Nghiên cứu chế tạo cảm biến ADN nhằm ứng dụng trong y học và thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
*****************





PHƯƠNG ĐÌNH TÂM




NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CẢM BIẾN ADN NHẰM
ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC VÀ THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Công nghệ vật liệu điện tử
Mã số: 62. 52. 92. 01






TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT

Hà nội – 2009
Công trình được hoàn thành tại: Đại học Bách khoa Hà nội



Người hướng dẫn khoa học:
GS.TS. Nguyễn Đức Chiến









Phản biện 1: GS.TS. Nguyễn Năng Định
Phản biện 2: PGS.TS. Nguyễn Văn Hùng
Phản biện 3: PGS.TS. Phạm Văn Hội




Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp nhà
nước họp tại Đại học Bách Khoa Hà nội, vào hồi 8h30 ngày 17
tháng 7 năm 2009

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
1. Đại học Bách khoa Hà nội
2. Thư viện Quốc gia



1. Phương Đình Tâm, Mai Anh Tuấn, Nguyễn Đức Chiến, Trần
Quang Huy, Electrochemical ADN sensor for Herpes virus
detection, Journal of Chemistry, 46 (2008), pp.127-132.
2. Phương Đình Tâm, Mai Anh Tuấn, Nguyễn Đức Chiến,
Fabrication Interdigitated electrode array for biosensor application,
journal of Communications in Physics, accepted
3. Phương Đình Tâm, Mai Anh Tuấn, Nguyễn Đức Chiến, ADN
covalent Attachment on Conductometric Biosensor for Modified
Genetic Soybean Detection, Communications in Physics, 17
(2007), pp. 234-240.
4. Phương Đình Tâm, Nguyễn Hải Bình, Mai Anh Tuấn, Nguyễn
Đức Chiến, Electrochemical ADN sensor for label – free soybean
transgenic detection, journal of Chemistry, 45 (2007), pp. 241-244.
5. Tuan. M. A, Binh. N. H, Tam. P. D, and Chien. N.D.
Conductometric biosensor for diabetic diagnosis and ADN
detection in transgenic corn, Communication physics, 15 (2005),
pp. 218-222.
3. Báo hội nghị quốc tế
1. Phương Đình Tâm, Mai Anh Tuấn, Nguyễn Đức Chiến, Tom
Aarnink, Directly Immobilized ADN Sensor for Label-free
Detection of Herpes Virus, The IEEE of 5th International

Conference on Information Technology and Application in
Biomedicine, ISBN 978-1-4244-2255-5, May 30-31, 2008, pp.
214-217.
2. T. D. Phuong, T. A. Mai, T. X. Vu, S. Ingebrandt, C. D. Nguyen,
DNA sensor based on carbon nanotubes for influenza virus (type
H5N1) detection, Proceeding of Eurosensor, 7-10/9/2008,
Dresden, Germany, 1177-1180.
3. T. Phuong Dinh, B. Nguyen Hai, T. Mai Anh, C. Nguyen Duc.
Development of ADN sensor for label – free transgenic detection
application. Processing of International Conference on
Engineering Physics, 2006, pp. 239-242.
4. Báo hội nghị trong nước
1. Phương Đình Tâm, Mai Anh Tuấn, Nguyễn Đức Chiến, Cố định
trực tiếp chuỗi ADN trên bề mặt cảm biến để xác định vi rút,
Tuyển tập báo cáo hội nghị vật lý chất rắn toàn quốc lần thứ 5,
Vũng tàu, 11-14/12/2007, 566-569


1
GIỚI THIỆU

Vi rút là một thực thể sống chưa có cấu tạo tế bào, kích thước trung
bình 10 - 100 nm. Các loại vi rút đều gây cho con người cũng như
động, thực vật những loại bệnh vô cùng nguy hiểm. Điển hình cho
các loại bệnh này là bệnh hội chứng suy giảm miễn dịch (sida) do vi
rút HIV gây ra, vi rút gây bệnh tả ở người, bệnh viêm loét chân tay
miệng. Gần đây là bệnh vi rút cúm gia cầm H5N1 đã giết chết hàng
trăm người trên thế gi
ới, trong đó có những công dân của Việt Nam.
Do vậy, cần phải có những phương pháp phát hiện sớm để nhận biết

nhanh các loại vi rút, đưa ra các kế hoạch phòng ngừa, bảo vệ thích
hợp, nhằm giảm thiểu những rủi do về con người cũng như về vật
chất do các loại vi rút gây lên.
Một lĩnh vực khác cũng đang được quan tâm đó là thực phẩm biến
đổi gen. Theo các nhà nghiên cứu sinh h
ọc, cây chuyển gen là một
thực vật mang một hoặc nhiều gen được đưa vào nhân tạo thay vì
thông qua lai tạo. Thông qua quá trình chuyển gen, cây chuyển gen
đã đem lại những lợi ích như: tăng sản lượng, giảm chi phí sản xuất,
tăng giá trị dinh dưỡng. Mặc dù có nhiều lợi ích như vậy, nhưng cây
chuyển gen vẫn có những nguy cơ tiềm ẩn như: việc vô tình đưa
những chất dị ứng vào th
ực phẩm, khả năng phát tán những gen biến
nạp trong cây trồng sang họ hàng hoang dại, sâu bệnh có nguy cơ
tăng cường sức kháng với các chất độc tiết ra từ cây chuyển gen,
nguy cơ những chất độc này tác động tới các sinh vật không phải là
sinh vật cần diệt. Do đó, cần phải có những kết luận mang tính khoa
học để đánh giá tác động của loại thực phẩm này đến đời s
ống xã
hội. Trong khi chờ đợi những kết luận cuối cùng thì cây chuyển gen
vẫn chưa được cả xã hội chấp nhận sử dụng rộng rãi. Việc tìm hiểu
các thông tin về thực phẩm chuyển gen là vấn đề thực sự được nhiều
quốc gia quan tâm.
Hiện nay, trên thế giới có rất nhiều phương pháp được sử dụng để
phát hiện ADN của vi rút gây bệnh hay nhận biết ADN củ
a cây trồng
chuyển gen như: phương pháp phản ứng chuỗi polyme (PCR),
phương pháp nhận biết các kháng nguyên - kháng thể, phương pháp
ELISA. Đây là các phương pháp cho kết quả sau từ một đến vài giờ,
thậm chí đến 24 giờ.

Ở Việt nam, các phương pháp phân tích truyền thống như như PCR,
ELISA v.v… thường chỉ được sử dụng ở các bệnh viện lớn, các
trung tâm nghiên cứu của Trung ương hoặc các thành phố lớn.
Những phươ
ng pháp này thường không hiệu quả về mặt kinh tế, thời
2
gian phân tích lâu, quá trình phân tích đòi hỏi người sử dụng phải có
chuyên môn.
Một phương pháp khác có thể bổ sung cho các phương pháp nói trên,
để nhận biết vi rút hay phát hiện chuyển gen là dựa vào sự phát hiện
lai hóa đoạn ADN của vi rút hay thực phẩm chuyển gen sử dụng các
cảm biến sinh học. Đây là loại cảm biến cho độ nhạy cao, thời gian
phân tích nhanh, dễ dàng sử dụng, và đặc biệt nhờ kích thước nhỏ
gọn người ta có th
ể sử dụng những loại cảm biến này tại những vùng
xa xôi, hẻo lánh. Phương pháp phân tích này có thể được coi như
một biện pháp phát hiện sớm, bổ sung tích cực cho các phương pháp
phân tích truyền thống tại các phòng thí nghiệm và bệnh viện lớn.
Hiện nay, số lượng cảm biến sinh học được thương mại hóa chưa
phải là nhiều, trong khi đó, sử dụng cảm biến sinh học để xác định s
ự
lai hóa các đoạn ADN vẫn còn là điều khá mới mẻ cho những người
làm xét nghiệm, do giá thành của loại cảm biến này nhập về Việt
Nam khá đắt, trong khi ở nước ta vẫn chưa có cơ sở nghiên cứu nào
thực hiện nghiên cứu, chế tạo loại cảm biến này. Chính vì vậy, vấn
đề đặt ra cho luận án là phải nghiên cứu khả năng phát triển loại cảm
biến ADN có chế
độ hoạt động đơn giản, phát hiện nhanh, chính xác,
dễ dàng sử dụng. Luận án “Nghiên cứu chế tạo cảm biến ADN
nhằm ứng dụng trong y học và thực phẩm” là nghiên cứu mở đầu

