Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm và kháng oxy hóa của cao chiết từ một số chủng nấm cordyceps sp phân lập tại việt nam
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.8 MB, 238 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LÂM KHẮC KỶ
NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM VÀ KHÁNG
OXY HÓA CỦA CAO CHIẾT TỪ MỘT SỐ CHỦNG NẤM
Cordyceps sp. PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA SINH HỌC
TP. Hồ Chí Minh - năm 2022
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LÂM KHẮC KỶ
NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM VÀ KHÁNG
OXY HÓA CỦA CAO CHIẾT TỪ MỘT SỐ CHỦNG NẤM
Cordyceps sp. PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM
Ngành: HÓA SINH HỌC
Mã số ngành: 62.42.01.16
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:
Phản biện độc lập 1:
Phản biện độc lập 2:
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS. TS. Ngô Đại Hùng
2. TS. Đinh Minh Hiệp
TP. Hồ Chí Minh - Năm 2022
LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan luận án tiến sĩ ngành hóa sinh học với đề tài “Nghiên cứu hoạt
tính kháng viêm và kháng oxi hóa của cao chiết từ một số chủng nấm Cordyceps sp.
phân lập tại Việt Nam” là cơng trình khoa học do Tơi thực hiện dưới sự hướng dẫn
của PGS.TS. Ngô Đại Hùng và TS. Đinh Minh Hiệp.
Những kết quả nghiên cứu của luận án hoàn toàn trung thực, chính xác và
khơng trùng lắp với các cơng trình đã cơng bố trong và ngồi nước.
Nghiên cứu sinh
(Ký tên, ghi rõ họ
tên)
PAGE \* MERGEFORMAT 4
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN...................................................................................................................3
MỤC LỤC ..........................................................................................................................4
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT..................................................................9
DANH MỤC CÁC BẢNG...................................................................................................10
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ..............................................................................13
MỞ ĐẦU
........................................................................................................................16
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN................................................................................................18
1.1.
Giới thiệu chung về Cordyceps...................................................................18
1.2.
Tình hình phân bố và đặc điểm sinh trưởng của Cordyceps spp.................20
1.3.
Cách sử dụng Cordyceps spp. như nguồn dược liệu theo truyền thống......21
1.4.
Các chiết xuất chủ yếu từ Cordyceps spp....................................................23
1.4.1.
Chiết xuất dùng nước làm dung môi....................................................23
1.4.2.
Chiết xuất dùng dung môi cồn..............................................................23
1.4.3.
Chiết xuất từ dung môi ethyl acetate....................................................23
1.4.4.
Chiết xuất carbon dioxide (CO2) siêu tới hạn.......................................24
1.5.
Các hợp chất hóa học thu nhận được từ Cordyceps spp..............................24
1.5.1.
Các phương pháp thu nhận hợp chất hóa học.......................................24
1.5.2.
Các hợp chất hóa học thu nhận từ Cordyceps......................................26
1.6.
Hiệu quả của việc chủ động ni trồng nấm Cordyceps.............................32
1.7.
Hoạt tính sinh học của các chiết xuất từ Cordyceps spp.............................34
1.8.
Tiềm năng dược lý của Cordyceps spp.......................................................37
1.8.1.
Khả năng chống oxy hóa......................................................................38
1.8.2.
Tiềm năng chống viêm.........................................................................40
PAGE \* MERGEFORMAT 4
1.8.3.
Khả năng điều hoà miễn dịch của Cordyceps spp................................42
1.8.4.
Tác dụng kháng virus của Cordyceps spp............................................42
1.8.5.
Tác dụng kháng khối u.........................................................................43
1.8.6.
Khả năng hỗ trợ hạ đường huyết..........................................................45
1.8.7.
Khả năng hỗ trợ làm hạ cholesterol, hạ huyết áp và điều hòa mạch máu.
..............................................................................................................46
1.8.8.
Khả năng hỗ trợ chống mệt mỏi và chống trầm cảm............................49
1.8.9.
Hỗ trợ tình dục......................................................................................50
1.8.10.
Tiềm năng bảo vệ thận và gan...........................................................52
1.8.11.
Khả năng chống lão hóa....................................................................53
1.9.
Giới thiệu về các nấm trong nghiên cứu......................................................54
1.9.1.
Nấm Cordyceps neovolkiana................................................................54
1.9.2.
Nấm Cordyceps takaomontana.............................................................57
1.9.3.
