Nghiên cứu chuyển hóa một số isatin tetra o acetyl β d glucopyranosyl thiosemicacbazon thế

1

Nghiên cứu chuyển hóa một số isatin tetra-O-
acetyl-β-D-glucopyranosyl thiosemicacbazon thế


Quách Thị Thanh Vân

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn ThS chuyên ngành: Ha hu cơ; Mã số: 60 44 27
Người hướng dẫn: PGS. TS Nguyễn Đình Thành
Năm bảo vệ: 2012


Abstract: Tổng hợp 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl)thiosemicarbazid.
Tổng hợp một số N-alkylisatin. Tổng hợp một số dẫn xuất N-alkylisatin 4-(2,3,4,6-tetra-
O-acetyl-β-D-glucopyranosyl)thiosemicarbazon. Tổng hợp isatin (2,3,4,6-tetra-O-acetyl-
β-D-glucopyranosy)l thiosemicarbazon từ 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl)
thiosemicarbazid. Tổng hợp một số dẫn xuất base Mannich từ isatin(2,3,4,6-tetra-O-
acetyl-β-D-glucopyranosyl) hiosemicarbazon. Xác định cấu trúc của các N-alkylisatin và
base Mannich của 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl)thiosemicarbazon tổng
hợp được bằng phương pháp phổ. Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất N-
alkylisatin 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl)thiosemicarbazon tổng hợp
được.

Keywords: Hóa hu cơ; Hợp chất glycoside; Hoạt tính sinh học; Hợp chất N-
alkylisatin


Content
Ngày nay với sự phát triển của khoa học kĩ thuật đã đem lại cho con người nhiều thành tựu

to lớn phục vụ cho cuộc sống, nhưng bên cạnh đ n cũng gây ra nhiều vấn đề về sức khỏe của
con người. Các loại bệnh tật không ngừng gia tăng đòi hỏi phải có nhng loại thuốc mới thích
ứng với chúng. Cùng với sự phát triển của hóa học nói chung, hóa học về tổng hợp các hợp chất
hu cơ ngày càng phát triển nhằm tạo ra các loại hợp chất phục vụ cho đời sống dân sinh, đặc
biệt là các hợp chất có hoạt tính sinh học cao đối với cơ thể người và động vật. Các hợp chất này
ngày càng trở nên c ý nghĩa quan trọng khi áp dụng vào lĩnh vực y dược học cha trị nhng căn
bệnh hiểm nghèo nâng cao sức đề kháng cho người và động vật.
2

Isatin và các dẫn chất thế của nó là một trong rất nhiều dãy chất hu cơ được nghiên cứu hệ
thống về mặt hóa học và tác dụng dược lý. Nhiều công nghiên cứu trên thế giới từ trước đến nay
đã cho thấy các dẫn chất của isatin có tác dụng dược lý đa dạng như kháng virus, kháng khuẩn,
kháng nấm, chống phân bào, ức chế men MAO, kháng lao… Chẳng hạn như năm 1954, nhà
nghiên cứu Nhật Bản S.K. Ochimura và các cộng sự đã tổng hợp và thử tác tác dụng chống lao
của một số dẫn xuất hydrazon của isatin. Ngày nay, một số loại quả như mơ, mận mà trong thành
phần có chứa isatin được y học khuyên dùng để hỗ trợ hệ tiêu hóa.
Từ lâu các hợp chất thuộc nhm glycoside đã được biết đến với nhiều hoạt tính sinh học
đáng quý: kháng virus viêm gan, HIV, chống ung thư… Các hợp chất glycoside được gắn với
các nhóm hoạt động sẽ dễ dàng xâm nhập vào vi khuẩn, virus nhờ có liên kết glycoside giống với
lớp vỏ của chúng từ đ tạo ra điều kiện thuận lợi cho sự tiêu diệt nhng vi khuẩn, virut này của
các nhóm hoạt động có trong phân tử. Do đ việc nghiên cứu và tổng hợp các hợp chất glycoside
mới và nâng cao hoạt tính sinh học của chúng là vấn đề rất được quan tâm hiện nay.
Nhằm góp phần vào việc nghiên cứu trong lĩnh vực hóa học của các hợp chất monosaccaride
có chứa hợp phần isatin, trong bản luận văn này chúng tôi đã thực hiện được một số nhiệm vụ
sau:
 Tổng hợp 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl)thiosemicarbazid;
 Tổng hợp một số N-alkylisatin;
 Tổng hợp một số dẫn xuất N-alkylisatin 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-
glucopyranosyl)thiosemicarbazon;
 Tổng hợp isatin (2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosy)l thiosemicarbazon từ (2,3,4,6-

tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl) thiosemicarbazid.
 Tổng hợp một số dẫn xuất base Mannich từ isatin(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-
glucopyranosyl)thiosemicarbazon.
 Xác định cấu trúc của các N-alkylisatin và base Mannich của 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-
glucopyranosyl)thiosemicarbazon tổng hợp được bằng phương pháp phổ
 Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất N-alkylisatin 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-
glucopyranosyl)thiosemicarbazon tổng hợp được.

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1. 1. TỔNG QUAN VỀ ISOTHIOCYANAT
1.1.1. Giới thiệu về glucosyl isothiocyanat
1.1.2. Phương pháp tổng hợp glycosyl isocyanat và glucosyl isothiocyanat
1.1.3. Tính chất hoá học của glycosyl isocyanat và glucosyl isothiocyanat
1.1.3.1 Phản ứng với amoniac và amin
1.1.3.2. Phản ứng với aminoacid
1.1.3.3. Phản ứng với amid
1.1.3.4. Phản ứng với aminoaceton hydrocloride
1.1.3.5.Phản ứng với 2-cloroethylamin hydrocloride
1.1.3.6. Phản ứng với diamin và diazomethan
1.2. VỀ TỔNG HỢP THIOSEMICARBAZID
1.2.1. Tổng hợp thiosemicacbazid

1.2.1.1. Phản ứng của isothiocyanat và hydrazin
1.2.1.2. Phản ứng khử thiosemicarbazon bằng NaBH
4
.
1.2.1.3. Phản ứng của hydrazin với các dẫn xuất của acid thiocarbamic
1.2.1.4. Phản ứng của cyanohydrazin với hydrosulfide.