về loại cảm biến sinh học này ở Việt nam. Với mục tiêu nghiên cứu,
chế tạo cảm biến ADN với điều kiện công nghệ hiện có ở trong
nước, luận án
đặt ra các nhiệm vụ cần phải giải quyết là: thiết kế cảm
biến phù hợp với điều kiện công nghệ trong nước, tiến hành thực
nghiệm chế tạo cảm biến, khảo sát các đặc trưng của cảm biến đã chế
tạo, đo đạc với mẫu bệnh phẩm thực tế do Viện vệ sinh dịch tễ Trung
ương và một số c
ơ sở khác có liên quan cung cấp. Trên cơ sở đó, rút
ra được những kết luận về khả năng chế tạo loại cảm biến này ở
trong nước, đưa ra những đề xuất làm cơ sở cho các định hướng
nghiên cứu sau này về lĩnh vực cảm biến sinh học ADN. Từ những
mục tiêu đặt ra của luận án, nội dung chính của luận án sẽ được chia
làm 4 chương:
Chươ
ng 1: Tổng quan về cảm biến ADN
Chương 2: Nghiên cứu, thiết kế, chế tạo và các đặc trưng của cảm
biến độ dẫn
Chương 3: Nghiên cứu cố định ADN
Chương 4: Nghiên cứu ứng dụng cảm biến ADN trong y học và thực
phẩm
3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ CẢM BIẾN ADN

1.1 Giới thiệu về cảm biến sinh học
Cảm biến sinh học là loại cảm biến bao gồm phần cảm nhận sinh học
kết hợp với bộ chuyển đổi tín hiệu như được mô tả trong hình 1.1.
Thành phần cảm nhận sinh học
là loại vật liệu sinh học được
liên kết với bộ chuyển đổi, nó

có thể liên kết hoặc phản ứ
ng
với cơ chất (chất cần phân tích)
sinh ra sản phẩm làm thay đổi
tín hiệu sinh hoá trong quá trình
phân tích. Hiện nay, thành phần
cảm nhận sinh học được sử dụng chủ yếu là các loại enzym, đoạn
ADN, ARN, các kháng thể và các vật liệu sinh học khác.
Trong cảm biến sinh học, bên cạnh thành phần cảm nhận sinh học
còn có một bộ phận rất quan trọng khác, đó là bộ chuyển đổi hay còn
được gọi là cảm bi
ến. Đây là thành phần chuyển đổi các tín hiệu
không điện do các phản ứng sinh học tạo ra thành các tín hiệu điện,
quang, cơ hoặc nhiệt.
1.2 Cảm biến sinh học trên cơ sở ADN
Cảm biến ADN là một loại thuộc họ cảm biến sinh học, thay vì sử
dụng phần cảm nhận sinh học thông thường là enzym, kháng thể
v.v… thì cảm biến sinh học ADN sử dụng phần cả
m nhận sinh học là
các đoạn ADN. Quá trình nhận biết ADN cần phân tích dựa trên sự
lai hóa của đoạn ADN dò được gắn trên bề mặt bộ chuyển đổi (cảm
biến) và ADN đích (ADN cần phát hiện).
Cảm biến ADN đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau
như: phát hiện vi rút, vi khuẩn gây bệnh, phát hiện chuyển gen của
cây trồng, xác định các ion kim loại nặng trong lĩnh vực bảo v
ệ môi
trường.
1.3 Các bộ chuyển đổi sử dụng trong cảm biến ADN
1.3.1 Cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi quang
Cảm biến sợi quang

Cảm biến trên cơ sở sợi quang kết hợp với các mô đun điện tử đã
được nghiên cứu khá kỹ trong hơn một thập kỷ qua. Trong phép đo
quang, người ta phải sử dụng những vật liệ
u có khả năng phát hoặc
H
ình 1.1.
C
ấu tạo của cảm biến sinh học
4
hấp phụ quang học, những vật liệu này thường được gắn lên các
phần tử cảm nhận sinh học (ADN), về điều này cảm biến sinh học sử
dụng bộ chuyển đổi quang thường được gọi là phương pháp đánh
dấu. Chất đánh dấu thường được sử dụng là brôm ethidium (3.8 –
diamino – 6 – phenyl – 5 – ethy – phenanthridium), picogreen, và
một số chất khác.
Cảm biến cộng hưởng plasmon bề mặ
t
Một loại cảm biến ADN khác cũng dựa trên bộ chuyển đổi quang
học là hệ thống cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR). Đây là cảm biến
không đòi hỏi phải đánh dấu đoạn ADN, kết quả của phép đo có thể
được hiển thị ngay trong quá trình đo. Hệ thống này dựa trên sự thay
đổi góc cộng hưởng của ánh sáng phản xạ ở bề mặt cả
m biến, khi có
sự lai hóa của đoạn ADN dò và ADN đích. Sự thay đổi này sẽ tương
ứng với sự thay đổi khối lượng phân tử tồn tại ở bề mặt cảm biến.
1.3.2 Cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi cơ học
Cảm biến ADN trên cơ sở vi cân tinh thể thạch anh (QCM)
Cảm biến QCM được chế tạo trên phiến tinh thể thạch anh mỏng
bằng cách lắng đọng lên đó một lớp kim loại (thông thường là vàng)
ở hai mặt phiến tạo thành một cặp điện cực. Để phát hiện lai hóa các

đoạn ADN, trên bề mặt lớp kim loại phải được gắn đoạn ADN dò.
Quá trình phát hiện lai hoá dựa vào sự thay đổi khối lượng trên bề
mặt cảm biến khi có bắt cặp bổ sung của đoạn ADN dò và đoạn
ADN đ
ích trong dung dịch phân tích để hình thành nên đoạn xoắn
kép. Sự thay đổi về khối lượng sẽ làm thay đổi tần số Δf của linh
kiện.
Cảm biến sóng âm bề mặt (SAW)
Nguyên tắc của cảm biến này là dựa trên cơ sở nhận biết sóng âm bề
mặt thông qua sự thay đổi khối lượng trên bề mặt cảm biến, sẽ làm
thay đổi vận tốc truyền sóng, dẫn đến s
ự thay đổi tần số cộng hưởng
của tinh thể khi có liên kết của đoạn ADN đích với đoạn ADN dò.
Cảm biến ADN kiểu thanh dầm
Đây là loại cảm biến dựa vào sự thay đổi ứng suất bề mặt của một
thanh dầm làm việc so với một thanh dầm chuẩn khi có sự bắt cặp
của đoạn ADN dò và đoạn ADN bổ sung hình thành đ
oạn xoắn kép
trên bề mặt cảm biến.


5
1.3.3 Cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi điện hoá
Cảm biến ADN sử dụng các phương pháp đánh dấu đoạn ADN
Cảm biến ADN trên cơ sở chất chỉ thị hoạt động điện
Đây là phương pháp nhận biết lai hoá dựa vào sự khử của chất chỉ thị
điện hoạt hoá được gắn vào đoạn ADN đích. Đo
ạn ADN dò được cố
định trên bề mặt cảm biến bằng nhiều phương pháp khác nhau. Khi
có sự kết cặp của đoạn dò và đích sẽ hình thành đoạn xoắn kép, dẫn

