Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ nhân giống hoa lily bằng phương pháp nuôi cấy in vitro doc

NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ
NHÂN GIỐNG HOA LILY BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO
Đỗ Minh Phú, Đoàn Thị Thùy Vân,
Đặng Văn Đông, Trịnh Khắc Quang
SUMMARY
Improving lily sorbone propagation technology by
in vitro culture method
The present invention belongs to the field of biotechnology, and is tissue culture method to
propagating great amount of Sorbone lily seedlings. Sorbone lily scale as explant, after sterilization
and cutting into blocks, is inoculated on culture medium with different plant hormones to induce
callus and cespitose bud; callus and cespitose bud are proliferated in secondary culture medium
until reaching seedling height of 5 cm and forming base bulb; and the seedling is transplanted in
grown bulb medium. The created and proliferation budlb culture medium includes MS
supplemented NAA 0.01 mg/L and BAP 0.4 mg/L. The grown culture medium includes MS NAA
0.2 mg/L and BAP 0.03 mg/L. The culture conditions include temperature of 25 - 26 deg.C,
illuminance of 2000 - 2200 lux, lighting 12 hr/day and pH 5.8.
Keywords: Biotechnology, tissue culture, callus, bulb, hormones.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Hoa lily là loại hoa cao cấp, có vẻ đẹp
sang trọng, độ bền cao, hương thơm nhẹ
nhàng và màu sắc phong phú. Từ lâu, loài
hoa này đã khẳng định được thế mạnh trên
thị trường thế giới. Và đặc biệt, những năm
gần đây, tại Việt Nam hoa lily đã trở thành
loại hoa phổ biến trong những ngày lễ, Tết
cũng như những sinh hoạt thường nhật của
người dân.
Hoa lily được nhân giống bằng nhiều
phương pháp khác nhau, trong đó phương
pháp nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô
in vitro có nhiều ưu điểm vượt trội. Kỹ

thuật này được áp dụng tại các quốc gia và
vùng lãnh thổ có ngành sản xuất hoa tiên
tiến trên thế giới như Hà Lan, Thái Lan, Đài
Loan, Trung Quốc Tuy nhiên, việc áp
dụng công nghệ này tại Việt Nam vẫn còn
nhiều hạn chế nên giá thành củ giống cao,
chất lượng vẫn còn thấp. Mặc dù, những
năm gần đây một số cơ quan khoa học như:
Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Công
nghệ sinh học - Đại học Nông nghiệp Hà
Nội, Phân Viện Công nghệ sinh học Đà Lạt,
Viện Nghiên cứu Rau quả đã và đang nỗ
lực nghiên cứu nhân giống lily nhằm tạo ra
nhng sn phNm tt nht vi giá thành hp
lý, tuy nhiên kt qu t ưc chưa cao.
Xut phát t nhng lý do trên, chúng
tôi ã tin hành thc hin  tài: “ghiên
cứu hoàn thiện quy trình công nghệ nhân
giống hoa lily bằng phương pháp nuôi cấy
in vitro”.
 tài nghiên cu ưc thc hin t
tháng 10/2007 n tháng 6/2009. Các thí
nghim ưc tin hành ti Phòng Thí
nghim nuôi cy mô - B môn Công ngh
sinh hc và Vưn ươm thí nghim - B môn
Hoa cây cnh - Vin N ghiên cu Rau qu.
Mục đích nghiên cứu: T
 nhng ưu,
nhưc im các nghiên cu trưc ó, da
trên nn tng ca quy trình “to c trc tip

t lát ct vy c - Vin Di truyn N ông
nghip”. Chúng tôi ã t ra mc tiêu ca
 tài:
- La chn quy trình tt nht, ơn gin,
d ng dng, có kh năng chuyn giao cho
mi i tưng, mi iu kin sn xut
- Ti ưu hoá quy trình nhân ging cây
hoa lily cho tng i tưng ging có trin
vng và thích nghi vi iu kin khí hu
ca vùng ng bng sông Hng cũng như
các tnh phía Bc.
- N âng cao cht lưng c ging, h giá
thành sn phNm. N ăng sut ln,  kh
năng cung cp ging cho th trưng.
II. VT LIU VÀ PHƯƠN G PHÁP
N GHIÊN CU
1. Vật liệu nghiên cứu
Là ging hoa lily Sorbone. ây là
ging hoa lily thơm, có màu hng, nhp ni
t Hà Lan, ưc Vin N ghiên cu Rau qu
tuyn chn và ã ưc B N ông nghiêp và
Phát trin nông thôn công nhn ging chính
thc tháng 6/2009.
2. ội dung nghiên cứu
Các nghiên cu ưc tin hành  3 giai
on:
Giai đoạn 1: (Khởi động)
- nh hưng ca hàm lưng BAP và
αN AA n kh năng phát sinh c nh t mô
vy c lily.

