Nghiên cứu: Chuyển hoá nh3 trong bể ươm tôm giống thành no3- nhờ nitrosomonas và nitrobacter cố định trên giá thể bc nhằm nâng cao năng suất thu hoạch

i
MỤC LỤC
CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Giới thiệu về Nitrosomonas sp. 3
2.1.1 Phân lập, duy trì và nuôi cấy 3
2.1.2 Đặc điểm về giống 4
2.1.3 Nitrosomonas europaea 7
2.1.4 Nitrosomonas eutropha 8
2.1.5 Nitrosomonas marina 9
2.1.6 Nitrosomonas mobilis 10
2.2 Giới thiệu về Nitrobacter sp. 11
2.2.1 Nitrobacter winogradsky 11
2.2.2 Nitrobacter alkalicus 12
2.2.3 Nitrobacter hamburgensis 14
2.2.4 Nitrobacter vulgaris 15
2.3 Quá trình nitrate hoá 15
2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nitrate hoá 25
2.3.3 Khả năng bám dính 27
2.4 Thu sinh khối Nitrosomonas europaea theo mẻ (batch) và liên tục 28
2.4.1 Bố trí thí nghiệm 29
2.4.2 Kết quả thí nghiệm 30
2.5 Giới thiệu về Acetobacter xylinum và màng bacterial cellulose 34
2.5.1 Sơ lược vi khuẩn Acetobacter xylinum 35
2.5.2 Các đặc điểm cấu trúc của BC 36
2.5.3 Vai trò của bacterial cellulose đối với Acetobacter xylinum 37
2.5.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tạo BC 38
2.5.5 Các ứng dụng của bacterial cellulose 39
2.6 Nghiên cứu về hệ vi khuẩn nitrate hoá và ứng dụng 40
CHƢƠNG 3. NGHIÊN CỨU TÌNH HUỐNG 43
3.1 Qui trình thực hiện 43

3.2 Tạo chất mang BC 43
3.3 Lên men thu sinh khối hệ vi khuẩn nitrate hoá 46
3.4 Phương pháp xác định ammonia, nitrite và nitrate 47
3.4.1 Xác định hàm lượng ammonia NH
3
theo TCVN 2662-78 và 4563-88 48
3.4.2 Xác định hàm lượng nitrite NO
2
-
theo TCVN 2658-78 và 4561-88 50
3.4.3 Xác định hàm lượng nitrite NO
3
-
theo TCVN 4562-88 52
3.5 Kết quả bước đầu 53
3.5.1 Cố định vi khuẩn lên BC 53
3.5.2 Thử nghiệm chế phẩm 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

ii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Các môi trường khác nhau dùng nuôi cấy vi khuẩn nitrite hoá. Môi trường 1, 2 và 3 đề xuất tương
ứng bởi Soriano và Walker (1968), Watson (1971) và Krinmel và Harms (1982) đối với vi khuẩn phân lập
từ đất, môi trường 4 đề xuất bởi Watson (1965) đối với vi khuẩn phân lập từ biển và môi trường 5 đề xuất
bởi Koops và cộng sự (1976) đối với vi khuẩn phân lập từ nước lợ. Tất cả các môi trường đều cần 5 g/l
CaCO
3
hoặc 4 g/l HEPES như chất đệm pH [7] 4
Bảng 2. Các đặc điểm phân loại giống vi khuẩn nitrite hoá [7] 5
Bảng 3. Năng lượng thu được từ quá trình oxi hoá các hợp chất vô cơ so với từ glucose (-686 kcal/mol)

[11] 16























iii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Hình thái tế bào Nitrosomonas dưới kính hiển vi quang học [7] 5
Hình 2. Hình thái tế bào Nitrosomonas dưới kính hiển vi điện tử cho thấy có sự khác nhau về hình dạng
và kích thước tế bào giữa các loài trong cùng giống Nitrosomonas. IM là màng bao tế bào chất

(intracytoplasmic membrane), C là carboxysome [7] 5
Hình 3. Cấu trúc tế bào thuộc giống Nitrosospira [7] 6
Hình 4. Cấu trúc tế bào thuộc giống Nitrosovibrio [7] 6
Hình 5. Cấu trúc tế bào thuộc giống Nitrosolobus [7] 7
Hình 6. Cấu trúc tế bào thuộc giống Nitrosococcus [7] 7
Hình 7. Quan sát tế bào Nitrosomonas europaea dưới kính hiển vi quang học. Bar = 5 μm [4] 8
Hình 8. Quan sát tế bào Nitrosomonas europaea dưới kính hiển vi điện tử. Bar = 1 μm [4] 8
Hình 9. Quan sát tế bào Nitrosomonas eutropha dưới kính hiển vi điện tử. Bar = 1 μm [4] 9
Hình 10. Quan sát tế bào Nitrosomonas marina dưới kính hiển vi điện tử quét. Bar = 1 μm [4] 9
Hình 11. Quan sát tế bào Nitrosomonas marina dưới kính hiển vi điện tử. Bar = 1 μm [4] 10
Hình 12. Cấu trúc tế bào Nitrosomonas mobilis dưới kính hiển vi điện tử quét. Bar = 1μm [4] 10
Hình 13. Cấu trúc tế bào Nitrosomonas mobilis dưới kính hiển vi điện tử. Bar = 1 μm [4] 11
Hình 14. Vi khuẩn Nitrobacter winogradsky được nhuộm Gram âm, có dạng quen ngắn. Bar = 1 μm [4]
12
Hình 15. Khuẩn lạc Nitrobacter alkalicus sau 2 tháng nuôi cấy ở pH 10. Bar = 0,1 cm [15] 12
Hình 16. Tiên mao (F) ở Nitrobacter alkalicus dưới kính hiển vi. Bar = 1 μm [15] 13
Hình 17. Cấu trúc tế bào Nitrobacter alkalicus dưới kính hiển vi điện tử. Lớp vỏ bao bên ngoài (S) được
cấu tạo gồm nhiều tiểu đơn vị protein ghép với nhau. Bar = 1 μm [15] 13
Hình 18. Cấu trúc lớp vỏ bên ngoài tế bào vi khuẩn Nitrobacter alkalicus. Bar = 0,5 μm [15] 13
Hình 19. Các bào quan ở Nitrobacter alkalicus (M) màng intracytoplasmic, (P) polyphosphate và (H) hạt
polyhydroxybutyrate. Bar = 1 μm [15] 14
Hình 20. Vi khuẩn Nitrobacter hamburgensis được nhuộm Gram âm, có dạng quả lê. Bar = 250nm. [4] 14
Hình 21. Cấu trúc tế bào Nitrobacter vulgaris gồm lớp màng introcytoplasmic và carboxysome. Bar =
250 nm. [4] 15
Hình 22. Hướng di chuyển electron dựa trên thế khử của các chất trong tế bào. Những chất khử luôn là
chất cho điện tử, và các chất oxi hoá luôn là chất nhận điện tử. [11] 17
Hình 23. Hai giai đoạn của quá trình nitrate hoá 18
Hình 24. Cấu trúc carboxysome và các enzyme cấu tạo lớp vỏ [18]. 20
Hình 25. Con đường vận chuyển điện tử ở Nitrosomonas [2-3, 8-9, 11] 23
Hình 26. Con đường vận chuyển điện tử ở Nitrobacter [3, 8-9, 11, 16] 24