đến nồng độ của chất chỉ thị sẽ tăng ở bề mặt cảm biến, làm thay đổi
tín hiệu điện hóa trong quá trình đo. Kết quả này có thể được nhận
biết bằng các ph
ương pháp xung, thế tuần hoàn hoặc bằng phương
pháp quét thế không đổi. Những chất chỉ thị thường được sử dụng là
Co(bpy)
3
3+
, Ru(bpy)
3
2+
, Co(phen)
3
3+
hoặc các chất hữu cơ có thể liên
kết theo những cách khác nhau đối với đoạn ADN.
Cảm biến ADN sử dụng hạt nano
Có hai phương pháp phổ biến sử dụng hạt nano để nhận biết ADN là
điện hóa học hạt nano kim loại ở điện cực được cố định AND dò khi
có sự bắt cặp của đoạn ADN bổ sung, hoặc sau khi lai, hóa hạt nano
được hòa tan trong dung dịch axít sau
đó đo tính chất điện hóa.
Một đặc điểm khi sử dụng hạt nano kim loại để nhận biết lai hóa là
khả năng phát hiện nhiều ADN đích cùng một lúc. Các đoạn ADN
đích khác nhau có thể được mã hóa với nhiều hạt nano kim loại khác
nhau. Tín hiệu của quá trình lai hóa có thể nhận được bằng việc phân
tích tín hiệu điện hóa lượng kim loại khi hòa tan trong dung dịch
axít. Tuy nhiên, đây là phương pháp tương đố
i phức tạp, tín hiệu của
cảm biến là không ổn định, mẫu phân tích sẽ bị phá hủy khi bị hòa

tan trong dung dịch.
Cảm biến điện hoá ADN không đánh dấu
Cảm biến ADN dựa vào sự ôxi hóa của các bazơ trong đoạn ADN
Đây là loại cảm biến dựa vào việc kiểm tra dòng ôxi hóa của các
bazơ purine, adenine và đặc biệt là sự ôxi hóa mạnh của bazơ
guanine làm cơ sở phân tích. Để khuếch
đại tín hiệu điện hóa,
Ru(bpy)
3
2+

đã được sử dụng làm xúc tác của cho quá trình ôxi hóa
các bazơ.
Cảm biến ADN dựa trên transistor hiệu ứng trường ISFET
Cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi transistor hiệu ứng trường
nhạy ion (ISFET) là loại cảm biến có kích thước nhỏ, độ nhạy cao,
quá trình phát hiện không cần đánh dấu đoạn ADN.
6
Quá trình nhận biết lai hóa dựa vào sự bắt cặp của ADN dò và đích
trên bề mặt ISFET dẫn đến sự tăng mật độ điện tích ở sát bề mặt cảm
biến. Điều này sẽ làm thay đổi điện áp trong kênh dẫn, làm cho tín
hiệu ra của cảm biến thay đổi.
Cảm biến ADN trên cơ sở vi điện cực độ dẫn
Cảm biến vi điệ
n cực đã được sử dụng phổ biến do có những ưu
điểm như: giá thành thấp, cấu trúc đơn giản, độ ổn định cao, đáng tin
cậy, không cần điện cực chuẩn, quy trình công nghệ chế tạo đơn
giản, phân tích nhanh và dễ dàng. Đây là loại cảm biến dựa trên sự
thay đổi độ dẫn điện ở lân cận bề mặt cảm biế
n khi có sự thay đổi về

tính chất vật lý, hoá học hoặc sinh học trong dung dịch phân tích.
Khi đó, sẽ làm thay đổi tín
hiệu điện ở đầu ra của cảm
biến. Hiện nay, vi điện cực
được sử dụng nhiều nhất để
ứng dụng cho cảm biến nói
chung và cảm biến sinh học
nói riêng là vi điện cực có
dạng hình tròn và đặc biệt là
các vi điện cực planar có c
ấu
trúc các thanh kim loại kích thước micromet đan xen (intedigitated
array (IDA)). Các vi cảm biến này được chế tạo lên trên một đế cách
điện bằng cách lắng đọng các kim loại quý như Au hoặc Pt trên các
khuôn định dạng.
Cũng như các loại cảm biến ADN khác, để xác định lai hoá đoạn
ADN, trên bề mặt cảm biến phải được cố định đoạn ADN dò. Quá
trình xác định lai hóa đoạn ADN dựa trên sự bắt cặp củ
a đoạn ADN
dò và ADN bổ sung hình thành đoạn xoắn kép (hình 1.2). Khi đó, sẽ
có sự thay đổi độ dẫn ở lân cận bề mặt cảm biến. Sự thay đổi độ dẫn
này được nhận biết bởi cảm biến và được chuyển thành tín hiệu điện
ở đầu ra.
CHƯƠNG 2
NGHIÊN CỨU, THIẾT KẾ, CHẾ TẠO VÀ CÁC ĐẶC
TRƯNG CỦA CẢM BIẾN ĐỘ DẪN

2.1 Thiết kế cảm biến
Thiết kế mặt nạ (MASK) cho vi cảm biến

H
ình 1.2.
C
ảm biến ADN vi điện cực độ dẫn
7
Trong công nghệ vi điện tử, mặt nạ (Mask) có vai trò truyền tải các
chi tiết của hệ thống được thiết kế lên phiến silíc. Mask còn được
hiểu như là các khuôn ánh sáng trong quá trình quang khắc (photo
lithography). Khi chiếu ánh sáng tử ngoại qua Mask lên lớp cảm
quang phủ trên bề mặt phiến silíc, ánh sáng tử ngoại sẽ làm biến đổi
tính hoà tan của cảm quang tại khu vực được chiếu sáng, tạo ra hình
ảnh giống như hình ảnh của Mask lên lớ
p cảm quang. Nhờ vậy, sẽ
tạo ra hình ảnh thực của linh kiện cần
chế tạo lên bề mặt phiến silíc.
Các loại Mask được thiết kế trong
luận án dựa trên 2 phần mềm là
Coreldraw và Clewin. Ở giai đoạn
nghiên cứu thử nghiệm, nhằm khảo sát
các kích thước thực, phù hợp với các
điều kiện công nghệ hiện có, mẫu thiết
kế được thay đổi nhiều l
ần, nên việc
chế tạo Mask theo quy chuẩn là rất tốn
kém và phức tạp. Do vậy, các Mask
được thiết kế trên CorelDraw có độ
chính xác của các chi tiết cỡ 1 μm.
Sau đó, Mask được in laze trực tiếp từ máy tính lên phim nhựa đen
trắng bằng máy in chuyên dụng, có độ phân giải cao, tỷ lệ 1:1. Hình
2.1 mô tả một số loại mask sau khi được chế tạo.

Với cấu hình vi cảm biến có các chi tiết nhỏ
hơn 10 μm, để đảm bảo
độ chính xác về kích thước của cảm biến, Mask đã được thiết kế trên
Clewin sau đó được in trên thủy tinh hữu cơ (hình 2.2).
2.2 Chế tạo cảm biến
Chế tạo cảm biến có kích thước các thanh kim loại làm điện cực lớn
hơn 20
μ
m
Hình 2.3a biểu diễn sơ đồ quy trình chế tạo của cảm biến có kích
thước các thanh kim loại làm điện cực lớn hơn 20 μm. Đầu tiên,


H
ình 2.2.
C
ấu hình cảm biến được thiết kế bằng Clewin
BiosensorBiosensor
§iÖn cùc ®é dÉn
70 - 30
BiosensorBiosensor
§iÖn cùc ®é dÉn

80 - 60
BiosensorBiosensor
§iÖn cùc ®é dÉn
40 - 20
BiosensorBiosensor
§iÖn cùc ®é dÉn
60 - 40
Hình 2.1. Cấu hình cảm biến thiế
t

k
ế t
r
ên CorelDraw
Formatted: Fo
8
phiến silíc được làm sạch bề mặt bằng các phương pháp khác nhau,
sau đó, được ô xi hóa tạo lớp ôxít có chiều dầy thích hợp. Tiếp theo,
phiến silíc được sử dụng để tạo hình linh kiện bằng quá trình quang
khắc.
Sau quang khắc là quá trình phún xạ Cr/Pt để tạo điện cực kim loại
trên bề mặt phiến Si. Cuối cùng là tẩy lớp cảm quang (lift-off) để thu
được các cảm biến. Sau quá trình này là các công đoạn cắt phiến, hàn
dây, và
đóng gói cảm biến.
Chế tạo cảm biến có kích thước các thanh kim loại làm điện cực nhỏ
hơn 10
μ
m
Việc chế tạo cảm biến có kích thước nhỏ hơn 10 μm là khó hơn do

giới hạn độ phân giải của máy quang khắc, điều kiện công nghệ hiện
có trong nước. Vì vậy, để đảm bảo được chất lượng linh kiện, với các
cảm biến có kích thước nhỏ hơn 10 μm, quy trình công nghệ chế tạo
được mô tả theo sơ đồ hình 2.3b. Theo sơ đồ này, ngoài các quá trình
làm sạch, ôxi hóa và quang khắ
c còn có thêm bước lắng đọng nhôm
để làm lớp màng hy sinh trong quá trình chế tạo cảm biến. Lớp nhôm
thu được trên bề mặt phiến silíc được thực hiện bằng phương pháp
bốc bay, đóng vai trò tạo hình linh kiện sau quá trình quang khắc.
Sau khi bốc bay nhôm, phiến được quang khắc và hiện hình. Sau đó,
tiến hành ăn mòn nhôm để tạo hình linh kiện. Tiếp theo, phiến silíc
được phún xạ Cr/Pt và cuối cùng là ăn mòn phần kim loại không cần
thiết để hình thành các vi cảm biế
n.
2.3 Các đặc trưng của cảm biến
Ảnh hưởng của khoảng cách thanh kim loại làm điện cực đến tín
hiệu ra của cảm biến
Các thông số kích thước có ảnh hưởng rất lớn đến giá trị điện dung
của cảm biến – một thông số liên quan đến tín hiệu ra của cảm biến.