1.2.1.5. Phản ứng tổng hợp dẫn xuất di- và trithiosemicarbazid từ các amin
1.2.2. Tính chất của thiosemicarbazid[32,13,17]
1.2.2.1. Phản ứng với các aldehyd
1.2.2.2. Phản ứng đóng vòng của thiosemicarbazid tạo thiadiazole
1.3. TỔNG QUAN VỀ ISATIN [6,18,19,24]
1.3.1. Phương pháp tổng hợp isatin [8,20,35,37,38,27]
1.3.1.1. Từ indigo
1.3.1.2. Từ anilin
1.3.1.3. Một số phương pháp khác
1.3.2. Tính chất hoá học của isatin [6,34,36,39]
1.3.2.1. Phản ứng tạo muối

4

1.3.2.2. Sự tautomer hoá
1.3.2.3. Oxy hoá và khử hoá
1.3.2.4. Acyl hoá và alkyl hoá
1.3.2.5. Halogen hoá, sunfo hoá và nitro hoá
1.3.2.6. Phản ứng với chất phản ứng Grignard
1.3.2.7. Phản ứng với hydroxylamin, phenylhydrazin và amin thơm:
1.3.2.8. Phản ứng với acid hydrocyanic, amoniac và amin béo
1.3.2.9. Ngưng tụ với các nhóm methylen
1.4. SỬ DỤNG LÒ VI SÓNG TRONG HOÁ HỌC CARBOHYDRATE
1.5. TỔNG QUAN VỀ BASE MANNICH [7, 22,28,29,31,33]
1.5.1. Sơ lược về lịch sử của phản ứng Mannich
1.5.2. Cơ chế phản ứng

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM
Điểm nóng chảy của các hợp chất được đo bằng phương pháp mao quản trên máy đo
điểm nóng chảy STUART SMP3 (BIBBY STERILIN-Anh). Phổ hồng ngoại được đo trên máy

phổ FTIR Magna 760 (NICOLET, Mỹ) bằng phương pháp đo phản xạ trên mẫu bột KBr. Phổ
1
H
và
13
C NMR được ghi trên máy phổ AVANCE Spectrometer 500MHz (BRUKER, Đức) trong
dung môi DMSO-d
6
, chất chuẩn nội TMS. Phổ MS được ghi trên máy phổ LTQ Orbitrap XL
(Theromo Scientific, USA).
TDẫn xuất 2,3,4,6-tetra-O-acetyl--glucopyranosyl isothiocyanat được tổng hợp theo tài
liệu [3,11,19,29]. Các phản ứng tổng hợp 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-
glucopyranosyl)thiosemicarbazon của isatin và N-alkylisatin thế được thực hiện bằng phương
pháp tổng hợp dùng lò vi sóng [15].
Sơ đồ phản ứng chung như sau:

5

N
O
O
R
O
OAc
NCS
AcO
AcO
OAc
NH
2

NH
2
.H
2
O
CH
2
Cl
2
O
OAc
NH
AcO
AcO
OAc
C
S
NH NH
2
+
C
2
H
5
OH
CH
3
COOH
O
OAc

NH
AcO
AcO
OAc
C
S
NH
N
N
O
R
(1)
(2)
(3a-3i)
(4a-4i)
R = CH
3
(3a, 4a); C
2
H
5
(3b, 4b); n-C
3
H
7
(3c, 4c);
i-C
3
H
7

(3d, 4d); n-C
4
H
9
(3e, 4e); i-C
4
H
9
(3f, 4f);
C
3
H
5
(3g, 4g); C
6
H
5
CH
2
(3h, 4h); C
6
H
5
C
2
H
5
(3i, 4i)

2.1. TỔNG HỢP (2,3,4,6-TETRA-O-ACETYL-

-D-GLUCOPYRANOSYL)
THIOSEMICARBAZID
2.1.1. Tổng hợp tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl bromide
O
OH
HO
HO
OH
OH
O
OAc
AcO
AcO
Br
OAc
1) Ac
2
O / HClO
4
2) Br
2
/ P ®á/ H
2
O

Cho anhydrid acetic (160ml) vào bình cầu ba cổ được đặt lên mày khuấy , có lắp nhiệt kế

và được làm lạnh, sau đ nhỏ gọt từ từ 0.96ml acid percloric 57% vào bình cầu. Khuấy tiếp dung
dịch phản ứng ở nhiệt độ lạnh 5 phút rồi nâng nhiệt độ lên ở nhiệt độ phòng và thêm từ từ α-D-
glucose monohydrat (40g) với tốc độ sao cho nhiệt độ của phản ứng ở khoảng 30-40
o
C. Sau khi
cho hết α-D-glucose monohydrat thì làm lạnh hỗn hợp phản ứng xuống dưới 20
o
c, thêm vào hỗn
hợp phản ứng phosphor đỏ (12g). Tiến hành nhỏ giọt brom (23.2ml) sao cho nhiệt độ của phản
ứng không vượt quá 20°C. Sau khi hết brom, nhỏ tiếp 14.4ml nước vào bình phản ứng, khuấy
6

mạnh và gi nhiệt độ không vượt quá 20°C. Tiếp tục khuấy 30 phút ở dưới 20°C và 2 giờ na ở
nhiệt độ phòng. Thêm 150ml cloroform vào phản ứng, lắc mạnh, lọc. Chiết lấy lớp cloroform ở
dưới, trung hoà bằng dung dịch NaHCO
3
bão hoà. Làm khô bằng CaCl
2
, sau đ hút chân không
thu được chất dạng siro có khối lượng 72.8g. Sản phẩm đủ tinh khiết cho chuyển hoá tiếp theo.
2.1.2. Tổng hợp tetra-O-acetyl-ß-D-glucopyranosyl isothiocyanat
O
OAc
AcO
AcO
Br
OAc
Toluen khan
O
OAc