- nh hưng ca nng  ưng n
phát sinh c nh t mô vy c lily.
Giai đoạn 2: (Sự phát triển củ nhỏ)
- nh hưng ca hàm lưng t hp
BAP và αN AA n kh năng nuôi ln c
lily nh.
- nh hưng ca nng  ưng
Saccarose, than hot tính, nưc da n tc
 sinh trưng ca c ging lily in vitro.
Giai đoạn 3: (ngoài vườn ươm)
- nh hưng ca giá th n kh năng
bt chi ca c ging lily in vitro.
- nh hưng ca mt s loi phân bón
lá n sinh trưng ca cây giai on sau
in vitro.
3. Phương pháp thí nghiệm
- La chn và tách các vy c t c lily
mu vi kích thưc dài vy t 2-3 cm.
- Kh trùng vt mu bng H
2
O
2
hoc
HgCl
2
.
- Môi trưng nuôi cy:
+ Môi trưng cơ bn: MS (Murashige
and Skoog, 1962) có ci tin v thành phn
ưng, agar.

+ Môi trưng khi ng, to c ban u
có b sung t hp BAP (6-Benzylaminopurine)
hàm lưng 0,01-0,05 mg/l và αN AA
(1-N aphtyl acetic acid) 0,1-0,5 mg/l.
+ Môi trưng nuôi ln c là môi trưng
cơ bn trên vi t hp BAP và αN AA. Hàm
lưng thay i cho phù hp vi mc ích
nuôi ln c.
(BAP: 0,02-1 mg/l; αN AA: 0,1-03
mg/l)
Và các cht b sung như: than hot
tính, nưc da
- Môi trưng ưc iu chnh v pH: 5,8.
- N hit  phòng nuôi: 26
0
C ± 2.
-  Nm không khí: 45 - 50%.
- Toàn b vt mu ưc t trong môi
trưng ti sut quá trình nuôi.
III. KT QU N GHIÊN CU VÀ THO
LUN
1. Kết quả và những đánh giá chủ yếu ở
giai đoạn in vitro
Ở giai đoạn 1, khi tiến hành tạo vật liệu
khởi đầu. Căn cứ vào các kết quả nghiên
cứu cho thấy: tổ hợp BAP với αNAA ở hàm
lượng 0,01 mg/l cho kết quả tốt nhất.
Bảng 1. Ảnh hưởng của hàm lượng BAP và αAA đến khả năng phát sinh củ nhỏ
Công thức thí nghiệm αNAA (mg/l) BAP (mg/l) Số củ thu được TB/1 mẫu
A1

0,01
0,1 0,52
A2 0,2 1,70
A3 0,3 3,01
A4 0,4 3,23
A5 0,5 2,81

Từ kết quả trình bày tại bảng 1 chúng ta
nhận thấy, tỷ lệ tạo củ nhỏ tăng dần với hàm
lượng của BAP có mặt trong môi trường từ
0,1-0,4 mg/l. Khi tăng hàm lượng BAP vượt
ngưỡng 0,4 mg/l, tỷ lệ tạo củ giảm rõ rệt từ
3,32 củ/1mẫu xuống còn 2,81 củ/1mẫu. Từ
kết quả này cho chúng ta thấy tác động của
tỷ lệ tổ hợp BAP và αNAA lên khả năng tạo
củ nhỏ. Khi tỷ lệ này mất cân đối sẽ có tác
động gây ức chế đến mẫu nuôi cấy.
Với tỷ lệ BAP và αNAA là (0,4:
0,01 mg/l) đã cho chúng ta kết quả tạo củ
nhỏ tốt nhất. Tuy nhiên thời gian tạo củ
khá lâu từ 40-60 ngày, cũng như tỷ lệ phát
sinh củ trên một mẫu còn thấp. Vấn đề đặt
ra là cần rút ngắn thời gian tái sinh của
mẫu, nâng cao chất lượng của củ tạo ra.
Kết quả ở bảng 2 dưới đây cho thấy nếu ta
thay đổi hàm lượng đường trong môi
trường nuôi cấy sẽ rút ngắn được đáng kể
thời gian phát sinh mẫu cũng như tăng tỷ
lệ phát sinh củ trên một mẫu nuôi cấy. Từ
đó rút ngắn được thời gian cho toàn bộ quá

trình nuôi cấy.
Bảng 2. Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến phát sinh củ nhỏ từ mô vảy củ lily
Công thức thí nghiệm Saccarose (g/l)
Số ngày sau cấy mẫu
phát sinh củ nhỏ
Số củ TB/mẫu
B1 30 55 - 60 2,48
B2 60 50 - 60 3,01
B3 90 40 - 50 3,27
B4 120 35 - 50 3,24
B5 150 40 - 50 3,17

Khi hàm lượng đường tăng dần, thời
gian phát sinh củ nhỏ được rút ngắn từ 5
cho đến 20 ngày. Tuy nhiên tỷ lệ tạo củ
chỉ đạt cao nhất khi hàm lượng đường có
trong môi trường là 90 g/l. Điều này cho
thấy: hàm lượng đường có tác động rất
lớn đến tỷ lệ tạo củ nhỏ. Trong nghiên
cứu quy trình ứng dụng sản xuất, bên
cạnh các chỉ tiêu về chất lượng, yếu tố
thời gian cũng như sản lượng luôn luôn là
yêu cầu thiết yếu nhất.