(a) (b)
Hình 2.3. Quy trình chế tạo cảm biến có kích thước chiều rộng và khoảng cách các
thanh kim loại làm điện cực >20
μ
m (a), < 10
μ
m (b)
9
Cảm biến có khoảng cách các thanh kim loại làm điện cực càng lớn
thì điện dung càng giảm và ngược lại. Theo các nghiên cứu của các

tác giả trước, khi đó, hằng số hệ đo K sẽ
tăng, dẫn đến tín hiệu ra của cảm biến
giảm, hay nói cách khác, tín hiệu ra của
cảm biến giảm khi điện dung giảm. Trong
luận án này, các thế hệ cảm biến được
chế tạ
o tại Đại học Bách khoa Hà Nội.
Với khoảng cách giữa các thanh kim loại
làm điện cực được thay đổi từ 2.5 μm đến
60 μm, chiều rộng được giữ cố định ở 10
μm. Hình 2.5 mô tả sự phụ thuộc tín hiệu
ra của cảm biến tỷ lệ nghịch với khoảng cách giữa các thanh kim loại
làm điện cực. Với cảm biến có khoảng cách giữ
a các thanh kim loại
càng lớn thì tín hiệu ra càng nhỏ. Khi tăng khoảng cách giữa các
thanh kim loại từ 2.5 μm đến 60 μm, tín hiệu ra của cảm biến giảm
từ 4 mV đến gần 1.2 mV theo hàm y = - 0.054X + 3.98.
Ảnh hưởng của chiều rộng thanh kim loại làm điện cực đến tín hiệu
ra của cảm biến
Trong quá trình nghiên cứu cảm biến chúng tôi thấy rằng, chiều rộng
của các thanh kim loại làm điện cực cũ
ng
ảnh hưởng đến tín hiệu ra của cảm biến
như được mô tả trong hình 2.6. Ở đây,
chiều rộng các thanh kim loại làm điện
cực được thay đổi theo thứ tự 80 µm, 70
µm, 20 µm, 10 µm, 5 µm, 2.5 µm.
Khoảng cách giữa các thanh kim loại
được cố định ở 10 µm. Từ hình 2.6 có thể
thấy rằng, tín hiệu ra của cảm biến phụ

thuộc vào chiều rộng các thanh kim loại
làm điện cực sẽ tă
ng tuyến tính bậc nhất
theo hàm y = 0.033X + 0.8. Ở cảm biến có giá trị chiều rộng thanh
kim loại làm điện cực là 80 µm thì tín hiệu ra của cảm biến cao nhất
ở xấp xỉ 3.5 mV.
Ảnh hưởng của số lượng thanh kim loại làm điện cực đến tín hiệu ra
của cảm biến
Trong luận án này, trên một đơn vị diện tích đã được xác định (1.2
mm x 1.5 mm) số lượng các thanh kim loại làm điệ
n cực đã được
thay đổi lần lượt là 280, 140, 70, 35 tương ứng với sự thay đổi kích
H
ình 2.6. Tín hiệu ra của cảm
biến phụ thuộc vào chiều
r
ộng các thanh kim loại

Hình 2.5. Tín hiệu ra của cảm
biến phụ thuộc vào khoản
g

cách giữa các thanh kim loại
10
thước về khoảng cách và chiều rộng thanh kim loại làm điện cực là
2,5 µm; 5 µm; 10 µm; 20 µm. Như biểu diễn ở hình 2.7, số lượng các
thanh kim loại tăng, sẽ làm tăng độ phân giải của các thanh kim loại
trên bề mặt cảm biến, làm cho sự di chuyển các điện tích giữa các
thanh kim loại làm điện cực nhanh hơn, do đó, làm tăng tín hiệu ra
của cảm biến. Giá trị này tăng tuyến tính theo hàm y = 0.01x + 0.13.

Đặc trư
ng tần số
−
điện áp của cảm biến
Để xác định đặc trưng tần số − điện áp, cảm biến đã được đo trên
máy lock − in RS − 830 của Stanford. Các phép đo được thực hiện ở
nhiệt độ phòng (25
0
C) trong dung dịch KCl có nồng độ 1 mM. Hình
2.8 mô tả tín hiệu ra của cảm biến phụ thuộc vào tần số dòng điện
được lấy trung bình trong 5 lần đo khác nhau. Có thể thấy rằng, khi
tăng tần số, điện áp nối ra giảm dần. Ở một tần số xác định, tín hiệu
ra của các cảm biến là khác nhau do phụ thuộc vào số lượng các các
thanh kim loại làm điện cực có trên cảm biến, kho
ảng cách, độ rộng
giữa chúng.
Xác định độ dẫn của cảm biến sử dụng phổ tổng trở

Vi cảm biến có kích thước về chiều rộng và khoảng cách các thanh
kim loại làm điện cực là 10 μm x 10
μm đã được sử dụng để xác định độ
dẫn của dung dịch KCl ở các nồng độ
khác nhau. Đặc trưng độ dẫn của dung
dịch được mô tả bằng đường Nyquist
của phổ tổng trở, nơi biểu diễn mối
quan hệ giữa đi
ện trở phần thực và
điện trở phần ảo của dung dịch như
được mô tả trong hình 2.9. Từ hình
2.9 chúng ta thấy rằng, ứng với mỗi

Hình 2.7. Tín hiệu ra của cảm biến
phụ thuộc vào số lượng các thanh
kim loại làm điện cực
Hình 2.8. Đặc trưng tần số
−
điện áp
của cảm biến có kích thước các thanh
kim lo
ạ
i làm đi
ệ
n c
ự
c khác nhau

H
ình 2.9. Đường cong Nyquist của
cảm biến trong dung dịch KCl,
nồng độ 0.05 mM, 0.1 mM, 1 mM
11
nửa đường tròn sẽ tương ứng với một trở kháng hay nói cách khác là
tương ứng với một độ dẫn của dung dịch. Với dung dịch có nồng độ
càng cao thì nửa đường tròn càng nhỏ, độ dẫn của dung dịch do cảm
biến đo được là càng lớn và ngược lại. Do vậy, có thể khẳng định,
cảm biến đã chế tạo có thể đo được độ dẫn c
ủa dung dịch ở các nồng
độ khác nhau.
Phổ tổng trở của vi cảm biến có kích thước chiều rộng và khoảng
cách các thanh kim loại làm điện cực khác nhau

Để xác định khả năng dẫn của các cảm biến đã được chế tạo, tác giả
đã sử dụng phổ tổng trở như được mô tả trong hình 2.10. Tất cả các
cảm biến được đo trong dung dịch KCl
có nồ
ng độ 0.5 mM, ở nhiệt độ phòng.
Từ hình 2.10 chúng ta có thể thấy rằng,
với vi cảm biến có kích thước chiều
rộng, khoảng cách các thanh kim loại
làm điện cực là 2.5 μm x 2.5 μm có điện
trở nhỏ nhất tương ứng với bán kính
vòng tròn bé nhất trên đường Nyquist
của phổ tổng trở. Tiếp đó tăng dần cho
đến vi cảm biến có kích thước 80 μm x
60 μm. Đi
ều này chỉ ra rằng, cảm biến
có kích thước 2.5 μm x 2.5 μm có số lượng các điện cực trên cùng
một đơn vị diện tích lớn nhất thì khả năng dẫn tốt nhất.
Kết luận
Do toàn bộ quy trình chế tạo cảm biến đều được thực hiện trong
nước, nên để chế tạo các loại cảm biến có kích thước nhỏ hơn 10 μm
tác giả đã sử dụng lớp màng nhôm có vai trò như một lớp màng hy
sinh để tạo khuôn hình dạng của cảm biến. Điều này, giảm được tối
đa số lượng cảm biến bị sai hỏng sau chế tạo.
Đặ
c trưng của cảm biến đã được khảo sát trên cơ sở đo sự phụ thuộc
tín hiệu ra vào chiều rộng, khoảng cách, số lượng các thanh kim loại
làm điện cực. Kết quả đã chỉ ra cho thấy, cảm biến phụ thuộc tỷ lệ
thuận với chiều rộng, số lượng các thanh kim loại và tỷ lệ nghịch với
khoảng cách giữa các thanh kim loại làm
điện cực.