AcO
AcO
OAc
N C S
Pb(SCN)
2

Cho muối chì thiocyanat ( 0.24 mol, 64 g) và tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl bromo
(0.175 mo, l72.8g) trong 400ml toluen khan. Hỗn hợp phản ứng được đun hồi lưu trong 3 giờ.
Dung dịch thu được c màu vàng đậm. Cất loại dung môi bằng máy hút chân không. Lọc sản
phẩm thu được bằng phễu lọc Buchner. Sản phẩm được kết tinh lại bằng ethanol. Thu được kết
tủa là 66g, điểm nóng chảy 110–112
o
C.
2.1.3. Tổng hợp tetra-O-acetyl-ß-D-glucopyranosyl thiosemicarbazid
Hợp chất 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-

-D-glucopyranosyl thiosemicarbazid được tổng hợp
theo hai phương pháp c sơ đồ chung như sau:

b. Phương pháp 2
Cho vào bình cầu 500 ml gồm CH
2
Cl
2
(140 ml) và (0.082 mol, 32 g) tetra-O-acetyl-β-D-
glucopyranosyl isothiocyanat, hỗn hợp được làm lạnh sâu và được khuấy trên máy khuấy từ.
Tiếp tục nhỏ từ từ hỗn hợp gồm 4.5 ml hydrazin hydrat và 140 ml CH
2
Cl

2
vào hỗn hợp được làm
lạnh.Sau khi nhỏ hết thì hỗn hợp phảnứng được khuấy thêm 1 giờ ở nhiệt độ 0-5
o
c và 2 giờ ở
20
o
c. Sau đ cất loại dung môi thu được dạng siro màu vàng đậm, đổ dạng siro vào cốc chứa 150
ml ethanol 96, đánh bông dạng siro ta thu được dạng bột màu trắng. Lọc và rửa trên phễu
Buchner thì thu được tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl thiosemicarbazid
hiệu suất 61%. Đ
nc
=183-185.
7

2.2. TỔNG HỢP MỘT SỐT N-ALKYLISATIN (3a-i)
Quy trình chung: Cho 0,03 mol isatin, 7 ml DMF vào bình cầu dung tích 100 ml lắc đều.
Thêm vào đ 0,03 mol alkyl halide và 0,042 mol K
2
CO
3
. Chiếu xạ trong lò vi sóng ở 180W. Để
nguội và rót hỗn hợp phản ứng vào 200 ml hỗn hợp nước đá kết hợp với khuấy mạnh xuất hiện
tinh thể. Lọc, rửa 2 lần bằng nước lạnh qua bộ lọc hút chân không thu sản phẩm N-alkylisatin.
2.2.1. Tổng hợp N-methylisatin (3a)
N
H
O
O
+

CH
3
I
K
2
CO
3
DMF
N
O
O
CH
3

Cho 4,41 gam isatin, 7ml DMF vào bình cầu dung tích 100ml lắc đều. Thêm vào đ 2,4
ml CH
3
I và 6,20 gam K
2
CO
3
. Thời gian chiếu xạ 2 phút. Lọc, rửa bằng nước lạnh qua bộ lọc hút
chân không thu được 4,06 gam N-methylisatin (84%) có nhiệt độ nóng chảy t
nc
= 130-131C.
Theo tài liệu [31] 129-130C.
2.2.2. Tổng hợp N-ethylisatin (3b)
N
H
O

O
+
C
2
H
5
Br
K
2
CO
3
DMF
N
O
O
CH
2
CH
3

Cho 4,41 gam isatin, 7ml DMF vào bình cầu dung tích 100ml lắc đều. Thêm vào đ 2,4
ml C
2
H
5
Br và 6,20 gam K
2
CO
3
. Thời gian chiếu xạ 3 phút. Lọc, rửa bằng nước lạnh qua bộ lọc

hút chân không thu được 4,09 gam N-ethylisatin (78%) có nhiệt độ nóng chảy t
nc
= 84-86C.
Theo tài liệu [31] 86-87C.
2.2.3. Tổng hợp N-n-propylisatin (3c)
N
H
O
O
+
K
2
CO
3
DMF
N
O
O
CH
2
CH
2
CH
3
CH
3
CH
2
CH
2

Br

Thời gian chiếu xạ 3 phút. Từ 0,03 mol chất đầu sau phản ứng lọc, rửa bằng nước lạnh
qua bộ lọc hút chân không thu được 4,25 gam N-n-propylisatin (75%) có nhiệt độ nóng chảy t
nc

8

= 74-76C.
2.2.4. Tổng hợp N-i-propylisatin (3d)
N
H
O
O
+
K
2
CO
3
DMF
N
O
O
CH CH
3
CH
3
CH
3
CH CH

3
Br

Thời gian chiếu xạ 6 phút. Từ 0,03 mol chất đầu sau phản ứng lọc, rửa bằng nước lạnh
qua bộ lọc hút chân không thu được 0,58 gam N-i-propylisatin (10%) có nhiệt độ nóng chảy t
nc
=
76-77C.
2.2.5. Tổng hợp N-n-butylisatin (3e)
N
H
O
O
+
K
2
CO
3
DMF
N
O
O
CH
2
CH
2
CH
2
CH
3

CH
3
CH
2
CH
2
CH
2
Br

Thời gian chiếu xạ 4 phút. Từ 0,03 mol chất đầu sau phản ứng lọc, rửa bằng nước lạnh
qua bộ lọc hút chân không thu được 3,86 gam N-n-butylisatin (63%) có nhiệt độ nóng chảy t
nc
=
36-38C. Tài liệu [31] 36-37C.
2.2.6. Tổng hợp N-i-butylisatin (3f)
N
H
O
O
+
K
2
CO
3
DMF
N
O
O
CH