Hình 27. Sự tạo thành nitrite trong quá trình sinh trưởng của N. europaea trên môi trường được cấy 4%
dịch giống và hàm lượng ammonia ban đầu là 7,8 mM [12] 28
Hình 28. Thiết bị fermenter dùng nuôi cấy theo mẻ và liên tục để xác định các yếu tố sinh trưởng tối ưu
cho Nitrosomonas [14] 30
Hình 29. Tác động của sắt đến sự phát triển của Nitrosomonas trong nuôi cấy theo mẻ. (A): đường cong
sinh trưởng ở mẫu đối chứng, không có sắt. (B): đường cong sinh trưởng ở mẫu thí nghiệm có hàm lượng
sắt là 0,5ppm [14] 32
Hình 30. Sự sinh trưởng của Nitrosomonas trong chế độ nuôi cấy liên tục. Đường cong phía trên là mật
độ tế bào theo thời gian, đường cong phía dưới là hàm lượng (NH
4
)
2
SO
4
[14] 33
Hình 31. Cấu trúc BC ở một số loài vi khuẩn 34
iv
Hình 32. BC được tạo từ môi trường tĩnh (a) và môi trường lắc (b) 37
Hình 33. (a) hệ vi sợi ở BC và (b) ở thực vật, độ phóng đại x5000 [5] 40
Hình 34. Hình chụp dươi kính hiển vi điện tử những mẫu gỗ A. altissima đã được loại lignin. A và B: kích
thước mẫu 300-500µm. C và D: kích thước mẫu 500-710µm [10] 41
Hình 35. Chế phẩm sau khi cố định, kích thước 300-1500µm. Thời gian cố định lần lượt là A: 6h, B: 12h,
C: 24h và D: 72h [10] 42
Hình 36. Thiết bị cố định dạng khuấy đảo, dung tích 50L. Sau 4 ngày cố định, khả năng nitrate hoá của
chế phẩm đạt cao nhất [10] 42
Hình 37. Đồ thị thể hiện hoạt lực nitrate hoá của chế phẩm theo thời gian. Tiến hành thí nghiệm lặp lại 3
lần [10] 42
Hình 38. Quan sát tế bào Acetobacter xylinum dưới kính hiển vi để kiểm tra các đặc điểm vi thể 44
Hình 39. Khuẩn lạc Acetobacter xylinum 44
Hình 40. Sau khi đảm bảo chắc chắn giống đang có là Acetobacter xylium thì từ ống giống gốc (A) ta cấy

chuyền qua ống thạch nghiêng (B), nếu thao tác không đúng sẽ dẫn đến tạp nhiễm (C) 45
Hình 41. Cùng với việc cấy chuyền, ta sẽ tiến hành nhân giống cấp 1 trong ống nghiệm. (1+2) lớp màng
BC tạo ra sau 5 ngày nhân giống, (3) các tế bào kết thành dải màu nâu nhạt 45
Hình 42. Tiến hành nhân giống cáp 2, sau khi cấy giống vào erlen chứa môi trường ở bình (A), để yên
erlen ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 5 ngày sẽ thấy xuất hiện lớp màng mỏng phía trên (B), nếu để đến
1 tuần thì lớp màng sẽ càng dày (C) 45
Hình 43. Tiến hành lên men thu BC bằng cách cấy vào khay nhựa chứa môi trường lên men (A), sau 7
ngày ta sẽ thu được sản phẩm (B). 46
Hình 44. Trong quá trình lên men, nếu nguyên liệu nước dừa già đã bị nhiễm bào tử nấm mốc thì khả
năng mốc mọc lên khi lên men là rất cao. Ngoài ra, nguyên nhân tạp nhiễm còn do rửa dụng cụ không
sạch và khay bị hở nắp nên bào tử nấm lọt vào 46
Hình 45. (A) Dịch giống Nitrobacter sp., (B) Dịch giống Nitrosomonas sp. 47
Hình 46. Hình thái tế bào Nitrobacter (bên trái) và Nitrosomonas (bên phải) dưới kính hiển vi. 47
Hình 47. Đường chuẩn NH
3
49
Hình 48. Đường chuẩn NO
2
-
51
Hình 49. Đường chuẩn NO
3
-
53
Hình 50. BC sau khi xử lý và hấp tiệt trùng, ở pH trung tính được sử dụng làm chất mang 54
Hình 51. Chế phẩm BC thu được sau 24, 48, 72 giờ cố định 54
Hình 52. Chế phẩm BC ở các chế độ bẫy-hấp phụ khác nhau được đem thử nghiệm trên nước biển 54
CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU

1

CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU
Trước tình hình biến đổi khí hậu diễn ra ngày một gay gắt như hiện nay, việc hướng
đến những quy trình chăn nuôi, trồng trọt theo hướng sinh thái, thân thiện với môi trường là
một đòi hỏi nóng bỏng của xã hội, đặc biệt là ở Việt Nam, khi mà nông nghiệp vừa là truyền
thống lâu đời vừa là đòn bẩy kinh tế đưa cả nước thoát nghèo và thoát khủng hoảng như lịch
sử đã minh chứng. Thời điểm tháng 4/2010, các tỉnh khu vực ven biển và đồng bằng sông
Cửu Long đang gánh chịu sự hạn hán, nhiễm mặn nghiêm trọng gây nguy hại đến an ninh
lương thực của cả nước và trên thế giới. Bài toán cho một nền nông nghiệp bền vững hiện
đang đặt ra cho các nhà khoa học, nhà quản lý ở Việt Nam phải giải quyết nhanh, mạnh và kịp
thời, nếu không những hệ luỵ tiếp theo từ sự suy giảm nông nghiệp sẽ rất khó lường.
“Con tôm ôm cây lúa” hiện là mô hình nông nghiệp sinh thái được đánh giá cao về
hiệu quả kinh tế lẫn tác động tích cực lên môi trường, khi luân canh giữa vụ tôm và vụ lúa thì
các chất dinh dưỡng trong vụ tôm sẽ được lúa hấp thụ và do đó giảm bớt nhiều chi phí hoá
chất bón phân. Ngoài ra, nuôi tôm thịt trong điều kiện quảng canh như vậy sẽ hạn chế dịch
bệnh, đảm bảo tôm phát triển bình thường và tận dụng tốt nguồn nước đang bị xâm mặn như
hiện nay.
Bên cạnh mô hình nông nghiệp sinh thái nuôi trồng quảng canh, thì mô hình nuôi tôm
công nghiệp với mật độ cao ở nước ta vẫn là nguồn cung cấp chính cho xuất khẩu. Thái Lan
là nước có lượng tôm xuất khẩu lớn nhất thế giới, sản lượng lên đến 250.000 tấn/năm, theo
sau đó là các nước trong khu vực Đông Nam Á với hệ thống nuôi tôm công nghiệp quy mô
lớn, dẫn đến 80% lượng tôm trên thế giới được sản xuất từ khu vực này. Để đáp ứng nhu cầu
về con giống, các trang trại nhân giống tôm đã áp dụng hình thức nuôi với mật độ rất dày đặc
cả tôm giống lẫn lượng thức ăn, vì nuôi trong những bể cô lập (trung bình thể tích 4 m
3
) nên
thức ăn thừa tồn đọng trong bể là rất lớn, khi đó lượng thức ăn này bị phân huỷ ra các hợp
chất thứ cấp và cuối cùng về ammonia do các nhóm vi khuẩn amon hoá thực hiện, chính
lượng ammonia này sẽ gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng tôm giống về sau [13].

