khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa của cao methanol cây hà thủ ô trắng (streptocaulon juventas merr )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
══●══

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG OXY
HÓA CỦA CAO METHANOL CÂY HÀ THỦ Ô TRẮNG
(Streptocaulon juventas Merr.)

GVHD:

SVTH:

Ts. Đái Thị Xuân Trang

Lâm Hồng Bảo Ngọc
MSSV: 3112380
Ngành: Sinh học Khóa 37

1 5 năm 2015
Cần Thơ, tháng


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
══●══

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG OXY
HÓA CỦA CAO METHANOL CÂY HÀ THỦ Ô TRẮNG
(Streptocaulon juventas Merr.)

GVHD:

SVTH:

Ts. Đái Thị Xuân Trang

Lâm Hồng Bảo Ngọc
MSSV: 3112380
Ngành: Sinh học Khóa 37

2 5 năm 2015
Cần Thơ, tháng


LỜI CẢM ƠN
Con xin khắc ghi công ơn ba mẹ và những người thân đã nuôi dưỡng và
giáo dục con nên người.
Tôi xin gửi lòng biết ơn đến:
 Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Cần Thơ
 Thầy cô bộ môn Sinh Học, khoa Khoa Học Tự Nhiên
Đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và
hoàn thành đề tài.
Tôi xin chân thành biết ơn:
 Ts. Đái Thị Xuân Trang
 Ths. Phan Kim Định

 Cô Võ Thị Tú Anh
Đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, dành nhiều thời gian và công sức để truyền
đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện tốt cho tôi hoàn
thành luận văn tốt nghiệp này.
Chân thành cảm ơn các bạn lớp Cử Nhân Sinh Học K37 đã động viên, giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài.

i


TÓM TẮT
Khả năng kháng khuẩn và kháng oxy hóa của cao methanol cây Hà Thủ Ô
trắng (thân và lá) được khảo sát. Bộ phận của cây Hà Thủ Ô được ly trích bằng
dung môi methanol. Khả năng kháng vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus
aureus được xác định bằng phương pháp Kirby-Bauer và khả năng kháng oxy hóa
được tiến hành bằng phương pháp DPPH (2,2-diphenyl-1 picrylhydrazyl). Kết quả
chứng minh hiệu quả kháng khuẩn của cao methanol cây Hà Thủ Ô rất cao ở giá trị
MIC = 16 µg/ml đối với 2 dòng vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus
aureus. Cao chiết methanol cây Hà Thủ Ô có khả năng kháng vi khuẩn
Escherichia coli và Staphylococcus aureus cao hơn thuốc kháng sinh chuẩn
ampicillin (MIC = 64 µg/ml) và amoxicillin (MIC E.

coli

= 64 µg/ml và

MICS. aureus = 16 µg/ml ). Hiệu quả loại bỏ gốc tự do hydro ở DPPH của cao Hà
Thủ Ô (IC50 = 349 µg/ml) thấp hơn so với vitamin C 15,5 lần (IC 5 0 = 22,55
µg/ml).
Từ khóa: cây Hà Thủ Ô, kháng khuẩn, kháng oxy hóa, DPPH, Kirby-Bauer.

ii


MỤC LỤC
Nội dung

Trang

LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................i
TÓM TẮT .......................................................................................................... ii
MỤC LỤC ......................................................................................................... iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..........................................................................v
DANH MỤC HÌNH ...........................................................................................vi
DANH MỤC BẢNG .........................................................................................vii
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU ......................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề ...........................................................................................1
1.2 Nội dung thực hiện .............................................................................2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................3
2.1 Giới thiệu về cây Hà thủ ô trắng ........................................................3
2.1.1 Đặc điểm thực vật học .................................................................3
2.1.2 Đặc điểm hình thái .......................................................................3
2.1.3 Phân bố .........................................................................................4
2.1.4 Công dụng của cây Hà thủ ô trắng ..............................................4
2.2 Giới thiệu một số đặc tính của vi khuẩn thử nghiệm .......................5
2.2.1 Vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) ...............................................5
2.2.1.1 Đặc điểm hình thái ..................................................................5
2.2.1.2 Đặc tính nuôi cấy ....................................................................5
2.2.1.3 Khả năng gây bệnh của E. coli .................................................6
2.2.1.4 Khả năng mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn E. coli ................6

2.2.2 Vi khuẩn Staphylococcus aureus (S.aureus) ................................7
2.2.2.1 Đặc điểm hình thái ..................................................................7
2.2.2.2 Đặc tính nuôi cấy .....................................................................7
2.2.2.3 Khả năng gây bệnh của S. aureus ............................................7
2.2.2.4 Khả năng mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn S. aureus ............8
2.2.3 Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa ..............................................8
2.2.3.1 Đặc điểm hình thái ..................................................................8
2.2.3.2 Đặc tính nuôi cấy .....................................................................8
2.2.3.3 Khả năng gây bệnh của P. aeruginosa .....................................8
2.2.3.4 Khả năng mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn P. aeruginosa ...10
iii