Đặc trưng độ dẫn của cảm biến đã được xác định bằng phép đo phổ
tổng trở trong dung dịch KCl có các nồng độ khác nhau. Kết quả đã
đã chỉ ra với dung dịch có nồng độ càng cao, thì độ dẫn cảm biến đo
được càng tốt và ngược lại.
H
ình 2.10. Đường Nyquist của
cảm biến có kích thước các
thanh kim loại làm điện cực
khác nhau trong 0.5 mM KCl
12
CHƯƠNG 3. NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH ADN
3.1 Phương pháp điện hoá
Đường cong vôn - ampe cố định đoạn ADN dò
Thông thường, pyrrole được polyme hóa cùng với sự có mặt của các
chất pha tạp khác nhau như: Cl
-
,
NO
3
-
, ClO
4
-
. Các đoạn ADN cũng
có thể coi như là các tạp anion
trong quá trình polyme hóa
pyrrole ở điện cực làm việc. Điều
này sẽ cho phép sự kết hợp đoạn
ADN vào trong lớp màng polyme
thông qua sự phân bố điện tích

của nhóm phốt phát trong đoạn
ADN. Đường cong vôn – ampe
của quá trình polyme hoá Ppy và
Ppy/ADN trên bề mặt cảm biến ở
dải điện thế quét từ - 0.7 V đến 0.6 V, tốc độ quét 100 mV/s trong
dung dị
ch 0.1 M LiClO
4
được mô tả trong hình 3.1. Ở đây, quá trình
polyme hóa có thể xẩy ra theo các giai đoạn: đầu tiên là sự ô xi hóa
của các monome pyrrole dẫn đến sự hình thành các cation radical,
tiếp theo là quá trình ô xi hóa của các dimer để hình thành lên lớp
màng polyme tích điện dương. Khi đó, sẽ cho phép sự tương tác giữa
điện tích dương của màng polyme và điện tích âm của đoạn ADN
hình thành lên lớp màng Ppy/ADN dẫn đến một sự tăng dòng trong
quá trình điện hoá.
Ảnh hưởng của nồng độ
ADN dò
Trong quá trình cố định ADN bằng phương pháp điện hoá sử dụng
polypyrrole làm vật liệu trung gian để liên kết ADN và bề mặt cảm
biến, tác giả đã nghiên cứu ảnh
hưởng của nồng độ ADN dò đến quá
trình cố định ADN như được biểu
diễn trong hình 3.2. Quá trình nghiên
cứu được thực hiện ở điện thế U = -1
V ÷ 1.5 V, nhiệt độ phòng, dung
dịch điện phân LiClO
4
, tốc độ quét
50 mV/s, nồng độ pyrrole 0.1 mM.

Từ đường cong vôn – ampe cho
thấy, mật độ dòng điện tăng dần

H
ình 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ
A
DN dò đến quá trình cố định ADN

H
ình 3.1. Đường vôn - ampe của quá
trình cố định ADN trong 0.5 mM Ppy,
C
ADN
= 0.05
μ
M, 0.1 M LiClO
4
, U =
−

0.7 V
÷
+ 0.6 V, tốc độ quét 100 mV/s
13
tương ứng với chiều tăng của nồng độ đoạn ADN (0.05 μM, 0.5 μM,
1 μM, 2 μM, 5 μM, 7 μM, 10 μM, 15 μM, 20 μM) là do có sự tăng
nồng độ điện tích âm nhóm phốt phát của đoạn ADN trong lớp màng
polyme.
Phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier (FTIR) xác định liên kết
Ppy/ADN trên bề mặt cảm biến

Sau quá trình polyme hoá cố định đoạn ADN, để kh
ẳng định đoạn
ADN đã được cố định trên bề
mặt cảm biến, tác giả đã sử dụng
phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi
Fourier (FTIR) hoạt động dựa
trên sự hấp phụ bức xạ hồng
ngoại của vật chất cần nghiên
cứu. Phổ FTIR của lớp màng
Ppy và Ppy / ADN được mô tả
ở trên hình 3.3. Chúng ta có thể
thấy, ở d
ải hấp phụ từ 1889 cm
-1

đến 1629 cm
-1
sẽ tương ứng với
dải phổ chuẩn của các bazơ G -
C và A - T trong đoạn ADN. Trong khi đó, nhóm phốt phát của ADN
được xác nhận ở 1095 cm
-1
. Ở đỉnh hấp phụ 1254 cm
-1
là dải phổ của
biopolaronic, đây là một dạng trung gian của Ppy được hình thành
trong quá trình ôxi hóa pyrrole. Các liên kết C - H, N - H của chuỗi
polypyrrole đã được quan sát thấy tương ứng ở phổ 735 cm
-1
(Ppy /

ADN), 734 cm
-1
(Ppy) và 894 cm
-1
(Ppy / ADN), 897 cm
-1
(Ppy).
Ảnh hiển vi điện tử quét (FE - SEM) của màng Ppy / ADN trên bề
mặt cảm biến
Hình thái bề mặt màng Ppy và Ppy / ADN đã được nghiên cứu bằng
kính hiển vi điện tử quét (FE - SEM) như được mô tả trong hình 3.4.
Trong đó, bề mặt màng Ppy
được polyme hoá trong dung
dịch LiClO
4
có cấu trúc không
đồng đều, có hình hoa cải hoặc
hình cầu hay các bán cầu (hình
3.4a) ở kích thước micro hoặc
nano mét. Hình 3.4b mô tả
hình thái bề mặt của cảm biến
khi pyrrole được polyme hoá trong dung dịch LiClO
4
với sự có mặt
các đoạn ADN. Trong đó, chúng ta có thể thấy đã có sự phân bố

Hình 3.4. Hình thái bề mặt màng Ppy /
LiClO
4
(a) và Ppy / LiClO

4
/ ADN (b)
H
ình 3.3. Phổ hồng ngoại FTIR của màn
g

P
py / ADN và màng Ppy, U =
−
1.2V
÷
+
1.2V, tốc độ quét thế 50 mV / s, T = 25
0
C, C
dò
= 0.5
μ
M, C
P
y
r
r
ole
= 0.05 M
14
đoạn ADN rất đồng đều trên nền Ppy – các chấm sáng. Điều này sẽ
tạo điều kiện thuận lợi cho sự bắt cặp của đoạn ADN dò và đoạn bổ
sung trên bề mặt cảm biến.
3.2 Phương pháp liên kết cộng hoá trị

3.2.1 Cố định sử dụng ống nano các bon
Đặc trưng ảnh hiển vi điện tử quét
Do đoạn ADN liên kết
đến bề mặt cảm biến thông qua sự tương tác
của các nhóm chức được hình thành trong quá trình ô xi hóa CNTs
và nhóm phốt phát trong đoạn ADN. Vì vậy, hai thí nghiệm khác
nhau đã thực hiện để xem xét hình thái bề mặt của cảm biến.
Trong thí nghiệm đầu tiên, ống nano sau khi được ô xi hóa đã được
phủ lên bề mặt cảm biến
không được cố định đoạn
ADN. Ảnh FE-SEM đã cho
thấy, chỉ có các ống nano các
bon với
đường kính khác nhau
nằm trên bề mặt của cảm biến
(hình 3.5a). Trong thí nghiệm
tiếp theo, cho ống nano các
bon liên kết với đoạn ADN được hoạt hóa bằng EDC/MIA. Như
được mô tả trong hình 3.5b, chúng ta có thể thấy, đã có sự xuất hiện
của đoạn ADN (những chấm trắng nhỏ) liên kết với ống các bon
thông qua tương tác giữa nhóm cacboxylic hoặc amin với nhóm phốt
phát của ADN.
Đặc trưng phổ hồng ngoại bi
ến đổi chuỗi Fourier (FTIR)
Tương tác liên kết cộng hóa trị giữa đoạn ADN dò và ống nano các
bon được đặc trưng bằng
phổ hồng ngoại FTIR như
được biểu diễn trên hình
3.6. Hình 3.6a là phổ
hồng ngoại của lớp màng

chỉ có ống nano các bon
đã được ô xi hoá phủ trên
bề mặt cảm biến. Chúng
ta có thể nhận thấy, các liên kết C - H, N - H tương ứng với các phổ
dao động ở mi
ền tần số thấp từ 974 cm
-1
đến 521 cm
-1
. Đối với lớp
màng CNTs/ADN, do có sự tương tác giữa ADN và CNTs khi hình
thành liên kết, nên dải phổ của các liên kết C - H, N - H này sẽ bị dao

