Xây dựng phương pháp đánh giá kháng nguyên ngoại và nội độc tố trong vắcxin ho gà - đề xuất tiêu chuẩn sản xuất vắcxin ho gà an toàn cao tại Viện Vắcxin Nha Trang

Bộ giáo dục v đo tạo bộ y tế
viện vệ sinh dịch tễ trung ơng
___________________________




nguyễn thị lan phơng



xây dựng phơng pháp đánh giá kháng
nguyên ngoại v nội độc tố trong vắcxin
ho g - đề xuất tiêu chuẩn sản xuất vắcxin ho
g an ton cao tại viện vắcxin nha trang





Chuyên ngành: Vi khuẩn học
Mã số: 62.72.6801






Tóm tắt luận án tiến sĩ y học

H nội -2008




1
Công trình đợc hoàn thành tại:
Viện vệ sinh dịch tễ trung ơng
Viện vắcxin nha trang


Ngời hớng dẫn khoa học:
pgs.ts.lê văn hiệp
pgs.ts. đặng đức anh



Phản biện 1: PGS.TS. Đinh Hữu Dung


Phản biện 2: PGS.TS. Lê Văn Phủng

Phản biện 3: PGS.TS. Đào Xuân Vinh








Luận án đã đợc bảo vệ trớc hội đồng chấm luận án cấp nhà nớc họp tại:
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng vào hồi 9h ngày 24 tháng 6 năm 2006





Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Th viện Quốc gia
- Th viện Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng




2
MỞ ĐẦU
Bệnh ho gà do vi khuẩn B.pertussis gây nên. Trước đây bệnh xảy ra rất
thơng thường, đặc biệt là ở trẻ em, gây nên những hậu quả nghiêm trọng.
Sau hơn 40 năm sử dụng vắcxin ho gà dưới dạng vắcxin phối hợp bạch
hầu, ho gà và uốn ván (vắcxin DPT) trong chương trình tiêm chủng mở
rộng (CTTCMR), đến nay bệnh cơ bản đã được kiểm sốt.

Hàng năm Viện Vắcxin Nha Trang s
ản xuất và cung cấp cho CTTCMR từ
8 đến 10 triệu liều vắcxin DPT, đủ để miễn dịch 3 mũi cơ bản cho trẻ mới
sinh trong năm .
Thành phần ho gà trong vắcxin DPT do Viện sản xuất là dạng tồn tế bào
bất hoạt, có ưu điểm giá thành rẻ, hiệu lực bảo vệ kéo dài và bền vững.
Mặc dù được sản xuất tn thủ theo những qui định nghiêm ngặt của Tổ
chứ
c Y tế Thế giới (TCYTTG) và của cơ quan Kiểm định Quốc gia nhưng
những vấn đề liên quan đến bản chất của vắcxin tồn tế bào vẫn cho thấy
vắcxin có tỷ lệ phản ứng phụ nhất định trên người sử dụng. Có ít nhất 5
loại độc tố là HLT, PT, LPS, ATC, và TCT tham gia vào độc tính đặc hiệu
của ho gà. Tuy nhiên hiện nay độc tính của vắcxin chỉ được kiểm tra
bằng thử nghiệm tăng trọng chuột mang tính chất an tồn chung hơn là xác
định độc tính đặc hiệu của từng kháng ngun độc tố riêng biệt. TCYTTG
khuyến cáo các nhà sản xuấ nên hình thành các thử nghiệm phù hợp để
giám sát chất lượng của vắcxin đặc biệt ngoại độc tố ho gà PT và nội độc
tố, 2 thành phần khơng bị huỷ bởi nhiệt nhưng chiếm tỷ lệ khá cao trong
vắcxin.
Việc hình thành hệ thống gồm 4 thử nghiệm giám sát nồng độ và hoạt tính
củ
a ngoại và nội độc tố trong vắcxin ho gà thực sự cần thiết để bảo đảm
tính an tồn và hiệu lực của vắcxin. Đồng thời việc xác định các giới hạn
phù hợp của các kháng ngun này trong vắcxin là vấn đề quan trọng
trong qui trình sản xuất vắcxin ho gà an tồn cao. Xuất phát từ những quan
điểm trên chúng tơi thực hiện đề tài “Xây dựng các phương pháp đánh
giá kháng ngun ngoại và nội độc tố trong vắcxin ho gà - đề
xuất tiêu
chuẩn sản xuất vắcxin ho gà an tồn cao tại Viện Vắcxin Nha trang”
với các mục tiêu sau:

3
1. Xõy dng 4 phng phỏp ỏnh giỏ khỏng nguyờn ngoi c t ho g v
ni c t trong vcxin ho g ton t bo bt hot.
2. Xác định và đánh giá tơng quan giữa các thành phần kháng nguyên,
ảnh hởng của một số yếu tố liên quan đến tính an toàn và công hiệu của
vắcxin ho gà sản xuất tại Viện Vắcxin Nha Trang là căn cứ đề xuất tiêu
chuẩn sản xuất vắcxin ho gà an toàn cao.
Nhng úng gúp mi v giỏ tr thc tin ca lun ỏn
L cụng trỡnh u tiờn ti Vit Nam xõy dng v thm nh hon chnh cỏc
phng phỏp xỏc nh hm lng v hot tớnh khỏng nguyờn c t ho g
v ni c t trong vcxin ho g ton t bo b
t hot. õy l nhng
phng phỏp cho kt qu nhanh nờn cú giỏ tr ng dng cao kim nh
trong qui trỡnh sn xut vcxin ho g ton t bo hin nay. ng thi cỏc
phng phỏp ny cũn l nhng cụng c hu ớch ỏnh giỏ cht lng khi
phỏt trin cỏc vcxin ho g tinh ch ti Vit nam.
Lun ỏn ó xỏc nh c hm lng v hot tớnh ca cỏc khỏng nguyờn
gõy c chớnh trong vcxin ho g v ỏnh giỏ s tng quan gia cỏc
khỏng nguyờn ú v
i c tớnh c hiu ca vcxin. õy l mt trong
nhng vn quan trng gii quyt tớnh an ton mc cao nht cú th
t c ca vcxin ho g ton t bo ang sn xut ti Vit nam.
Xỏc nh c cỏc nh hng ca phng phỏp bt hot, thi gian lu tr
nh hng ca cht hp ph i vi tớnh an ton v cụng hiu ca v
cxin
ho g m trc õy cha cú tỏc gi no ỏnh giỏ mt cỏch cú h thng.
xut c tiờu chun sn xut vcxin ho g an ton cao vi nhng ch
tiờu c th, cú th ng dng ngay qui trỡnh xut ny trong thc t sn