2.3 Hoạt tính kháng oxy hóa ..................................................................10
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..............................................12
3.1 Vật liệu .............................................................................................12
3.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ..........................................................12
3.2.1 Thiết bị, dụng cụ ........................................................................12
3.1.2 Hóa chất .....................................................................................12
3.3 Phương pháp tiến hành ...................................................................13
3.3.1 Điều chế cao chiết methanol cây HTO .......................................13
3.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết cây
Hà Thủ Ô..............................................................................................14
3.3.3 Phương pháp khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao chiết
cây Hà Thủ Ô .......................................................................................14
3.3.4 Phương pháp thống kê, phân tích số liệu ..................................15
CHƯƠNG 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................16
4.1 Kết quả chiết cao methanol cây Hà Thủ Ô......................................16
4.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết cây Hà Thủ Ô 16
4.3 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao Hà Thủ Ô ......25

CHƯƠNG 5 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................29
5.1 Kết luận ............................................................................................29
5.2 Kiến nghị ..........................................................................................29
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................30
PHỤ LỤC ..........................................................................................................33

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DPPH : 2,2 – diphenyl – 1 – picrylhydrazyl
HTO : Hà Thủ Ô, tên khoa học Streptocaulon juventas (Merr).
IC50 : Inhibitory concentration 50% (Nồng độ ức chế 50%)
MIC : Minimum inhibitory concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu)
E. coli : Escherichia coli
S. aureus : Staphylococcus aureus
P. aeruginosa : Pseudomonas aeruginosa

v


DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Cây Hà Thủ Ô trắng..................................................................................4
Hình 2: Quy trình xử lý nguyên liệu và điều chế cao methanol thân và lá
cây Hà Thủ Ô.....................................................................................................13
Hình 3: Vòng vô khuẩn của cao Hà Thủ Ô trên 3 loại vi khuẩn (mm)..................17
Hình 4: Biểu đồ đường kính vòng vô khuẩn của cao methanol Hà Thủ Ô trên hai
dòng vi khuẩn ......................................................................................................18
Hình 5: Biểu đồ hoạt tính kháng S. aureus của cao Hà Thủ Ô so với 2 loại kháng
sinh ampicillin và amoxicillin..............................................................................22

Hình 6: Biểu đồ thể hiện hoạt tính kháng E. coli của cao Hà Thủ Ô so với 2 loại
kháng sinh ampicillin và amoxicillin ...................................................................23
Hình 7: Đường chuẩn kháng oxy hóa của vitamin C (µg/ml) ...............................26

vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Khả năng kháng khuẩn của cao methanol cây Hà Thủ Ô ........................16
Bảng 2: Khả năng kháng khuẩn của hai loại kháng sinh ampicillin (10 µg/ml) và
amoxicillin (25 µg/ml).........................................................................................19
Bảng 3: Nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu (MIC) của cao Hà Thủ Ô và 2 loại
kháng sinh ...........................................................................................................24
Bảng 4: Hiệu suất kháng oxy hóa của cao Hà Thủ Ô (thân và lá) và nồng độ
vitamin C (µg/ml) tương ứng...............................................................................27
Bảng 5: Giá trị IC50 của cao methanol Hà Thủ Ô so với vitamin C ......................27

vii


CHƯƠNG 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Cây Hà thủ ô (HTO) trắng là một loại dược liệu quý và được sử dụng như
một loại thảo dược mang lại sự trường xuân cho con người. Bên cạnh đó, HTO
trắng còn có nhiều công dụng khác: dùng để giải độc, trị cảm sốt, trị vết sưng đau,
vết thương do rắn cắn...(Đỗ Tất Lợi, 1995).
Hiện nay vẫn chưa có nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng dược lý cũng
như tính ứng dụng của cây HTO trắng. Theo tạp chí cây thuốc quý, dây và lá Hà
thủ ô trắng phối hợp với lá Bồ cu vẽ được dùng để điều trị cho bệnh nhân viêm hắc

võng mạc. Lá và rễ cây HTO trắng lúc tươi còn được dùng để trị rắn cắn.
Ngày nay, nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trở nên rất phổ biến và có thể gây ra
nhiều bệnh nguy hiểm đặc biệt đối với trẻ nhỏ và có thể gây tử vong. Một trong
những nguyên nhân chính gây ra tình trạng này là do vi khuẩn đường ruột. Họ vi
khuẩn đường ruột đứng đầu trong các nguyên nhân chính gây tiêu chảy ở người.
Ngoài đường tiêu hóa, các vi khuẩn đường ruột còn có khả năng gây bệnh ở nhiều
cơ quan khác như tiết niệu, thần kinh, hô hấp… chúng gây ra các chứng viêm
đường tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết. Có thể nói khái quát ở bất kỳ bệnh phẩm nào
cũng có thể gặp thành viên của họ vi khuẩn đường ruột. Và phương pháp chữa trị
chủ yếu hiện nay là sử dụng kháng sinh. Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh có thể
gây ra nhiều rủi ro do hiện tượng kháng thuốc. Do đó, việc tìm ra một nguồn
nguyên liệu tự nhiên có khả năng kháng khuẩn sẽ đem lại phương pháp điều trị
một cách hiệu quả đối với một số bệnh nhiễm khuẩn (Đỗ Thị Túy Phượng, 2007).
Bên cạnh đó, stress oxy hóa đang là mối quan tâm hàng đầu với các nhà
khoa học hiện nay. Stress oxy hóa là hiện tượng xuất hiện trong cơ thể sinh vật khi
có sự mất cân bằng giữa việc sản xuất các gốc tự do và hoạt động của các chất
kháng oxy hóa. Hiện tượng này là nguyên nhân của rất nhiều bệnh nguy hiểm
trong đó có ung thư, các bệnh tim mạch, các bệnh suy giảm hệ thần kinh
(Alzheimer, Parkinson) (Fouad T, 2006) và lão hóa sớm (Lại Thị Ngọc Hà, 2009).