(a) (b)
Hình 3.6. Phổ hồng ngoại FTIR của CNT bị ô xi
hóa
(
a
)
và liên
k
ết ADN / CNTs
(
b
)


(a) (b)
H
ình 3.5. Ảnh hiển vi điện tử quét FE -

SEM của CNTs (a )và ADN / CNTs (b)
15
động ở đỉnh 881cm
-1
đến 517 cm
-1
. Đồng thời cũng có xuất hiện các
đỉnh 1600 cm
-1
và 1251 cm
-1
(hình 3.6b) tương ứng với sự có mặt
của các liên kết bazơ A - T, G - C trong đoạn ADN.
3.2.2 Cố định ADN sử dụng APTS
Phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier (FTIR) xác định liên kết ADN
và APTS
Hình 3.7 biểu diễn phổ hồng ngoại của màng ADN/APTS. Có thể
quan sát thấy, ở phổ hấp phụ tại các
đỉnh từ 1750 cm
-1
÷ 1600 cm
-1
tương
ứng với sự dao động của các liên kết
bazơ G - C, A - T trong đoạn ADN.
Trong khi đó, liên kết N - H của APTS
có thể được xác nhận ở phổ dao động
1526 cm
-1
. Ở dải tần số phổ dao động

thấp còn nhận thấy sự có mặt nhóm
phốt phát của ADN dao động ở đỉnh 1085 cm
-1
. Ngoài ra, ở các đỉnh
800cm
-1
là đặc trưng liên kết của Si-O-Si, đỉnh 960cm
-1
tương ứng
với liên kết của Si-O-H (số liệu không nêu ra đây). Như vậy, với việc
phân tích phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier đã có thể xác định
được các liên kết hóa học giữa lớp màng APTS với bề mặt vi cảm
biến và sự tồn tại liên kết hóa học giữa nhóm phốt phát của ADN đầu
dò với nhóm amino của APTS.
Đặc trưng AFM của ADN/APTS trên bề mặt cả
m biến
Hình thái bề mặt cảm biến sau khi được gắn đoạn ADN dò được mô
tả trên hình 3.8. Từ hình
3.8a có thể thấy sự sắp xếp
hỗn độn trong màng APTS
của các phân tử ADN trên
bề mặt cảm biến, có sự co
cụm phân tử ADN để hình
thành các đảo nhỏ. Do sự
phân bố đoạn ADN dò
không đều, nó sẽ làm giảm
hiệu xuất lai hóa của đoạn ADN. Ở hình 3.8b mậ
t độ phân bố đoạn
ADN đồng đều hơn nhưng mật độ phân bố đoạn ADN vẫn không
như mong đợi, vẫn còn những khoảng trống tương ứng với những

miền tối. Chính các miền này có thể sẽ tạo điều kiện cho sự hấp phụ
các đoạn ADN đích trong quá trình đo dẫn đến sự sai số tín hiệu.
H
ình 3.7. Phổ hồng ngoại của
màng APTS/
A
D
N


(a) (b)
H
ình 3.8. Hình thái bề mặt của cảm biến c
ố

định ADN của đậu tương chuyển gen
16
Ảnh hưởng của nồng độ ADN dò
Ảnh hưởng của nồng độ ADN dò đến tín hiệu ra của cảm biến được
mô tả trong hình 3.9. Hình 3.9(a) mô tả tín hiệu ra của cảm biến phụ
thuộc vào nồng độ ADN dò ở các nồng độ ADN đích khác nhau.
Hình 3.9(b) mô tả tín hiệu ra của cảm biến phụ thuộc vào nồng độ
ADN dò ở nồng độ ADN đích là 3nM.
Chúng ta có thể nhận thấy trong hình 3.9b, khi nồng độ
ADN dò
càng tăng, tín hiệu ra của cảm biến càng tăng là do trong quá trình cố
định, khi mật độ ADN tăng, dẫn đến các đoạn ADN được liên kết ở
bề mặt cảm biến nhiều hơn, nên xác suất gặp nhau giữa đoạn dò và
đích tăng lên, làm tăng khả năng bắt cặp của chúng để hình thành
đoạn xoắn kép trên bề mặt cảm biến. Trên hình 3.9(a) chúng ta cũng

có thể thấy, ở
đường mô tả nồng độ ADN dò là 1 μM và 2 μM, khi
nồng độ ADN đích nằm trong khoảng 0.5 nM đến 1 nM, tín hiệu ra
của cảm biến gần như không thay đổi. Điều này có thể được lý giải là
do ADN được cố định trên bề mặt cảm biến là tương đối ít. Kết quả
là, khi nồng độ ADN đích nhỏ, khả năng lai hoá của ADN dò − đích
để hình thành đoạn xoắn kép là r
ất thấp, do đó, tín hiệu ra gần như
không có sự thay đổi. Với các nồng độ ADN đích cao hơn, xác suất
gặp nhau giữa ADN dò và đích nhiều hơn dẫn đến khả năng hình
thành đoạn xoắn kép cao hơn, nên tín hiệu ra của cảm biến có sự
chênh lệch rõ nét hơn như đã được mô tả trong hình 3.9 (a).
Ảnh hưởng của các chất cố định ADN đến tín hiệu lai hoá
Đường cong mô tả sự
lai hoá đoạn ADN sử dụng các hợp chất trung
gian liên kết giữa đoạn ADN và bề mặt cảm biến được biểu diễn trên
hình 3.10. Đồ thị hình 3.10 chỉ ra cho thấy, tín hiệu ra của cảm biến
phụ thuộc vào nồng độ ADN đích như một hàm tuyến tính. Trong
đó, cường độ tín hiệu khi sử dụng Ppy để cố định ADN là mạnh nhất
(xấp xỉ 0.5 mV ở nồng
độ ADN đích là 0.01 μM), sau đó đến CNTs

(a) (b)
Hình 3.9. Ảnh hưởng nồng độ ADN dò đến tín hiệu ra của cảm biến ở các nồng độ
A
DN đích khác nhau (a), ở nồng độ ADN đích = 3nM, T = 25
0
C (b)
17
(0.37 mV), cuối cùng là APTS (0.2

mV). Tất cả các quá trình lai hoá này
được thực hiện ở nhiệt độ phòng,
nồng độ ADN dò là 0.5 μM.
KẾT LUẬN
Các kết quả khảo sát thực nghiệm
cho thấy, đoạn ADN đã được cố định
trực tiếp trên bề mặt cảm biến bằng
hai phương pháp là phương pháp điện
hoá và liên kết cộng hoá trị. Trong đó, phương pháp điện hoá dựa
vào sự
polyme hoá của polyme dẫn cùng với đoạn ADN khi đặt một
dòng điện hoặc điện áp vào cảm biến. Với phương pháp liên kết cộng
hoá trị, luận án đã sử dụng sự hoạt hoá đoạn ADN bằng EDC / MIA,
sau đó, cố định lên màng polyme dẫn hoặc ống nano các bon. Các
vật liệu để liên kết đoạn ADN đến bề mặt cảm biến được sử dụng
trong luận án là polypyrrole, ống nano các bon và hợp chất 3-Amino
Propyl Triethoxy Silane (APTS), trong đó tín hiệu ra của cảm biến
khi sử dụng Ppy là lớn nhất, kế tiếp là đến ống nano các bon và cuối
cùng là APTS.
Điều này cho phép khẳng định, với điều kiện công nghệ hiện có tại
Đại học Bách khoa Hà nội, các phương pháp cố định trực tiếp ADN
lên bề mặt cảm biến đã được thực hiện thành công. Trên cơ sở này,
tạ
o điều kiện thuận lợi cho việc chế tạo cảm biến ADN cho các ứng
dụng trong y học và trong ngành thực phẩm cũng như ứng dụng
trong kiểm tra môi trường.
CHƯƠNG 4. ỨNG DỤNG CỦA CẢM BIẾN ADN TRONG
Y SINH VÀ THỰC PHẨM
4.1 Ứng dụng của cảm biến AND để phát hiện chuyển gen trong
công nghệ thực phẩm