xut vcxin ho g hin nay ti Vin Vcxin.
Cu trỳc ca lun ỏn
Lun ỏn gm 120 trang, 4 chng. Cu trỳc tng phn nh sau: t vn
: 2 trang. Ch
ng 1: Tng quan 28 trang, 6 hỡnh minh ha. Chng 2:
Vt liu Phng phỏp: 19 trang, 2 hỡnh minh ha. Chng 3: Kt qu 43
trang, 30 bng, 15 hỡnh. Chng 4: Bn lun 25 trang, 2 hỡnh. Kt lun: 2
trang. ngh: 1 trang. Ph lc 2 trang. 110 ti liu trong ú 18 ti liu
ting Vit v 92 ti liu ting Anh, 4 cụng trỡnh cú liờn quan n lun ỏn.


4
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh ho gà
1.1.1 Tác nhân gây bệnh
Tác nhân gây bệnh ho gà là vi khuẩn Bordetella pertussis.
1.1.2 Dịch tễ học và sinh bệnh học
Hàng năm trên thế giới có khoảng 20-40 triêu người mắc, số người chết
khoảng 200.000 – 300.000. Tỷ lệ mắc ho gà giảm rõ rệt nhờ CTTCMR.
Tại Việt Nam, trước những năm 70 số mắc từ 70000 -100000. Sau TCMR
tỷ lệ mắc và chết vì ho gà giảm rõ rệt và t
ừ năm 1995 đến nay bệnh đã
được khống chế .
Sinh bệnh học: lây truyền trực tiếp do tiếp xúc với ngưoời mang mầm
bệnh. Cơ chế sinh bệnh do ngoại độc tố và nội độc tố của vi khuẩn.
1.1.3 Các kháng nguyên chính
Các yếu tố bám dính bao gồm: FHA (filamentous haemagglutinin), FIM
(Fimbriae: ngưng kết nguyên 1, 2, 3), Pectartin.
Các độc tố bao gồm: PT (pertussis toxin), ATC (Adenylate cyclase toxin),
TCT (Tracheal cytotoxin), DNT (Dermonecrotic toxin)

1.1.4 Đáp ứng miễn dịch
Đáp
ứng miễn dịch dịch thể và đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào là
cơ chế bảo vệ quan trọng. Miễn dịch qua trung gian tế bào có vai trò trong
đáp ứng miễn dịch tự nhiên và duy trì sự bảo vệ lâu dài sau mắc bệnh.
Đáp ứng miễn dịch của vắcxin ho gà toàn tế bào giống với quá trình nhiễm
trùng tự nhiên. Đáp ứng miễn dịch của vắcxin ho gà vô bào trên người bao
gồm cả 2 hướng ch
ọn lọc Th1 và Th2.
1.2 Sản xuất và kiểm định vắcxin ho gà
1.2.1 Vắcxin ho gà toàn tế bào bất hoạt
Liên quan đến sản xuất vắcxin ho gà toàn tế bào bất hoạt bao gồm các yêu
cầu về chủng giống, môi trường, nuôi cấy lên men, tách lọc thu sinh khối,
bất hoạt và pha chế vắcxin.


5
Kiểm định vắcxin ho gà toàn tế bào bất hoạt theo tiêu chuẩn của
TCYTTG.
1.2.2 Vắcxin ho gà vô bào
Vắcxin ho gà vô bào là vắcxin tinh chế thường chứa các kháng nguyên PT,
FHA và PRN. Tuy nhiên thành phần kháng nguyên, hàm lượng kháng
nguyên chưa có sự thống nhất của các nhà sản xuất.
Tiêu chuẩn của vắcxin ho gà vô bào giống với vắcxin ho gà toàn tế bào
nhưng trong phương pháp kiểm định cần xác định hàm lượng của các
kháng nguyên và hiệu quả đáp ứng miễn dịch trên súc vật thí nghi
ệm vaø
xác định công hiệu của vắcxin. Kiểm tra an toàn đặc hiệu bằng thử nghiệm
tăng trọng chuột.
1.3 Xây dựng và đánh giá phương pháp phân tích

1.3.1. Các thử nghiệm invitro và invivo xác định hàm lượng và hoạt
tính độc tố ho gà
Hiện nay phương pháp tăng trọng chuột (MWG) là phương pháp đánh giá
tính an toàn dùng để xuất xưởng của vắcxin ho gà. Một số thử nghiệm đã
được phát triển dự
a vào đặc tính kháng nguyên của vắcxin theo nhu cầu
của nhà sản xuất:
- Định lượng kháng nguyên độc tố ho gà bằng phản ứng ELISA
- Các thử nghiệm trên tế bào CHO
- Xác định yếu tố nhạy cảm histamin (HSF)
- Thử nghiệm xác định yếu tố kích hoạt lymphô bào (LPF)
- Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) …
1.3.2. Đánh giá qui trình phân tích và thẩm định phương pháp
Đánh giá qui trình phân tích là một yêu cầu trước khi áp dụng phương
pháp. Trong đ
ó một số các thuộc tính của qui trình phân tích ( phương
pháp phân tích) cần được đánh giá trong quá trình thẩm định bao gồm: độ
đúng (accuracy), độ chính xác (precision), độ nhạy (sensitivity), độ đặc
hiệu (selectivity)….Thực hiện một nghiên cứu tương quan giữa 2 phương
pháp đôi khi cũng cần thiết trong thẩm định.