Nấm Isaria tenuipes..............................................................................61
1.9.4.
Nấm Isaria cicadae...............................................................................64
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP..................................................................71
2.1.
Thu nhận cao chiết từ sinh khối và quả thể của các nấm............................71
2.1.1.
Vật liệu và hóa chất..............................................................................71
2.1.2.
Phương pháp chiết cao..........................................................................71
2.2.
Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa in vitro bằng các phương pháp hóa học.75
2.2.1.
Khảo sát năng lực khử..........................................................................76
2.2.2.
Khảo sát hoạt tính bắt gốc tự do DPPH................................................77
2.2.3.
Khảo sát hoạt tính bắt gốc tự do ABTS +..............................................78
2.2.4.
Khảo sát ức chế enzyme xanthine oxydase (XO).................................79
PAGE \* MERGEFORMAT 4
2.3.
Khảo sát khả năng kháng viêm in vitro của cao chiết bằng phương pháp ức
chế biến tính BSA bởi nhiệt độ..............................................................................81
2.4.
Phân chất từ cao phân đoạn.........................................................................82
2.4.1. Sắc ký lớp mỏng.......................................................................................82
2.4.2. Sắc ký cột hở............................................................................................83
2.5.
Khảo sát độc tính trên tế bào RAW 264.7...................................................87
2.6.
Phân tích Western blot.................................................................................89
2.7.
Khảo sát khả năng ức chế sinh tổng hợp Nitric Oxide trên tế bào RAW
264.7......................................................................................................................91
2.8.
Xác định ảnh hưởng của sự oxy hoá trên protein.......................................92
2.9.
Khảo sát khả năng bảo vệ DNA tế bào của chiết xuất................................93
2.10.
Phương pháp xử lí số liệu........................................................................95
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.........................................................................96
3.1.
Kết quả hiệu suất chiết xuất cao tổng và các cao phân đoạn từ các mẫu sinh
khối và quả thể nấm...............................................................................................96
3.1.1.
Kết quả hiệu suất chiết cao tổng và các cao phân đoạn từ các mẫu sinh
khối nấm C. neovolkiana DL0004, C. takaomontana DL0038a, I. cicadae F004
và I. tenuipes VHI-2...........................................................................................96
3.1.2.
Kết quả hiệu suất chiết cao tổng và các cao phân đoạn từ các mẫu quả
thể nấm C. neovolkiana DL0004, C. takaomontana DL0038a, I. cicadae F004
và I. tenuipes VHI-2...........................................................................................98
3.2.
Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro của các mẫu cao chiết 100
3.2.1.
Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro theo phương pháp
xác định năng lực khử......................................................................................101
3.2.2.
Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro theo phương pháp
khảo sát bắt gốc tự do DPPH...........................................................................116
PAGE \* MERGEFORMAT 4
3.2.3.
Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro theo phương pháp
khảo sát bắt gốc tự do ABTS...........................................................................121
3.2.4.
Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro theo phương pháp ức
chế enzyme xanthine oxidase (XO).................................................................126
3.3.
Kết quả khảo sát hoạt tính kháng viêm in vitro của các mẫu cao chiết theo
phương pháp khảo sát hoạt tính ức chế biến tính bovine serum albumin bởi nhiệt
độ.
...................................................................................................................130
3.3.1.
Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế biến tính BSA bởi nhiệt độ của cao
EtOH và cao phân đoạn từ sinh khối nấm C. neovolkiana DL0004 và C.
takaomontana DL0038a...................................................................................130
3.3.2.
Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế biến tính BSA bởi nhiệt độ của cao
EtOH và cao phân đoạn từ quả thể nấm C. neovolkiana DL0004 và C.
takaomontana DL0038a...................................................................................132
3.4.
Kết quả phân tách chất từ cao phân đoạn EA của sinh khối nấm C.
neovolkiana DL0004...........................................................................................136
3.5.
Kết quả khảo sát khả năng gây độc tế bào RAW 264.7 của các chất được
phân tách từ cao phân đoạn EA của sinh khối nấm C. neovolkiana DL0004.....138
3.6.
Kết quả khảo sát khả năng ức chế sinh tổng hợp Nitric oxide trên tế bào
RAW 264.7................................................................................................................
139
3.7.
Kết quả khảo sát ức chế p50 và p65 trên tín hiệu NF-kB của tế bào RAW
264.7 ...................................................................................................................140
3.7.1.