Để tôm phát triển tốt, cần kiểm soát lượng ammonia (NH
3
) phải nhỏ hơn 0,1 ppm
(1,33-1,53 mg/L ở pH 8,0 và nhiệt độ 28-30
0
C), nếu lượng ammonia tăng cao sẽ làm tôm bắt
mồi kém, sinh trưởng chậm và dễ nhiễm bệnh. Thông thường người ta sẽ thường xuyên luân
chuyển đến 40% lượng nước trong bể để giảm nồng độ các chất thải độc hại, việc làm này đã
gây tình trạng phú dưỡng cho các nguồn nước lân cận, dẫn đến tăng nguy cơ xuất hiện tảo độc
và vi sinh vật gây bệnh. Do vậy, việc quản lý nguồn nước trong các trang trại nuôi tôm (tôm
giống và tôm thương phẩm) là một yêu cầu tiên quyết trong việc nâng cao sản lượng và hạn
chế thiệt hại đến môi trường xung quanh [10, 13].
Hiện có nhiều giải pháp kĩ thuật để kiểm soát nồng độ ammonia (TAN – total
ammonia nitrogen) trong nước, phương pháp phổ biến là cho nước nuôi tôm chạy qua một lớp
vật liệu đệm, vi khuẩn nitrate hoá sẽ được giữ trên lớp vật liệu đệm này sẽ tiến hành oxy hoá
ammonia trong nước thải, có thể tiến hành sục khí để tăng hiệu quả, các nghiên cứu liên quan
CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU


2

đã được áp dụng như phương pháp dòng chảy chìm (submerged flow biofilter) (Abeysinghe et
al. 1996), nitrate hoá hiệu suất cao qua lớp đệm (high-rate linear-path trickling nitrification
filter) (Twarowska et al. 1997) [17], bench-scale fluidized bed bioreactor (Ng et al. 1996), hệ
thống xử lý liên tục với vật liệu đệm là gel alginate cố định vi khuẩn nitrate hoá (Kim et al.
2000)… các nghiêu cứu này đã tiến hành ở qui mô pilot và đạt được những thành công nhất
định. Cụ thể, hệ thống xử lý nước thải dùng phương pháp này đã làm giảm đến 25% lượng
ammonia theo nghiên cứu tiến hành bởi Chin và Ong (1997) ở trang trại nuôi tôm thương
phẩm. Tuy vậy, nhược điểm lớn của các phương pháp trên chính là chi phí đầu tư ban đầu lớn,
tốn kém trong quá trình bảo trì-vận hành, hơn nữa, công nghệ sử dụng khá phức tạp nên khó

ứng dụng đối với những hộ nuôi tôm có quy vừa và nhỏ vốn là thành phần chủ lực trong sản
xuất tôm giống ở những nước Đông Nam Á.

1. Phương pháp dòng chảy qua lớp đệm
[17]


2. Phương pháp dòng chảy chìm [17]

Giải pháp sử dụng trực tiếp chế phẩm vi sinh để xử lý ammonia hiện đang được ứng
dụng nhằm khắc phục nhược điểm của phương pháp vật liệu đệm. 2 hệ vi khuẩn được sử dụng
trong chế phẩm vi sinh thuộc nhóm hoá tự dưỡng, Nitrosomonas sp. và Nitrobacter sp., đây là
những chủng có tốc độ sinh trưởng chậm, thường có sẵn trong nước nuôi tôm nhưng vì việc
thay nước thường xuyên đã làm rửa trôi hệ vi khuẩn có lợi này, kết quả là hoạt lực nitrate hoá
tự nhiên trong bể nuôi tôm bị giảm đáng kể. Các chế phẩm thương mại thì hiện trên thị trường
rất nhiều nhưng hiệu quả thật sự thì vẫn chưa rõ ràng bởi các nhà sản xuất thường nói quá
hiệu quả của chế phẩm. Các nguyên nhân dẫn đến sự kém hiệu quả khi sử dụng chế phẩm vi
sinh tự do này (dạng lỏng, dạng bột) là chúng có khả năng thích nghi kém với môi trường
nước nuôi tôm từng địa phương, khu vực, sự cạnh tranh cơ chất với chủng vi sinh vật nội tại
trong bể nuôi tôm. Trở ngại lớn nhất là việc duy trì mật độ tế bào vi khuẩn nitrate hoá phải ở
mức cao thì mới có khả năng phân giải ammonia một cách rõ ràng, điều này rất khó đảm bảo
khi vi khuẩn nitrate hoá cũng bị rửa trôi trong quá trình thay nước.
Chính vì thế, mục tiêu nghiên cứu của tôi là kết hợp giữa 2 phương pháp trên lại với
nhau, làm thế nào tạo ra một chế phẩm có khả năng nitrate hoá vừa rẻ tiền, thích hợp cho các
hộ nuôi trồng vừa và nhỏ, tiết kiệm chi phí đầu tư, bảo dưỡng trang thiết bị, vừa có hoạt lực
nitrate hoá cao, hệ vi sinh vật ít bị rửa trôi và giảm tỉ lệ thay nước thường xuyên. Chất mang
BC (bacterial cellulose) có thể là một giải pháp trọn vẹn cho các tiêu chí trên.
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về Nitrosomonas sp.
Winogradsky là người đặt nền tảng nghiên cứu về các loại vi khuẩn oxi hoá ammonia
(vi khuẩn nitrite hoá) vào năm 1892. Tuy vậy, việc phân lập và nghiên cứu sâu hơn về các
loại vi khuẩn này đã không được tiếp nối nên trong một thời gian dài, người ta chỉ biết đến
chủng Nitrosomonas europaea. Bắt đầu từ năm 1960, Watson và cộng sự đã mở ra một kỉ
nguyên mới trong việc phân lập và nuôi cấy loại vi khuẩn này, họ đã phát hiện và đặt tên cho
hơn 16 chủng vi khuẩn oxi hoá ammonia khác. Từ đó đến nay, kiến thức về loại vi khuẩn này
liên tục được cập nhập, người ta đã dùng kỹ thuật PCR để xác định đoạn gen amoA (mã hoá
cho trung tâm hoạt động của enzyme chìa khoá trong quá trình nitrite hoá là ammonia
monooxygenase-AOB) và phương pháp phát hiện trực tiếp vi khuẩn này bằng kỹ thuật FISH
(fluorescence in situ hybridization). Với các thành tựu này, việc kiểm soát các loại vi khuẩn
oxi hoá ammonia trong thực tế trở nên dễ dàng hơn rất nhiều.
2.1.1 Phân lập, duy trì và nuôi cấy
Để phân lập một loại vi khuẩn nào đó, ta nắm vững nguyên tắc “cơ chất nào thì sẽ có
vi sinh vật loại đó phân huỷ”, vì vậy cần lấy mẫu ở những nơi mà vi khuẩn nitrite hoá tập
trung cao. Tiếp theo, sử dụng phương pháp MPN ứng với một loạt các loại môi trường nuôi
cấy khác nhau nhằm phản ánh tác động của yếu tố môi trường lên quá trình nghiên cứu.
Chẳng hạn, trong quá trình tăng sinh khối từ môi trường acid, pH thấp và thêm vào urea như
nguồn cơ chất sinh năng lượng duy nhất, người ta có thể phân lập được những chủng trội của
vi khuẩn nitrite hoá, có thể thích nghi trong điều kiện khắt nghiệt. Về tổng quát, hai yếu tố
ảnh hưởng quan trọng nhất là ammonia (NH
3
) và nồng độ muối, tiếp đến là nhiệt độ và pH
môi trường.
Sau khi có được công thức môi trường thích hợp nhất cho vi khuẩn nitrite hoá phát
triển, ta sẽ dùng một trong hai cách sau để phân lập vi khuẩn nitrite hoá là: phương pháp MPN
(số lượng tế bào chắc chắn có thể) dựa trên phân phối Poisson khi phân tích một loạt mẫu pha

