tác của H-6 & H-7, H-7 & H-8, H-2 & H-3 là các cặp proton
có liên kết trực tiếp. Phổ HSQC xuất hiện đầy đủ các tơng tác của các cacbon
và hydro có liên kết trực tiếp của CE7. Phổ HMBC cũng xuất hiện các tín hiệu
đặc trng cho các tơng tác xa giữa hydro và cacbon.
Cht ny ln u tiờn c phõn lp t tự nhiên v c t tờn l
cratoxanton B (21).

Hình 4.9.b Phổ HSQC của CE7
Hình 4.9.c Phổ HMBC của CE7


15
4.3.2 Nghiên cứu thành phần hoá học phần chiết phân cực CT
4.3.2.1 Phân lập các hợp chất













Hình 4.11 Sơ đồ phân tách phần chiết CT

4.3.2.2 Xác định cấu trúc các hợp chất
Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc
của 5 hợp chất GT1, GT2, GT3, GT4 và GT5. Các hợp chất GT2, GT3, GT4
cũng đợc phân lập từ phần chiết CE với các ký hiệu tơng ứng là CE11 (25),
CE12 (26) và CE13 (27). Ngoại trừ mangiferin (GT5, 29) các hợp chất còn
lại đều lần đầu tiên đợc phân lập từ lá cây thành ngạnh trơn.

(28)
OH
OH
O
O
OH
HO
O
O
O
O
OH
OH
OH
OHOH
HO
CH
3
2
3
4
10
9
5
6
7
8
1'
2'
3'

4'
5'
6'
1''
2''
3''
4''
5''
6''
1'''
2'''
3'''
4'''
5'''

CT1 (Rutin)


5a
8a
4a
1a
8
7
6
5
4
3
1
(29)

OH
OHO
OOH
HO
O
OH
OH
CH
2
OH
OH
1'
2'
3'
4'
5'
6'
2


CT5 (Mangiferin)

(3b)

CT

T1 (
100% H
2
O)

T2(
75% H
2
O)

T3(
50% H
2
O)

T4(
25% H
2
O)

T5(
100% MeOH)

CC, Dianion HP
-
20 , metanol: H
2
O
(gradient)

CT
-
2

CT

-
3

CT
-
1

CT
-
4

CT
-
5

(1a)

(1b)

(4b)

(2b)

(2b)

Ghi chú:

1a
1b
2b

3b
4b
CC, RP-18, metanol (100%); TLC, SiO
2
, EtOAc/ MeOH/ H
2
O (50/3/10)
CC, Sephadex LH-20, MeOH (100%)
TLC, SiO
2
, EtOAc/ MeOH/ H
2
O (50/3/10)
TLC, SiO
2
, CHCl
3
/ MeOH/ H
2
O - 100/15/1)
TLC , SiO
2
, EtOAc/ MeOH/ H
2
O (50/3/10)


16
4.4 nghiên cứu hoạt tính sinh học
Để làm sáng tỏ tác dụng chữa bệnh trong dân gian cũng nh tìm

hiểu cơ chế chống viêm của cây diếp cá suối và lá thành ngạch trơn chúng tôi
khảo sát một số hoạt tính liên quan đến tác dụng chống viêm là:
- Hoạt tính ức chế hoạt động NF-B in vitro
- Hoạt tính ức chế chuyển dạng lympho bào in vitro
- Hoạt tính chống viêm in vivo
4.4.1 Nghiên cứu hoạt tính ức chế NF-

B (in vitro) của các phần chiết
chọn lọc và một số chất tinh khiết phân lập đợc.
Hoạt động quá mức của NF-B cũng là nguyên nhân gây viêm,
đồng thời làm dai dẳng và nặng thêm tình trạng bệnh lý. Sự ức chế hoạt động
của NF-B có thể xảy ra theo nhiều cách khác nhau, song có điểm chung là
làm giảm hàm lợng NF-B hoạt động trong nhân. Bằng cách định lợng
hàm lợng NF-B ở tế bào RAW 264.7 đã bị kích hoạt bởi LPS trong điều
kiện nuôi cấy có hay không có các mẫu nghiên cứu sẽ đánh giá đợc ảnh
hởng của các mẫu lên hoạt động của NF-B.
Khả năng ức chế hoạt động NF-B của các phần chiết đợc đánh giá
thông qua giá trị IC
50
. Mẫu thử có giá trị IC
50
càng nhỏ thì khả năng ức chế
càng mạnh, có IC
50
> 50àg/ml đợc coi là không có hoạt tính. Kết quả trên
bảng 4.10 a cho thấy chỉ có các phần chiết GE, GT từ diếp cá suối và CE từ
thành ngạnh trơn có tác dụng ức chế hoạt động của NF-B. ác dụng ức chế
giảm dần theo thứ tự GE > CE >> GT.
Bảng 4.10.a Hoạt tính ức chế hoạt động NF-