Kết quả khảo sát ức chế p50 và p65 trên tín hiệu NF-kB tế bào RAW
264.7 của cao EA từ sinh khối C. neovolkiana................................................140
3.7.2.
Kết quả khảo sát ức chế p50 trên tín hiệu NF-kB tế bào RAW 264.7
của các hợp chất được phân tách từ cao chiết EA............................................142
PAGE \* MERGEFORMAT 4
3.7.3.
Kết quả khảo sát ức chế p65 trên tín hiệu NF-kB tế bào RAW 264.7
của các hợp chất được phân tách từ cao chiết EA............................................144
3.8.
Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa protein màng của tế bào RAW
264.7 ...................................................................................................................148
3.9.
Kết quả khảo sát khả năng bảo vệ DNA của tế bào RAW 264.7..............150
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................153
DANH MỤC CƠNG TRÌNH TÁC GIẢ............................................................................156
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................157
PHỤ LỤC
......................................................................................................................169
PAGE \* MERGEFORMAT 4
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT
PAGE \* MERGEFORMAT 4
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Hệ thống phân loại Cordyceps.................................................................19
Bảng 1.2: Các hợp chất hóa học của Cordyceps spp................................................26
Bảng 1.3: Tóm tắt một số mơ tả các hợp chất dược chính và các đặc tính điều trị của
các loại chiết xuất từ nấm Cordyceps spp.................................................................34
Bảng 1.4: Tóm tắt một số cơ chế kháng u từ các hợp chất thu được ở nấm
Cordyceps spp...........................................................................................................44
Bảng 1.5: Tóm tắt một số cơ chế chống đái tháo đường từ các hợp chất thu được ở
nấm Cordyceps spp...................................................................................................46
Bảng 1.6: Tóm tắt một số cơ chế hạ huyết áp và điều hòa mạch máu từ các hợp chất
thu được ở nấm Cordyceps spp.................................................................................48
Bảng 1.7: Tóm tắt một số cơ chế hỗ trợ chống mệt mỏi và chống trầm cảm từ các
hợp chất thu được ở nấm Cordyceps spp..................................................................50
Bảng 1.8: Tóm tắt một số cơ chế hỗ trợ hỗ trợ tình dục...........................................52
Bảng 2.1: Nguồn gốc nguyên liệu trong nghiên cứu................................................71
Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm khảo sát năng lực khử..................................................76
Bảng 2.3: Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng bắt gốc tự do DPPH........................78
Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng bắt gốc tự do ABTS........................79
Bảng 2.5: Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế enzyme xanthine oxydase...80
Bảng 2.6: Bố trí thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng viêm......................................81
Bảng 2.7: Phân đoạn trên cao phân đoạn ethyl acetate.............................................86
Bảng 2.8: Quy trình Western blot.............................................................................90
Bảng 2.9: Quy trình khảo sát ức chế NO..................................................................92
Bảng 2.10: Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng bảo vệ DNA tế bào RAW 264.7...94
Bảng 3.1: Kết quả hiệu suất chiết cao tổng và các cao phân đoạn từ 4 mẫu sinh khối
nấm............................................................................................................................96
Bảng 3.2: Kết quả hiệu suất chiết cao tổng và các cao phân đoạn từ 4 mẫu quả thể
nấm............................................................................................................................98
Bảng 3.3: Kết quả năng lực khử in vitro của vitamin C.........................................101
PAGE \* MERGEFORMAT 4
Bảng 3.4: Kết quả năng lực khử in vitro của cao chiết sinh khối nấm C. neovolkiana
.................................................................................................................................102
Bảng 3.5: Kết quả năng lực khử in vitro của cao chiết quả thể nấm C. neovolkiana
.................................................................................................................................105
Bảng 3.6: Kết quả năng lực khử in vitro của cao chiết sinh khối nấm C.