Xác định đoạn ADN của đậu tương chuyển gen
Sau khi cố định đoạn ADN dò cảm biến ADN được đưa vào trong
dung dịch có chứa đoạn ADN cần phát hiện. Nếu đoạn ADN cần
phát hiện có các nucleotide phù hợp với các nucleotide của đoạn đầu
dò thì một đoạn xoắn kép s
ẽ được hình thành trên bề mặt cảm biến.
Khi đó, mật độ điện tích ở lân cận bề mặt cảm biến sẽ thay đổi dẫn
đến làm thay đổi tín hiệu ra của cảm biến. Nếu các đoạn ADN cần
phát hiện không phù hợp với đoạn dò thì sẽ không có hiện tượng gì
xẩy ra. Kết quả này được mô tả trên hình 4.1, trong đó, sự bắt cặp

Hình 3.10. Lai hoá đoạn ADN sử
dụng hoá chất cố định khác nhau
18
của các đoạn ADN được giải thích bằng sự tăng điện áp lối ra tuyến
tính cùng với nồng độ đoạn ADN đích theo hàm Y = 4.28X + 0.006.
Khi tiếp tục tăng nồng độ ADN đích đến
xấp xỉ nồng độ của ADN dò, tín hiệu ra
của cảm biến sẽ bão hòa, do lúc này đã
có sự bắt cặp hoàn toàn của đoạn ADN
đích với đoạn ADN dò (số
liệu không
chỉ ra). Với nồng độ đoạn ADN đích
nhỏ hơn 1nM tín hiệu ra của cảm biến bị
nhiễu, rất khó phát hiện. Khi không có
sự bắt cặp, tín hiệu ra của cảm biến
không thay đổi như được biểu diễn bằng
đường nằm ngang trong hình 4.1. Trong trường hợp hai đoạn ADN
dò và đích bắt cặp hoàn toàn thì độ nhạy của cảm biến xấp xỉ 0.0042
mV/nM, giới hạn nhận biết của cảm biến khoảng 1nM/lít. Thời gian

đáp ứng của cảm biến trong vòng 3 phút ÷ 4 phút, như được biểu
diễn ở hình nhỏ hơn.
Ảnh hưởng của nhiệt độ lai
Hình 4.2 (a) mô tả mối quan hệ giữa tín hiệu ra của cảm biến phụ
thuộc vào nồng độ đoạn ADN đích ở các nhiệt độ khác nhau (từ 32
0
C
đến 82
0
C). Ở dải nhiệt độ từ 32
0
C đến 62
0
C, tín hiệu ra của cảm biến
tăng tuyến tính với sự thay đổi nhiệt độ (hình 4.2b) (do nhiệt độ đã
làm tăng tốc độ phản ứng lai của đoạn ADN), khi tăng đến 62
0
C, tín
hiệu ra có xu hướng giảm dần. Quá trình giảm tín hiệu này là do
nhiệt độ lúc này không đóng vai trò làm tăng tốc độ phản ứng cho sự
bắt cặp của 2 đoạn ADN mà nó đóng vai trò biến tính, tách đoạn
ADN kép trở thành 2 đoạn đơn làm cho tín hiệu của cảm biến giảm.
Theo đó, để đạt được xác suất bắt cặp tốt nhất, nhiệt độ thực tế lai
hoá nên nhỏ h
ơn T
m
cỡ từ 10 % đến 25 %. Như vậy, giá trị nhiệt độ

(a) (b)
Hình 4.2. Tín hiệu ra của cảm biến phụ thuộc vào nhiệt độ ở nồng độ ADN đích

khác nhau (a), ảnh hưởng của nhiệt độ lai hóa đến tín hiệu ra của cảm biến (b)

H
ình 4.1. Tín hiệu ra phụ thuộc
vào nồng độ ADN đích

19
62
0
C có thể được xem là giá trị nhiệt độ biến tính (T
m
) đối với đoạn
ADN được sử dụng trong thí nghiệm của luận án. Khi đó, nhiệt độ lai
hóa đoạn ADN không nên vượt quá giá trị 62
0
C.
Nhận biết sự lai hóa đoạn ADN của mẫu thực
Sau quá trình chế tạo, cảm biến ADN đã được sử dụng để xác định
chuyển gen của một số mẫu đậu tương
được bán trôi nổi trên thị trường ở một
số chợ như: Kim liên, Bách khoa, Mơ,
Đồng tâm và mẫu đậu tương có tính
trạng kháng thuốc diệt cỏ được cung
cấp từ Viện Di truy
ền Nông nghiệp Việt
nam. Hình 4.3 là kết quả đo mẫu thực
của cảm biến với đoạn ADN dò là loại
đậu tương kháng thuốc diệt cỏ. Có thể
nhận thấy, với mẫu đậu tương được
cung cấp từ Viện Di truyền Nông nghiệp Việt nam, tín hiệu ra của

cảm biến lớn hơn so với các mẫu được lấy từ các chợ là do có sự bắt
cặp hoàn toàn giữa đoạn ADN dò với đoạn bổ sung. Các mẫu được
cung cấp từ các chợ cho tín hiệu thấp, bởi đây là những mẫu đậu
tương có thể không phải mang tính trạng kháng thuốc diệt cỏ. Nhưng
vẫn có tín hiệu là do có thể trong đoạn ADN đích của các mẫu này
vẫn có một số ít các bazơ bổ sung với các bazơ đoạn dò nên vẫn có
sự lai hóa củ
a đoạn ADN.
4.2 Ứng dụng của cảm biến ADN xác định vi rút gây bệnh
Xác định đoạn ADN của virus herpes bằng cảm biến ADN
Hình 4.4 mô tả tín hiệu ra của cảm biến ADN theo thời gian ở nồng
độ 0,5 nM ADN đích, tại nhiệt độ phòng.
Có thể thấy, đáp ứng tín hiệu ra của cảm
biến chỉ sau 1 phút, và đạt giá trị ổn định
sau thời gian khoảng 4 phút. Sự ổn định
của tín hiệu là do đã có sự bắt cặp hoàn
toàn của đoạn ADN đích với đoạn dò cố
định trên bề mặt cảm biến.
Để xác định đặc trưng lai hóa của cảm
biến, thí nghiệm được lặp lại 03 lần ở các
nồng độ thay đổi từ 0,5 nM tới 3 nM như
được mô tả trong hình 4.5. Có thể thấy rằng, khi tăng dần nồng độ
ADN đích
đến 3nM, tín hiệu ra của cảm biến cũng tăng theo một
M
S
1
M
S
2

