Nghiên cứu sản xuất thuốc lipidan điều trị rối loạn lipid máu

BỘ Y TẾ




BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ



NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT THUỐC
LIPIDAN ĐIỀU TRỊ RỐI LOẠN LIPID MÁU





Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Phạm Vũ Khánh
Cơ quan chủ trì đề tài: Học viện Y - Dược học cổ truyền Việt Nam












8444

HÀ NỘI - 2011


BỘ Y TẾ




BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ


NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT THUỐC LIPIDAN
ĐIỀU TRỊ RỐI LOẠN LIPID MÁU


Chủ nhiệm đề tài
Cơ quan chủ trì đề tài
Học viện YDHCT Việt Nam
PGS TS Phạm Vũ Khánh

HÀ NỘI - 2011

CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ALT aspartate amino transferase
AST alanin amino transferase
BC bạch cầu
BCTT bạch cầu trung tính
CCT chuột cống trắng
CNT chuột nhắt trắng
dd dung dịch
DĐVN III Dược điển Việt Nam lần xuất bản thứ 3
DĐVN IV Dược điển Việt Nam lần xuất bản thứ 4
Hb hemoglobin
HC hồng cầu
Hct hematocrit
hd hỗn dịch
HDL-C high density lipoprotein cholesterol
KQ kết quả
LDL-C low density lipoprotein cholesterol
LPD LIPIDAN
MN micronucleus (vi nhân)
MN/PCE tỷ lệ vi nhân/tế bào hồng cầu đa sắc
NC nghiên cứu
NCE normochromatic erythrocyte: hồ
ng cầu đơn sắc (hồng cầu trưởng thành)
PCE polychromatic erythrocyte: hồng cầu đa sắc (hồng cầu non)
PCE/NCE tỷ lệ hồng cầu đa sắc/hồng cầu đơn sắc/1000 tế bào/chuột nhắt trắng
PL phụ lục

STT số thứ tự
TC tiểu cầu
TLCT trọng lượng cơ thể
TLTB trọng lượng trung bình
TN thí nghiệm
YHCT y học cổ truyền
YHHĐ y học hi
ện đại

1
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 3

CHƯƠNG 1 4
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1. Sự chuyển hóa và tác dụng của lipid trong cơ thể 4
2. Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh rối loạn lipid máu 5
3. Tình hình nghiên cứu bào chế thuốc điều trị hội chứng rối loạn lipid
máu 6

3.1. Ngoài nước 6
3.2. Trong nước 8
4. Quan niệm của y học cổ truyền về hội chứng rối loạn lipid máu 10
4.1. Nguyên tắc điều trị chứng đàm ẩm 10
4.2. Phương pháp điều trị đàm 10
5. Về thuốc LIPIDAN 11
5.1. Trần bì 11
5.2. Bán hạ nam 12
5.3. Bạch linh 12
5.4. Mộc hương nam 12

5.5. Hậu phác nam 13
5.6. Ngũ gia bì chân chim 13
5.7. Sơn tra 13
5.8. Xa tiền tử 14
5.9. Sinh khương 14
CHƯƠNG 2 15
NGUYÊN LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
1. Nguyên liệu nghiên cứu 15
1.1. Công thức bài thuốc LIPIDAN . 15
1.2. Hỗn dịch và dung dịch sử dụng trong nghiên cứu 15
2. Đối tượng nghiên cứu 16
3. Phương pháp nghiên cứu 16
3.1. Nghiên cứu bào chế viên nang LIPIDAN 16
3.2. Đánh giá các chỉ số kỹ thuật của viên nang LIPIDAN 17
3.3. Theo dõi độ ổn định của thuốc 20
3.4. Xác định độ an toàn của thuốc 20
3.5. Nghiên cứu tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu trên động vật thí
nghiệm 26