takaomontana..........................................................................................................107
Bảng 3.7: Kết quả năng lực khử in vitro của cao chiết quả thể nấm C. takaomontana
.................................................................................................................................108
Bảng 3.8: Kết quả năng lực khử in vitro của cao chiết sinh khối nấm I. cicadae...110
Bảng 3.9: Kết quả năng lực khử in vitro của cao chiết quả thể nấm I. cicadae......112
Bảng 3.10: Kết quả năng lực khử in vitro của cao chiết sinh khối nấm I. tenuipes113
Bảng 3.11: Kết quả năng lực khử in vitro của các loại cao chiết của 4 giống nấm ở
nồng độ 1000 μg/mL...............................................................................................115
Bảng 3.12: Giá trị IC50 (μg/mL) của các mẫu cao chiết từ sinh khối của các mẫu
nấm khảo sát theo phương pháp DPPH..................................................................117
Bảng 3.13: Giá trị IC50 (μg/mL) của các mẫu cao chiết từ quả thể của các mẫu nấm
khảo sát theo phương pháp DPPH..........................................................................119
Bảng 3.14: Giá trị IC50 (μg/mL) của các mẫu cao chiết từ sinh khối của các mẫu
nấm khảo sát theo phương pháp ABTS..................................................................122
Bảng 3.15: Giá trị IC50 (μg/mL) của các mẫu cao chiết từ quả thể của các mẫu nấm
khảo sát theo phương pháp ABTS..........................................................................124
Bảng 3.16: Giá trị IC50 (μg/mL) của các mẫu cao chiết từ sinh khối của các mẫu
nấm khảo sát theo phương pháp ức chế XO...........................................................126
Bảng 3.17: Giá trị IC50 (μg/mL) của các mẫu cao chiết từ quả thể của các mẫu nấm
khảo sát theo phương pháp ức chế XO...................................................................128
Bảng 3.18: Giá trị IC50 (μg/mL) của các mẫu cao chiết từ sinh khối của các mẫu
nấm khảo sát theo phương pháp ức chế biến tính BSA bằng nhiệt độ...................130
Bảng 3.19: Giá trị IC50 (μg/mL) của các mẫu cao chiết từ quả thể của các mẫu nấm
khảo sát theo phương pháp ức chế biến tính BSA bằng nhiệt độ...........................132
PAGE \* MERGEFORMAT 4
Bảng 3.20: Thành phần các hợp chất thu được từ cao EA sinh khối C. neovolkiana
.................................................................................................................................136
Bảng 3.21: Phần trăm (%) sống sót của tế bào RAW 264.7 sau khi xử lý với các
mẫu khảo sát từ nồng độ 1 – 100 ppm....................................................................138
Bảng 3.22: Giá trị IC50 (μg/mL) của cao EA và 4 hợp chất khảo sát ức chế lượng
NO sinh tổng hợp trên tế bào RAW 264.7..............................................................139
Bảng 3.23: Tỷ lệ (%) ức chế p50 và p65 trên tín hiệu NF-kB tế bào RAW 264.7 của
cao chiết EA sinh khối nấm C. neovolkiana...........................................................140
Bảng 3.24: Tỷ lệ (%) ức chế p50 trên tín hiệu NF-kB tế bào RAW 264.7 của 4 hợp
chất được phân tách từ cao chiết EA sinh khối nấm C. neovolkiana......................142
Bảng 3.25: Tỷ lệ (%) ức chế p65 trên tín hiệu NF-kB tế bào RAW 264.7 của 4 hợp
chất được phân tách từ cao chiết EA sinh khối nấm C. neovolkiana......................144
Bảng 3.26: Tỷ lệ (%) ức chế p50 và p65 trên tín hiệu NF-kB tế bào RAW 264.7 của
cao chiết EA sinh khối nấm C. neovolkiana và 4 hợp chất được phân tách từ cao
chiết EA tại 10 μg/mL.............................................................................................146
Bảng 3.27: Giá trị IC50 (ppm) của cao phân đoạn EA sinh khối C. neovolkiana và 4
hợp chất được phân tách từ cao EA khi khảo sát khả năng bảo vệ protein màng tế
bào RAW 264.7......................................................................................................149
PAGE \* MERGEFORMAT 4
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Cordyceps militaris...................................................................................19
Hình 1.2: Sơ đồ biểu diễn chiết xuất và tinh chế polysaccharides C. sinensis.........25
Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của các hợp chất hoạt tính sinh học được phân lập từ
Cordyceps spp...........................................................................................................32
Hình 1.4: Hình thái của chủng DL0004....................................................................55
Hình 1.5: Cấu trúc sinh sản (synemas) của Cordyceps takaomontana trên nhộng
Lepidoptera...............................................................................................................58
Hình 1.6: Nấm C. takaomontana..............................................................................58
Hình 1.7: Mẫu vật, cấu trúc sinh bào tử và khuẩn lạc trên mơi trường PDA của
I.tenuipes...................................................................................................................62
Hình 1.8: Các kiểu hình và sự phát triển của quả thể vơ tính ở C. cicadae..............65
Hình 2.1: Quy trình tổng qt chiết cao phân đoạn..................................................75
Hình 2.2: Phản ứng bắt gốc tự do DPPH..................................................................77
Hình 2.3: Sắc ký bản mỏng.......................................................................................83
Hình 2.4: Sắc ký cột silical thường...........................................................................83
Hình 2.5: Sơ đồ tách chất đã xác định được cấu trúc hóa học..................................87
Hình 2.6: Phản ứng gây độc tế bào...........................................................................88
Hình 3.1: Cấu trúc hóa học của 3 hợp chất thu được từ cao EA của sinh khối C.