6
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1.Sinh phẩm
- Nước cốt ho gà BP 509, BP134, PM (Viện Vắcxin )
- Vắcxin ho gà mẫu chuẩn Quốc gia RP5 (Viện KĐQG - Việt Nam), mẫu
chuẩn xác định yếu tố kích hoạt lympho bào PU585 (Viện RIVM –Hà
Lan)

- Độc tố ho gà mẫu chuẩn Quốc tế JNIH-5 (Viện NIBSC - Anh) - Kháng
thể đơn dòng kháng độc tố ho gà (Biken -Nhật bản) - Cộng hợp kháng
thỏ g
ắn biotin ( Sigma)
- Fetuin (Sigma)
- Lysat ( Bio Whitake) - Endotoxin chuẩn (Cambrex)
2.1.2.Tế bào – Môi trường – Dung dịch
- Tế bào CHO –K1 (Viện Biken - Nhật)
- Môi trường EMEM + 10% HTBTB (Sigma)
- Các dung dịch đệm, dung dịch thuốc nhuộm…
2.1.3 Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt 11-14g; 15-17g
2.1.4 Hoá chất: Tetramethylbenzidine, Tween 20, axit sulfuaric…
2.1.5 Dụng cụ thiết bị: Multichannels, máy đọc ELISA, máy siêu âm
đồng hoá, máy ly tâm lạnh, tủ ấm, cân…
2.2 Phương pháp
2.2.3 Xây dựng các phương pháp xác định kháng nguyên độ
c tố ho gà
PT và nội độc tố trong vắcxin ho gà toàn tế bào bất hoạt
 Các bước cơ bản để hình thành và ứng dụng phương pháp mới: xác định
các điều kiện tối ưu của phương pháp, xây dựng qui trình thực hiện và
thẩm định phương pháp (độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác, độ đúng).
 4 phương pháp xác định kháng nguyên ngoại độc tố ho gà và nội
độc tố là:


7
- Xây dựng và chuẩn hoá phương pháp ELISA định lượng nồng độ
kháng nguyên độc tố ho gà PT trong vắcxin ho gà toàn tế bào.
- Xây dựng, chuẩn hoá và thẩm định phương pháp chuẩn độ độc tố ho
gà hoạt động trên tế bào CHO-K1.

- Xây dựng phương pháp xác định yếu tố kích hoạt tăng lymphô bào
(LPF) trên chuột nhắt trắng
- Xây dựng và chuẩn hoá phương pháp LAL xác định nội độc tố

(endotoxin) trong vắcxin ho gà toàn tế bào
2.2.4 Phương pháp kiểm định công hiệu và an toàn đặc hiệu vắcxin ho
gà toàn tế bào bất hoạt
- Phương pháp thử thách xác định công hiệu của vắcxin ho gà: Theo
thường qui của TCYTTG.
- Phương pháp tăng trọng chuột (MWG) xác định an toàn đặc hiệu của
vắcxin ho gà: Theo thường qui của TCYTTG.
2.2.5 Xây dựng tiêu chuẩn pha vắcxin ho gà
- Tương quan giữa chỉ số tă
ng trọng chuột và chỉ số tăng bạch cầu.
- Tương quan giữa các kết quả xác định hàm lượng, hoạt tính của PT với
số lượng bạch cầu chuột.
- Tương quan giữa số lượng vi khuẩn và nồng độ endotoxin với tăng
trọng chuột.
- Công hiệu của thành phần ho gà trước và sau hấp phụ AlPO
4
.
- Ảnh hưởng của phương pháp bất hoạt và thời gian lưu trữ.
 Đề xuất tiêu chuẩn pha vắcxin ho gà:
- Đậm độ vi khuẩn (OIU/ml)
- Nồng độ nội độc tố (EU/ml)
- Hàm lượng kháng nguyên PT tính bằng μg/ml (pp ELISA)
- Hoạt tính kháng nguyên PT tính bằng μg/ml (ppCHO-K1)
- Chỉ số tăng bạch cầu (LPU)
- Chỉ số tăng trọng chuột (%).

8
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
3.1. Xây dựng các phương pháp xác định độc tố ho gà PT và nội độc tố
trong vắcxin ho gà toàn tế bào
3.1.1. Xây dựng và chuẩn hoá phản ứng ELISA định lượng nồng độ PT
3.1.1.1 Tối ưu các điều kiện của phản ứng ELISA
- Nồng độ fetuin tối ưu: 25μg/ml
- Nồng độ kháng thể thỏ kháng PT: 1/500
- Cộng hợp phù hợp cho hệ
ELISA -fetuin: Cộng hợp kháng thỏ gắn
Biotin và SBC 1/5000
3.1.1.2. Xây dựng đường chuẩn
Khoảng tuyến tính có OD từ 0,1-1,4 tương đương nồng độ PT trong mẫu
thử từ 0,03μg/ml đến 0,25 μg/ml (hình 3-3).









Hình 3 -3. Đồ thị đường chuẩn của phản ứng
3.1.1.2. Kết quả xác định độ nhạy của phản ứng:
LOD của phản ứng có OD là 0,090255 và LOQ có OD tương đương
0,1416. D
ựa theo đường chuẩn độ nhạy của phản ứng là 0,025 μg/ml.
3.1.1.3. Kết quả xác định tính đặc hiệu:

Mật độ quang của mẫu thử không có PT tương đương với mật độ quang
nền (mẫu trắng). Nếu mẫu thử có PT có mật độ quang cao gấp trên 20 lần
mật độ quang nền.
-1.2
-1
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0
0.2
0.4
-3.5 -3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0
Lg [
kháng nguyên PT (mcg)]
Lg(OD 450)


9

3.1.1.4. Độ chính xác và độ đúng của phương pháp ELISA
 Độ chính xác: Hệ số biến thiên trung bình:
- Trong cùng phản ứng : CV= 12,74%
- Giữa các lần thực hiện phản ứng: CV= 7,67%
 Độ đúng: Tỷ lệ phục hồi: trung bình 98,11%
3.1.1.5 Xử lý mẫu và ảnh hưởng của mẫu khơng tinh khiết đến tính ổn
định của phương pháp
- Xử lý mẫu bằng đồng hố, sau đó ly tâm 10000 rpm. Hàm lượng PT
trong mẫu được đồng hóa ln cao h
ơn mẫu khơng được đồng hố.

