Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn nhãn bản địa Việt Nam bằng kĩ thuật SSR (Microsatellite) potx

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN NHÃN BẢN ĐỊA
VIỆT NAM BẰNG KĨ THUẬT SSR (MICROSATELLITE)
Khuất Hữu Trung
1
, guyễn Trường Khoa
1
,
Trần Minh Hoa
1
, gô Hồng Bình
2
, Lê Thị
Tươi
3
, guyễn Xuân Viết
3
, Đặng Trọng
Lương
1

SUMMARY
Studying of genetics diversity of native longans in Vietnam utilizing SSR technique
Longan is an important crop in agricultural systems in Vietnam. The information on
level of genetic diversity and origin is very important for conservation gene resource,
selection and development of commercially important longan. In our study, 10 SSR
markers derived from lychee-a close kinship with longan- were used to evaluate genetic
diversity of local cultivars of longan. Genomic DA was extracted from 48 samples belong
to 22 local cultivars for the PCR amplification of the SSR loci. The PCR products were
resolved on denaturing polycrylamide gel. A total of 27 alleles were detected with an
average of 2.7 alleles per locus. Polymorphism information content (PIC) value ranges
from 0.0 to 0.75, with an average of 0.24. Heterozygosity percentage ranges from 0% to

30% data missing is 15%. Genetic similarity was determined using Jaccard’s similarity
coefficient and final dendrogram construction using a UPGMA clustering methods showed
that 48 samples were divided into 9 distinguished heterotic groups with genetic similarity
from 0.22 to 1.0. All of the information has diversified application in longan study in the
future.
Keywords: Dimocarpus longan, native, genetic diversity, heterozygosity, SSR makers.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây nhãn (Dimocapus longan Lour.)
thuộc họ Sapindaceae là loài cây ăn quả
nhiệt đới có giá trị kinh tế cao. Ở nước ta,
nhãn được trồng phổ biến và tập trung tại
một số khu vực hình thành các vùng chuyên
canh với nhiều giống nhãn nổi tiếng như:
Nhãn lồng Hương Chi và nhãn Đường Phèn
của Hưng Yên, nhãn cùi của Lào Cai, nhãn
tiêu Da Bò của Bà Rịa-Vũng Tàu, nhãn
xuồng Cơm Vàng của Tiền Giang Các
giống nhãn của Việt Nam chủ yếu được
chọn lọc, nhân giống và bảo tồn một cách
tự phát, các cá thể có phNm cht tt ưc
nhân lên, di thc và ưc t tên ch yu
da vào mt s các c im hình thái hoc
a im phát sinh. Vì vy, ã gây ra s
nhm ln và hiu sai v xut x, ngun gc
bn a và mi quan h di truyn gia các
ging. ây cũng chính là nguyên nhân làm
thu hp a dng di truyn và dn n tình
trng xói mòn ngun gen nhãn [2].
Chin lưc bo tn tài nguyên a dng

di truyn, nhn dng chính xác các ngun
gen phc v công tác lưu gi và ăng kí bn
1
Vin Di truyn N ông nghip;
2
Vin N ghiên cu Rau qu;
3
i hc Sư phm Hà N i.
quyn nhng cây trng bn a, c bit là
nhng cây có giá tr kinh t cao là rt cn
thit. Tuy nhiên,  Vit N am các báo cáo v
cây nhãn mi ch tp trung ch yu vào
nghiên cu các c tính nông hc và nghiên
cu a dng di truyn  mc hình thái [3,4].
Trong báo cáo này chúng tôi s dng 12 mi
SSR ã ưc thit k cho cây vi là mt cây
ăn qu có quan h di truyn gn vi cây
nhãn  nghiên cu a dng di truyn ca
tp oàn nhãn bn a ca Vit N am.
II. VT LIU VÀ PHƯƠN G PHÁP
N GHIÊN CU
1. Vật liệu nghiên cứu
- Vt liu s dng bao gm 48 mu
thuc 22 ging nhãn bản địa của Việt Nam
được thu tại vườn tập đoàn của Viện Nghiên
cứu Rau quả-Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội;
Viện Cây ăn quả miền Nam-Long Định,
Tiền Giang; và tại các địa phương đang
trồng phổ biến các giống nhãn này (bảng 1).
Bảng 1. Danh sách các giống nhãn nghiên cứu