Ảnh 1. Củ lily phát sinh từ mô vảy củ
Bảng 3. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và αAA đến khả năng phát triển củ lily in vitro
Công thức

thí nghiệm
Số lượng

mẫu
αNAA
(mg/l)
BAP
(mg/l)
Khối lượng củ
ban đầu (g)
Khối lượng củ
sau 60 ngày nuôi (g)

C6 50
0,2
0,01 2,0 3,27
C7 50 0,03 1,9 5,13
C8 50 0,05 1,9 4,22
C9 50 0,07 1,8 3,87
C10 50 1,00 1,9 2,94

Từ những kết quả nghiên cứu, chúng
tôi nhận thấy BAP kết hợp với 0,2 mg/l
αNAA cho kết quả tăng trưởng tốt nhất.
Tương tự như nghiên cứu về khả năng tạo
củ nhỏ, kết quả của nghiên cứu này cũng
cho thấy tỷ lệ của tổ hợp BAP và αNAA tác
động rất mạnh lên mẫu nuôi cấy. Với hàm
lượng của αNAA là 0,2 mg/l, hàm lượng
của BAP tăng dần từ 0,01 -1 mg/l đã cho
những kết quả rất khác nhau. Và đạt được
kết quả tốt nhất ở công thức C7 với tỷ lệ
BAP: αNAA là 0,03 : 0,2 mg/l.

Bảng 4. Ảnh hưởng của hàm lượng đường, nước dừa và than hoạt tính
đến sinh trưởng của củ lily in vitro
CTTD

CTTN
Hàm lượng
Khối lượng củ ban đầu
(g)
Khối lượng củ
sau 60 ngày nuôi (g)
Đường Saccarose (g/l)
90 1,9 5,23
120 1,8 5,54
150 1,9 5,50
Nước dừa (ml/l)
50 1,9 5,61
100 1,8 6,28
150 1,9 6,24
Than hoạt tính (g/l)
0,5 1,9 6,35
1,0 1,8 6,42
1,5 1,8 6,40

Từ kết quả ở bảng 4 cho thấy để tăng chất
lượng củ lily in vitro, làm tăng khối lượng củ
tốt nhất, hàm lượng của đường có trong môi
trường là 120 g/l, hàm lượng của nước dừa là
10 ml/l và than hoạt tính là 1,0 g/l.

Ảnh 2. Củ lily in vitro sau 60 ngày nuôi

2. Giai đoạn ra ngôi ngoài vườn ươm
Củ đưa từ ống nghiệm ra đất đạt tỷ lệ
sống cao sẽ quyết định khả năng ứng dụng
của kỹ thuật nhân giống bằng phương pháp
này vào sản xuất củ giống. Chính vì vậy,
chỉ tiêu đầu tiên và quan trọng nhất của
khâu này là xác định được giá thể đưa cây
từ in vitro ra ex vitro. Kết quả thu được thể
hiện ở bảng 5.
Bảng 5. Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng bật chồi và sinh trưởng của cây
CTTN
Tỷ lệ bật chồi
(%)
Chiều cao cây
(cm)
Số lá
(cái)
Đường kính củ
sau thu hoạch vụ đầu (cm)

1 62,3 20,5 1,5 1,5
2 53,2 23,2 2,1 1,6
3 85,4 35,2 3,5 2,3
4 49,4 25,4 1,8 1,5
5 80,7 30,6 3,1 1,9
Ghi chú: 3 khay/công thức, 30 cây/khay.
CT1: Trấu hun + đất phù sa; CT2: Sơ dừa + trấu hun; CT3: Sơ dừa nghiền nhỏ.
CT4: Đất phù sa; CT5: Sơ dừa + đất phù sa.
Kết quả cho thấy công thức 3 và 4 cho
kết quả tốt nhất. Đặc biệt là công thức 3 với