B của các phần chiết
STT

Ký hiệu
IC
50
(à
àà
àg/ml)
1. GH >50
2. GE 10.81 2.21
3. GT 40.63 4.16
4. CH >50
5. CE 12.79 3.91
6. CT >50
7. Đối chứng (+) Parthenolid 6.03 0.06
Chúng tôi cũng đánh giá hoạt tính ức chế hoạt động NF-B của một
số hợp chất phân lập đợc từ cây diếp cá suối và lá thành ngạch trơn.

17
Bảng 4.10.b Hoạt tính ức chế hoạt động NF-



B của các chất tinh khiết
phân lập đợc.
STT

Ký hiệu
IC
50
(à
àà
àg/ml)
Tên chất
1 GE2 >50
-amyrin
2 GE3 3.08 0.25 Axit ursolic
3 GE7 >50 Curcudiol
4 GE10 4.47 0.18
5, 6-dihydroxy-7-metoxy flavon
5 GT3 15.11 1.45 Gymnothezit*
6 CE1 > 50
-amyrin
7 CE4 3.40 0.15 Kaempferol
8 CE5 >50 Pancixanton B
9 CE6 27.82 1.48 Cratoxanton A*
10 CE7 >50 Cratoxanton B*
11 CE8 4.22 0.53 Quercetin
12 CE11 >50 Quercitrin
13 CE12 12.72 1.15 Juglanin
14 CE13 >50
Kaempferol-3-O--glycozit
15 CT1 35.01 4.87 Rutin
16 CT5 22.60 1.84 Mangiferin
17 Đối chứng (+) 6.03 0.06 Parthenolid
(*) chất mới
Kết quả trên bảng 4.10.b cho thấy hầu hết các chất có hoạt tính tốt

đều có mặt ở các phần chiết etyl axetat GE và CE. Đặc biệt axit ursolic
(GE3), 5, 6-dihydroxy-7-metoxy flavon (GE10), kaemferol (CE4) và
quercetin (CE8) có hoạt tính ức chế NF-B mạnh hơn chất đối chứng (+) là
parthenolid. Hai hợp chất xanton CE6 (cratoxanton A) và CT5 (mangiferin)
có hoạt tính trung bình. Sự có mặt các chất có hoạt tính hoàn toàn phù hợp
kết quả thử nghiêm với các phần chiết GE và CE ở bảng 4.10.a đồng thời
cũng lý giải đợc tác dụng chống viêm của 2 dợc liệu nghiên cứu.
Các phần chiết etylaxetat GE và CE có hoạt tính ức chế NF-B tốt
nhất nên đợc lựa chọn cho các thử nghiệm tiếp theo.
4.4.2 Nghiên cứu ảnh hởng của GE và CE lên đáp ứng chuyển dạng
lympho bào in vitro
Các tế bào lympho là một trong những loại tế bào chính tham gia
vào quá trình viêm và các phản ứng miễn dịch. Trong các bệnh viêm ở ngời,
quá trình chuyển dạng lympho bào đợc coi là một nguyên nhân gây bệnh
quan trọng trong các bệnh viêm mãn tính. Bởi vậy việc đánh giá sự ức chế
chuyển dạng lympho bào là quan trọng khi nghiên cứu các dợc liệu theo