M
S
3
M
S
4
F
1
0
.
0
0
.
5
1
.
0
1
.
5
2
.
0
§
i
Ö
n

¸
p

r
a

(
m
V
)
M
É
u

A
D
N

Hình 4.3. Kết quả đo mẫu thực
sử dụng cảm biến ADN
H
ình 4.4. Thời gian đáp
ứng của cảm biến ADN
20
cách tuyến tính. Điều này chứng tỏ đã có sự lai hoá xuất hiện khi có
sự bắt cặp giữa ADN đầu dò với ADN đích trong mẫu phân tích hình
thành đoạn xoắn kép trên bề mặt cảm
biến. Nếu tiếp tục tăng nồng độ ADN
đích, tín hiệu ra của cảm biến sẽ tiếp tục
tăng và sẽ đạt giá trị bão hoà khi nồng độ
ADN đích bằng nồng độ
ADN dò cố định

trên bề mặt cảm biến. Giá trị tín hiệu ra
của cùng một cảm biến được đo ba lần là
gần giống nhau. Điều này thể hiện tính ổn
định của vi cảm biến ADN được chế tạo
là khá tốt. Đường nằm ngang phía dưới
đồ thị thể hiện giá trị đo của cảm biến trong nước khử ion, không có
ADN bổ sung nên tín hiệu ra không thay đổi trong suố
t quá trình đo.
Sự phụ thuộc vào nhiệt độ lai của cảm biến
Hình 4.6 mô tả ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát hiện đoạn
ADN bổ sung ở các nồng độ ADN khác nhau. Khi tăng nhiệt độ từ
30°C lên đến 70°C, tín hiệu tăng tuyến tính. Trong đó, khoảng nhiệt
độ từ 30°C đến khoảng 50°C (vùng I) tín hiệu ra tăng chậm, nhưng
từ 50°C đến giá trị 70°C (vùng II) tín hiệ
u ra tăng rất nhanh rồi giảm
đột ngột khi nhiệt độ tiếp tục tăng đến
85°C (vùng III). Như vậy, có thể thấy
sự bắt cặp giữa ADN dò và đoạn ADN
bổ sung ít bị tác động ở dải nhiệt độ
phòng đến khoảng 50°C, nhưng lại bị
tác động mạnh mẽ ở dải nhiệt độ từ
50°C đến hơn 70°C. Theo thực nghiệm,
tín hiệ
u đạt giá trị cực đại tại khoảng
73°C rồi giảm mạnh, nên đây có thể coi
là khoảng giá trị nhiệt độ biến tính T
m
.
Do đó, để có tín hiệu lai hoá tốt thì nhiệt độ lai hoá nên nằm ở
khoảng nhiệt độ từ 65

0
C đến 70
0
C. Khi đó sẽ làm cho phản ứng lai
của ADN xẩy ra nhanh và đặc hiệu hơn.
Nhận biết sự lai hóa đoạn ADN của vi rút herpes sử dụng mẫu PCR
Để xác định độ nhạy và khả năng phát hiện vi rút của vi cảm biến
trên mẫu thực, tác giả tiến hành đo đạc thử nghiệm với sản phẩm
PCR của vi rút herpes (HSV). Mẫu bệnh phẩm được lấy từ dịch não
tủ
y bệnh nhân dương tính với HSV ký hiệu VN 055 và được xác
định bằng kỹ thuật PCR tại phòng thí nghiệm các vi rút Herpes, khoa
H
ình 4.6. Ảnh hưởng của nhiệ
t

đ
ộ đến tín hiệu của vi cảm biến
H
ình 4.5. Nhận biết tín hiệu
lai hóa sử dụng cảm biến AD
N
21
Vi rút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Từ 20 µl sản phẩm PCR
của HSV thu được, lấy 10 µl chia đôi
và chạy điện di gel, 10 µl còn lại sử
dụng để làm mẫu phân tích cho cảm
biến ADN.
Hình 4.7 là kết quả PCR dương tính
của mẫu bệnh phẩm số VN 055 được

minh chứng bằng hai dải sáng trên cột
số 8 và số 9. Từ cột số 2 đến cột số 7
là chứng dương theo số
lượng 10
5
–
10
0
bản sao ADN của HSV chuẩn từ phòng thí nghiệm, cột số 1 là
chứng âm với nước, M là cột so sánh (Master). Trước khi tiến hành
các phép đo với cảm biến ADN, mẫu phân tích chạy PCR phải được
nâng nhiệt độ lên 95°C để ADN sợi đôi của HSV tách ra hoàn toàn
thành các sợi ADN đơn, sau đó làm nguội
nhanh xuống 50 °C ÷ 55°C. Quá trình đo
đạc được thực hiện ngay để giảm thiểu
khả năng tái bắt cặp giữa các ADN sợi
đơn. Hình 4.8 mô tả khả năng phát hiện
đoạn ADN của sản phẩm chạy PCR của
vi rút HSV sử dụng cảm biến ADN. Có
thể thấy rằng, tín hiệu ra của cảm biến
tăng tuyến tính cùng với lượng ADN
tăng. Như vậy, đã có sự phù hợp giữa
phương pháp phân tích bằng PCR và
phương pháp phân tích sử dụng cảm biến ADN được chế tạo tại Đại
học bách khoa Hà N
ội.
4.3.2. Ứng dụng cảm biến ADN phát hiện ADN của virus cúm A
Hình 4.9 là đường mô tả tín hiệu ra của cảm biến khi xác định đoạn
ADN của vi rút cúm A. Chúng ta
có thể thấy, tín hiệu ra của cảm

biến phụ thuộc vào nồng độ ADN
đích theo hàm tuyến tính Y =
0.019X + 0.028. Nếu tăng tiếp
nồng độ ADN đích thì tín hiệu ra
cảm biến cũng tăng và sẽ đạt giá
trị bão hoà khi nồng độ ADN đích
bằng với nồng độ ADN dò. Như
được mô tả trên hình 4.9, vi cảm biến ADN có thể phát hiện được

H
ình 4.7. Ảnh PCR dương tính với
H
SV của bệnh nhân VN 055
H
ình 4.8.
C
ảm biến ADN phá
t

hiện ADN của vi rút herpes
trong sản phẩm PCR

H
ình 4.9. Đặc t
r
ưng của cảm biến AD
N
22
ADN đích với nồng độ thấp nhất là 0,5 nM tại nhiệt độ phòng với độ
nhạy khi có sự lai hoá hoàn toàn giữa đoạn ADN dò với đoạn ADN

bổ sung là 0,019 mV/nM. Trong trường hợp không có sự lai hoá thì
tín hiệu lối ra không thay đổi (đường nằm ngang).
Ảnh hưởng của đoạn ADN bị đột biến đến tín hiệu ra của cảm biến
Để nghiên cứu ảnh hưởng của đoạn bị
đột biến gen đến tín hiệu lai
hoá của cảm biến, tác giả đã sử dụng 2
đoạn ADN bị đột biến ở hai điểm khác
nhau, sau đó, so sánh với tín hiệu lai hoá
của đoạn ADN không bị đột biến. Hình
4.10 chỉ ra sự đáp ứng tín hiệu ra của cảm
biến sau khi cho lai hoá với đoạn bổ sung
và 2 đoạn bị đột biến gen. Kết quả
đã cho
thấy, tín hiệu ra lớn nhất khi đoạn ADN
lai hóa hoàn toàn với đoạn dò. Sự giảm
tín hiệu lai hoá cũng được chỉ ra khi cho
lai hoá với hai đoạn đột biến. Như vậy, có thể khẳng định cảm biến
ADN đã chế tạo có độ nhạy đủ lớn để nhận biết các đoạn ADN bị đột
biến ở một vài vị trí.
Khả n
ăng tái sử dụng của cảm biến ADN
Trong phần này, tác giả đã nghiên cứu khả năng tái sử dụng cảm biến
ADN bằng cách tách sợi ADN đích ra khỏi đoạn ADN dò trên bề
mặt của cảm biến. Sau đó, sử dụng
cảm biến này để tiếp tục xác định lai
hóa đoạn ADN. Quá trình này dựa
trên sự biến tính và hồi tính của đoạn
xoắn kép ở nhi
ệt độ T
m

. Để thực hiện
biến tính, cảm biến đã được nâng
nhiệt độ lên qua nhiệt độ T
m
, khi đó
đoạn ADN đích và đoạn ADN dò sẽ
tách nhau hoàn toàn. Tiếp theo, làm
nguội nhanh và rửa trôi các đoạn
ADN đích ra khỏi bề mặt của cảm biến. Thí nghiệm đã được lặp lại
để xác định sự phụ thuộc tín hiệu ra của vi cảm biến với nồng độ
ADN đích như mô tả trong hình 4.11. Kết quả chỉ ra cho thấy, gần
như không có sự khác biệt về
sự phụ thuộc tín hiệu lối ra của cảm
biến với nồng độ của ADN đích đối với những phép đo trước và sau
biến tính. Điều này cho phép nghĩ tới việc tái sử dụng của cảm biến
ADN.

H
ình 4.11. Độ lặp lại của cảm biến
A
DN trước và sau khi biến tính

H
ình 4.10. Cảm biến
A
D
N

nhận biết đoạn đột biến gen