2
CH
CH
3
CH
3
CH
3
CH CH
2
Br
CH
3

Thời gian chiếu xạ 5 phút. Từ 0,03 mol chất đầu sau phản ứng lọc, rửa bằng nước lạnh
qua bộ lọc hút chân không thu được 0,49 gam N-i-butylisatin (8%) có nhiệt độ nóng chảy t
nc
=
88-89C.
2.2.7. Tổng hợp N-allylisatin (3g)
N
H
O
O
+
K
2
CO
3
DMF

N
O
O
CH
2
CH CH
2
CH
2
CH CH
2
Cl

9

Thời gian chiếu xạ 2 phút. Từ 0,03 mol chất đầu sau phản ứng lọc, rửa bằng
nước lạnh qua bộ lọc hút chân không thu được 5,05 gam N-allylisatin (90%) có nhiệt độ nóng
chảy t
nc
= 92-93C.
2.2.8. Tổng hợp N-benzylisatin (3h)
N
H
O
O
+
K
2
CO
3

DMF
N
O
O
CH
2
CH
2
Cl

Thời gian chiếu xạ 3 phút. Từ 0,03 mol chất đầu sau phản ứng lọc, rửa bằng nước lạnh
qua bộ lọc hút chân không thu được 7,03 gam N-benzylisatin (99%) có nhiệt độ nóng chảy t
nc
=
128-130C. Theo tài liệu [31] 130-132C.
2.2.9. Tổng hợp N-phenethylisatin (3i)
N
H
O
O
+
K
2
CO
3
DMF
N
O
O
CH

2
CH
2
CH
2
CH
2
Br

Thời gian chiếu xạ là 4 phút. Từ 0,03 mol chất đầu sau phản ứng lọc, rửa bằng nước lạnh
qua bộ lọc hút chân không thu được 6,84 gam N-phenethylisatin, hiệu suất 93% có nhiệt độ nóng
chảy t
nc
= 102-105C.
2.3. TỔNG HỢP MỘT SỐ N-ALKYLISATIN 4-(2,3,4,6-tetra-O-ACETYL-

-D-
GLUCOPYRANOSYL)THIOSEMICARBAZON (4a-i)
Quy trình chung: Cho 2 mmol 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-

-D-glucopyranosyl)
thiosemicarbazid, 3-5 ml ethanol vào bình cầu dung tích 100 ml lắc đều. Thêm vào đ 2 mmol
N-alkylisatin và 0,1 ml axit acetic băng. Chiếu xạ trong lò vi sóng ở 600W. Để nguội và rót vào
cốc thấy xuất hiện tinh thể. Lọc, kết tinh lại trong hỗn hợp ethanol : toluen (v/v 6:1).
2.3.1. Tổng hợp N-methylisatin 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-

-D-glucopyranosyl)
thiosemicarbazon (4a)
10

O
OAc
NH
AcO
AcO
OAc
C
S
NH NH
2
+
N
O
O
CH
3
C
2
H
5
OH
CH
3
COOH

O
OAc
NH
AcO

AcO
OAc
C
S
NH
N
N
O
CH
3
(4a)

Tiến hành phản ứng với lượng 0,84 gam 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-

-D-
glucopyranosyl)thiosemicarbazid và 0,33 gam N-methylisatin. Thực hiện phản ứng trong lò vi
sóng ở 600W trong thời gian 5 phút. Sau phản ứng thu được 0,92 gam sản phẩm đạt hiệu suất
76%. Nhiệt độ nóng chảy đo được là 208-209
o
C.
2.3.2. Tổng hợp N-ethylisatin 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-

-D-glucopyranosyl) thiosemicarbazon
(4b)
O
OAc
NH
AcO
AcO
OAc

C
S
NH NH
2
+
N
O
O
C
2
H
5
C
2
H
5
OH
CH
3
COOH
O
OAc
NH
AcO
AcO
OAc
C
S
NH
N

N
O
C
2
H
5
(4b)

Phản ứng được thực hiện trong lò vi sóng ở 600W, thời gian phản ứng là 6 phút. Với
lượng đẳng mol ban đầu là 2 mmol thì sau phản ứng thu được 1,16 gam. Hiệu suất phản ứng là
89% và điểm nóng chảy đo được là 152C-153C.
11

2.3.3. Tổng hợp N-n-propylisatin 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-

-D-glucopyranosyl)
thiosemicarbazon (4c)
O
OAc
NH
AcO
AcO
OAc
C
S
NH NH
2
+
N
O

O
n_C
3
H
7
C
2
H
5
OH
CH
3
COOH

O
OAc
NH
AcO
AcO
OAc
C
S
NH
N
N
O
n_C
3
H
7

(4c)

Tiến hành phản ứng với lượng 0,84 gam 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-

-D-
glucopyranosyl)thiosemicarbazid và 0,38 gam N-n-propylisatin. Thực hiện phản ứng trong lò vi
sóng ở 600W trong thời gian 13 phút. Sau phản ứng thu được 0,89 gam sản phẩm đạt hiệu suất
75%. Nhiệt độ nóng chảy đo được là 187-189
o
C.
2.3.4. Tổng hợp N-i-propylisatin 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-

-D-glucopyranosyl)
thiosemicarbazon (4d)
O
OAc
NH
AcO
AcO
OAc
C
S
NH
NH
2
+
N
O
O
i_C

3
H
7
C
2
H
5
OH
CH
3
COOH
O
OAc
NH
AcO
AcO
OAc
C
S
NH N
N
O
i_C
3
H
7
(4d)

Tiến hành phản ứng với lượng 0,84 gam 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-


-D-
glucopyranosyl)thiosemicarbazid và 0,38 gam N-i-propylisatin. Thực hiện phản ứng trong lò vi
12

sóng ở 600W trong thời gian 13 phút. Sau phản ứng thu được 0,83 gam sản phẩm đạt hiệu suất
70%. Nhiệt độ nóng chảy đo được là 207-209
o
C.
2.3.5. Tổng hợp N-n-butylisatin 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-