loãng theo nhiều tỉ lệ khác nhau vào các ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy thích hợp nhất
cho vi khuẩn nitrite hoá phát triển; phương pháp trãi đĩa petri từ mẫu ban đầu. Cần lưu ý là vi
khuẩn nitrite hoá phát triển cực kì chậm, nên đối với phương pháp MPN thì có thể xác định
mẫu có chứa tế bào vi khuẩn sau 2-3 tuần nuôi cấy (dựa trên sự thay đổi màu sắc cho chất chỉ
thị pH gây ra), phương pháp trãi đĩa thì cần chờ đến 6-8 tuần mới thu được khuẩn lạc.
Các môi trường chuẩn để nhân giống được liệt kê bên dưới, đối với môi trường giữ
giống, thì CaCO
3
(5 g/l) hoặc N-2-hydroxyethyl-piperarine-N’-2’ethanesulfonic acid
(HEPES, 4,77 g/l) được dùng như một chất đệm pH. Khi nuôi cấy, thì pH luôn được chỉnh
bằng NaHCO
3
10%. Giá trị pH tối ưu phụ thuộc vào nồng độ các muối ammonium thêm vào.
10 mM muối ammonium thêm vào ở pH 8.0 được xem là tạo điều kiện rất tốt cho quá trình
phát triển của vi khuẩn. Nếu nuôi cấy ở thể tích lớn thì cần phải khuấy hoặc sục oxy vào.
Nhiệt độ 30
0
là thích hợp với quá trình phát triển của vi khuẩn. Thời gian cấy chuyền trong
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


4

khoảng 3-4 tháng, có thể trữ vi khuẩn nitrite hoá ở dạng dịch lỏng chứ không nhất thiết ở
dạng thạch nghiêng. Việc lưu trữ bằng phương pháp lạnh sâu về cơ bản tỏ ra không thành
công.
Bảng 1. Các môi trường khác nhau dùng nuôi cấy vi khuẩn nitrite hoá. Môi trường 1, 2 và 3
đề xuất tương ứng bởi Soriano và Walker (1968), Watson (1971) và Krinmel và Harms (1982)
đối với vi khuẩn phân lập từ đất, môi trường 4 đề xuất bởi Watson (1965) đối với vi khuẩn
phân lập từ biển và môi trường 5 đề xuất bởi Koops và cộng sự (1976) đối với vi khuẩn phân

lập từ nước lợ. Tất cả các môi trường đều cần 5 g/l CaCO
3
hoặc 4 g/l HEPES như chất đệm
pH [7]
Thành phần
Môi trƣờng
1
2
3
4
5
Nước cất (ml)
1000
1000
1000

600
Nước biển (ml)



1000
400
NH
4
Cl (mg)


535
1320

500
(NH
4
)
2
SO
4
(mg)
500
130



MgSO
4
.7H
2
O (mg)
40
200
49,3
200

CaCl
2
.2H
2
O (mg)
40
20

147
20

KH
2
PO
4
(mg)
200

54,4

50
K
2
HPO
4
(mg)

87

114

KCl (mg)


74,4


NaCl (mg)

584


Chelated iron FeNaEDTA (mg)

1

1

FeSO
4
.7H
2
O (μg)


973,1


Fe-EDTA (mg)
0,5




Na
2
MoO

4
.2H
2
O (μg)

100

1

(NH
4
)
6
Mo
7
O
24
.4H
2
O (μg)


37,1


MnCl
2
.4H
2
O (μg)

200

2

MnSO
4
.4H
2
O (μg)


44,6


CoCl
2
.6H
2
O (μg)

2

2

CuSO
4
.5H
2
O (μg)

20
25
20

ZnSO
4
.7H
2
O (μg)

100
43,1
100

H
3
BO
3
(μg)


49,4


Phenol red 0,5% (ml)
0,1
1

1

Cresol red 0,5% (ml)


1

1
2.1.2 Đặc điểm về giống
Việc phân loại vi khuẩn này về cơ bản dựa vào hình dáng của tế bào, sau đó là sự sắp
xếp của màng bao tế bào chất (intracytoplasmic membrane). Với các tiêu chí này, người ta đã
phân loại vi khuẩn nitrite hoá thành 5 giống chính là Nitrosomonas, Nitrosococcus,
Nitrosospira, Nitrosolobus và Nitrosovibrio. Trong đó, hiện có 16 loài vi khuẩn đã được phân
biệt dựa trên tỉ lệ G+C trong DNA, hoạt động của carboxysome, hoạt tính urease, tốc độ
chuyển hoá NH
3
, nồng độ tới hạn ammonia trong môi trường, yêu cầu về độ mặn và nồng độ
muối tới hạn.
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


5

Bảng 2. Các đặc điểm phân loại giống vi khuẩn nitrite hoá [7]
Đặc điểm
Nitrosococcus
Nitrosolobus
Nitrosomonas
Nitrosospira
Nitrosovibrio
Hình dạng

Dạng tròn đến
ellipse
Dạng thuỳ đa
hình
Dạng que
thẳng
Cuộn xoắn ốc
Dạng que mảnh,
hơi cong
Kích thước
(μm)
1,5-1,8x1,7-2,5
1,0-1,5x1,0-
2,5
0,7-1,5x1,0-
2,4
0,3-0,8x1,0-
8,0
0,3-0,4x1,1-3,0
Kiểu tiên mao
Mọc thành chùm
Mọc rải rác
Mọc ở cực
Mọc rải rác
Mọc ở cực
Cấu trúc màng
Có lỗ xuất hiện
thành cụm
Chia thành
nhiều ngăn

Có lỗ xuất
hiện rải rác
Gấp cuộn vào
bên trong
Gấp cuộn vào
bên trong

Giống Nitrosomonas (Winogradsky, 1982): tế bào về cơ bản là hình que, màng bao tế
bào chất có các lỗ nằm rải rác, đôi khi lớp màng này gấp cuộn vào bên trong tế bào
chất.

