Phương pháp định lượng RNA

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG RNA
NỘI DUNG BÁO CÁO
I
• GIỚI THIỆU
II
• PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ KẾ
• PHƯƠNG PHÁP MEIBAUM
III
• ỨNG DỤNG
Phương
pháp định
lượng
RNA
I. Giới thiệu chung
Khái niệm định lượng acid nucleic
Khái niệm định lượng RNA
I. GIỚI THIỆU
Phương pháp định
lượng RNA là phương
pháp gì????
Là phương pháp dùng để xác định
nồng độ trung bình của RNA có
mặt trong 1 hỗn hợp nào đó!!!!
II. CÁC PHƯƠNG PHÁP
G
ỒM 2 PP CHÍNH
PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ KẾ
PHƯƠNG PHÁP MEIBAUM
Phương
pháp định

lượng
RNA
II. PHƯƠNG PHÁP QUANG
PHỔ KẾ
Nguyên tắc
Nguyên liệu
Cách làm
Các yếu tố ảnh hưởng
Ưu và nhược điểm
PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ KẾ
Nguyên Tắc:
- Do thành phần bazơ nitơ trong RNA có
khả năng hấp thụ ánh sáng vùng tử
ngoại, với bước sóng cực đại là 260 nm.
- Độ hấp thụ tỉ lệ với nồng độ RNA
Nguyên liệu:
- Dung dịch RNA tinh sạch ( tách chiết siêu li tâm, sắc
kí, điện li, RNA tinh sạch )
- -Cuvet thạch anh
Phương
pháp định
lượng
RNA
Cách làm
1 ml RNA
Cuvet
thạch anh
Đo độ hấp
thụ ở =

260nm
Độ hấp thụ ánh sáng của ống có RNA ≤ 1
- Nồng độ RNA trong mẫu được tính theo công thức:
- Trong đó:
♥ C: nồng độ của RNA ( μg/ml)
♥ A
260nm:
là độ hấp thụ của dd RNA ở 260nm
♥ 40 là hệ số chuyển đổi với RNA
♥ n: là số lần pha loãng
C (μg/ml)=A
260nm
. 40.n
ƯU ĐIỂM KHUYẾT ĐI ỂM
-
Đơn giản
-
Nhanh chóng
-
Số đọc bị ảnh hưởng nếu mẫu
dd RNA có lẫn DNA và
protein.
-
Độ chính xác tương đối.
CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG:
 Nhiệt độ
 Nồng độ ion
 Độ pH
 Tạp chất ( DNA, Protein)
Phương

pháp định
lượng
RNA
III. PHƯƠNG PHÁP MEIBAUM
Nguyên tắc
Nguyên liệu
Cách làm
Nguyên tắc
RNA
Phức
chất có
màu
xanh lá
cây
Orcinol
Hấp thụ ánh
sáng cực
đại ở  =
670nm
Cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng RNA
trong dung dịch
Đun
nóng
PHƯƠNG PHÁP MEIBAUM
NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT:
♥ DD RNA chuẩn 500μg/ml
♥ DD RNA cần xác định hàm lượng
♥ DD H
2
SO

4
10%
♥ Thuốc thử orcinol
♥ FeCl
3
0,1% trong HCl (đặc)
♥ Thiết bị:
♥ Nồi cách thủy (100*C)
♥ Máy so màu quang điện
orcinol
Phương
pháp định
lượng
RNA
Cách làm
2ml dung
dịch RNA
10ml H
2
SO
4
10%
Dung dịch thủy phân
RNA
Bình nón
(V = 50ml)
Có nút
nhám
Đặt vào nồi cách thủy
đang sôi trong 30 phút

Làm nguội
2ml Dung dịch
thủy phân RNA
Ống
nghiệm
Thuốc thử
orcinol
Dung dịch
màu xanh lá
cây
Lắc đều
Đặt vào nồi cách thủy
đang sôi trong 20 phút.
Làm nguội đến
nhiệt độ phòng

Xây dựng đồ thị chuẩn RNA :
 Từ dung dịch gốc RNA tinh khiết có
nồng độ xác định tiến hành pha loãng để có các
nồng độ 50, 100, 200, 300, 400 và 500 m/ml.
 Lấy từ mỗi nồng độ ra 2ml
 Tiến hành thí nghiệm như với dung
dịch RNA mẫu ở trên
 Dựng đồ thị tương quang giữa mật độ
quang học và nồng độ RNA tương ứng
Từ số đọc về mật độ quang học thu được
của dung dịch mẫu đối chiếu với đồ thị
RNA => lượng RNA trong mẫu
III. ỨNG DỤNG
- Phương pháp định lượng RNA dùng để xác định nồng độ RNA có

trong 1 hỗn hợp, đây là một trong những bước cơ bản của mọi nghiên
cứu, thí nhiệm trong các lĩnh vực sinh học y học, di truyền,…
• TÀI LIỆU THAM KHẢO:
-Giáo trình thực tập sinh hóa – Trường Đại học
Cần thơ- Biên soạn T.S Nguyễn Ming Chơn,
Th.S Phan thị Bích Trâm, Th.S Nguyễn Thị
Thu Thủy.
-Sinh học phân tử - Hồ Huỳnh Thùy Dương –
Nhà Xuất bản giáo dục
-Internet: tailieu.tv