18
định hớng chống viêm.
Kết quả thực nghiệm trình bày trên bảng 4.11 và hình 4.12 cho thấy
các phần chiết GE và CE đều có khả năng ức chế chuyển dạng lympho bào
(in vitro), mức độ ức chế phụ thuộc nồng độ. ở các ngỡng nồng độ (50-
1000 àg/ml) GE luôn thể hiện khả năng ức chế mạnh hơn CE.
Bảng 4.11 Kết quả đáp ứng chuyển dạng lympho bào khi nuôi cấy có thêm
PHA và GE hoặc CE (n= 3).
Mức độ chuyển dạng lympho bào (% ức chế) STT Mẫu nuôi cấy
GE CE
1 Không PHA, không CC
216 77 (0)
2 PHA, không CC

22686 1072 (0.0)
3
50 àg/ml CC và PHA 18171 1048 (19.9)

21047 1026 (7.2)

4
100 àg/ml CC và PHA 13441 681 (40.8)

16074 1214 (29.1)

5
250 àg/ml CC và PHA 11926 1033 (47.4)

14256 1218 (37.2)

6
500 àg/ml CC và PHA 4346 569 (76.4)

8930 1356 (60.6)

7
1000 àg/ml CC và PHA 2148 912 (91.4)

5834 722 (74.3)

8
1500 àg/ml CC và PHA 226 190 (99.0)

248 66 (98.9)

9
2000 àg/ml CC và PHA 202 46 (99.5)

124 44 (99.5)

Ghi chú: CC cặn chiết, p < 0.05








Hình 4.12 Sự thay đổi của % ức chế khi thêm PHA và GE hoặc CE .
Sự tơng đồng giữa tác dụng ức chế chuyển dạng của lympho bào
và tác dụng ức chế NF-B của GE và CE chứng tỏ mối liên quan mật thiết
giữa hai hoạt tính này và là bằng chứng rõ nét về vai trò của yếu tố phiên mã
NF-B trong đáp ứng miễn dịch và viêm.
4.4.3 Nghiên cứu tác dụng chống viêm in vivo của các phần chiết GE và
CE
4.4.3.1 Nghiên cứu trên chuột gây viêm cơ đùi bằng dextran
Để đánh giá tác dụng chống viêm, tiến hành thí nghiệm trên chuột
0
20
40
60
80
100

120
0 500 1000 1500 2000 2500
GE
CE

àg/ml
% ức chế



19
nhắt khoẻ mạnh chủng Swiss trọng lợng 20-25g. Chuột đợc gây viêm bằng
dextran 5% nh đã mô tả ở phần thực nghiệm. Mức độ viêm đợc đánh giá
qua độ sng phù của chân chuột. Theo dõi các thời điểm 30 phút, 60 phút, 90
phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút, 210 phút và 240 phút. Tại mỗi thời điểm
giết 5 chuột để xác định độ phù chân chuột (tính theo giá trị tăng thể tích
chân chuột trung bình). Kết quả thí nghiệm trình bày trên bảng 4.12 a biểu
thị sự thay đổi thể tích chân chuột theo thời gian gây viêm.
Qua các kết quả thu đợc nhận thấy rõ sự thay đổi thể tích chân chuột
theo thời gian sau khi gây viêm. Sau khi gây viêm 150 phút thể tích chân chuột
đạt tới cực đại so với lô đối chứng. Vì vậy chọn thời điểm xác định thể tích
chân chuột là 150 phút sau khi gây viêm cho các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 4.12.a Sự thay đổi thể tích chân chuột sau gây viêm
Chỉ tiêu thí
nghiệm
Số liệu thực nghiệm
Thời gian sau khi
gây viêm ( phút )
30 60 90 120

150

180 210

240

Tăng thể tích (%)

21.0


5.2
27.1


6.1
43.7


3.8
48.5

4.3
61.5

4.8
60.3

3.1
60.5

2.8
61.1

3.6
ở lô thí nghiệm sử dụng các phần chiết điều trị cho chuột theo 3
đờng (uống, tiêm, bôi). Kết quả thu đợc trình bày trên bảng 4.12.b.
Bảng 4.12.b Sự thay đổi thể tích chân chuột bị viêm và sử dụng GE hoặc CE
Mức độ tăng thể tích chân chuột
(%)

Mẫu

Đờng dùng
Lô chứng Lô dùng chiết phẩm

% ức
chế
( I % )
Uống 53.5 6.6 32.2 5.2 39.8
Tiêm dới da 54.1 6.0 18.2 4.2 66.4

GE
Bôi trên da 53.5 5.5 24.0 6.4 55.1
Uống 55.5 4.6 28.2 4.6 49.2
Tiêm dới da 51.4 7.0 14.1 3.8 72.6

CE
Bôi trên da 52.5 5.5 21.0 5.1 60.0
Số liệu trên bảng 4.12.b và hình 4.13 cho thấy phần chiết GE và CE

thể hiện tác dụng kháng viêm khá rõ trên mô hình gây viêm thực nghiệm.