neovolkiana.............................................................................................................138
Hình 3.2: Kết quả điện di gel SDS-PAGE p50 và p65 từ tế bào RAW 264.7 sau xử
lý bằng cao chiết EA sinh khối C. neovolkiana......................................................141
Hình 3.3: Kết quả điện di gel SDS-PAGE p50 từ tế bào RAW 264.7 sau xử lý bằng
4 hợp chất được phân tách từ cao chiết EA sinh khối C. neovolkiana...................143
Hình 3.4: Kết quả điện di gel SDS-PAGE p65 từ tế bào RAW 264.7 sau xử lý bằng
4 hợp chất được phân tách từ cao chiết EA sinh khối C. neovolkiana...................145
Hình 3.5: Kết quả điện di DNA của tế bào RAW 264.7.........................................150
Hình 4.1: Mơ phỏng tác động của Thymine từ cao EA sinh khối C. neovolkiana
DL0004 ức chế p50/p65 trên tín hiệu tế bào NF-kB của tế bào RAW 264.7.........154
PAGE \* MERGEFORMAT 4
Đồ thị 3.1: Đồ thị biểu diễn khả năng khử của vitamin C......................................101
Đồ thị 3.2: Đồ thị biểu diễn khả năng khử của các cao chiết sinh khối nấm C.
neovolkiana.............................................................................................................103
Đồ thị 3.3: Đồ thị biểu diễn khả năng khử của các cao chiết quả thể nấm C.
neovolkiana.............................................................................................................105
Đồ thị 3.4: Đồ thị biểu diễn khả năng khử của các cao chiết sinh khối C.
takaomontana..........................................................................................................108
Đồ thị 3.5: Đồ thị biểu diễn khả năng khử của các cao chiết C. takaomontana.....109
Đồ thị 3.6: Đồ thị biểu diễn khả năng khử của các cao chiết sinh khối I. cicadae. 111
Đồ thị 3.7: Đồ thị biểu diễn khả năng khử của các cao chiết quả thể I. cicadae....112
Đồ thị 3.8: Đồ thị biểu diễn khả năng khử của các cao chiết sinh khối I. tenuipes 114
Đồ thị 3.9: Đồ thị biểu diễn giá trị IC 50 (μg/mL) của các cao chiết từ sinh khối của
bốn mẫu nấm theo phương pháp DPPH..................................................................118
Đồ thị 3.10: Biểu đồ giá trị IC 50 (μg/mL) của các cao chiết từ sinh khối nấm của bốn
mẫu nấm theo phương pháp DPPH.........................................................................120
Đồ thị 3.11: Biểu đồ giá trị IC 50 (μg/mL) của các cao chiết từ sinh khối của bốn mẫu
nấm theo phương pháp ABTS.................................................................................122
Đồ thị 3.12: Biểu đồ giá trị IC 50 (ug/mL) của các cao chiết từ quả thể của bốn mẫu
nấm theo phương pháp ABTS.................................................................................124
Đồ thị 3.13: Biểu đồ giá trị IC50 (ug/mL) của các cao chiết từ sinh khối của bốn mẫu
nấm theo phương pháp ức chế XO.........................................................................127
Đồ thị 3.14: Biểu đồ giá trị IC 50 (μg/mL) của các cao chiết từ sinh khối của hai mẫu
nấm theo phương pháp ức chế biến tính BSA bởi nhiệt độ....................................131
Đồ thị 3.15: Biểu đồ giá trị IC50 (μg/mL) của các cao chiết từ quả thể của hai mẫu
nấm theo phương pháp ức chế biến tính BSA bởi nhiệt độ....................................133
Đồ thị 3.16: Biểu đồ tỷ lệ (%) ức chế p50 và p65 từ tế bào RAW 264.7 sau xử lý
bằng cao chiết EA sinh khối C. neovolkiana..........................................................141
PAGE \* MERGEFORMAT 4
Đồ thị 3.17: Biểu đồ tỷ lệ (%) ức chế p50 của tế bào RAW 264.7 sau xử lý bằng 4
hợp chất được phân tách từ cao chiết EA sinh khối C. neovolkiana......................143
Đồ thị 3.18: Biểu đồ tỷ lệ (%) ức chế p65 của tế bào RAW 264.7 sau xử lý bằng 4
hợp chất được phân tách từ cao chiết EA sinh khối C. neovolkiana......................145
Đồ thị 3.19: Biểu đồ tỷ lệ (%) ức chế p50 và p65 của tế bào RAW 264.7 sau xử lý
bằng cao chiết EA sinh khối C. neovolkiana và 4 hợp chất được phân tách từ cao
chiết EA tại 10 μg/mL.............................................................................................147
Đồ thị 3.20: Biểu đồ giá trị IC 50 (ppm) của cao phân đoạn EA sinh khối C.