tỷ lệ bật chồi đạt 85,4%, đường kính củ sau
thu hoạch đạt tới 2,3 cm vượt trội so với các
công thức khác, đặc biệt các chỉ số về sinh
trưởng như chiều cao cây cũng như số lá
trên một cây đều đạt chỉ số theo dõi cao
nhất. Kết quả này cho thấy, củ lily in vitro
trong giai đoạn vườn ươm cần được trồng
trong môi trường thoáng, xốp và giàu oxi.
Tuy nhiên phi gi Nm và thoát nưc tt.
 nâng cao cht lưng cũng như tăng
cưng kh năng sinh trưng ca cây. Trong
thi gian vưn ươm, ngoài nghiên cu các
ch s v giá th, chúng tôi tin hành nghiên
cu nh hưng ca mt s loi phân bón lá
n sinh trưng và phát trin ca cây.
Bảng 6. Ảnh hưởng của phân bón lá đến sinh trưởng của cây ngoài vườn ươm
CTTN Công thức TN
Chiều cao cây
(cm)
Số lá
(cái)
Đường kính củ sau thu hoạch
vụ đầu (cm)
CT1 Đối chứng 35,2 3,5 2,3
CT2 Komix 30,5 3,0 1,8
CT3 Chế phẩm Thiên nông 30,2 3,1 2,1
CT4 Đầu trâu 502 35,2 3,8 2,4
CT5 Atonik 30,6 3,3 1,9

Kết quả thu được, trên bảng 6 cho

thy vic s dng các ch phNm phân bón
lá có tác ng không ng u  các công
thc khác nhau, mt s công thc còn cho
thy nh hưng xu n cây trng khi so
sánh các ch tiêu vi i chng. Tuy
nhiên, phân bón lá “u trâu 502” cho kt
qu khá tt, các ch s như s lá, ưng
kính c sau thu hoch u cao hơn so vi
i chng. Vi công thc này, sinh
trưng và phát trin ca cây u vưt tri
so vi các công thc khác, c bit là kh
năng chu nhit, khi trng vào các tháng
có nhit  cao.

Ảnh 3. Củ lily giống Sorbone được xử lý trước khi đưa ra vườn ươm
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
7
IV. KẾT LUẬN
Điều kiện tối ưu cho nhân giống hoa lily Sorbone bằng kỹ thuật nuôi cấy mô in
vitro là:
- Môi trường cho tạo củ nhỏ lily là: MS + 90 g/l Sacarose + 0,01 g/l NAA + 0,4 mg/l
BAP + 6 g/l agar.
- Môi trường nuôi lớn củ nhỏ lily là: MS + 120 g/l Sacarose + 0,2 mg/l NAA + 0,03
mg/l BAP + 100 ml/l CW + 1 g/l than + 6 g/l agar.
- Nền giá thể tối ưu cho giai đoạn vườn ươm: Sơ dừa nghiền nhỏ.
- Phân bón cho cây lily giai đoạn vườn ươm: Phân Đầu trâu 502.
TÀI LIỆU THAM KHẢO:
1. Cao Thị Huyền Trang, Dương Minh ga, Đỗ Minh Phú, Đỗ ăng Vịnh, Hà Thị Thuý,
2006. Nghiên cứu tạo củ trực tiếp từ lát cắt vảy củ lily in vitro, T/C Nông nghiệp và Phát
triển nông thôn 2006/Số 8

2. Dương Tấn hựt, 2006. Hệ thống nuôi cấy bioreactor trong công nghệ sinh học thực
vật. Tạp chí Công nghệ sinh học,
4 (3): 265-283.
3. Dương Tấn hựt, Đỗ ăng Vịnh, 2004. Nuôi cấy lỏng và nuôi cấy thoáng khí trong
việc gia tăng sự tái sinh chồi và nâng cao chất lượng cây hoa lily (Lilium
longiflorum). Tạp chí Công nghệ sinh học, 2 (4): 487-499.
4. guyễn Thị Phương Thảo, 1999. Nghiên cứu tạo củ giống hoa loa kèn trong ống
nghim, Tp chí N ông nghip, Công nghip, Thc phNm 2/1999. 82-84
5. Takateru Ishimori, Yoshiji iimi, Dong-Sheng Han, 2009. In vitroflowering of Lilium
rubellum Baker. Scientia Horticulturae, 120, 246-249.
6. Rong-Yan Xu, Yoshiji iimi, Dong-Sheng Han, 2006. Changes in endogenous abscisic
acid and soluble sugars levels during dormancy-release in bulbs of Lilium rubellum.
Scientia Horticulturae, 111, 68-72.
7. J.M.Van Tuyl, M.P Van Dien, M.G.M. Van Creij, T.C.M.Van Kleinwee, J.Franken
and R.J.Bino: Application of in vitro pollination, ovary culture, ovule culture and
embryo rescue for overcoming incongruity barriers in interspecific Lilium crosses.
Plance Science, 74 (1991) 115-126. Elsevier Scientific Publishers Ireland Ltd
gười phản biện: Trần Duy Quý