Hình 3. Hình thái tế bào Nitrosomonas dưới kính hiển vi quang học [7]

Hình 4. Hình thái tế bào Nitrosomonas dưới kính hiển vi điện tử cho thấy có sự khác nhau về
hình dạng và kích thước tế bào giữa các loài trong cùng giống Nitrosomonas. IM là màng bao
tế bào chất (intracytoplasmic membrane), C là carboxysome [7]
Giống Nitrosospira (Winogradsky, 1933): tế bào là dạng que xoắn, đôi khi có dạng
dấu phẩy. Không quan sát thấy màng bao tế bào chất.
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


6


Hình 5. Cấu trúc tế bào thuộc giống Nitrosospira [7]
Giống Nitrosovibrio (Harms và cộng sự, 1976): tế bào dạng dấu phẩy. Không quan sát
thấy màng bao tế bào chất. Màng trong tế bào gấp cuộn vào bên trong tế bào chất đã
được ghi nhận.

Hình 6. Cấu trúc tế bào thuộc giống Nitrosovibrio [7]

Giống Nitrosolobus (Watson và cộng sự, 1971): tế bào có dạng thuỳ đa hình, chia
thành ngăn bởi màng tế bào chất.
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


7


Hình 7. Cấu trúc tế bào thuộc giống Nitrosolobus [7]
Giống Nitrosococcus (Winogradsky, 1892): đại diện cho phân lớp gamma-
proteobacterial của vi khuẩn nitrite hoá. Có hai loài tiêu biểu là N. oceani và N.
halophilus với dạng cầu cho đến ellipse, được ghi nhận có màng bao tế bào chất với
các lỗ tập trung thành từng cụm.

Hình 8. Cấu trúc tế bào thuộc giống Nitrosococcus [7]
2.1.3 Nitrosomonas europaea
Vi khuẩn này được đặt tên là europaea vì được phân lập lần đầu tiên ở châu Âu
(1892), có dạng hình que, hai cực tế bào có dạng hình tròn, kích thước từ 0,8-1,1 x 1,0-1,7
μm, về cơ bản thì tồn tại từng tế bào riêng lẽ, Gram âm. Khả năng di động thì chưa được ghi
nhận. Carboxysome cũng không có trong tế bào chất. Không có hoạt tính urease. Ở pH
khoảng 7,8 thì tế bào chịu được nồng độ muối ammonium lên đến 400 mM. Hằng số Ks oxi
hoá NH
3
nằm trong khoảng 30-56 μM. Tuy không đòi hỏi phải có muối trong môi trường,
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


8

nhưng tế bào có thể chịu được nồng độ muối NaCl lên đến 500 mM. Vi khuẩn phân bố ở các

hệ thống xử lý rác, nguồn nước bị phú dưỡng hoá và thỉnh thoảng tồn tại trong đất [4].
Tỉ lệ mol% G + C trong DNA là 50,6-51,4. Dòng điển hình: ATCC 25978. GenBank
accesion number (16S rRNA): M96399.

Hình 9. Quan sát tế bào Nitrosomonas europaea dưới kính hiển vi quang học. Bar = 5 μm [4]

Hình 10. Quan sát tế bào Nitrosomonas europaea dưới kính hiển vi điện tử. Bar = 1 μm [4]
2.1.4 Nitrosomonas eutropha
Vi khuẩn này có tên eutropha có nghĩa là sống ở nơi có hàm lượng dinh dưỡng cao, có
nhiều hình dạng từ hình que đến hình trái lê, kích thước 1,0-1,3 x 1,6-2,3 μm, thỉnh thoảng kết
thành chuỗi ngắn. Cấu trúc thành tế bào Gram âm. Hầu hết các dòng đều có thể di động được.
Carboxysome nằm trong tế bào chất. Tế bào không có hoạt tính urease. Ở pH 7,8 thì khả năng
chịu nồng độ muối ammonium lên đến 600 mM và hằng số Ks oxi hoá NH
3
là 35-36 μM.
Không đòi hỏi phải có muối trong môi trường, nhưng tế bào vẫn sống được khi nồng độ NaCl
lên đến 500 mM. Rất thường thấy ở số lượng nhiều trong các cống rãnh, nguồn nước phú
dưỡng và thỉnh thoảng ở trong đất [4].
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


9

Tỉ lệ mol% G + C trong DNA là 47,9-48,5. Dòng điển hình: C-91, Nm 57. GenBank
accesion number (16S rRNA): AJ298739, AY 23795, M96402.

Hình 11. Quan sát tế bào Nitrosomonas eutropha dưới kính hiển vi điện tử. Bar = 1 μm [4]
2.1.5 Nitrosomonas marina
Vi khuẩn này có tên marina vì thường gặp ở biển. Tế bào dạng que dài, ở 2 đầu có
dạng hình tròn, kích thước 0,7-0,9 x 1,4-2,3 μm. Cấu tạo thành tế bào Gram âm, có thêm một

lớp bổ sung bên ngoài được cấu tạo bởi một dãy các đại phân tử. Khả năng di động chưa được
ghi nhân. Không có carboxysome. Cần phải có muối trong môi trường nuôi cấy, nồng độ
NaCl tối ưu cho vi khuẩn nằm trong khoảng 400 mM, tế bào có thể chịu đến nồng độ 800
mM. Ngoài ra, tế bào có thể chịu được nồng độ muối ammonium đến 200 mM ở pH 7,8. Hoạt
tính urease dương tính. Phân bố phổ biến ở biển và các khu vực ven biển [4].
Tỉ lệ mol% G + C trong DNA là 47,4-48. Dòng điển hình: Nm 22. GenBank accesion
number (16S rRNA): Z46990.

Hình 12. Quan sát tế bào Nitrosomonas marina dưới kính hiển vi điện tử quét. Bar = 1 μm [4]
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


10


Hình 13. Quan sát tế bào Nitrosomonas marina dưới kính hiển vi điện tử. Bar = 1 μm [4]
2.1.6 Nitrosomonas mobilis
Vi khuẩn có tên mobilis nghĩa là di động được. Về cơ bản, tế bào có dạng hình cầu,
đường kính từ 1,5 đến 1,7 μm. Tuy nhiên, một số dòng có dạng hình que, kích thước 1,5-1,7 x
1,7-2,5 μm. Tế bào thường ở dạng đơn hoặc cặp đôi, thỉnh thoảng kết thành chuỗi ngắn. Cấu
trúc thành tế bào Gram âm. Tế bào di động nhờ một bó sợi gồm từ 1 đến 22 tiên mao, có
chiều ngang khoảng 12 nm và chiều dài 3-5 μm. Không có carboxysome trong tế bào chất. Tế
bào sống ở nơi có độ mặn vừa, với nồng độ NaCl tối ưu khoảng 100 mM, tuy nhiên khi tăng
nồng độ lên đến 600 mM thì tế bào vẫn sống được. Ở pH 7,8 thì tế bào chịu được nồng độ các
hợp chất ammonium đến 300 mM. Hoạt tính urease âm tính. Dòng vi khuẩn này được phân
lập ở khu vực nước lợ và các hệ thống xử lý nước thải [4].
Tỉ lệ mol% G + C trong DNA là 49,3. Dòng điển hình: Nc 2. GenBank accesion
number (16S rRNA): AF287287, AJ298728, M96403.