-D-glucopyranosyl)
thiosemicarbazon (4e)
O
OAc
NH
AcO
AcO
OAc
C
S
NH
NH
2
+
N
O
O
n_C
4
H

9
C
2
H
5
OH
CH
3
COOH

O
OAc
NH
AcO
AcO
OAc
C
S
NH
N
N
O
n_C
4
H
9
(4e)

Tiến hành phản ứng với lượng 0,84 gam 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-


-D-
glucopyranosyl)thiosemicarbazid và 0,41 gam N-n-butylisatin. Thực hiện phản ứng trong lò vi
sóng ở 600W trong thời gian 15 phút. Sau phản ứng thu được 1,05 gam sản phẩm đạt hiệu suất
87%. Nhiệt độ nóng chảy đo được là 186-189
o
C.
2.3.6. Tổng hợp N-i-butylisatin 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl--D-glucopyranosyl)
thiosemicarbazon (4f)
O
OAc
NH
AcO
AcO
OAc
C
S
NH
NH
2
+
N
O
O
CH
2
CH CH
3
CH
3
C

2
H
5
OH
CH
3
COOH
O
OAc
NH
AcO
AcO
OAc
C
S
NH
N
N
O
CH
2
CH CH
3
CH
3
(4f)

13

Phản ứng được thực hiện trong lò vi sóng ở 600W, thời gian phản ứng là 15 phút. Với

lượng đẳng mol ban đầu là 2 mmol thì sau phản ứng thu được 1,04 gam. Hiệu suất phản ứng là
86% và điểm nóng chảy đo được là 190C-193C.
2.3.7. Tổng hợp N-allylisatin 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-

-D-glucopyranosyl)thiosemicarbazon
(4g)
O
OAc
NH
AcO
AcO
OAc
C
S
NH
NH
2
+
N
O
O
CH
2
CH CH
2
C
2
H
5
OH

CH
3
COOH

O
OAc
NH
AcO
AcO
OAc
C
S
NH
N
N
O
CH
2
CH CH
2
(4g)

Phản ứng được thực hiện trong lò vi sóng ở 600W, thời gian phản ứng là 20 phút. Với
lượng đẳng mol ban đầu là 2 mmol thì sau phản ứng thu được 1,04 gam. Hiệu suất phản ứng là
88% và điểm nóng chảy đo được là 150C-154C.
2.3.8. Tổng hợp N-benzylisatin 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-

-D-glucopyranosyl)
thiosemicarbazon (4h)
O

OAc
NH
AcO
AcO
OAc
C
S
NH
NH
2
+
N
O
O
CH
2
C
2
H
5
OH
CH
3
COOH
O
OAc
NH
AcO
AcO
OAc

C
S
NH
N
N
O
CH
2
(4h)

14

Tiến hành phản ứng với lượng 0,84 gam 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-

-D-
glucopyranosyl)thiosemicarbazid và 0,48 gam N-benzylisatin. Thực hiện phản ứng trong lò vi
sóng ở 600W trong thời gian 15 phút. Sau phản ứng thu được 1,20 gam đạt hiệu suất 94% và
điểm nóng chảy đo được là 195-196C.
2.3.9. Tổng hợp N-phenethylisatin 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-

-D-glucopyranosyl)
thiosemicarbazon (4i)

O
OAc
NH
AcO
AcO
OAc
C

S
NH
NH
2
+
N
O
O
CH
2
C
2
H
5
OH
CH
3
COOH

O
OAc
NH
AcO
AcO
OAc
C
S
NH
N
N

O
C
2
H
5
(4i)

Tiến hành phản ứng với lượng 0,84 gam 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-

-D-
glucopyranosyl)thiosemicarbazid và 0,50 gam N-phenethylisatin. Thực hiện phản ứng trong lò vi
sóng ở 600W trong thời gian 9 phút. Sau phản ứng thu được 1,34 gam đạt hiệu suất 96% và điểm
nóng chảy đo được là 200-203C.
2.4. TỔNG HỢP MỘT SỐ BASE MANNICH CỦA ISATIN(2,3,4,6-TETRA-O-ACETYL-

-DGLUCOTOPYRANOSYL)THIOSEMICARBAZON
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát việc tổng hợp các hợp chất base Mannich của isatin(tetra-
O-acetyl-β-D-glucopyranosyl)thiosemicarbazon với một số công việc sau:
1. Tổng hợp insatin (tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl)thiosemicarbazon .
2. Tổng hợp các base Mannich của isatin(tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl) thiosemicarbazon
với một số amin là morpholine, piperydine,
15

Các phản ứng tổng hợp dẫn xuất 2,3,4,6-(tetra-O-acetyl-β-D-gluc°Ctopyranosyl)
thiosemicarbazon của isatin được thực hiện bằng phương pháp tổng hợp dùng lò vi sóng.

Sơ đồ phản ứng chung:

* Tổng hợp insatin (2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl) thiosemicarbazon .
16

Cho vào bình cầu 100 ml hỗn hợp gồm 0,84g (0,002 mol) 2,3,4,6-tetra-O-acetyl--D-
glucopyranosyl thiosemicarbazid,5 ml ethanol tuyệt đôi, 0,29g (0,002 mol) isatin và 2-3 giọt acid
axetic băng làm xúc tác.Lắc đều.Thực hiện phản ứng trong lò vi sóng ở 600W trong thời gian 10
phút.Sản phẩm thu được có màu vàng cam không tan trong ethanol tuyệt đối ,lọc hút rửa bằng
ethanol 96, kết tinh lại sản phẩm thu được trong ethanol 96% và toluen tỉ lệ 1:1.Sản phẩm cuối
cùng có màu vàng,khối lượng thu được 0,89 g (82%). Đnc :225-230
0
C.
** Tổng hợp một số base Mannich của insatin (2,3,4,6-tetra-O- acetyl-