- Trong điều kiện bình thường với các mẫu thử không tinh khiết (PM 46
Ỉ 48) và canh khuẩn ho gà (BP134: 1306, BP 134: 3306 và BP509: 1406)
Phương pháp có tính ổn định đạt u cầu độ chính xác và độ đúng
(CV=3,17 % , tỷ lệ phục hồi của tất cả các mẫu đạt > 90% trung bình đạt
94,55%.)
3.1.2 Kết quả xây dựng và chuẩn hố phương pháp chuẩn độ độc tố ho
gà PT hoạt động trên tế bào CHO –K1.
3.1.2.1. Tối ưu hố các đ
iều kiện cho phản ứng CHO –K1
- Mơi trường ni tế bào: Mơi trường EMEM có 10% huyết thanh bào
thai bê hay có 5% huyết thanh bào thai bê và 10% Glutamin thuận lợi cho
tế bào CHO-K1 phát triển.
- Số lượng tế bào trong phản ứng chuẩn độ: 10
6
tế bào/ml
- Thời gian gây nhiễm: thời gian gây nhiễm 72h cho thấy tế bào có hình
thái đặc hiệu nhất. Cho tế bào cùng lúc chuẩn độ hay cho trước khi chuẩn
độ 24h đều có kết quả như nhau
3.1.2.2.Tính đặc hiệu của độc tố ho gà tác động trên tế bào CHO–K1
Tính đặc hiệu thể hiện bằng sự biến đổi đặc hiệu hình thái của tế bào khi
được tiếp xúc với độc tố ho gà hoạt động hoặc vi khuẩ
n ho gà độc. Hiệu
quả này khơng xảy ra khi tế bào tiếp xúc với các vi khuẩn khác hay các


10
khỏng nguyờn khỏc ca ho g hoc khi c t PT hot ng b trung ho
bi khỏng huyt thanh ho g ton phn ( bng 3-11 v 3-12).
Bng 3-11 Tỏc ng ca mt s chng vi khun trờn t bo CHO-K1
Mu th Bin i hỡnh thỏi t bo

15 x10
9
VK/ml 5x10
9
VK/ml 1x10
9
VK/ml
H. influenza - - -
Liờn cu - - -
E.coli - - -
BP 18323 + + +
BP 134 + + +
BP 509 + + +
(+): tế bào bị tác động đặc hiệu (-) tế bào bình thờng
Bng 3-12 nh hng c hiu ca c t ho g trờn t bo CHO K1

Mu th Bin i hỡnh thỏi t bo
Anti pertussis
serum 89/530
AGG-2 serum
89/598
B.pertussis
88/522
H. influenza - - +
E.coli K12 - - +
Liờn cu - - +
BP 18323 - + +
BP 134 - + +
BP 509 - + +
JNIH- 5 - + +

(+): tế bào bị tác động đặc hiệu (-) tế bào bình thờng


11

3.1.2.3 Xác định nồng độ tối thiểu của độc tố ho gà tác động trên tế
bào CHO –K1
Phương pháp có thể phát hiện được độc tố ho gà hoạt động ở nồng độ
62,5pg. Đây cũng chính là độ nhạy của phản ứng.
3.1.2.4. Độ lặp lại và độ đúng của phương pháp
 Độ chính xác: Hệ số biến thiên trung bình:
- Trong cùng phản ứng : CV= 2,8 %
- Giữa các lần thực hiện phản
ứng: CV= 15,03%
 Độ đúng: Tỷ lệ phục hồi: trung bình 114,,9%
 Phương pháp đạt tính ổn định với các mẫu thử ho gà (PM) khác nhau
(CV%= 7,8 , tỷ lệ phục hồi = 94,23%).
3.1.3. Kết quả xây dựng và chuẩn hố phương pháp xác định yếu tố
kích hoạt tăng lympho bào (LPF) trên chuột nhắt trắng
3.1.3.1.Chuẩn hố qui trình thử nghiệm
 Tiêu chuẩn của chuột thí nghiệm
Số lượng bạch cầu máu ngọai vi trung bình củ
a chuột nhắt trưởng thành,
giống đực, 15-17g/con, 4-5 tuần tuổi, cùng lứa, khoẻ mạnh là 4651,94 ±
1330,66 BC/mm
3
(hình 3-10).
 Chọn đường tiêm và thời gian lấy máu
Số lượng bạch cầu tăng cao nhất vào ngày thứ 5 và 6 tuỳ theo đường tiêm.
Duy trì ổn định 4-5 ngày sau đó và giảm từ từ đến ngày thứ 21 thì bình

thường. Đường tiêm tĩnh mạch cho thấy bach cầu tăng cao nhất nhưng
kém ổn định hơn 2 đường tiêm dưới da và phúc mạc (hình 3-11)



12

Hỡnh 3-11. Thi gian gõy tng bch cu - nh hng ca ng tiờm
3.1.3.2.Tớnh n nh ca qui trỡnh th nghim
Qui trỡnh cú tớnh n nh cao khi lp li th nghim 11 ln vi mu th l
vcxin PU 585 (CV=10,13%) v nc mui sinh lý (CV=13,91%)
3.1.3.3.Tiờu chun ca mu chun
Mu chun c chn l RP5. pha loóng tng thớch l 1/17
(5,1 OIU/ml)
Bng 3-21 So sỏnh 2 mu chun PU 585 v RP5

Mẫu
chuẩn
PU 585 RP5
Đậm độ 1/10 (5 OIU/ml) 1/17 (5,1 OIU/ml)
SL bạch
cầu /mm
3

46 158,51 4
677,95
47061,44
4899,34
CV% 10,13 10,41

3.1.4 Chun hoỏ phng phỏp LAL xỏc nh nng ni c t trong
vcxin ho g ton t bo bt hot
3.1.4.1.Xỏc nh nhy thc t cca phn ng
nhy thc t ca phn ng l 0,09333 EU/ml 0,0246 . Trong 6 ln
thc hin nhy ca phn ng u trong gii hn qui nh (50%-200%).