Hình 14. Cấu trúc tế bào Nitrosomonas mobilis dưới kính hiển vi điện tử quét. Bar = 1μm [4]

CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


11


Hình 15. Cấu trúc tế bào Nitrosomonas mobilis dưới kính hiển vi điện tử. Bar = 1 μm [4]
2.2 Giới thiệu về Nitrobacter sp.
2.2.1 Nitrobacter winogradsky
Tên dòng vi khuẩn này được đặt theo tên nhà sinh vật học Winogradsky là người đầu
tiên phân lập được nó. Vi khuẩn có dạng que ngắn, hình quả lê, thỉnh thoảng có dạng cầu,
kích thước 0,6-0,8 x 1,0-2,0 μm. Carboxysome thường xuất hiện ở dạng thể vùi trong nguyên
sinh chất. Tế bào có thể di động nhờ tiên mao ở gần cực và bên hông. Nhiều dòng vi khuẩn
nitrite hoá này là loại hoá tự dưỡng không bắt buộc. Khi nuôi trên môi trường có nhiều loại
dinh dưỡng, vi khuẩn nitrite hoá sẽ ưu tiên dùng nitrite trước, sau đó mới oxi hoá các hợp chất
hữu cơ còn lại. Vi khuẩn cũng có thể sử dụng pyruvate, acetate và glycerol như nguồn sinh
năng lượng, cùng với dịch chiết nấm men, casamino acid, peptone, NH
3
và nitrate như nguồn
cung cấp nitơ. Dưới điều kiện môi trường gồm các chất khoáng vô cơ hay môi trường hỗn
hợp nhiều loại dinh dưỡng, thời gian thế hệ dao động từ 8 đến 14 giờ. Trong khi ở môi trường
giàu chất hữu cơ thì vi khuẩn phát triển chậm nên thời gian thế hệ từ 70 đến 100 giờ. Vi
khuẩn có khả năng sống trong điều kiện kị khí với nitrate là chất nhận điện tử và tạo ra các
dạng nitrite, nitric oxide (NO), nitrous oxide (N
2
O). Tế bào ít nhạy cảm với oxy khi được
chuyển từ điều kiện kị khí sang điều kiện hiếu khí. NO có thể là nguồn cơ chất thay thế nitrite
cho vi khuẩn oxi hoá trong điều kiện hiếu khí thành nitrate. Những dòng vi khuẩn điển hình
chủ yếu được phân lập từ đất. Ngoài ra, vi khuẩn này còn phân bố ở nước ngọt, biển, cống
rãnh, hệ thống xử lý nước thải và phân bón. [4]

Tỉ lệ mol% G + C trong DNA là 61,7. Dòng điển hình: ATCC 25391.
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


12


Hình 16. Vi khuẩn Nitrobacter winogradsky được nhuộm Gram âm, có dạng quen ngắn. Bar =
1 μm [4]
2.2.2 Nitrobacter alkalicus
Vi khuẩn này có tên alkalicus nghĩa là alkaline, độ kiềm vì khả năng sống trong pH
kiềm khá cao từ 6,5 đến 10,2 và pH tối thích là 9,5. Vi khuẩn có dạng quả lê, kích thước từ
0,6-0,8 x 1,2-1,8 μm. Vách tế bào có thêm một lớp bọc bên ngoài được cấu trúc bởi các tiểu
đơn vị protein theo một trật tự nhất định. Nitrite là nguồn sinh năng lượng cho vi khuẩn ở điều
kiện môi trường khoáng vô cơ, trong khi môi trường hữu cơ thì người ta không ghi nhận được
sự phát triển của vi khuẩn. Đối lập với các loại vi khuẩn nitrite hoá khác, người ta không phát
hiện thấy carboxysome trong vi khuẩn này, do đó để sinh trưởng thì vi khuẩn bắt buộc phải
dùng nguồn carbon ở dạng ion carbonate. Vi khuẩn này được phân lập ở lớp bùn trong các hồ
nước khoáng có hàm lượng Na
2
CO
3
cao (soda lake) hoặc từ đá vôi, đá khoáng (soda soil) ở
Siberia và Kenya. [4]
Tỉ lệ mol% G + C trong DNA là 62. GenBank accesion number (16S rRNA): AF
069956.

Hình 17. Khuẩn lạc Nitrobacter alkalicus sau 2 tháng nuôi cấy ở pH 10. Bar = 0,1 cm [15]
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

13


Hình 18. Tiên mao (F) ở Nitrobacter alkalicus dưới kính hiển vi. Bar = 1 μm [15]

Hình 19. Cấu trúc tế bào Nitrobacter alkalicus dưới kính hiển vi điện tử. Lớp vỏ bao bên
ngoài (S) được cấu tạo gồm nhiều tiểu đơn vị protein ghép với nhau. Bar = 1 μm [15]

Hình 20. Cấu trúc lớp vỏ bên ngoài tế bào vi khuẩn Nitrobacter alkalicus. Bar = 0,5 μm [15]
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


14


Hình 21. Các bào quan ở Nitrobacter alkalicus (M) màng intracytoplasmic, (P) polyphosphate
và (H) hạt polyhydroxybutyrate. Bar = 1 μm [15]
2.2.3 Nitrobacter hamburgensis
Vi khuẩn được phân lập đầu tiên ở thành phố Hamburg, Đức, và để tưởng nhớ sự kiện
đó người ta đã đặt tên thành phố cho dòng vi khuẩn này. Hình thái và cấu trúc tế bào tương tự
như các dòng vi khuẩn nitrite hoá khác. Carboxysome hiện diện ở tế bào chất. Khả năng di
động nhờ tiên mao ở đuôi và bên hông. Phát triển kém trên môi trường khoáng vô cơ nhưng
lại có khả năng phát triển tốt ở môi trường hỗn hợp. Khi môi trường có nitrite, pyruvate, dịch
chiết nấm men và peptone thì tốc độ sinh trưởng đạt cao nhất. Đây là dòng duy nhất có thể
phát triển tốt trong môi trường có chất hữu cơ. Cả nirtite và chất hữu cơ đều được sử dụng
trong quá trình biến dưỡng của tế bào. Tế bào còn có thể khử nitrate để phục vụ quá trình sinh
trưởng. Vi khuẩn khá nhạy cảm với oxy khi chuyển từ điều kiện kị khí sang hiếu khí. Dòng vi
khuẩn này được phân lập từ đất ở Hamburg (Đức), Yucatan (Mexico) và Corse (Pháp). [4]
Tỉ lệ mol% G + C trong DNA là 61,6. Dòng điển hình là X 14. GenBank accesion

number (16S rRNA): L11663.