-D-glucopyranosyl)
thiosemicarbazon

Quy trình chung: Cho vào bình cầu 100 ml 0,55 g(0,001mol)(2,3,4,6-tetra-O-acetyl--D-
glucopyranosyl)thiosemicarbazon của isatin, 5 ml ethanol,1ml HCHO 37-40% và 2 mmol một
amin bậc 2 (HCHO và amin bậc 2 lấy dư) và 3 ml dioxane . Hỗn hợp được đun hồi lưu nhẹ trong
5 giờ. Làm nguội đến nhiệt độ phòng, rồi bổ xung thêm 0,8ml HCHO 37-40% , khuấy ở nhiệt độ
17

phòng trong 24giờ. Sau đ lọc kết tủa tách ra, lấy kết tủa thu được đem kết tinh lại trong hỗn hợp
ethanol 96% và toluen tỉ lệ 1:1.
2.4.1. Tổng hợp 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-

-D-glucopyranosyl thiosemicarbazon củaN-
(morpholino)methylenisatin:
Cho vào bình cầu 100 ml 0,55 g (0,001 mol) 2,3,4,6-tetra-O-acetyl--D-glucopyranosyl
thiosemicarbazon isatin, 5 ml ethanol, 0,3 ml HCHO 37-40% , 0,3 ml Morpholine và 3 ml
dioxane . Hỗn hợp được đun hồi lưu nhẹ trong 5giờ và khuấy ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Sau

đ lọc kết tủa tách ra, lấy kết tủa thu được đem kết tinh lại trong hỗn hợp ethanol 96% và toluen
tỉ lệ 1:1. Phản ứng được thực hiện với amin bậc 2 là morpholin. Với lượng dư HCHO và
morpholine thì sau phản ứng thu được 0,43 g (hiệu suất 62,6 %) Đnc: 212-214
0
C

2.4.2. Tổng hợp 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-

-D-glucopyranosyl thiosemicarbazon củaN-
(piperidino)methylenisatin.
18


Phản ứng được thực hiện với amin bậc 2 là piperidin. Với lượng dư HCHO và piperidin
thì sau phản ứng thu được 0,27 g (hiệu suất 41,7 %).
2.4.3. Tổng hợp 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-

-D-glucopyranosyl thiosemicarbazon củaN-(1 metyl-
piperazino)methylenisatin.

Phản ứng được thực hiện với amin bậc 2 là 1-metyl-piperazine. Với lượng dư HCHO và
1-metyl-piperazine thì sau phản ứng thu được 0,238 g (hiệu suất 36,3 %), Đnc : 215-217
0
C
2.4.4. Tổng hợp2,3,4,6-tetra-O-acetyl-

-D-glucopyranosyl thiosemicarbazon củaN-
(diethylaminno) methylenisatin.
19

Cho vào bình cầu 100 ml 0,55 g (0,001 mol) 2,3,4,6-tetra-O-acetyl--D-gluco pyranosyl
thiosemicarbazon isatin, 5 ml ethanol, 0,3 ml HCHO 37-40% , 0,3 ml Diethylamin và 7-10 ml
dioxane . Hỗn hợp được đun hồi lưu nhẹ trong 5giờ và khuấy ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Sau
đ lọc kết tủa tách ra, lấy kết tủa thu được đem kết tinh lại trong hỗn hợp ethanol 96% và toluen
tỉ lệ 1:1. Khối lượng sản phẩm thu được 0,31g (hiệu suất 48,80%). Đnc :239- 240
0
C.
2.4.5. Tổng hợp 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-

-D-glucopyranosyl thiosemicarbazon củaN-
(triaminotriazino)methylenisatin

NH
C
NH
S
O
OAc
H
H
H
H
AcO
AcO
OAc
N
H
N
O

C
2
H
5
NH
C
NH
S
O
OAc
H
H
H
H
AcO
OAc
N
N
O
CH
2
N
C
2
H
5
HCHO
(C
2
H

5
)
2
NH
20

Phản ứng được thực hiện với amin bậc 1 là triaminotriazine. Khi phản ứng khuấy có màu vàng
chanh. Với lượng dư HCHO và triaminotriazin thì sau phản ứng thu được 0,45 g (hiệu suất 68,9
%).
2.4.6. Tổng hợp 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-

-D-glucopyranosyl thiosemicarbazon củaN-(N-metyl-
anilino)methylenisatin

Phản ứng được thực hiện với amin bậc 2 là N- metyl-aniline. Với lượng dư HCHO và metyl-
aniline thì sau phản ứng thu được 0,364 g (hiệu suất 54,62 %)
2.4.7. Tổng hợp 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-

-D-glucopyranosyl thiosemicarbazon củaN-
(paranitroanilino)methylenisatin

21

Phản ứng được thực hiện với amin bậc 2 là paranitro aniline. Với lượng dư HCHO và
paranitro aniline thì sau phản ứng thu được 0,14 g (hiệu suất 20 %)

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TỔNG HỢP TETRA-O-ACETYL-β-D-GLUCOPYRANOSYL ISOTHIOCYANAT
Các alkyl hoặc acyl isothiocyanat được tổng hợp bằng bằng phản ứng của alkyl halide
hoặc acyl cloride tương ứng với KSCN hoặc muối thiocyanat của kim loại nặng. Phản ứng xảy ra

trong điều kiện phản ứng êm dịu và đạt hiệu suất cao.
Dựa trên cơ sở đ, trong luận văn này, để tổng hợp tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl
isothiocyanat chúng tôi đã tiến hành phản ứng chuyển hoá dẫn xuất tetra-O-acetyl-α-D-
glucopyranosyl bromide với muối chì thiocyanat trong dung môi toluen khan. Phản ứng chạy
theo cơ chế phản ứng thế nucleophil lưỡng phân tử (S
N
2). Phản ứng tổng hợp tetra-O-acetyl-β-D-
glucopyranosyl isothiocyanat tiến hành tương đối dễ dàng, hiệu suất phản ứng 80%. Cấu trúc của
sản phẩm được xác nhận bằng điểm chảy và ghi phổ hồng ngoại.