1


Các chất kháng oxy hóa ngày càng được quan tâm và nghiên cứu để ứng dụng trị
bệnh cho con người và đặc biệt các chất có nguồn gốc từ thực vật có tác dụng ngăn
chặn quá trình oxy hóa không mong muốn trong cơ thể như các chất carotenoid,
flavonoid, phenol, vitamin C, vitamin E... Ngăn chặn sự sản xuất ra nhiều gốc tự
do bằng cách bổ sung các chất kháng oxy hóa tự nhiên có trong thực vật bởi các
chất kháng oxy hóa này có khả năng làm sạch gốc tự do có hại cho cơ thể từ sự
stress oxy hóa (Pal et al., 2011).

Xuất phát từ yêu cầu trên, đề tài “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng
oxy hóa của cao methanol cây Hà thủ ô (Streptocaulon juventas Merr.)” được tiến
hành. Mục tiêu của đề tài là khảo sát khả năng kháng vi khuẩn của cây HTO cũng
như khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH của cây HTO.
1.2 Nội dung thực hiện
 Dùng phương pháp nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch, sử dụng
phương pháp vòng kháng khuẩn và pha loãng liên tục để xác định nồng độ ức chế
tối thiểu của cao methanol cây HTO.
 Thử hoạt tính kháng oxy hóa của cao methanol cây HTO bằng phương
pháp xác định khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH.

2


CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1

Giới thiệu về cây Hà thủ ô trắng

2.1.1 Đặc điểm phân loại
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliosida
Bộ: Gentianales
Họ: Asclepiadaceae
Chi: Streptocaulon
Loài: Streptocaulon juventas
Tên thông thường: hà thủ ô nam, bạch hà thủ ô, củ vú bò, dây sữa bò, dây
mốc, cây sừng bò, cây đa lông, mã liên an (Đỗ Tất Lợi, 1995).
2.1.2 Đặc điểm hình thái

Hà thủ ô trắng là loại dây leo dài từ 2 – 5 m. Thân và cành màu hơi đỏ hay
nâu đỏ, có rất nhiều lông, khi già thì nhẵn dần. Lá mọc đối, hình mác dài, đầu
nhọn, đáy tròn hoặc hơi hình nón cụt, có lông mịn và nhiều ở mặt dưới, mặt trên
cũng có lông ngắn hơn. Phiến lá dài 4 – 14 cm, rộng 2 – 9 cm, cuống lá dài 5 – 8
cm cũng có nhiều lông. Hoa màu nâu nhạt hoặc vàng tía mọc thành xim, rất nhiều
lông. Quả đại tách đôi ngang ra trông như sừng bò (do đó có người gọi là cây sừng
bò). Quả hình thoi, màu xám nhiều lông, dài 7 – 11 cm, rộng 8 mm. Hạt dẹt, phồng
ở lưng, dài 5 – 7 mm, rộng 2 mm, có chùm lông mịn dài 2 cm (Đỗ Tất Lợi, 1995).
(Hình 1).

3


Hình 1: Cây Hà Thủ Ô trắng
Vì cây có nhiều lông trông như mốc cho nên có nơi còn gọi là dây mốc.
Toàn cây, băm thân, lá, quả non ra chỗ nào cũng cho thứ nhựa trắng như sữa nên
cây còn có tên cây sữa bò.
2.1.3 Phân bố
Cây Hà thủ ô trắng mọc hoang ở khắp những đồi núi trọc của nước ta.
Thường ưa những nơi đất đồi cứng vùng Vĩnh Phúc, Hà Tây, Hà Giang, Tuyên
Quang, Cao Bằng, Lạng Sơn (Đỗ Tất Lợi, 1995).
2.1.4 Công dụng của cây Hà thủ ô trắng
Củ Hà thủ ô trắng vị đắng, tính mát, có tác dụng bổ máu bổ gan thận. Theo
kinh nghiệm của các lương y Việt Nam: Củ Hà thủ ô trắng có tác dụng thanh nhiệt,
giải độc, chữa sốt nóng, sốt rét, cảm sốt ra nhiều mồ hôi, bị thương sưng đau, phụ
nữ ít sữa. Kích thích nhẹ sự co bóp tim, co mạch ngoại vi. Kích thích hô hấp
nhưng không làm thay đổi huyết áp. Kích thích nhẹ nhu động ruột, lợi tiểu, an thần
nhẹ, hạ nhiệt cơ thể, tăng sức lực, tăng cân. Nâng cao tỷ lệ sống hoặc kéo dài thời
gian cầm cự với súc vật đã tiêm liều độc nọc rắn Hổ mang. Cây Hà Thủ Ô trắng
(Streptocaulon juventas Merr.) và các bộ phận của cây được các nhà khoa học

quan tâm trong những năm gần đây. Các thử nghiệm về hoạt tính kháng ung thư
cho thấy dịch chiết methanol rễ cây Hà Thủ Ô trắng có độc tính chọn lọc đối với
năm dòng tế bào ung thư là tế bào ung thư tử cung Hela người, tế bào ung thư phổi
người A549, tế bào ung thư chuột colon 26-L5, tế bào ung thư phổi chuột LLC và
tế bào ung thư ruột kết chuột B16-BL6 chuột (Udea, 2003). Dịch chiết của S.
4


juventas (cả cây) có khả năng kháng khuẩn (Nguyen và Eun, 2013) và kháng oxy
hóa (Nguyen và Eun, 2011).
2.2