neovolkiana và 4 hợp chất được tách từ cao EA khi khảo sát khả năng bảo vệ
protein màng tế bào RAW 264.7............................................................................149
Đồ thị 3.21: Biểu đồ tỷ lệ (%) bảo vệ DNA tế bào RAW 264.7 của cao phân đoạn
EA sinh khối C. neovolkiana và 4 hợp chất được phân tách từ cao EA.................151
PAGE \* MERGEFORMAT 4
MỞ ĐẦU
Nấm Cordyceps có truyền thống lâu đời được sử dụng như một nguyên liệu tự
nhiên ở châu Á vì có tác dụng kháng viêm, kháng oxy hóa, giảm mệt mỏi và kích
thích hệ thống miễn dịch ở người. Nguồn tài nguyên nấm này rất hạn chế trong tự
nhiên do tính đặc hữu của lồi cũng như cùng với sự phát triển sinh học đặc hiệu và
quá trình cộng sinh lâu dài giữa nấm và ấu trùng (từ mùa thu đến mùa xuân) mất
nhiều thời gian. Do vậy việc thu nhận lồi nấm này từ mơi trường tự nhiên trở nên
không đủ để đáp ứng sự phát triển nhu cầu về nguyên liệu thô để sản xuất thực
phẩm chức năng và dinh dưỡng phục vụ con người. Việc tìm nguồn thay thế được
thúc đẩy bởi rất nhiều nghiên cứu nuôi trồng, nấm và thu nhận các hợp chất quý có
hoạt tính sinh học cao. Bên cạnh hợp chất cordycepin đã được báo cáo có nhiều
hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe con người thì cịn nhiều hợp chất có hoạt tính
sinh học khác cũng được nghiên cứu và ứng dụng.
Mục đích của luận án này là thu nhận cao chiết có tính phân cực tăng dần từ một số
loài Cordyceps đặc hữu ở Việt Nam như Cordyceps neovolkiana, Cordyceps
takaomontana, Isaria cicadae …thông qua sàng lọc một số hoạt tính sinh học như
kháng oxi hóa và kháng viêm để tìm ra phân đoạn có hoạt tính sinh học tiềm năng.
Từ kết quả nghiên cứu thực tế cũng như kết quả của các nghiên cứu trước đây,
chúng tôi chọn được phân đoạn cao chiết Ethyl acetate như một tập hợp thu nhỏ có
chứa các hợp chất sinh học tiềm năng. Chạy sắc ký bản mỏng để xác định chất,
kiểm tra các phân đoạn thu được bằng sắc ký lớp mỏng. Tiến hành sắc kí cột trên 2
phân đoạn cao cùng “băng” gom thành một. Tiếp tục sắc ký trên cột silica gel rửa
giải với hệ dung mơi thích hợp thu được 12 chất. Xác định cấu trúc được 4 chất thu
được bằng các thiết bị ghi phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và 2DNMR tại phịng Phân tích Trung tâm trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học
Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.