3.2. VỀ TỔNG HỢP (2,3,4,6-TETRA-O-ACETYL-

-D-
GLUCOPYRANOSYL)THIOSEMICARBAZID
Đây là giai đoạn tiếp theo của quá trình tổng hợp, là giai đoạn tạo ra hợp chất
thiosemicarbazid từ hợp chất tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl isothiocyanat . Hợp chất này
được dùng để tiến hành hàng loạt các phản ứng ngưng tụ với isatin thế ở giai đoạn sau
Trong phổ hồng ngoại của hợp chất này xuất hiện băng sng hấp thụ đặc trưng cho dao
động hoá trị của nhóm C=O (ester) ở 1752 cm
–1
, đồng thời băng sng hấp thụ mạnh ở 1242 cm
–
1
và ở 1043 cm
–1
đặc trưng cho dao động hoá trị và biến dạng của nhóm liên kết C–O–C (ester).
Băng sng hấp thụ mạnh và rộng xuất hiện ở 2026 cm
–1
đặc trưng cho dao động hoá trị đối xứng
của liên kết N=C=S đã không còn và thay vào đ là băng sng ở vùng 3322 cm

–1
và 3129 cm
–1

xuất hiện đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm NH
2
và NH. Băng sng hấp thụ ở 1090 cm
–1

đặc trưng cho dao động hoá trị của liên kết C=S (Hình 3.2).
Trong phổ
1
H NMR của hợp chất này xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng của các proton
của phần gốc đường. Chẳng hạn, proton H
1
ở =5,82 ppm, proton H
2
ở =5,08 ppm, proton H
3
ở
=5,36 ppm, proton H
4
ở =4,92 ppm, proton H
5
ở =3,97 ppm, và các proton H-6a và H-6b ở
=4,16 và 3,97 ppm. Các proton ở nhóm thiosemicarbazid NHCSNHNH
2
có các tín hiệu
22

proton của các nhóm NH và NH
2
ở =9,25; 8,18 và 4,59 ppm tương ứng (Hình 3.3).
Các số liệu phổ IR và
1
H NMR của sản phẩm chứng tỏ hợp chất tetra-O-acetyl-β-D-
glucopyranosyl thiosemicacbazi được chuyển hóa thành công từ tetra-O-acetyl-β-D-
glucopyranosyl isothiocyanat.
3.3. TỔNG HỢP CÁC N-ALKYLISATIN
Bảng 3.1. Kết quả tổng hợp của một số N-alkylisatin (3a-i)
STT
R
Tác nhân

Phút/W*
(%)
Đ
nc
(C)
TN
TL
[14,31]
TN
TL
[14,31]
3a
CH
3

CH

3
I
3/180
88
95
130-
131
129-130
3b
C
2
H
5

C
2
H
5
Br
4/180
87
90
84-86
86-87
3c
n-C
3
H
7

n-C
3
H
7
Br
4/180
75
-
74-76
-
3d
i-C
3
H
7

i-C
3
H
7
Br
3/180
10
-
76-77
-
3e
n-C
4
H

9

n-C
4
H
9
Br
4/180
63
-
36-38
36-37
3f
i-C
4
H
9

i-C
4
H
9
Br
4/180
8
-
88-89
-
3g
C

3
H
5

C
3
H
5
Br
3/180
90
-
92-93
-
3h
CH
2
C
6
H
5

CH
2
C
6
H
5
Br
3/180

99
-
128-
130
130-132
3i
CH
2
CH
2
C
6
H
5

C
6
H
5
CH
2
CH
2
Br
4/180
93
-
102-
105
-

* W: Công suất của lò vi sóng.

3.3. TỔNG HỢP N-ALKYLISATIN (2,3,4,6-TETRA-O-ACETYL-β-D-
GLUCOPYRANOSYL)THIOSEMICARBAZON
Chúng tôi đã thực hiện phản ứng ngưng tụ của 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-

-D-
glucopyranosyl)thiosemicarbazid với 9 isatin thế khác nhau trong dung môi ethanol khan và
dùng axit acetic băng làm xúc tác. Phản ứng được thực hiện trong lò vi sóng với thời gian từ 5-15
23

phút, tùy vào từng nhóm thế.
3.4. VỀ TỔNG HỢP CÁC BASE MANNICH CỦA INSATIN (2,3,4,6-TETRA-O-
ACETYL-

-D-GLUCOTO-PYRANOSYL)THIOSEMICARBAZID
Hiệu suất, nhiệt độ nóng chảy và màu sắc 7 base Mannich của isatin (2,3,4,6-tetra-O-
acetyl--D-glucopyranosyl)thiosemicarbazon ứng với mỗi amin bậc 2 khác nhau tổng hợp được
được trình bày trong Bảng 3.6:
Để chứng minh cấu trúc của sản phẩm base mannich đã tổng hợp được, chúng tôi đã ghi
được phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân
1
H-NMR,
13
C-NMR kết hợp với kỹ thuật phổ
2 chiều tương tác gần HSQC, tương tác xa HMBC và khối phổ.
Phổ IR cho biết sự có mặt của các nhóm chức đặc trưng trong phân tử. Với các sản phẩm
base Mannich được tổng hợp từ phản ứng của isatin (2,3,4,6-tetra-O-acetyl--D-
glucopyranosyl)thiosemicarbazon với andehit fomic và các dẫn xuất amin bậc 2 cho băng sng
hấp thụ ở 3232 cm