Giới thiệu một số đặc tính của vi khuẩn thử nghiệm

2.2.1 Vi khuẩn Escherichia coli (E.coli)
Vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, họ vi khuẩn thường trực ở
trong ruột, chiếm tới 80% các vi khuẩn hiếu khí vừa là vi khuẩn cộng sinh thường
trực đường tiêu hóa, vừa là vi khuẩn gây nhiều bệnh ở đường ruột và ở các cơ quan
khác (Lê Văn Tạo, 1997).
2.2.1.1 Đặc điểm hình thái
E. coli là một trực khuẩn ngắn 2 đầu tròn, kích thước 2 – 3 µm. Trong cơ
thể có hình cầu, trực khuẩn đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Trong môi
trường nuôi cấy, có khi quan sát thấy những trực khuẩn dài 4 – 8 µm và thường
gặp trong canh khuẩn giả. Phần lớn vi khuẩn E. coli có khả năng di động do có
lông ở xung quanh thân, nhưng cũng có một số chủng không có khả năng di động.
Vi khuẩn không sinh nha bào, có thể có giáp mô (Nguyễn Như Thanh, 1997).
Vi khuẩn bắt màu Gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu. Nếu
lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc để nhuộm có thể quan sát thấy giáp mô. Dưới kính hiển
vi điện tử còn phát hiện được cấu trúc pilli – yếu tố mang kháng nguyên bám dính
của vi khuẩn E. coli (Nguyễn Như Thanh, 1997).

2.2.1.2 Đặc tính nuôi cấy
Vi khuẩn E. coli dễ dàng phát triển trên môi trường nuôi cấy thông thường,
một số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp nên người ta đã chọn
chúng để nghiên cứu về sinh vật học.
E. coli là trực khuẩn hiếu khí không bắt buộc, có thể sinh trưởng ở
nhiệt độ từ 5 - 40ºC, nhiệt độ thích hợp nhất là 37ºC. pH thích hợp nhất là 7,2 –
7,4, phát triển được ở pH từ 5,5 – 8 (Nguyễn Như Thanh, 1997).
Môi trường thạch thường: sau 24 giờ nuôi cấy, ở 37ºC, vi khuẩn hình thành
những khuẩn lạc tròn, ướt nóng láng, đục, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính
5


từ 2 – 3 mm. Nếu nuôi lâu, khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc rộng ra, có thể quan
sát thấy cả những khuẩn lạc dạng R (thô, nhám) và M (trơn, nhầy) (Nguyễn Như
Thanh, 1997).
2.2.1.3 Khả năng gây bệnh của E. coli
Nhóm bệnh do E. coli gây tiêu chảy xuất huyết đường ruột (EHEC) đã được
biết từ năm 1982 khi có các vụ dịch viêm ruột xuất huyết xảy ra ở Mỹ do một típ
huyết thanh O157:H7 gây ra mà trước đây chưa hề được xác định là nguyên nhân
gây bệnh đường tiêu hóa. Một số chủng E. coli trong nhóm EHEC, trong
đó có E. coli O157:H7 có khả năng tiết ra độc tố Shiga được xếp vào nhóm các vi
khuẩn E. coli sản xuất độc tố Shiga (STEC) (Trần Như Dương, 2011).
Bệnh tiêu chảy do EHEC gây ra có thể diễn biến từ thể nhẹ, phân không có
máu hoặc ít máu đến thể nặng phân toàn máu nhưng không chứa bạch cầu. Nguy
hiểm hơn khi nhiễm chủng STEC có thể gây ra hội chứng tan máu suy thận cấp
(Haemolytic Uraemic Syndrom: HUS) và các chứng ban đỏ do thiếu tiểu cầu, đây
là nguyên nhân chính gây tử vong. Bệnh cảnh của hội chứng tan máu suy thận cấp
được ghi nhận cả ở người lớn và trẻ em với biểu hiện thiếu máu tan huyết, giảm
tiểu cầu và suy thận cấp tính tăng urê huyết, có thể kèm theo các rối loạn thần kinh
hoặc sốt. Chủng E. coli O157:H7 là nguyên nhân chủ yếu gây ra hội chứng tan

máu suy thận cấp trên toàn thế giới. Khoảng 15% trẻ em và một tỷ lệ thấp hơn ở
người lớn nhiễm E. coli O157:H7 tiến triển tới hội chứng này, trong đó 50% số
bệnh nhân phải chạy thận và 5% tử vong (Trần Như Dương, 2011).
2.2.1.4 Khả năng mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn E. coli
Để điều trị bệnh đường ruột, nhiều loại kháng sinh được sử dụng. Kháng
sinh còn được trộn vào thức ăn với tỷ lệ thấp để phòng bệnh và kích thích tăng
trọng. Vì vậy, khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột nói chung và vi
khuẩn E. coli nói riêng đang ngày một tăng, làm cho hiệu quả điều trị giảm, thậm
chí nhiều loại kháng sinh còn bị vô hiệu hóa hoàn toàn. Khả năng kháng kháng
sinh của vi khuẩn tăng nhanh, lan rộng vì gen sản sinh yếu tố kháng kháng sinh
nằm trong plasmid R (resistance). Plasmid này có thể di truyền dọc và di truyền
ngang cho tất cả quần thể vi khuẩn thích hợp (Falkow, 1975).
6