13
3.1.4.2. Tính ổn định của phản ứng khi xác định nội độc tố trong một
số mẫu vắcxin ho gà
Bảng 3-23 Nồng độ nội độc tố trong 1 số mẫu vắcxin ho gà PM
MÉu
thö(30
OIU/ml)
Nång ®é nội độc tố (EU/ml)
TB SD CV%
LÇn 1 LÇn 2 LÇn 3
PM 44 1200 1000 1200 1133,3 115,4 10,1
PM 45 3700 3500 4280 3826,7 405,1 10,5
PM 46 9800 10000 9500 9766,6 251,7 2,5
PM 0106 5000 7250 6500 6250 1145,6 18,3
PM 0206 9500 9800 9474 9591,3 181,1 1,9
PM 0306 5000 6000 4500 5166,7 763,4 14,7
PM 0406 5000 6000 4800 5266,7 642,9 12,2
PM 0506 16364 17000 15800 16388 600,4 3,7
PM 0606 18000 15000 12500 15166,7 2753,7 18,1
PM 0706 18000 12500 18000 16166,7 3174,4 19,6
PM 0806 10000 12500 12500 11666,7 1443,3 12,37
Trung b×nh 9126,3 1043,5 11,4
Nồng độ nội độc tố trong vắcxin ho gà thay đổi tuỳ theo lô. Hệ số biến

thiên giữa các lần thực hiện phản ứng trung bình 11,4%.
3.2. Xây dựng tiêu chuẩn pha vắcxin ho gà
3.2.1. Tương quan giữa chỉ số tăng trọng chuột và chỉ số tăng BC
Khảo sát chỉ số tăng bạch cầu của 3 nhóm vắcxin ho gà chưa hấp phụ dựa
vào kết quả tăng trọ
ng chuột cho thấy có sự liên quan giữa 2 chỉ số trên. Ở
nhóm vắcxin có kết quả tăng trọng chuột đạt trên 80% (trung bình 87,44%
± 4,26%) có chỉ số tăng bạch cầu trung bình 3,39 ± 0,56. Ở nhóm vắcxin
có kết quả tăng trong từ 70 -79% (trung bình 75,71% ± 2,52%) có chỉ số


14
tăng bạch cầu 4,93 ±1,29 và ở nhóm vắcxin có kết quả tăng trọng chuột từ
60-69% (trung bình 66,52 ± 2,28%) có chỉ số tăng bạch cầu 7,01 ±1,53.
3.2.2. Tương quan giữa các kết quả định lượng PT với kết quả tăng
bạch cầu trên chuột
Bảng 3-25 Nồng độ và hoạt tính PT trong vắcxin ho gà

MÉu thö
(30
OIU/ml)
PT
(ELISA)
(µg/ml)
PT (CHO)
(µg/ml)
Sè l−în
g
BC
(BC/mm

3
)
PM 31 ND (*) 0,399 33000
PM 35 ND (*) 0,299 26320
PM 37 ND (*) 0,199 17160
PM 38 ND (*) 0,199 20650
PM 39 ND (*) 0,399 30080
PM 45 0,46 0,097 9560
PM 46 0,735 0,125 8240
PM 47 0,724 0,130 10650
PM 48 0,733 0,13 9840
PM 0406 0,752 0,184 17600
PM 0506 0,78 0,136 12540
PM 0606 1,48 0,162 15480
PM 0806 1,26 0,196 22600
RP5 1,36 0, 750 56800
ND (*): Kh«ng thùc hiÖn
Nồng độ độc tố ho gà hoạt động trong vắcxin ho gà không vượt quá 0,4
μg/ml. (bảng 3-25)
3.2.3.Tương quan giữa đậm độ vi khuẩn ( độ đục) và nồng độ nội độc
tố với tăng trọng chuột
Số lượng vi khuẩn và nồng độ nội độc tố có ảnh hưởng đến sự tăng trọng
của chuột đặc biệt sau 18h và 24 giờ. Trọng lượng củ
a chuột chỉ hồi phục
sau ngày thứ 3 (hình 3-12, 3-13, 3-14).


15
-3
-2

-1
0
1
2
3
4
5
6
7
18 24 48 72 96 120 144 168
Th
ờ
i gian (h)
Tăng trọng trung bình (
g
30 (OUI/ml) 15 (OIU/ml) 7.5 (OIU/ml) NMSL
E.coli k12


Hình 3-12 Tương quan giữa tăng trọng chuột và đậm độ vi khuẩn khi sử
dụng mẫu thử là hỗn dịch vi khuẩn E.coki K12 bất hoạt

-3
-2
-1
0
1
2
3
4

5
6
7
18 24 48 72 96 120 144 168
Th
ờ
i gian (h)
Tăng trọng trung bình (g)
30 (OUI/ml) 15 (OIU/ml) 7.5 (OIU/ml) NMSL
RP5


Hình 3-13 Tương quan giữa tăng trọng chuột và đậm độ vi khuẩn khi sử
dụng mẫu thử là vắcxin ho gà mẫu chuẩn RP5

-1
0
1
2
3
4
5
6
7
18 24 48 72 96 120 144 168
Th
ờ
i gian (h)
Tăng trọng trung bình (g)
30 (OIU/ml) 15 (OIU/ml) 7.5 (OIU/ml) NMSL

PU 585


Hình 3-14 Tương quan giữa tăng trọng chuột và đậm độ vi khuẩn khi sử
dụng mẫu thử là vắcxin ho gà mẫu chuẩn PU 585


16
3.2.4 Công hiệu của thành phần ho gà trước và sau hấp phụ AlPO
4
(vắcxin DPT)
Khảo sát công hiệu của ho gà trước và sau khi hấp phụ AlPO
4
của 2 nhóm
vắcxin có đậm độ 30 OIU/ml và 28 OIU/ml cho thấy công hiệu trung bình
trước hấp phụ lần lượt là 7,755 ± 0,256 và 7,28 ± 0,063 tương ứng với sau
khi hấp phụ lần lượt là 10,11 ± 1,777 và 8,67 ± 0,383 (bảng 3-25 và 3-26).
3.2.5. Ảnh hưởng của phương pháp bất hoạt và thời gian lưu trữ
Nghiên cứu tính ổn định về công hiệu và an toàn của vắcxin ho gà bất hoạt
nhiệt và bất hoạt formalin cho thấy vắcxin ho gà bất hoạt nhiệt ổn đị
nh về
an toàn và công hiệu trong khoảng từ 6-9 tháng sau sản xuất và bền vững
về công hiệu hơn so với vắcxin bất hoạt bằng formalin.