TT Tên mẫu Nguồn gốc Địa điểm thu mẫu
1 Nhãn lồng (PH-S99-1.1) Hưng Yên Viện Nghiên cứu Rau quả
2 Nhãn lồng B14 Hưng Yên Viện Nghiên cứu Rau quả
3 Nhãn lồng (PH-M99-2.2) Hưng Yên Viện Nghiên cứu Rau quả
4 Nhãn cùi (YB-10) Yên Bái Viện Nghiên cứu Rau quả
5 Nhãn cùi (YB-28) Yên Bái Viện Nghiên cứu Rau quả
6 Nhãn cùi (LC-4) Lào Cai Viện Nghiên cứu Rau quả
7 Nhãn cùi (LC-9) Lào Cai Viện Nghiên cứu Rau quả
8 Nhãn cùi (LC11) Lào Cai Viện Nghiên cứu Rau quả
9 Đường Phèn Hưng Yên Hưng Yên Địa phương
10 Nhãn cùi (HTM-1) Hà Tây Viện Nghiên cứu Rau quả
11 Tiêu Da bò Tiền Giang Viện Cây ăn quả miền Nam
12 Xuồng Cơm Vàng Tiền Giang Viện Cây ăn quả miền Nam
13 Nhãn tiêu Lá Bầu Tiền Giang Viện Cây ăn quả miền Nam
14 Nhãn nước N1 Hưng Yên Viện Nghiên cứu Rau quả
15 Nhãn thóc T1 Hưng Yên Viện Nghiên cứu Rau quả
16 Nhãn lồng B10 Hưng Yên Viện Nghiên cứu Rau quả
17 Nhãn cùi B5 Hưng Yên Viện Nghiên cứu Rau quả
18 Nhãn lồng B7 Hưng Yên Viện Nghiên cứu Rau quả
19 Nhãn lồng DH3 Phú Thọ Viện Nghiên cứu Rau quả
20 Nhãn lồng VT22 Vĩnh Phúc Viện Nghiên cứu Rau quả
21 Nhãn lồng TQ20 Tuyên Quang Viện Nghiên cứu Rau quả
22 Nhãn cùi C2 Hưng Yên Viện Nghiên cứu Rau quả

- 12 cp mi SSR ưc s dng có ký
hiu t LMLY1 n LMLY12 (bng 2) do
hãng Invitrogen cung cp da vào các thông
tin v trình t lp, kích thưc, s alen trên
mi locus ã ưc Viruel và Hormaza phát
hin  cây vi (Viruel, Hormaza, 2004).

Bảng 2. Tên và trình tự các cặp mồi SSR
TT Cặp mồi Trình tự mồi xuôi Trình tự mồi ngược
1 LMLY1 TTTGTGTAATTTGTCGTACTT ATGAAAGATGAGAAGAAAAAG
2 LMLY2 AAGATGAGATGAGTGTTTTTAC GAATACTTTTTGACTTGTTCTC
3 LMLY3 GAGTAGATAAAAATGGTAATGG CACCTACACCTCCCTATATT
4 LMLY4 CAAATAACATGAAAAAGATGA ATGTCAATATGTCAGTGTCTCT
5 LMLY5 TGGAGAGGACATGATTACTA AAAGAGAATTGCACAGAAAC
6 LMLY6 AAGGAATAAAGCTATCAATAAA GATCTCTATCTCATCAAACCT
7 LMLY7 ACCTTCTTGAATAGGATAAAG TCAGATGAGATAGATTAGAAAGA
8 LMLY8 ATGATGGTAGAGGTCAAGTT CCCTATGAGAGAGAAAATATAA
9 LMLY9 CATTATCTTCTTTATTACCA CACAAGTATTTTCTCTGC
10 LMLY10 AATAGGGTTTGTGTAATTTGT ATATCAAAGGCGATAGATTC
11 LMLY11 GTTTTCATATTGGACTTATTTT ACTCATATTTCATTCTCTCACT
12 LMLY12 GAAGCTGTCTTACACTCCAC ACAAACCTAGAAACCAAAAG

2. Phương pháp nghiên cứu
- Tách chiết AD tổng số: Lá bánh
t ca các mu ging ưc thu thp, x
lý và tách chiết ADN tổng số theo
phương pháp CTAB như mô tả của
Cheng et al. (1994).
- Chạy PCR: Các phn ng PCR ưc
thc hin theo chu trình nhit: 94
0
C (5
phút), 35-37 chu kì [94
0
C (40s); 55
0
C-60