20
Đối với các chuột dùng GE: tác dụng theo đờng tiêm dới da có hiệu lực
nhanh và mạnh nhất (giá trị ức chế đạt 66, 4%), tiếp đến là đờng bôi trên da
(giá trị ức chế đạt 55, 1%), đờng uống thể hiện tác dụng yếu (giá trị ức chế
đạt 39, 8%). . Đối với các chuột dùngCE: tác dụng theo đờng tiêm dới da
cũng có hiệu lực nhanh và mạnh nhất (giá trị ức chế đạt 72, 6%), tiếp đến là
đờng bôi trên da (giá trị ức chế đạt 60, 0%), đờng uống thể hiện tác dụng
yếu (giá trị ức chế đạt 49, 2%).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
U T B
%
GE
CE

Hình 4.13 Mức độ ức chế viêm của GE và CE theo các đờng uống (U),
tiêm (T) và bôi (B)
Trong tất cả các trờng hợp tác dụng ức chế của CE đều lớn hơn GE.
4.4.3.2. Nghiên cứu trên chuột gây viêm hoại tử gan bằng CCl
4

Khi có tổn thơng hoại tử ở gan các men transferaza đổ vào máu nhiều
và làm tăng nồng độ trong máu. Trong viêm gan do nhiễm độc, xơ gan, SGOT và
SGPT tăng rất nhiều, định lợng men trong quá trình điều trị sẽ giúp tiên lợng
mức độ hoại tử tế bào gan. Các thuốc chống viêm, bảo vệ gan phải có tác dụng
hạ đợc hai loại men này cũng nh ức chế quá trình POL. Kết quả thí nghiệm
đợc trình bày trên bảng 4.13 và các hình 4.14.a & 4.14.b.

Bảng 4.13 Tác dụng bảo vệ gan sau 72 h dùng GE hoặc CE

Mẫu thử SGOT (U/l) SGPT (U/l) MDA (nM/ml)
Đối chứng trắng 14.4 3.6 20.22.6 0.890.33
CCl
4 (
đối chứng bệnh) 202.022.1 163.010.9 2.800.81
CCl
4
& GE 86.817.2 95.412.3 1.710.37
CCl
4
& CE 66.88.6 72.611.0 1.200.21


21
0
50
100
150
200
250
SGOT (U/l) SGPT (U/l)

Đối chứng trắng
CCl4 (đối chứng bệnh)
CCl4 & GE
CCl4 & CE

Hình 4.14.a. Tác dụng làm giảm men
gan của GE và CE

0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
MDA (nM/ml)
Đối chứng trắng
CCl4 (đối chứng bệnh)
CCl4 & GE
CCl4 & CE

Hình 4.14.b Tác dụng ức chế quá trình
POL của GE và CE
Kết quả nghiên cứu cho thấy ở lô chuột gây độc và không cho uống chế
phẩm GE hoặc CE, hàm lợng men gan tăng cao so với đối chứng (tăng 14 lần
với SGOT và 8 lần với SGPT), quá trình POL cũng tăng mạnh (hàm lợng MDA
tăng 3.14 lần). Điều này cho thấy ở gan chuột vào thời điểm giết chuột đang
diễn ra quá trình viêm và bị hoại tử mạnh.
Kết quả ở các lô chuột bị gây độc và cho uống GE hoặc CE đều cho thấy
sự giảm men gan so với đối chứng gây độc. Sau 72 giờ dùng GE men gan hạ