17
0
20
40
60

80
100

120
140
036912
Th?i gian ( tháng )
T
?
l
?
t
?

ng MWG
(%)

PM b
?
t ho
?
t nhi
?
t PM b
?
t ho
?
t formalin 0,1%

0
20
40
60
80
100
120
036912
Thời gian (tháng)
Tỉ lệ giảm công hiệu (
%
PM b
ấ
t ho
ạ
t nhi
ệ
t PM b
ấ
t ho
ạ
t formalin 0,1%

Hình 3-15 Tính ổn định công hiệu của vắcxin ho gà


Hình 3-16 Tính ổn định an toàn MWG của vắcxin ho gà


0

20
40
60
80
100
120
036912
Thời gian (tháng)
T
ỉ
l
ệ
gi
ả
m LP (%)
PM b
ấ
t ho
ạ
t nhi
ệ
t PM b
ấ
t ho
ạ
t formalin 0,1%


Hình 3-17 Tính ổn định LPF của vắcxin ho gà

18
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN
4.1 Xây dựng và chuẩn hóa các phương pháp xác định độc tố PT và
nội độc tố trong vắcxin ho gà toàn tế bào
4.1.1.Phương pháp ELISA định lượng kháng nguyên độc tố ho gà
Đường chuẩn và độ nhạy: khoảng tuyến tính ở nồng độ 0,03 đến
0,25µg/ml. Nồng độ PT trong mẫu thử dựa trên so sánh OD của mẫu thử
với OD của mẫu chuẩn để khoảng tuyến tính luôn luôn nằm trong giới hạn
giữ
a giá trị OD tối đa và OD tối thiểu tương thích giữa mẫu chuẩn và mẫu
thử đảm bảo cho thử nghiệm luôn nằm trong miền giá trị .
Độ nhạy là 0,025μg/ml (2,5ng/giếng). Theo Sato.H và cs, độ nhạy phát
hiện PT trong phản ứng ELISA haptoglobin là 1ng/giếng. Kết quả của
chúng tôi phù hợp với Nguyễn Thị Minh Hiền và cs khi xây dựng các hệ
ELISA định lượng kháng nguyên và kháng thể dại tại phòng kiểm định
Viện Vắcxin .
Độ
đặc hiệu: Bảng 3.2 cho thấy những mẫu thử có PT, mật độ quang luôn
luôn cao gấp trên 20 lần những mẫu thử không có PT hay mẫu trắng.
Độ chính xác, độ đúng và tỷ lệ hồi phục: Độ chính xác cần đạt xung
quanh giá trị trung bình và không nên vượt quá 15% của hệ số biến thiên
(CV% = SD/Xmean x100%) ngoại trừ tại điểm LOQ khi đó hệ số biến
thiên không nên vượt quá 20%. Tương tự như thế độ
đúng cần đạt xung
quanh giá trị trung bình trong khoảng ± 15% so với giá trị lý thuyết, ngoại
trừ tại điểm LOQ khi đó độ lệch không nên vượt quá 20%.
Mẫu kiểm định (QC samples) chỉ những mẫu thử đại diện cho một sản
phẩm trong qui trình sản xuất và thường là không tinh khiết. Với những
“mẫu kiểm định” có thể có những yếu tố tương tác làm phản ứng trở nên

âm tính gi
ả hay dương tính giả. Độ đúng và độ chính xác được kiểm chứng
với những mẫu thử là nước cốt ho gà khác nhau (mẫu kiểm định) vẫn đạt
được ở mức độ cho phép nhỏ hơn 15% như kết quả đã chỉ ra ở bảng
3.7 và 3-8.



19

4.1.2 Phương pháp chuẩn độ PT trên tế bào CHO-K1
Chuẩn hoá qui trình thực hiện: Các bước của qui trình thực hiện của
chúng tôi cũng tương tự với qui trình của 2 viện RIVM và Biken song các
điều kiện của phản ứng được chuẩn hoá để phù hợp với mẫu thử là vắcxin
ho gà toàn tế bào và theo điều kiện phòng thí nghiệm hiện có bao gồm: Số
lượng tế bào trong 1 giếng 100µl (10
6
tế bào/ml).Thời gian đọc kết quả
72h, sau khi nhuộm. Có thể cho tế bào đồng thời với mẫu thử hay nuôi tế
bào trên phiến trước 24h.
Độ đặc hiệu và độ nhạy: Những biến đổi hình thái đặc hiệu của tế bào
CHO-K1 khi tiếp xúc với độc tố ho gà đã được chỉ ra trên các hình 3.3 đến
3.6. Về cơ chế thực sự của sự biến đổi hình thái này hiện nay cũng chư
a
được giải thích rõ ràng. Độc tố PT hoạt động bằng cách ly giải ADP-
ribosylation của phân tử GTP của một protein điều hòa gắn trên màng tế
bào. Cơ chế hoạt động này tương tự như độc tố bạch hầu và 1 số ngoại độc
tố khác có cấu trúc dạng A –B nhưng sự biến đổi hình thái tế bào CHO-K1
chỉ xảy ra đặc hiệu đối với độc tố ho gà PT.
Kết quả

xác định độ nhạy của phương pháp đạt ở nồng độ 0,0625ng tức
khoảng 62,5pg, phù hợp với kết quả của Hewlett E.L. và CS tìm được giới
hạn phát hiện PT trên tế bào CHO-K1 là 120pg Halperin và cs tìm thấy độ
nhạy của phản ứng xác định vi khuẩn ho gà trong mẫu nuôi cấy bệnh phẩm
từ đường hô hấp trên là 725pg. Tuy nhiên phương pháp này khác so với
phương pháp của chúng tôi
Độ chính xác, độ đúng và tỷ lệ hồi phục:
Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ
lệ phục hồi của phương pháp trung bình đạt 114,9% lệch chỉ 14,9% so với
giá trị thực. Đồng thời độ lặp lại trong cùng phản ứng và giữa các phản
ứng khác nhau có hệ số biến thiên trung bình tương ứng là 2,18% và
15,03%. Với một phương pháp sinh học kết quả phụ thuộc vào rất nhiều
yếu tố và có độ biến thiên cao thì các giá trị thu được như trên là ch
ấp
nhận được.