0
C
(30s), 72
0
C (30s-1 phút)] và kt thúc 
72
0
C (5 phút).
- Điện di sản phm PCR và nhuộm:
Sn phNm PCR ưc bin tính trưc khi
chy in di trên gel polyacrylamide 4,5%
và ưc phát hin bng phương pháp
nhum bc.
- Phương pháp phân tích và xử lý số
liệu: Kt qu ưc thng kê da vào s
xut hin hay không xut hin ca các băng
ADN; hệ số PIC (Polymorphic Information
Content-Chỉ số thông tin đa hình của mồi)
được tính theo công thức: PIC = 1- ΣP
i
2

(trong đó P
i
là tần số xuất hiện của alen thứ
i). Số liệu được xử lý, phân tích bằng
chương trình Excel version 5.0 và phần
mềm NTSYSpc 2.1
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Hệ số PIC, số alen và tổng số băng

AD thể hiện trên từng mồi
Kt qu phân tích 10 mi SSR vi 48
mu thuc 22 ging nhãn ưc trình bày 
bng 3.
Bảng 3. Hệ số PIC, số alen/locus và tổng số alen của từng mồi SSR
TT Cặp mồi Số alen/locus Tổng số alen/mồi PIC
1 LMLY1 2 44 0,05
2 LMLY2 4 46 0,57
3 LMLY3 3 51 0,31
4 LMLY4 - - -
5 LMLY5 1 48 0,00
6 LMLY6 2 54 0,19
7 LMLY7 3 54 0,12
8 LMLY8 - - -
9 LMLY9 1 42 0,00
10 LMLY10 6 24 0,75
11 LMLY11 4 52 0,41
12 LMLY12 1 43 0,00
Tổng 27 458 2,40
Trung bình 2,7 45,8 0,24
(-): không khuch i  c 22 ging nhãn nghiên cu
S liu  bng 3 cho thy: Trong s 12
cp mi SSR ca cây vi, có 10 cp mi
khuch i  c 22 ging nhãn nghiên cu
thu ưc tng s 27 loi alen, trung bình
2,7 alen/locus. Có 3 cp mi (LMLY5,
LMLY9 và LMLY12) ch thu ưc các
locus ơn hình; 7 cp mi (LMLY1,
LMLY2, LMLY3, LMLY6, LMLY7,
LMLY10 và LMLY11) cho các locus a

hình. Trong ó: 2 mi ch thu ưc 2 alen,
2 mi thu ưc 3 alen, 2 mi thu ưc 4
alen, 1 mi thu ưc 6 alen (bng 3). Tng
s alen thu ưc là 458 (trung bình là 45,8
alen/mi). H s a hình (PIC-Polymorphic
Information Content) ca 10 mi dao ng
t 0 ( các mi ch xut hin băng ơn
hình) n 0,75 ( mi LMLY10 có 6 alen
th hin); h s PIC trung bình ca c tp
oàn là 0,24.
2. Tỷ lệ dị hợp (H%) của các mẫu giống
nhãn nghiên cứu
T l các locus d hp (H%) cao nht là
25%  mu N32; các mẫu N10, N17, N34,
N42, N46 và N47 có mức dị hợp là 20%; 24
mẫu có mức dị hợp từ 11,1% đến 14,3%; 17
mẫu đồng hợp ở cả 10 locus nghiên cứu
(mức dị hợp là 0%). Như vậy, phân tích với
10 locus thì tỷ lệ dị hợp trung bình của cả
tập đoàn là khá thấp (8,7%). Kết quả trên
cũng cho thấy giữa các giống có sự khác
nhau về mức độ dị hợp; giữa các mẫu trong
cùng một giống cũng có sự khác nhau ở các
locus nghiên cứu. Những kết quả này rất
hữu ích để so sánh giữa các giống với nhau,
nghiên cứu đa dạng di truyền bên trong
giống, xác định nguồn gốc các mẫu giống
và nhận dạng chính xác những mẫu giống
(cá thể ưu việt) trong tập đoàn phục vụ
công tác chọn, tạo và nhân giống.