Hình 22. Vi khuẩn Nitrobacter hamburgensis được nhuộm Gram âm, có dạng quả lê. Bar =
250nm. [4]
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


15

2.2.4 Nitrobacter vulgaris
Vulgaris trong tiếng La tinh nghĩa là phổ biến. Đặc điểm hình thái và cấu trúc tương tự
như các dòng nitrite hoá khác. Carboxysome hiện diện trong tế bào chất. Phần lớn tế bào
trong dòng này có 2 pha sinh trưởng, pha đầu tiên sẽ oxi hoá nitrite thường, pha thứ hai oxi
hoá các hợp chất hữu cơ khác. Mức độ sinh trưởng trong pha đầu tiên (hoá tự dưỡng) thường
chậm hơn pha thứ hai (hoá dị dưỡng). Tế bào ở dòng Z có thời gian nhân đôi là 140 giờ ở pha
đầu tiên và 25 giờ ở pha thứ hai. Cả nitrate và oxy đều là chất nhận điện tử và acetate hoặc
pyruvate là chất cho điện tử khi tế bào sử dụng hợp chất hữu cơ. Tế bào sản sinh ra những
polymer ngoại bào giúp liên kết những tế bào xung quanh lại tạo thành cụm, màng (biofilm).
Điểm khác biệt với các dòng nitrite hoá khác là vi khuẩn Nitrobacter vulgaris không nhạy
cảm với oxy chuyển từ môi trường kị khí sang môi trường hiếu khí. Trên màng nguyên sinh
chất ở Nitrobacter vulgaris thì chỉ có duy nhất một loại cytochrome c 32 kDa trong khi ở N.
winogradsky và N. hamburgensis thì có cả loại cytochrome 30 kDa. Dòng vi khuẩn này được
phân lập từ đất, nước ngầm, nước ngọt hoặc nước lợ, cống rãnh và cả trong tổ mối. N.
vulgaris là loài phổ biến nhất trong loài Nitrobacter, thậm chí nó có xuất hiện trong bê tông
và những toà nhà xây dựng từ đá, gạch. [4]
Tỉ lệ mol% G + C trong DNA là 59,4. Dòng điển hình là Z.

Hình 23. Cấu trúc tế bào Nitrobacter vulgaris gồm lớp màng introcytoplasmic và
carboxysome. Bar = 250 nm. [4]
2.3 Quá trình nitrate hoá

Các loại vi khuẩn hoá năng vô cơ (chemolithotrophic) thường là loại tự dưỡng, đều sử
dụng chu trình Calvin để cố định CO
2
như nguồn carbon duy nhất. Ở vi khuẩn nitrate hoá,
được xếp vào loại hoá tự dưỡng (chemoautotrophic) sẽ sử dụng năng lượng thu được từ quá
trình oxi hoá ammonia hay nitrite để phục vụ cho việc khử CO
2
thành carbohydrate. Khi một
phân tử CO
2
đi vào chu trình Calvin, nó cần đến 3 phân tử ATP và 2 phân tử NADPH. Điều
khó khăn là năng lượng thu từ quá trình oxi hoá các phân tử vô cơ (nói chung) của vi khuẩn
nitrate hoá lại nhỏ hơn rất nhiều so với việc oxi hoá hoàn toàn glucose ở loại vi khuẩn thông
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


16

thường. Tỉ lệ P/O trong quá trình oxi hoá phosphoryl hoá ở vi khuẩn nitrate hoá thường bằng
1, chính vì tỉ lệ quá thấp như vậy, nên vi khuẩn nitrate hoá nói riêng và các loại vi khuẩn hoá
năng vô cơ khác nói chung, cần oxi hoá một lượng lớn các hợp chất vô cơ để sinh trưởng và
sinh sản, điều này nói lên tác động của hệ vi khuẩn này đối với môi trường rất sâu sắc.
Bảng 3. Năng lượng thu được từ quá trình oxi hoá các hợp chất vô cơ so với từ glucose (-686
kcal/mol) [11]
Phản ứng
ΔG
o
’ (kcal/mol)
H
2

+ 1/2 O
2
 H
2
O
-56,6
NO
2
-
+ 1/2 O
2
 NO
3
-

-17,4
NH
4
+
+ 1½ O
2
 NO
2
-
+ H
2
O + 2H
+

-65,0

S
0
+ 1½ O
2
+ H
2
O  H
2
SO
4

-118,5
S
2
O
3
2-
+ 2O
2
+ H
2
O  2SO
4
2-
+ 2H
+

-223,7
2Fe
2+

+ 2H
+
+ 1/2 O
2
 2Fe
3+
+ H
2
O
-11,2
Ở vi khuẩn nitrate hoá, năng lượng giải phóng từ quá trình oxi hoá ammonia lẫn nitrite
được sử dụng để tổng hợp nên ATP (hoạt hoá các enzyme, cơ chất, là hợp chất dự trữ năng
lượng) và NAD(P)H (nguồn cung cấp electron trong chuỗi vạn chuyển điện tử, cung cấp H
+
dùng để khử các hợp chất khác, là hợp chất chứa năng lượng khử). Chính 2 hợp chất quan
trọng này, mà vi khuẩn nitrate hoá sử dụng để khử CO
2
và các hợp chất khác phục vụ cho quá
trình biến dưỡng của tế bào.
Quá trình tổng hợp ATP ở vi khuẩn nitrate hoá về nguyên tắc rất giống với hoạt động
tổng hợp ATP của ti thể ở các vi sinh vật có nhân thật. Con đường chính để tạo ATP là thông
qua các hoạt động oxi hoá ammonia và phân ly nước (ở vi khuẩn nitrite hoá) và oxi hoá nitrite
(ở vi khuẩn nitrate hoá), H
+
được tạo ra và đẩy vào periplasm (là khoảng không gian giữa
màng trong và màng ngoài của tế bào vi khuẩn), từ đó tạo nên gradient H
+
làm cho H
+
chạy

qua phức ATPase vào trong cytoplasm (nguyên sinh chất) giúp tái tạo ADP thành ATP. Con
đường phụ (diễn ra ở Nitrobacter sp., trong khi ở Nitrosomonas sp. thì không hiện diện) để
tạo ATP là thông qua hoạt động của chất khử NADH và hoạt động của phức vận chuyển điện
tử trên màng, giúp tổng hợp ATP.
Quá trình tổng hợp NADH thì khó khăn hơn nhiều và hiện chưa được lý giải rõ hoàn
toàn, vì nó liên quan đến quá trình vận chuyển electron theo chiều ngược lại (reverse electron
transport – RET). Lý do chính vì những phân tử như ammonia, nitrite thì có thế khử cao (E’
0

NO
3
-
/NO
2
-
= 0,421 V) hơn so với NAD
+
(E’
0
NAD
+
/NADH = -0,32) nên VI KHUẨN nitrate
hoá không thể cung cấp electron trực tiếp từ quá trình oxi hoá ammonia và nitrite để tổng hợp
nên NAD(P)H qua hệ enzyme NADH-oxidoreductase. Bởi vì electron chỉ có thể di chuyển từ
chất cho (donor) có thế khử thấp hơn đến chất nhận (acceptor) có thế khử cao hơn. Để giải
quyết khó khăn này, vi khuẩn nitrate hoá đã sử dụng lực đẩy proton (proton motive force –
PMF) để đảo lại chiều di chuyển electron, qua các chất vận chuyển điện tử, nhằm khử NAD
+

về NADH. Ngoài ra PMF còn dùng cho sự chuyển động của tiên mao, các hoạt động trao đổi

chất trong tế bào.
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


17

Có thể thấy nếu so sánh với quá trình tạo nên NADH và ATP qua con đường đường
phân hay chu trình Krebs ở các vi sinh vật khác, thì quá trình tạo NADH và ATP ở vi khuẩn
nitrate hoá tiêu tốn nhiều năng lượng hơn và lượng sản phẩm tạo ra ít hơn. Nhưng vì nguồn cơ
chất ammonia, nitrite mà vi khuẩn nitrate hoá sử dụng lại không bị cạnh tranh như các nguồn
cơ chất khác (glucose, lipid, protein), nên vi khuẩn nitrate hoá vẫn thích nghi được với con
đường biến dưỡng bằng các hợp chất này.