Trong mơ hình viêm do lipopolysaccharide (LPS) gây ra ở đại thực bào RAW
264.7, các đơn chất thu được gồm 3,5,6-trimethylpiperazin-2-one, Thymine và
PAGE \* MERGEFORMAT 4
Nicotinic acid được chứng minh là làm giảm sự biểu hiện tín hiệu Nuclear factor
kappaB (NF-kB) bao gồm p50 và p65 và ức chế sản xuất các chất trung gian gây
viêm, cụ thể là NO được tạo ra bởi LPS trong các đại thực bào. Kết quả nghiên cứu
cũng xác định được khả năng bảo vệ sự tổn thương DNA và protein màng tế bào do
các tác nhân oxy hóa.
Nghiên cứu này đã xác định được một số đơn chất có đặc tính y học từ sinh khối
Cordyceps neovolkiana DL0004 phân lập tại Việt Nam thể hiện hoạt tính kháng
viêm và kháng oxi hóa tiềm năng, góp phần vào kết quả nghiên cứu của tập hợp các
nấm Cordyceps ở trong nước. Nấm C. neovolkiana xứng đáng được coi là nguồn
nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng và sử dụng làm nguyên liệu dược
mà chúng ta có thể chủ động nguồn sản xuất trong nước cũng như kiểm soát được
q trình ni cấy một cách tích cực.
PAGE \* MERGEFORMAT 4
CHƯƠNG 1:
1.1.
TỔNG QUAN
Giới thiệu chung về Cordyceps
Hiện nay, trên thị trường xuất hiện rất nhiều dược phẩm và thực phẩm chức năng có
nguồn gốc từ đơng trùng hạ thảo – Cordyceps như một trào lưu chăm sóc sức khỏe
cộng đồng. Thực tế, Cordyceps được biết đến từ rất lâu như dược liệu truyền thống
nổi tiếng có nhiều hợp chất giàu hoạt tính sinh học. Cordyceps có các tên gọi chung
khác nhau như nấm côn trùng, nấm sâu bướm, vàng Himalaya…, nhưng đều bắt bắt
nguồn từ các từ Latin “cord = chùy’, và “ceps = đầu’[1]. Cordyceps là danh pháp
khoa học của một chi nấm túi (Ascomycetes). Chi nấm này được Frank và Link xác
định vào năm 1983, với khoảng 150 lồi và hiện nay đã tìm thấy hơn 700 lồi trên
toàn thế giới [2]. Theo cơ sở dữ liệu NCBI, Cordyceps thuộc giới nấm, ngành
Ascomycetes, bộ Hypocreales, họ Clavicipitaceae, chi Cordyceps. Trong sự phát
triển của nấm hiện nay cũng có tranh cãi là nấm ký sinh hay nấm cộng sinh. Theo
nhà bệnh lý côn trùng Jaroslav Weiser (1965) Tiệp Khắc và Jayaraj, S. Ấn Độ thì
Cordyceps là ký sinh vì trong đó có nhiều lồi của Beauveria, Metarhizium, Isaria
và ngay cả Cordyceps cũng gây bệnh côn trùng và được sử dụng trong phòng trừ
sâu hại. Ngày nay, các giống nấm trên được coi là đồng danh, cùng giống lồi
nhưng có tên khác nhau hay dị hình thái. Một số nhà sinh học khác lại coi là nấm
cộng sinh [2].
Chi nấm Cordyceps có hình thức sống kí sinh trên các loại ấu trùng côn trùng, tránh
được hệ thống miễn dịch của vật chủ bằng cách hòa hợp vào vòng đời của vật chủ
để tồn tại và sinh sản, khi trưởng thành có hình dáng quả thể đặc thù [2]. Bên cạnh
đó, vòng đời sinh trưởng và phát triển của chúng cũng rất phức tạp do đan xen giữa
thể hữu tính và vơ tính, tế bào đơn bội và đa bội. Do nấm Cordyceps có các giai
đoạn phát triển khác nhau tùy theo yếu tố môi trường hay tùy theo điều kiện nuôi
cấy được bảo đảm đầy đủ mà việc nuôi trồng nấm Cordyceps ở dạng cấy nấm (thu
quả thể) hay dạng sợi (thu sinh khối) [2] hoặc dạng dị hình thái nên rất khó phân
loại. Do đó, cùng một giống lồi có các tên khác nhau. Việc phân loại chính xác cần
PAGE \* MERGEFORMAT 4
phải dùng đến sinh học phân tử và phân tích gen như các kỹ thuật PCR, điện di, tách
dòng hay giải trình tự và xử lý số liệu.