Hình 1. Kt qu in di sn phNm PCR ca 48 mu nhãn vi cp mi LMLY7 (marker φX174)
Bảng 4. Tỷ lệ dị hợp (H%) của các mẫu giống nhãn
dựa trên kết quả phân tích 10 locus SSR
TT Kí hiệu Tên giống H% TT Kí hiệu

Tên giống H%
1 N1 Nhãn lồng (PH-S99-1.1) 0 25 N25 Đường Phèn Hưng Yên 14,3
2 N2 Nhãn lồng (PH-S99-1.1) 0 26 N26 Đường Phèn Hưng Yên 12,5
3 N3 Nhãn lồng (PH-S99-1.1) 0 27 N27 Đường Phèn Hưng Yên 0
4 N4 Nhãn lồng B14 11,1 28 N28 Nhãn cùi (HTM-1) 0
5 N5 Nhãn lồng B14 0 29 N29 Nhãn cùi (HTM-1) 0
6 N6 Nhãn lồng B14 11,1 30 N30 Nhãn cùi (HTM-1) 10
7 N7 Nhãn lồng (PH-M99-2.2) 0 31 N31 Tiêu Da Bò 14,3
8 N8 Nhãn lồng (PH-M99-2.2) 10,0 32 N32 Tiêu Da Bò 25,0
9 N9 Nhãn lồng (PH-M99-2.2) 10,0 33 N33 Tiêu Da bò 0
10 N10 Nhãn cùi (YB-10) 20,0 34 N34 Xuồng Cơm Vàng 20,0
11 N11 Nhãn cùi (YB-10) 10,0 35 N35 Xuồng Cơm Vàng 11,1
12 N12 Nhãn cùi (YB-10) 11,1 36 N36 Xuồng Cơm Vàng 12,5
13 N13 Nhãn cùi (YB-28) 11,1 37 N37 Nhãn tiêu Lá Bầu 0
14 N14 Nhãn cùi (YB-28) 11,1 38 N38 Nhãn tiêu Lá Bầu 0
15 N15 Nhãn cùi (YB-28) 11,1 39 N39 Nhãn tiêu Lá Bầu 0
16 N16 Nhãn cùi (LC-4) 10,0 40 N40 Nhãn nước N1 0
17 N17 Nhãn cùi (LC-4) 20,0 41 N41 Nhãn thóc T1 11,1
18 N18 Nhãn cùi (LC-4) 12,5 42 N42 Nhãn lồng B10 20,0
19 N19 Nhãn cùi (LC-9) 0 43 N43 Nhãn cùi B5 10,0
20 N20 Nhãn cùi (LC-9) 0 44 N44 Nhãn lồng B7 11,1
21 N21 Nhãn cùi (LC-9) 11,1 45 N45 Nhãn lồng DH3 12,5
22 N22 Nhãn cùi (LC11) 0 46 N46 Nhãn lồng VT22 20,0
23 N23 Nhãn cùi (LC11) 11,1 47 N47 Nhãn lồng TQ20 20,0

24 N24 Nhãn cùi (LC11) 0 48 N48 Nhãn cùi C2 11,1
Trung bình 8,7

3. Kết quả phân tích mối quan hệ di
truyền của tập đoàn nhãn nghiên cứu
S liu thu ưc t 10 mi SSR ưc
thng kê và phân tích bng phn mm
NTSYSpc2.1, từ đó thiết lập được hệ số
tương đồng di truyền và sơ đồ cây quan hệ
chủng loại của các mẫu nhãn (hình 2).
Dựa vào sơ đồ hình cây cho thấy: Ở
mức tương đồng di truyền 57%, 48 mẫu
giống nhãn nghiên cứu được chia thành 2
nhóm lớn:
Nhóm I: Bao gồm 39 mẫu giống đều
thuộc các giống nhãn phân bố ở miền Bắc
được chia thành nhóm nhỏ hơn:
Nhóm 1.1 có 13 mẫu: N1, N2 và N46
thuộc các giống nhãn lồng N11, N12, N19,
N20, N22 và N24 thuộc các giống nhãn cùi;
N25 và N26 thuộc giống nhãn Đường Phèn
Hưng Yên; N40 thuộc giống nhãn nước;
N41 thuộc giống nhãn thóc. Trong đó các
nhóm mẫu (N1 và N40), (N2, N20, N24),
(N41, N46) và (N11, N12, N25 và N26) có
kiều gen tương tự nhau ở cả 10 locus nghiên
cứu (Hệ số tương đồng di truyền là 1).
Nhóm 1.2 gồm 9 mẫu: N10, N13, N14,
N15, N16, N17, N18 và N23 đều thuộc các
giống nhãn cùi; N42 thuộc giống nhãn lồng.