Hình 24. Hướng di chuyển electron dựa trên thế khử của các chất trong tế bào. Những chất
khử luôn là chất cho điện tử, và các chất oxi hoá luôn là chất nhận điện tử. [11]
Quá trình nitrate hoá là quá trình chuyển hoá ammonium (NH
4
+
) thành nitrate (NO
3
-
)
bởi tác động của vi sinh vật trong điều kiện hiếu khí. Quá trình này được thực hiện bởi hai
nhóm vi khuẩn tuần tự nối tiếp nhau, gồm 2 bước: giai đoạn nitrite hoá (nitrition) chuyển
NH
4
+
thành nitrite (NO
2
-

) và giai đoạn nitrate hoá (nitration) từ nitrite thành nitrate (NO
3
-
).
Chuyển NH
4
+
thành NO
2
-

Nhóm vi khuẩn chuyển ammonium thành nitrite là Nitrosomonas (N. europaea, N.
aligocarbogenes) oxi NH
4
+
thành NO
2
-
qua sản phẩm trung gian là hydroxylamine
(NH
2
OH)
2NH
4
+
+ O
2
 2NH
2
OH + 2H

+


NH
2
OH + O
2
 NO
2
-
+ 2H
+
+ H
2
O + 275 kJ

CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


18

Chuyển NO
2
-
thành NO
3
-

Nhóm vi khuẩn chuyển nitrite thành nitrate là Nitrobacter (N. agilis, N. winogradsky)
theo phản ứng sau:

NO
2
-
+ 0,5O
2
 NO
3
-
+ 73 kJ


Hình 25. Hai giai đoạn của quá trình nitrate hoá
Trước khi đi sâu vào các quá trình xảy ra trên màng tế bào chất của vi khuẩn nitrate
hoá, cần điểm lại kiến thức liên quan đến các hợp chất nitơ, các phức vận chuyển điện tử.
2.3.1.1
-3). Ammonia NH
3
ammonium NH
4
+
-
. Nitrite
NO
2
-
+5.
Sự tồn tại của ammoni trong nước được phân thành 2 loại: NH
3
(khí hoà tan) và NH
4

+

(dạng ion hoá). Sự phân chia này phụ thuộc vào pH, nhiệt độ và độ mặn của nước, nhưng ảnh
hưởng của pH là quan trọng hơn cả. Chỉ có dạng NH
3
là gây độc cho động vật nuôi trồng. Khi
hàm lượng NH
3
trong nước quá mức cho phép sẽ làm ảnh hưởng đến vật nuôi và dễ nhiễm
bệnh từ vi khuẩn. Thực tế trong ngành thuỷ sản, hàm lượng NH
3
quy định trong nước phải
nhỏ hơn 0,1ppm, khi hàm lượng lên đến 0,45ppm sẽ làm giảm 50% tốc độ sinh trưởng của
tôm.

ammonia-nitrogen
(NH
3
-nitrogen (NH
4
+
-nitrogen hay to -
3
:
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


19

,
2
-
:

2.3.1.2 M liên quan
o Cytochrome
-
2+
hay Fe
3+
-
550nm.
Cy .


26 .
o Periplasm space
(-)
vi
khuẩn - vi khuẩn
(peptidoglyca
(x
-
.
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


20

27
Gram (-)
o Carboxysome: là những vi bào (microcompartment) có chứa enzyme liên quan đến
quá trình cố định carbon. Cấu tạo của carboxysome do polyhedral protein bao bọc bên
ngoài, có đường kính từ 80 đến 140 nm. Chức năng của carboxysome được nhìn nhận
là nơi tập trung hàm lượng CO
2
cao nhằm tăng cường hiệu quả hoạt động và tỉ lệ
enzyme RuBisCo trong chu trình Calvin, giúp khởi đầu chu trình Calvin được thuận
lợi. Những bào quan này được tìm thấy ở các loại vi khuẩn sử dụng CO
2
như nguồn
carbonhydrate như vi khuẩn lam (cyanobacteria) và rất nhiều loài vi khuẩn hoá dưỡng
khác. Carboxysome là một ví dụ cho rất nhiều nhóm protein tuy có cấu tạo giống nhau
nhưng thực hiện chức năng không tương đồng, nguyên nhân do khác nhau dựa trên
cấu tạo hình thái của lớp vỏ được hình thành bởi protein đó.

Hình 28. Cấu trúc carboxysome và các enzyme cấu tạo lớp vỏ [18].
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


21

2.3.1.3 Quá trình nitrite hoá ở Nitrosomonas sp.
Hai enzyme chìa khoá ở đây là ammonia monooxygenase - AMO (oxi hoá NH
3
thành
NH
2

OH và H
2
O) và hydroxylamine oxidoreductase (oxi hoá NH
2
OH thành NO
2
-
). Trong tế
bào vi khuẩn nitrite hoá, cơ chế chung như sau: đầu tiên, enzyme ammonia monooxygenase
xúc tác chuyển NH
3
ngoài môi trường thành NH
2
OH theo phản ứng:
NH
3
+ O
2
+ 2e
-
+ 2H
+
 NH
2
OH + H
2
O + 0,7 kcal/mol
(1)

(1)

.
Hydroxylamine (NH
2
a 1 proton (H
+
).
NH
2
OH + O
2
+ H
2
O  NO
2
-
+ H
2
O + H
+
+ 83,3 kcal/mol
(2)

3 2
2
-
(2)
.
2
-
.

2 2
- +
(OH)
2
a
ion H
+
.
Ở phản ứng (1)
3
NH
2
(2)
2
O
2
, H
+ -

NH
2
OH + H
2
O  NO
2
-
+ H
+
+ 4[H

+
+ e
-
]
(3)

2
OH ra NO
2
-
,
do đó phản ứng (2) có thể tách thành 2 giai đoạn như sau:
NH
2
OH  (HNO) + 2[H
+
+ e
-
]

(HNO) + H
2
O  NO
2
-
+ H
+
+ 2[H
+
+ e

-
]

Như vậy, phản ứng chung của quá trình nitrite hoá như sau:
NH
3
+ 1,5O
2
 NO
2
-
+ H
+
+ H
2
O + 84 kcal/mol

Điều cần lưu ý là trong quá trình nitrite hoá, cơ chất của ammonia monooxygenase là
NH
3
chứ không phải NH
4
+
, vì vậy quá trình nitrite hoá diễn ra mạnh nhất ở pH trung tính hoặc