-1
và 3354 cm
-1
đặc trưng cho dao động hóa trị của NH, băng sng hấp thụ
trong khoảng 2867–2960 cm
-1
đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết C-H của các nhóm
ankyl, băng sng hập thụ ở 1746 cm
-1
và 1230 cm
-1
đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm
C=O (este) và C-O-C (este). Ngoài ra còn c băng sng hấp thụ ở 1373 cm
-1
đặc trưng cho dao
động hóa trị của nhm C=S, băng sng ở 1517–1600 cm
-1
đặc trưng cho dao động hóa trị của
liên kết CH trong vòng thơm. Kết quả phổ IR của các dẫn xuất base Mannich của (2,3,4,6-tetra-
O-acetyl--D-glucopyranosyl)thiosemicarbazon được trình bày trong Bảng 3.7.
* Để nghiên cứu cụ thể về cấu trúc, chúng tôi chọn ra base Mannich với morpholine:
Phổ IR cho biết sự có mặt của các nhóm chức đặc trưng trong phân tử. Với sản phẩm
base Mannich được tổng hợp từ phản ứng của isatin (2,3,4,6-tetra-O-acetyl--D-
glucopyranosyl)thiosemicarbazon với andehit fomic và morpholine cho băng sng hấp thụ ở
3232 cm
-1
và 3354 cm
-1
đặc trưng cho dao động hóa trị của NH, băng sng hấp thụ trong khoảng
2866–2959 cm

-1
đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết C-H của các nhm ankyl, băng sng
hập thụ ở 1746 cm
-1
và 1230 cm
-1
đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm C=O (este) và C-O-
C (este). Ngoài ra còn c băng sng hấp thụ ở 1373 cm
-1
đặc trưng cho dao động hóa trị của
nhm C=S, băng sng ở 1517–1600 cm
-1
đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết CH trong
vòng thơm.

24

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
1
H-NMR và
13
C-NMR cho biết độ chuyển dịch hóa học của
các proton và nguyên tử C13 trong phân tử. Hợp chất base Mannich N-(methylenmorpholine)
isatin (2,3,4,6-tetra-O-acetyl--D-glucopyranosyl) thiosemicarbazon được chọn làm chất đại
diện để phân tích cụ thể cấu trúc. Quy ước hợp chất được đánh dấu như sau:

Trên phổ
1
H-NMR của hợp chất này cho thấy các proton trong vòng đường c độ chuyển
dịch hóa học nằm trong khoảng 4,3–5,9 ppm, các proton của hợp phần indole cho tín hiệu cộng

hưởng ở 6,8–7,9 ppm. Proton H
a
cho douplet ở 9,637 ppm (J
HaH1’
= 8 Hz), proton H
b
cho singlet
ở 12,675 ppm, các proton của nhóm OAc có tín hiệu cộng hưởng trong khoảng 1,9–2,1 ppm
(xem Hình 3.13).
Trên phổ
13
C-NMR cho thấy độ chuyển dịch hóa học của C=S ở 179,599 ppm, các nhóm
C=O (OAc) ở 170,463 ppm – 169,851 ppm. Tín hiệu cộng hưởng của C=O (indole) ở 162,135
ppm. Các nguyên tử C13 trong vòng monosaccarit nằm trong khoảng 82,787 ppm – 61,804 ppm.
Độ chuyển dịch hóa học của các C13 trong vòng thơm nằm trong khoảng 132,764 ppm –
111,709 ppm. Nhóm C=N cho tín hiệu cộng hưởng ở 144,423 ppm. Các nguyên tử C13 của
nhm OAc c độ chuyển dịch hóa học nằm trong khoảng 20,992 ppm – 20,824 ppm. C10 cho tín
hiệu cộng hưởng ở 66,495 ppm. Các nguyên tử C13 của morpholine cho 2 cặp tín hiệu cộng
hưởng ở 51,035 ppm và 69,106 ppm (xem Hình 3.14)

.
Ngoài ra hợp chất này còn được ghi phổ 2D-NMR, phổ tương tác gần HSQC cho biết sự
tương tác của nguyên tử C13 và proton liên kết trực tiếp với C13 đ còn phổ tương tác xa
HMBC cho biết sự tương tác của proton và nguyên tử C13 ở cách xa nó. Kết quả phân tích cho
thấy sự tương tác hoàn toàn phù hợp với cấu trúc sự kiến của sản phẩm

3.5. THĂM DÒ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC N-ALKYLISATIN 4-(2,3,4,6-tetra-O-
O
H
OAc

H
H
H
H
NH
AcO
AcO
OAc
C
S
NH N
N
O
N O
a
b
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14

15
16
1'
2'
3'
4'
5'
6'
25

ACETYL-β-D-GLUCOPYRANOSYL)THIOSEMICARBAZON
Bảng 3.8. Kết quả thăm dò hoạt tính kháng vi sinh vật của các N-alkylisatin 4-(2,3,4,6-tetra-
O-acetyl-

-D-glucopyranosyl)thiosemicarbazon (4a-i)
STT
R
Đ
Đ
ư
ư
ờ
ờ
n
n
g
g


k

k
í
í
n
n
h
h


v
v
ò
ò
n
n
g
g


v
v
ô
ô


k
k
h
h
u

u
ẩ
ẩ
n
n


(
(
m
m
m
m
)
)


E.coli
S.aureus
C.albican
50μL
100μL
150μL
50μL
100μL
150μL
50μL
100μL
150μL
4a

CH
3

0
17
30
0
0
15
0
20
32
4b
C
2
H
5

0
18
28
0
0
0
0
18
30
4f
i-C
4

H
9

0
16
30
0
0
18
0
17
30
4g
C
3
H
5

0
19
30
0
0
10
0
15
28
4h
C
6

H
5
CH
2

0
18
29
0
0
14
0
21
32

Như vậy: Khi thay đổi lượng sản phẩm từ 100L sang 150L, một số sản phẩm có sự
thay đổi về hoạt tính sinh học với đường kính vòng vô khuẩn tăng lên đáng kể. Nhưng cũng c
sản phẩm thì sự thay đổi là ít hoặc không đáng kể. Nhng sản phẩm này có hoạt tính sinh học
mạnh hơn.
3.5.2. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH
a) Chuẩn bị mẫu.
Các dẫn xuất N-ankylinsatin (2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl)
thiosemicarbazon và chất chuẩn resveratrol được pha trong etanol thành các dung dịch có nồng
độ 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0; và 12,0 mM. DPPH được pha trong ethanol thành dung dịch có nồng độ
150 μM bằng cách hòa tan 5,9 mg DPPH trong 100 ml ethanol.
b) Phương pháp tiến hành