2.2.2 Vi khuẩn Staphylococcus aureus (S.aureus)
2.2.2.1 Đặc điểm hình thái
S. aureus (còn được gọi là tụ cầu vàng) có dạng hình cầu, Gram dương,
đường kính 0,8 – 1 µm và đứng thành hình chùm nho, hình thức tập hợp này do vi
khuẩn phân bào theo nhiều chiều trong không gian (Nguyễn Trần Hải Hoàng,
2014).
Trong bệnh phẩm thì vi khuẩn thường hợp lại từng đôi một hay tạo thành
những đám nhỏ. Vi khuẩn này không di động, không có lông, không sinh nha bào
và thường không có vỏ (Nguyễn Trần Hải Hoàng, 2014).
2.2.2.2 Đặc tính nuôi cấy
S. aureus phát triển dễ dàng ở môi trường thông thường, là vi khuẩn kỵ khí
không bắt buộc. S. aureus phát triển được ở nhiệt độ 10 - 45ºC, mọc tốt ở 37ºC
nhưng tạo sắc tố tốt ở 20ºC. Ở môi trường thạch, khuẩn lạc tròn, mô lồi, bóng láng,
óng ánh, đường kính khoảng 1 – 2 mm, có thể có màu vàng đậm, màu vàng cam
hoặc màu trắng, tương đối lớn sau 24 giờ (Nguyễn Trần Hải Hoàng, 2014).

2.2.2.3 Khả năng gây bệnh của S. aureus
Tụ cầu vàng thường ký sinh ở da và mũi họng. Vi khuẩn này gây bệnh cho
những người bị suy giảm đề kháng do chúng có nhiều yếu tố độc lực. Tụ cầu vàng
là vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và có khả năng gây nhiều bệnh khác nhau
(Lê Huy Chính, 2001):
- Nhiễm khuẩn da
Do tụ cầu ký sinh trên da và niêm mạc mũi, nên nó có thể xâm nhập qua lỗ
chân lông, chân tóc hoặc các tuyến dưới da. Sau đó gây nên các nhiễm khuẩn sinh
mủ : mụn nhọt, các ổ áp xe, eczema, hậu bối. Mức độ các nhiễm khuẩn này phụ
thuộc vào sự đề kháng của cơ thể và độc lực của vi khuẩn. Nhiễm tụ cầu ngoài da
thường gặp ở trẻ em và người suy giảm miễn dịch. Đinh râu có thể gây nên những
biến chứng nguy hiểm.

7


- Nhiễm khuẩn huyết
Tụ cầu vàng là vi khuẩn thường gây nhiễm khuẩn đường huyết nhất. Do
chúng gây nên nhiều loại nhiễm khuẩn, đặc biệt là nhiễm khuẩn ngoài da, từ đây vi
khuẩn xâm nhập vào máu gây nên nhiễm khuẩn đường huyết. Ðây là một nhiễm
trùng rất nặng. Từ nhiễm khuẩn đường huyết tụ cầu đi tới các cơ quan khác nhau
và gây nên các ổ áp xe (gan, phổi, não, tuỷ) hoặc viêm nội tâm mạc. Có thể gây
nên các viêm tắc tĩnh mạch. Một số nhiễm trùng khu trú này trở thành viêm mãn
tính như viêm xương.
- Viêm phổi
Viêm phổi do tụ cầu vàng rất ít gặp. Nó chỉ xảy ra sau khi viêm đường hô
hấp do virus hoặc sau nhiễm khuẩn huyết. Tuy vậy cũng có viêm phổi tiên phát do
tụ cầu vàng ở trẻ em hoặc người suy yếu. Tỷ lệ tử vong ở những bệnh nhân này
khá cao, vì thế nó được coi là bệnh nguy hiểm.
- Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp

Ngộ độc thức ăn do tụ cầu có thể do ăn uống phải độc tố ruột của tụ cầu,
hoặc do tụ cầu cư trú ở ruột chiếm số lượng ưu thế. Nguyên nhân là sau một thời
gian dài bệnh nhân dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng, dẫn đến các vi khuẩn chí
bình thường của đường ruột nhạy cảm với kháng sinh bị tiêu diệt và tạo điều kiện
cho tụ cầu vàng (kháng kháng sinh) tăng trưởng về số lượng. Triệu chứng của ngộ
độc thức ăn do tụ cầu vàng thường rất cấp tính. Sau ăn phải thức ăn nhiễm phải
độc tố tụ cầu 2 – 8 giờ, bệnh nhân nôn và đi ngoài dữ dội, phân lẫn nước, càng về
sau phân và chất nôn chủ yếu là nước. Do mất nhiều nước và chất điện giải nên có
thể dẫn tới sốc. Ngoài bệnh nguyên nhân do tụ cầu một số trường hợp có thêm vai
trò của Clotridium diffiticile, sau khi dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng.
2.2.2.4 Khả năng mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn S. aureus
Hầu hết các dòng S. aureus kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau. Một
vài dòng kháng với tất cả các loại kháng sinh ngoại trừ vancomycin, và những
dòng này ngày càng tăng. Những dòng MRSA (Methicilin resistant Staphylococcus
aureus) rất phổ biến và hầu hết các dòng này cũng kháng với nhiều kháng sinh
khác. Trong phòng thí nghiệm, người ta đã tìm thấy plasmid kháng vancomycin ở