Chi Cordyceps được phân loại theo thứ tự Hypocreales; họ Ophiocordycipitaceae;
và phylum Ascomycota. Một số chi thuộc họ Cordycipitaceae và một phần họ
Clavicipitaceae như được trình bày trong Bảng 1.1 [1]{Daba, 2020 #16;Daba, 2020
#16}.
Hình 1.1: Cordyceps militaris (Nguồn: Marjan Kusten; Địa phương: Gabrovac, Serbia)
Bảng 1.1: Hệ thống phân loại Cordyceps (Cordyceps sensu lato) (Nguồn: Daba, 2020)
Loài
Số
lượng
Partial Clavicipitaceae
Loài
Số
lượng
Ophiocordycipitaceae
Loài
Số lượng
Cordycipitaceae
Drechmeria
2
Blistum
1
Akanthomyces
13
Hypocrella
50
Didymobotryopsis
3
Ascopolyporus
7
Metacordyceps
4
Elaphocordyceps
1
Beauveria
31
Metarhizium
35
Haptocillium
8
Beejasamuha
1
Nomuraea
3
Hirsutella
78
Cordyceps
Pochonia
3
Hymenostilbe
22
Coremiopsis
2
Podocrella
4
Ophiocordyceps
155
Engyodontium
5
Regiocrella
2
Paraisaria
2
Gibellula
21
Sphaerocordyceps
2
Perennicordyceps
4
Hyperdermium
2
Tyrannicordyceps
5
Polycephalomyces
12
Insecticola
2
Purpureocillium
3
Isaria
83
PAGE \* MERGEFORMAT 4
175
Tổng cộng: 10
1.2.
110
Syngliocladium
5
Lecanicillium
21
Synnematium
1
Microhilum
1
Tolypocladium
39
Phytocordyceps
1
Trichosterigma
1
Pseudogibellul
a
1
Rotiferophthor
a
27
Simplicillium
8
Torrubiella
66
Tổng cộng: 18
467
Tổng cộng: 15
335
Tình hình phân bố và đặc điểm sinh trưởng của Cordyceps spp.
Các nhà khoa học ghi nhân có hơn 700 lồi nấm được cơng nhận trên chi
Cordyceps, khoảng 20 loài ký sinh trên chi Elaphomyces, và các lồi cịn lại ký sinh
trên cơn trùng và động vật chân đốt thuộc các lớp Arachnida, Hymenoptera,
Isoptera, Coleoptera, Hemiptera và Lepidoptera. Sự đa dạng về loài này bao gồm
C. sinensis (Ophiocordyceps sinensis (Berk.), C. ophioglossoides (Tolypocladium
ophioglossoides (Ehrh.), C. militaris ( L.) Fr., C. gracilis (Grev.) Durieu & Mont.,
C. sobolifera (Hill ex Watson), C. subsessilis Petch, C. gunnii (Berk.) Berk., C.
cicadae SZ Shing, C. lao tố (Lebert) Maire, C. scarabaeicola Kobayasi, C. minuta
Kobayasi, C. myrmecophila Ces., C. canadensis Ellis & Everh., C. nutans Pat., C.
agriota A. Kawam., C. ishikariensis M Zang, D. Liu và R. Hu, C.herecocephala
(Berk.) Sacc, C. konnoana Kobayasi & Shimizu, C. nigrella Kobayasi & Shimizu,
C. cleinosa Petch, C. tricentri Yasuda, trong số những loài khác [1-3].
Sự phân bố địa lý của chúng chủ yếu dựa trên sự phân bố của vật chủ, tuy nhiên,
chúng có thể mọc trên núi cao ở độ cao từ 3.600 – 4.000 m so với mực nước biển.
Do đó, Cordyceps spp. đã được tìm thấy phổ biến ở Bắc Mỹ, Châu Âu và Châu Á,
hầu hết ở các nước như Trung Quốc, Nhật Bản, Nepal, Bhutan, Việt Nam, Hàn
Quốc và Thái Lan. Ở Ấn Độ, nấm chủ yếu hiện diện ở các vùng cận núi như
Kumaun Himalaya và Garhwal Himalaya [4]. Hơn nữa, người ta đã báo cáo rằng
các loài như C. gunnii (Berk.) Berk. được tìm thấy ở Úc [5].
PAGE \* MERGEFORMAT 4