4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 28
4.1. Địa điểm 28
4.2. Thời gian 28
2
5.
Xử lý số liệu 28
6. Cách chọn mẫu, cỡ mẫu 28
6.1. Cách chọn mẫu 28
6.2. Cỡ mẫu 28
7. Các biện pháp khống chế sai số 29
8. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 29

CHƯƠNG 3 30
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30
1. Quy trình sản xuất viên nang LIPIDAN 30
1.1. Tiêu chuẩn nguyên liệu 30
1.2. Sơ chế nguyên liệu 30
1.3. Phương pháp bào chế cao khô LIPIDAN 31
1.4. Quy trình bào chế viên nang LIPIDAN 34
1.5. Xây dựng tiêu chuẩn thành phẩm 37
1.6. Theo dõi độ ổn định của thuốc 37
2. Độ an toàn của thuốc 38
2.1. Độc tính cấp 38
2.2. Độc tính bán cấp 39
2.3. Ảnh hưởng lâu dài của thuốc trên di truyền và sinh sản 46
3. Tác dụng của thuốc LIPIDAN trên thực nghiệm. 49
3.1. Tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu của LIPIDAN theo cơ chế
ngoại sinh 49

3.2. Tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu của LIPIDAN theo cơ chế nội
sinh 52

CHƯƠNG 4 54
BÀN LUẬN 54
1. Nghiên cứu bào chế thuốc LIPIDAN 54
1.1. Kiểm nghiệm thuốc nguyên liệu, bán thành phẩm. 54
1.2. Nghiên cứu bào chế thuốc LIPIDAN 54
2. Độc tính của thuốc LIPIDAN 55
2.1. Độc tính cấp và độc tính bán cấp 55
2.2. Ảnh hưởng lâu dài của thuốc trên di truyền và sinh sản 56
3. Tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu của thuốc LIPIDAN 57
CHƯƠNG 5 58

KẾT LUẬN 58
KIẾN NGHỊ 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

3
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hội chứng rối loạn chuyển hóa lipid máu là một trong những tình trạng
thường gặp ở các nước phát triển, có xu hướng tăng ngày càng nhanh ở các nước
đang phát triển. Đây là một trong những yếu tố nguy cơ quan trọng trong việc
hình thành bệnh vữa xơ động mạch. Ở nước ta, bệnh vữa xơ động mạch - với
các biến chứng như suy động mạch vành, đột tử, nhồi máu cơ
tim, nhồi máu não
trước đây ít gặp - đang có xu hướng tăng nhanh theo nhịp độ phát triển của xã
hội, dự báo sẽ trở thành một bệnh đáng lo ngại cho sức khỏe của người cao tuổi.
Ngoài bệnh vữa xơ động mạch, rối loạn lipid máu cũng được coi là yếu tố nguy
cơ quan trọng của một số bệnh tim mạch khác như: tăng huyết áp, đái tháo
đường [1],[2],[9]. Theo tài liệu c
ủa Tổ chức Y tế thế giới, ở các nước phát triển,
tử vong nhiều nhất là do bệnh tim (32%) mà chủ yếu là do vữa xơ động mạch,
rồi đến tai biến mạch máu não (13%), nhiều hơn hẳn các loại bệnh khác [9]. Giải
quyết rối loạn chuyển hóa lipid máu đã trở thành một mục tiêu trong các biện
pháp dự phòng tiên phát và thứ phát của các bệnh đó.
Công thức thuốc LIPIDAN được thành lập dựa trên c
ơ sở lý luận của y học
cổ truyền. Đây là bài thuốc kinh nghiệm đã được sử dụng dưới dạng thuốc sắc,
dùng để điều trị hội chứng rối loạn lipid máu trong nhiều năm cho kết quả khả
quan.
Để có thể sản xuất các chế phẩm thuốc cổ truyền trên dây chuyền công
nghiệp đạt tiêu chuẩn chất lượng theo quy định của Bộ
Y tế; tạo điều kiện dễ

dàng trong việc bảo quản và sử dụng thuốc, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề
tài với mục tiêu:
1. Xây dựng quy trình sản xuất thuốc ở quy mô pilot.
2. Xây dựng tiêu chuẩn của thuốc LIPIDAN.