8


Enterococcus faecalis có thể chuyển sang S. aureus, và người ta nghĩ rằng việc
chuyển này có thể xảy ra ngoài tự nhiên, trong đường tiêu hóa chẳng hạn. Ngoài
ra, S. aureus còn kháng với chất khử trùng và chất tẩy uế (Kenneth Todar , 2005).
Khảo sát tính chất chống đối kháng sinh tại Thành phố Hồ Chí Minh năm 2005
cho thấy các chủng S.aureus phân lập từ bệnh phẩm cho thấy có đến 94,1% chủng
kháng Penicillin, 52,9% kháng Ciprofloxacin, 52% kháng Amoxillin và 12,5%
kháng Getamicin (Nguyễn Thị Kê và cs, 2006).
2.2.3 Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)
2.2.3.1 Đặc điểm hình thái
P. aeruginosa là trực khuẩn hiếu khí Gram âm, hình dạng thẳng hoặc hơi

cong nhưng không xoắn, hai đầu tròn, kích thước 0,5 – 1 µm × 1,5 – 5 µm.
P. aeruginosa có một lông duy nhất ở một cực, các pili của chúng dài khoảng 6
nm, là nơi tiếp nhận nhiều loại phage và giúp vi khuẩn gắn vào bề mặt
của tế bào vật chủ. P. aeruginosa là loài không sinh bào tử (Nguyễn Hoàng
Thu Trang, 2007).
2.2.3.2 Đặc tính nuôi cấy
Vi khuẩn mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, điều
kiện hiếu khí tuyệt đối. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 37ºC, phát triển được ở nhiệt
độ 5ºC – 42ºC, pH thích hợp là 7,2 – 7,5 (có thể chịu được pH 4,5 – 9). Trên môi
trường dặc, thường có 2 loại khuẩn lạc: một loại to, dẹt, nhẵn, trung tâm mô hơi
lồi; một loại nhỏ, xù xì, mô lồi (Nguyễn Hoàng Thu Trang, 2007).
2.2.3.3 Khả năng gây bệnh của P. aeruginosa
P. aeruginosa là loại vi khuẩn gây bệnh có điều kiện khi cơ thể bị suy giảm
miễn dịch, bị bệnh ác tính, hoặc mãn tính, khi dùng corticoid lâu dài, việc sử dụng
kháng sinh tùy tiện, việc sử dụng các dụng cụ thăm khám hoặc các vết bỏng, vết
thương hở,... Chúng có thể gây ra nhiều bệnh khác nhau như: gây viêm màng trong
tim, viêm đường hô hấp, viêm phổi, nhiễm trùng đường máu, đường tiết niệu,
viêm màng não mủ và áp xe não, viêm tủy xương, viêm tai, gây bệnh hóa sừng ở
mắt, gây nhiễm trùng da, mô mềm,...(Trần Linh Phước, 2006).
9


P. aeruginosa xâm nhiễm vào trong mắt thường gây ra những tổn thương
giác mạc, sự nhiễm này thường liên quan đến việc sử dụng kính sát tròng (Deanna,
2003). Ở Việt Nam, theo kết quả nghiên cứu tại Viện Mắt trong vòng khoảng 20
năm trở lại đây, P. aeruginosa đã vượt lên với trên 70% các trường hợp xét
nghiệm vi khuẩn dương tính trong viêm loét giác mạc sau chấn thương nông
nghiệp (là chấn thương do hạt thóc bắn vào mắt hoặc do lá lúa quệt vào mắt) (Trần
Linh Phước, 2006).
Các bệnh nhân nằm viện bị mắc các chứng bệnh về tim mạch, đái tháo