20
4.1.3.Phương pháp xác định yếu tố kích hoạt tăng lympho bào (LPF)
Tiêu chuẩn của chuột thí nghiệm: Số lượng bạch cầu bình thường của mỗi
giống chuột đều có sự khác nhau. Trong mỗi giống chuột số lượng bạch
cầu cũng có thể khác nhau giữa chuột đực và cái, giữa các nhóm tuổi khác
nhau, giữa các chế độ dinh dưỡng, điều kiện chăm sóc và tình trạng bệnh
tật khác nhau. Vì thế
để tiêu chuẩn hoá, cần thiết phải chọn một nhóm
chuột tương đối đồng nhất về các chỉ tiêu trên trước khi đưa vào thí
nghiệm. Chúng tôi đã chọn giống chuột Swiss địa phương, giống đực,
trưởng thành, 15-17g tức vào khoảng 4 tuần tuổi để khảo sát số lượng bạch
cầu. Kết quả xác định được nhóm chuột này có số lượng bạch cầu máu
ngoại vi bình thường là 4651,94 ± 1330,66 BC/mm

3
.

Chuẩn hoá qui trình thực hiện: Do có những khác biệt đáng kể đáng kể
giữa các qui trình thực hiện giữa các nơi khác nhau nên nghiên cứu đã
khảo sát và chọn những thông số cơ bản, tối ưu để xây dựng qui trình thử
nghiệm bao gồm: đường tiêm, thời gian lấy máu, liều tiêm, mẫu chuẩn và
cách tính kết quả.
Mẫu chuẩn: Mẫu chuẩn được so sánh với mẫu chuẩn Hà lan PU585 đảm
b
ảo tính ổn định.
4.1.4. Phương pháp LAL chuẩn độ nội độc tố
Theo hướng dẫn của nhà sản xuất bộ kít và hướng dẫn của Dược điển châu
Âu, cần phải xác định lại độ nhạy thực tế của phản ứng LAL khi thực hiện
phản ứng. Nếu độ nhạy thực tế nằm trong khoảng 50-200% so với độ nhạy
nhà sản xuất
đưa ra thì kết quả của phản ứng là hợp lệ. Khi xác định lại độ
nhạy của phản ứng LAL, kết quả thu được đều trong giới hạn cho phép.
Vì phản ứng LAL là một phản ứng enzym, nên có thể bị ức chế bởi một số
yếu tố có thể có trong mẫu thử. Cách tốt nhất để phát hiện có yếu tố ức chế
trong mẫu thử hay không là thự
c hiện một loạt các độ pha của mẫu thử có
thêm nội độc tố chuẩn có nồng độ tương đương gấp 2 lần độ nhạy của
lysate (mẫu spike). Nếu kết quả của những mẫu này dương tính chứng tỏ
phản ứng không bị ức chế. Trong thiết kế phương pháp luôn luôn mỗi một
mẫu thử đều thực hiện đồng thời các mẫu “spike” (là m
ẫu thử có thêm
25µl nội độc tố chuẩn có nồng độ 0,125 EU/ml). Nếu các mẫu “spike”

21
luôn luôn dương tính chứng tỏ phản ứng không bị ức chế Kết quả cũng
cho thấy độ lặp lại của phản ứng trong giới hạn khuyến cáo < 15%

4.2.Xây dựng tiêu chuẩn pha vắcxin ho gà an toàn cao
Các kết quả trung bình về chỉ số tăng trọng chuột và chỉ số tăng bạch cầu
của các nhóm cho thấy có sự tương quan cao. Như vậy để chuột tăng trọng
> 75% thì ch
ỉ số bạch cầu không nên quá 5,5.
Nồng độ PT xác định bằng phản ứng ELISA (0,8655 ± 0,332 µg/ml) cao
hơn hoạt tính PT chuẩn độ trên tế bào CHO–K1 (0,204 ± 0,1 µg/ml,
H.Sato tìm được là 0,3 µg/ml và 0,1 µg/ml). Theo Munoz và CS hàm
lượng PT đủ để bảo vệ 50% chuột sau thử thách phải đạt 1,4 -1,7 µg/chuột
nhưng hoạt tính gây độc của PT giới hạn ở mức 0,1 µg/chuột. Khi PT đã
được giải độc tăng liều lên từ 0,016 đến 20, 30µg/chuột v
ẫn không còn khả
năng gây nhạy cảm Histamin (gây độc) cho chuột. Acklan.N cũng khuyến
cáo để vắcxin ho gà giảm độc nồng độ PT hoạt động nên < 0,2 µg/liều
vắcxin. Vì thế nồng độ kháng nguyên PT xác định bằng phản ứng ELISA
đề xuất ở 0,6-1,2 µg/ml (0,3-0,6 µg/liều) trong đó nồng độ PT hoạt động
chuẩn độ trên tế bào CHO –K1 là 0,1-0,3 µg/ml (0,05-0,15µg/liều).
Có sự tương quan cao giữa chỉ số tăng bạch cầu và hoạ
t tính xác định trên
tế bào CHO –K1 vì cả 2 đều đánh giá hoạt tính của PT nhưng xác định
bằng các phương pháp và thể hiện bằng các đơn vị khác nhau.
Nhiều tác giả chứng minh nội độc tố ảnh hưởng đến trọng lượng chuột
trong thử nghiệm MWG. Các thí nghiệm của chúng tôi cũng cho thấy kết
quả tương tự. Kiểm tra một số mẫu thử vắcxin ho gà (30 OIU/ml) cho thấy
nồng độ n
ội độc tố có độ biến thiên cao từ 6000 -16000 EU/ml nhưng

không vượt quá 20000 EU/ml. Vì thế giới hạn tối đa có thể đề xuất cho
nồng độ nội độc tố trong vắcxin ho gà là không vượt quá 25000 EU/ml.
Nghiên cứu ảnh hưởng của chất hấp phụ cho thấy để vắcxin ho gà sau hấp
phụ đạt công hiệu tối thiểu 8 IU/ml theo yêu cầu của TCYTTG thì công
hiệu tối thiểu đối với vắcxin ho gà của Vi
ện trước khi hấp phụ cần đạt 6,96
IU/ml và đậm độ tối thiểu là 27 OIU/ml. Đậm độ này không lệch ra ngoài
qui định của TCYTTG cho phép đậm độ vi khuẩn tối thiểu trong 1 liều