đáng kể, SGOT chỉ còn 86.8 (U/l) trong khi ở đối chứng gây độc là 202.0 (U/l),
SGPT chỉ còn 95.4 (U/l) trong khi ở đối chứng là 163 (U/L). ở lô dùng CE, tác
dụng hạ men gan và cả tác dụng ức chế POL so với đối chứng gây độc đều cao,
đồng thời tác dụng cao hơn hẳn lô dùng GE (p<0.05).
4.4.3.3 Khảo sát ảnh hởng của GE và CE tới sự phát sinh lipit lạ ở thỏ
viêm gan
Viêm kéo dài là một trong những nguyên nhân dẫn đến ung th. Viêm
gan nhiễm độc kéo dài dễ dấn đến xơ gan hoặc ung th.
Để tiến sâu hơn một bớc nữa khảo sát tác dụng đối với tế bào gan,
chúng tôi thăm dò tác dụng của các mẫu thử đối với sự xuất hiện lipit lạ khi
gan bị huỷ hoại. Thỏ đợc gây viêm gan bằng tác nhân CCl
4
, khi thỏ đã bị
bệnh, theo dõi sự tiến triển của bệnh giữa lô chứng và lô cho uống GE và CE.
Dùng phơng pháp Khakim kiểm soát sự xuất hiện của lipit lạ. Phản ứng này
mang tên tác giả ngời Nhật đã phát hiện ra lipit lạ (lipit ác tính) trong
máu bệnh nhân ung th. Kết quả thí nghiệm đợc đánh giá thông qua số thỏ
gây bệnh cho phản ứng Khakim dơng tính. Số thỏ thí nghiệm gồm 60 con
chia làm 3 lô, 2 lô thí nghiệm và 1 lô đối chứng. Kết quả đợc trình bày trên
bảng 4.14.

22

Bảng 4.14 ảnh hởng của GE và CE tới sự phát sinh lipit lạ ở
thỏ viêm gan
Sau 7 ngày gây
bệnh
Sau 15 ngày gây
bệnh
Sau 60 ngày gây

bệnh

ĐC GE CE ĐC GE CE ĐC GE CE

Tỷ lệ
cho PƯ
dơng
tính
(%)


0


0


0


0


0


0


10

0


0
Sau 60 ngày gây bệnh ở các lô thỏ có sử dụng GE hoặc CE không
thấy xuất hiện lipit lạ trong khi lô đối chứng có 2 con (~10%) cho phản ứng
Khakim dơng tính. Điều này cho thấy GE và CE đều có tác dụng ức chế sự
xuất hiện lipit lạ, biểu hiện của bệnh ung th ở thỏ viêm gan do nhiễm độc
CCl
4
.
4.4.4 Nhận xét
Kết quả nghiên cứu về hoá học và hoạt tính sinh học của phần chiết
etylaxetat của diếp cá suối (GE) và lá thành ngạnh trơn (CE) cho thấy mặc dù
có thành phần hoá học rất khác nhau nhng cả hai chiết phẩm đều có hoạt
tính ức chế hoạt động của NF-B in vitro, ức chế quá trình chuyển dạng
lympho bào in vitro và có tác dụng chống viêm tốt in vivo. Hoạt tính sinh học
của GE đợc quyết định bởi axit ursolic, các dẫn xuất metoxy flavonoit,
gymnothezit và các chất có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định mạnh nh
curcudiol, aspeglaucid, trong khi taxifolin, kaempferol, quercetin,
mangiferin, cratoxanton A và các biflavonoit lại là những hợp phần quyết
định tác dụng sinh học của CE. Tuỳ theo cấu trúc hoá học mỗi lớp chất đều
thể hiện tác dụng chống viêm theo một cơ chế riêng nh đã trình bày ở phần
tổng quan và nghiên cứu hoá học nhng hầu nh tất cả đều liên quan đến con
đờng NF-B (hoặc trực tiếp ức chế sự hoạt động của NF-B hoặc tiêu diệt
các tác nhân có thể làm hoạt hoá NF-B).
Các kết quả nghiên cứu về hoá học và hoạt tính sinh học cây diếp cá
suối và lá thành ngạnh trơn đã làm sáng tỏ cơ chế tác dụng chống viêm của

các dợc liệu và là tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo sâu hơn phục vụ
cho việc phát triển các dợc phẩm theo định hớng chống viêm từ chúng.