đường hay bị các u ác tính bị sốc do nhiễm trùng máu do nhiễm khuẩn thường có tỉ
lệ tử vong khá cao. Tác nhân thường gặp là P. aeruginosa chiếm từ 5% đến 50%
so với các tác nhân vi khuẩn khác. P. aeruginosa dẫn đầu trong các tác nhân nhiễm
trùng hô hấp bệnh viện, đặc biệt đối với những bệnh nhân có hỗ trợ các máy thông
khí, khả năng bị viêm phổi cao gấp 20 lần và tỉ lệ tử vong cao. Một số nghiên cứu
còn cho thấy P. aeruginosa giữ vai trò gây bệnh trong giai đoạn đầu và cuối của
bệnh đái tháo đường (Deanna, 2003).
2.2.3.4 Khả năng mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn P. aeruginosa
P. aeruginosa còn là vi khuẩn kháng thuốc phổ biến đối với nhiều loại
kháng sinh. Tính kháng thuốc thường được quy định bởi các plasmid và các yếu tố
di truyền này có thể được lan truyền trong quần thể thông qua hiện tượng biến nạp
và tải nạp tạo ra những dạng đột biến kháng thuốc mới. P. aeruginosa hiện kháng
với rất nhiều loại kháng sinh nên việc làm kháng sinh đồ trước khi điều trị là việc
cần thiết (Trần Linh Phước, 2006).
2.3 Hoạt tính kháng oxy hóa
Hiện nay, ngày càng có nhiều mối quan tâm về các chất kháng oxy hóa thứ
cấp từ thực vật như là nguồn bổ sung cho các hệ thống bảo vệ chống lại sự oxy hóa
có hại tồn tại sẵn có trong cơ thể. Trong đời sống các sinh vật kỵ khí và hiếu khí
đều thiết lập một sự cân bằng tinh tế giữa ích lợi và nguy cơ trong việc sử dụng
oxy để đạt năng lượng. Trong quá trình hô hấp các sinh vật kỵ khí và hiếu khí đã
tạo ra các hợp chất trung gian là các gốc tự do: anion superoxide (O2), hydroxyl
(OH), chất oxy hóa như H2O2 có hoạt tính phản ứng rất lớn, mà từ các chất này
10


cũng như các sản phẩm phản ứng của chúng là nguyên nhân phá hủy các phân tử
sinh học như DNA, lipid, protein,...(Bùi Trọng Đạt, 2003).
Mặc dù bản thân của sinh vật đã tự phát triển các hệ thống enzyme nhằm
điều hòa các loại phân tử oxy hoạt tính cao này như superoxide dismutase,
catalase, glutathinone peroxidase là các enzyme điều hòa nhằm duy trì sự an toàn

trong giới hạn cho phép của anion superoxide, H2O2 và các hydroperoxide hữu cơ
tương ứng. Superoxide dismutase, catalase, glutathinone peroxidase được xem là
các enzyme khử độc chính trong cơ thể. Đôi khi hệ thống enzyme bị quá tải, không
khí bị ô nhiễm, khói thuốc lá, bức xạ tử ngoại...các loại oxy hoạt tính cao này vượt
quá giới hạn cho phép sẽ là nguồn gây bệnh, thúc đẩy nhanh quá trình lão hóa cho
sinh vật. Các chất kháng oxy hóa từ thực vật đã góp phần hỗ trợ cho hệ thống bảo
vệ của cơ thể, ngăn chặn oxy hóa không mong muốn như các carotenoid,
flavonoid, vitamin C, E...và các hợp chất trao đổi chất thứ cấp từ thực vật đã và
đang được quan tâm nghiên cứu (Bùi Trọng Đạt, 2003).

11


CHƯƠNG 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1

Vật liệu
Thân và lá cây Hà Thủ Ô trắng (Streptocaulon juventas Merr.) được thu ở

Hưng Khánh Trung B, Chợ Lấp, Bến Tre.
Các dòng vi khuẩn được sử dụng trong thử nghiệm: Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. Những dòng vi khuẩn được
chọn là các dòng được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về tính kháng khuẩn.
Ba dòng vi khuẩn này có khả năng gây bệnh nghiêm trọng về đường tiêu hóa trên
người và các loài động vật. Ba dòng vi khuẩn do Trung tâm kiểm nghiệm thuốc,
mỹ phẩm, thực phẩm Cần Thơ cung cấp.
3.2

Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

3.2.1 Thiết bị, dụng cụ
 Dùng cho thí nghiệm vi sinh
Tủ ủ (BE 200, Memmert, Đức)
Nồi hấp khử trùng autoclave (HVE – 50, Hirayama, Nhật)
Tủ cấy (Class II BSC, Esco, Indonesia)
 Dùng cho thí nghiệm sinh hóa
Cân phân tích (AB104 – S, Mettler Toledo, Thụy Sỹ)
Máy ly tâm (Mikro 12 – 24, Hettich, Đức)
Máy vortex (ZX3, Velp, Ý)
Máy đo quang phổ
3.2.2 Hóa chất
 Dùng cho thí nghiệm vi sinh
Môi trường LB
Thuốc kháng sinh chuẩn ampicillin (10 µg/ml) và amoxicillin (25 µg/ml).
12


 Dùng cho thí nghiệm sinh hóa
Methanol (Trung Quốc, Merck)
Vitamin C
DPPH (1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)
3.3

Phương pháp tiến hành

3.3.1 Điều chế cao chiết methanol cây Hà Thủ Ô
Sau khi thu hái và phơi khô cây HTO, cây được cắt nhỏ và nghiền thành
bột. Hỗn hợp bột thô cây HTO được ngâm trong dung môi methanol trong 48 giờ.
Sau đó hỗn hợp được đem cô quay loại bỏ dung môi dưới áp suất thấp. Quy trình

điều chế cao chiết methanol cây HTO được trình bày qua sơ đồ Hình 2.
Thu hái Hà Thủ Ô (phơi khô)

Cắt nhỏ mẫu từ 2 – 4 cm

Phơi mẫu dưới ánh nắng đến trọng lượng
không đổi

Đóng gói, ngâm trong methanol 48 giờ

Cô quay áp suất thấp
Cao tổng methanol thân và lá

Hình 2: Quy trình xử lý nguyên liệu và điều chế cao methanol thân và lá cây Hà Thủ Ô