Trong đó, các mẫu trong các nhóm mẫu
(N10, N18), (N13, N14, N15, N16) và
(N17, N23) có kiểu gen tương tự nhau ở các
locus nghiên cứu (Hệ số tương đồng di
truyền là 1).
Nhóm 1.3 có 8 mẫu: N3, N5, N6, N7,
N8 và N9 thuộc giống nhãn lồng; N28 và
N30 thuộc giống nhãn cùi.
Nhóm 1.4 có 8 mẫu: N4, N44, N45,
N47 (nhãn lồng); N21, N29, N43, N48
(nhãn cùi).
Nhóm 1.5 có duy nhất mẫu N27 (giống
Đường Phèn Hưng Yên).
Nhóm II bao gồm 9 mẫu giống thuộc
các giống nhãn phân bố ở miền Nam được
chia thành 3 nhóm nhỏ hơn:
Nhóm 2.1 có 3 mẫu N31, N32 và N33
đều thuộc giống nhãn tiêu Da Bò. Trong đó
N31 và N32 có kiểu gen tương tự nhau và
có hệ số tương đồng di truyền với mẫu N33
là 0,83.
Nhóm 2.2 có 3 mẫu N34, N35 và N36
đều thuộc giống nhãn xuồng Cơm Vàng, có
kiểu gen tương tự nhau ở các locus nghiên
cứu (Hệ số tương đồng di truyền là 1).
Nhóm 2.3 có 3 mẫu N37, N38 và N39
đều thuộc giống nhãn tiêu Lá Bầu, có kiểu
gen tương tự nhau ở các locus nghiên cứu
(Hệ số tương đồng di truyền là 1).

Hình 2. Sơ đồ quan hệ chủng loại của 48 mẫu nhãn nghiên cứu
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
8
Kết quả phân nhóm cho thấy: Sự khác biệt giữa 2 nhóm lớn là các giống nhãn ở
miền Bắc và các giống nhãn ở miền Nam; các mẫu trong cùng một giống có hệ số
tương đồng di truyền cao được phân trong cùng một nhóm có thể là do được nhân giống
theo phương pháp nhân giống vô tính bằng chiết cành, ghép cành từ những cây có
chung một nguồn gốc; các mẫu cùng một giống có hệ số tương đồng thấp được phân ở
các nhóm khác nhau có thể do giống có nền di truyền rộng hoặc do sự di thực và gọi tên
theo tên địa phương khác nhau.
IV. KẾT LUẬN
Tập đoàn nhãn bản địa của Việt Nam rất đa dạng và phong phú, kết quả phân tích với
10 mồi SSR trên 48 mẫu thuộc 22 giống nhãn bản địa của Việt Nam đã thu được 27 loại
alen khác nhau (số alen thể hiện/mồi trung bình là 2,7); hệ số PIC dao động từ 0,0 đến
0,75 (trung bình 0,24); tỷ lệ các locus dị hợp của các mẫu nghiên cứu dao động từ 0%
đến 25,0%.
Ở mức tương đồng 57%, 48 mẫu nhãn được phân thành 8 nhóm khác biệt thuộc 2
nhóm lớn, hầu như các mẫu của mỗi giống đều nằm trong một nhóm riêng và có thể dễ
dàng phân biệt với các giống nhãn khác. Kết quả này là cơ sở để xác định các marker
phân tử nhận dạng chính xác các giống nhãn bản địa của Việt Nam.
Dựa vào sự sai khác giữa các mẫu trong cùng một giống (sự đa dạng di truyền bên
trong giống) có thể xác định nguồn gốc phát sinh của các mẫu giống, chọn ra các cá thể
ưu việt phục vụ công tác chọn, tạo giống, nhân giống và bảo tồn có hiệu quả các nguồn
gen nhãn quý của Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Billote ., Lagoda P.J.L., Risterucci A.M., Baurens F.C., 1999. Microsatellite-
enriched libraries: applied methodology for the development of SSR markers in
tropical crops. Fruits 54: 277-288.
2 Cheng Y.J., Guo W.W., Yi H.L., Pang X.M., Deng X.X., 2003. An efficient protocol
for genomic ADN extraction from Citrus species. Plant Mol. Biol. Reporter 21: 177.

3 Li M., Zheng X., Zhu Y., Wang X., Liang S., Li L. and Wu X., 2006, Development and
characterization of SSR markers in lychee (Litchi chinensis). Molecular Ecology
otes 6: 1205-1207.
4 Li M.F., Zheng X.Q., 2004. Development of SSR markers in lychee (Litchi chinensis).
Yichuan 26: 2911-2916.
5 Viruel M.A., Hormaza J.I., 2004. Development, characterization and variability
analysis of microsatellites in lychee (Litchi chinensis Sonn., Sapindaceae).
Theoretical Applied Genetics108: 896-902.
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
9
gười phản biện: GS.TSKH. Trần Duy Quý