22
vắcxin không được vượt quá 20 OIU. Để hài hoà với các chỉ tiêu khác liên
quan trong nghiên cứu, đậm độ vi khuẩn hiện tại nên đề xuất ở khoảng 27
– 30 OIU/ml (13,5 -15 OIU/liều).
Tại thời 6-9 tháng các chỉ số sinh học bao gồm công hiệu, an toàn và chỉ
số tăng bạch cầu của vắcxin ho gà bất hoạt nhiệt ở mức độ ổn định cao và
phù hợp với các mức giới hạn về an toàn, công hiệu và LPF đề xuấ
t ở trên.
Theo Ackland N. nếu kết quả MWG không đạt nên để vắcxin ở 4
o
C trong
một khoảng thời gian nữa để giảm độc tính xuống mức có thể chấp nhận
được. Trong thời gian này PT tiếp tục bị bất hoạt ở 4
o
C đồng thời chất bảo
quản merthiolate có trong vắcxin cũng tham gia thúc đẩy quá trình bất hoạt
này. TCYTTG cũng khuyến cáo hạn dùng của vắcxin ho gà không vượt
quá 1 năm, vì thế thời gian sử dụng của vắcxin ho gà bất hoạt nhiệt sản
xuất tại Viện Vắcxin trong giới hạn 6-9 tháng là hợp lý. Đối với vắcxin ho
gà bất hoạt thêm với formalin 0,1% có thể các chỉ số về tính an toàn đạt tốt

hơn nh
ưng chỉ sau 3 tháng vắcxin giảm công hiệu một cách mạnh mẽ (hình
3-15, 3-16, 3-17). Formalin được ứng dụng để giải độc độc tố ho gà PT
tinh chế trong vắcxin ho gà vô bào. Đối với vắcxin ho gà toàn tế bào một
số tác giả khuyên không nên sử dụng formalin làm chất bất hoạt vì nó có
thể làm biến đổi màu của vắcxin và làm sụt giảm công hiệu nhanh. Các kết
quả của chúng tôi cũng phù hợp với nhận xét này.
 Đề xuất tiêu chu
ẩn sản xuất vắcxin ho gà
Từ những nghiên cứu tương quan ở trên qui trình pha vắcxin ho gà được đề
xuất theo các chỉ tiêu sau:
- Đậm độ vi khuẩn: 27-30 OIU/ml
- Nồng độ nội độc tố: < 25000 EU/ml
- Hàm lượng kháng nguyên PT: 0,6- 1,2 µg/ ml (phản ứng ELISA).
- Hoạt tính kháng nguyên PT: 0,1-0,3 µg/ ml (chuẩn độ tế bào CHO–K1)
- Chỉ số tăng bạch cầu LPU: ≤ 5,5
- Tăng trọng chuột MWG:
≥ 75%, chuột chết không quá 5%



23
Kết luận
1. Đã xây dựng hoàn chỉnh 4 phơng pháp xác định kháng nguyên
ngoại độc tố ho gà và nội độc tố trong vắcxin ho gà toàn tế bào
bất hoạt.
Phơng pháp ELISA-fetuin:
Các điều kiện tối u của phản ứng: fetuin: 25 g/ml, kháng thể thỏ
kháng PT: 1/500, cộng hợp kháng thỏ gắn biotin và SBC nồng độ
1/5000.

Đờng chuẩn ở nồng độ PT từ 0,03 g/ml đến 0,25 g/ml (OD từ 0,4
-1,4). Độ nhạy: 0,025 g/ml. Đặc hiệu với PT tinh chế và PT ở mẫu
không tinh khiết.
Hệ số biến thiên trong cùng phản ứng : 12,7%, giữa các phản ứng:
7,34%. Tỷ lệ phục hồi: 98,8%.
Phơng pháp thể hiện tính ổn định cao trong điều kiện bình thờng.
Phơng pháp chuẩn độ PT trên tế bào CHO-K1:
Các điều kiện tối u của phản ứng: Môi trờng nuôi tế bào EMEM +
10% HTBTB hay EMEM + 5% HTBTB + 10% glutamin. Số lợng tế
bào 10
5
TB/giếng. Thời gian đọc kết quả: 72h.
Độ nhạy: 62,5pg PT/giếng. Đặc hiệu cao với PT tinh khiết và PT
trong mẫu ho gà.
Hệ số biến thiên trong cùng phản ứng: 2,8%, giữa các lần thực hiện
phản ứng: 15,03%. Tỷ lệ phục hồi: 114,9%.
Phơng pháp thể hiện tính ổn định cao với mẫu thử ho gà không tinh
khiết.
Phơng pháp xác định hoạt tính gây kích hoạt tăng lymphô bào
Chuẩn hoá chuột thí nghiệm: chuột nhắt trắng giống Swiss, cùng lứa,
giống đực, trọng lợng 15-17g, 3-4 tuần tuổi.
Chuẩn hoá mẫu chuẩn: Mẫu chuẩn địa phơng RP5
Chuẩn hoá qui trình: 5 chuột cho 1 mẫu thử, đờng tiêm dới da,
chứng dơng: mẫu chuẩn RP5, chứng âm: nớc muối sinh lý. Liều
tiêm 1 liều tiêm cho ngời, 1ml/chuột. Thời gian đếm bạch cầu: 6


24
ngày. Tính kết quả: số lợng bạch cầu trung bình /mm
3

hay chỉ số
tăng bạch cầu: LPU = Số lợng BC mẫu thử - Số lợng BC chứng âm
/10000.
Hệ số biến thiên giữa các lần thực hiện: 10,14%.
Phơng pháp LAL chuẩn độ nội độc tố:
Độ nhạy thực tế của phản ứng đạt yêu cầu qui định
Hệ số biến thiên giữa các lần thực hiện phản ứng với các mẫu thử
khác nhau : 11,4%
Nồng độ nội độc tố trong vắcxin ho gà sản xuất tại Viện Vắcxin biến
thiên cao nhng không vợt quá 20000 EU/ml.
2. Đã đề xuất tiêu chuẩn sản xuất vắcxin ho gà an toàn cao. Trong
1ml vắcxin có:
Đậm độ vi khuẩn: 27-30 OIU
Nồng độ nội độc tố : < 25000 EU
Hàm lợng kháng nguyên PT: 0,6-1,2 g
Nồng độ kháng nguyên PT hoạt động: 0,1 - 0,3 g
Chỉ số tăng bạch cầu 5,5
Tỷ lệ tăng trọng chuột: 70%, chuột chết 5%.