13


Hiệu suất chiết cao được tính theo công thức sau:

H (%) 
Trong đó:

mcao
 100
mt

mcao là trọng lượng cao
mt là trọng lượng mẫu sau khi thu hái đã được phơi khô đến trọng

lượng không đổi.
3.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết cây Hà Thủ Ô
Chuẩn bị cao chiết: cao chiết được pha với dung môi methanol thành các
nồng độ 8 µg/ml, 16 µg/ml, 32 µg/ml, 64 µg/ml và 128 µg/ml.
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn: dịch nuôi vi khuẩn đã pha loãng trong
nước muối sinh lý tương đương độ đục ≥ 0,5 Mc Farland mật số vi khuẩn là 108
được trãi đều trên môi trường LB đặc. Đĩa thạch được để khô 15 phút trước khi đặt
khoanh giấy có tẩm cao chiết.
Cao chiết HTO (100 µl) được cho trực tiếp lên khoanh giấy (đường
kính 6 mm) vô trùng ở các nồng độ khác nhau. Các kháng sinh ampicillin và
amoxicillin được sử dụng như đối chứng dương và được pha thành các nồng độ
tương tự như cao chiết. Ngoài ra, do sử dụng methanol để pha cao chiết nên ảnh
hưởng của methanol lên sự phát triển của vi khuẩn cũng được khảo sát. Mỗi đĩa
thạch được đặt từ 1, 2 hay 3 khoanh giấy tẩm cao chiết, sau đó để khô. Mỗi nồng
độ được lặp lại 3 lần. Các đĩa thạch được ủ ở 32ºC trong 24 - 48 giờ. Đường kính
vùng ức chế (bao gồm đường kính khoanh giấy) được đo bằng thước đo đơn vị
mm. Nồng độ ức chế tối thiểu là nồng độ cao chiết thấp nhất mà tại đó xuất hiện
vòng vô khuẩn, đo ngang các khuẩn lạc li ti nếu có.
3.3.3 Phương pháp khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao chiết cây Hà Thủ Ô
Khả năng kháng oxy hóa của cao chiết methanol cây Hà Thủ Ô trắng được
thực hiện theo phương pháp DPPH (2,2 – Diphenyl – 1 –picrylhydrazyl) như sau:
cao methanol Hà Thủ Ô được pha thành các nồng độ 100, 200, 300, 400, 500
µg/ml trong methanol. Lượng cao chiết được pha vào phản ứng là 100 µl và DPPH
6.10-4 M là 100 µl (mỗi nồng độ lặp lại 3 lần). Hỗn hợp phản ứng được ủ trong 60
14


phút và trong tối, sau đó được đo độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 517nm. Khả
năng kháng oxy hóa được tính dựa vào giá trị IC50. Giá trị IC50 được tính dựa trên
phương trình tuyến tính của cao chiết.

3.3.4 Phương pháp thống kê, phân tích số liệu
Kết quả được xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab 16.0 và Microsoft
Excel 2003.

15


CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1

Kết quả chiết cao methanol cây Hà Thủ Ô
Theo quy trình chiết cao, 500 gr bột thô cây HTO được ngâm trong dung

môi methanol sau đó cô quay thu được 20,04 gr cao chiết dạng sệt. Đặc điểm của
cao chiết sau khi cô quay có dạng đặc sệt, màu xanh đậm chuyển sang đen. Hiệu
suất cao chiết cao methanol thân và lá cây HTO là 3,55% trên trọng lượng khô.
4.2

Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết cây Hà Thủ Ô
Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết cao methanol cây HTO được thể hiện

qua đường kính vòng kháng khuẩn trên đĩa petri được trình bày trong Bảng 1. Thí
nghiệm đối chứng được tiến hành trên cùng 3 dòng vi khuẩn với 2 loại kháng sinh
ampicillin (10 µg/ml) và amoxicillin (25 µg/ml) đươc thể hiện qua Bảng 2 và 3.
Kết quả cho thấy đường kính vòng kháng khuẩn tỉ lệ thuận với nồng độ cao chiết
(Bảng 1).
Bảng 1. Khả năng kháng khuẩn của cao methanol cây Hà Thủ Ô
Đường kính vòng vô khuẩn (mm)

Nồng độ cao
(µg/ml)

E. coli

S. aureus

P. aeruginosa

0

-

-

-

8

10,3dA ± 0,6

11,7cA ± 1,5

-

16

25,3cA ± 0,6

22,7bB ± 0,6

-

32

26,7bcA ± 0,6

23,3abB ± 0,6

-

64

27,7abA ± 0,6

24,0abB ± 1,0

-

128

29,0aA ± 1,0

25,3aB ± 0,6

-

Chú thích: kết quả ± với độ lệch chuẩn của từng giá trị. Các giá trị có mẫu tự viết thường theo sau trong
cùng một cột, và các giá trị có các mẫu tự viết hoa theo sau trong cùng một hàng khác biệt có ý nghĩa
thống kê ở mức 5%. (-) là không kháng khuẩn.

Cao methanol Hà Thủ Ô (thân và lá) cho hoạt tính kháng khuẩn cao nhất
đối với E. coli sau đó đến S. aureus. Ở nồng độ 16 µg/ml, cao HTO có hoạt tính ức

16