3. Thử tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu của thuốc trên súc vật thí
nghiệm.

Nội dung nghiên cứu chủ yếu:
- Nghiên cứu quy trình sản xuất thuốc LIPIDAN quy mô pilot.
- Xác định độ an toàn của thuốc (độc tính cấp, bán cấp, ảnh hưởng của
thuốc trên di truyền và sinh sản).
- Thử tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu của thuốc trên súc vật thí
nghiệm.
- Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm (nguyên liệu, bán thành phẩm, thành
phẩm).

4
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Sự chuyển hóa và tác dụng của lipid trong cơ thể
Trong cơ thể, lipid được chuyển hóa theo hai chu trình: ngoại sinh và nội
sinh.
- Chu trình ngoại sinh: lipid sau khi được đưa vào cơ thể qua đường thức
ăn, một phần được tiêu hóa ngay từ tá tràng; tại đây, dưới tác dụng của men
lipase, các acid béo được chuyển thành các dạng tự do, từ đó hấp thu vào cơ thể
theo đường tĩnh mạch cửa để vào gan, tham gia vào chu trình nội sinh. Còn lạ
i,
phần lớn lipid từ thức ăn kết hợp với muối mật thành dạng nhũ tương (gọi là
chylomicron) rồi được hấp thu qua đường bạch mạch ruột để vào tuần hoàn

chung.
- Chu trình nội sinh: đây là chu trình tạo ra phần lớn lượng lipid trong cơ
thể. Tại gan, các sản phẩm chuyển hóa của cơ thể như: acetyl Co-enzym A,
glycerol-3-phosphate sẽ tham gia vào quá trình tổng hợp thành acid béo và
glycerin, từ đó tạo thành lipid trong cơ
thể.
Lipid được hấp thu vào cơ thể qua đường thức ăn và lipid được hình thành từ
con đường nội sinh tại gan đều được đưa vào tuần hoàn chung bằng cách gắn
với các apoprotein để tạo thành lipoprotein tỷ trọng rất thấp (VLDL - Very low
density lipoprotein) mà thành phần chủ yếu là triglycerid.
VLDL theo đường tuần hoàn tới mô mỡ, sau khi trao phần lớn triglycerid cho
mô mỡ, tỷ trọng tăng lên và lần lượt biến thành lipoprotein tỷ trọng trung gian
(IDL - Intermediate density lipoprotein) rồi lipoprotein tỷ trọ
ng thấp (LDL -
Low density lipoprotein) gồm đa số là cholesterol và phospholipid.
Sau khi trao cholesterol cho các tế bào theo nhu cầu, LDL chuyển thành
lipoprotein tỷ trọng cao (HDL - High density lipoprotein). HDL có tác dụng vận
chuyển cholesterol ra khỏi các mô ngoại vi về gan nếu mô thừa chất này [10].
Tác dụng của lipid trong cơ thể:
- Triglycerid được sử dụng vào việc cung cấp năng lượng cho cơ thể.
- Cholesterol, phospholipid và một số ít triglycerid tham gia cấu tạo nên
màng tế bào, màng các bào quan ở bào tương, thực thi một số chức năng trong tế

bào. Cholesterol còn là nguyên liệu ban đầu để tạo vitamin D, hormon sinh dục,
hormon thượng thận và muối mật
Một người được coi là có chỉ số lipid máu bình thường khi:
- Cholesterol: < 5,2mmol/l (200mg/dL)
5
- HDL-C: ≥ 0,9mmol/l (35mg/dL)
- LDL-C: < 3,4mmol/l (130mg/dL)

- Triglycerrid: 1,7mmol/l - 2,3mmol/l (150mg/dL - 200mg/dL) [2], [14],
[15], [24]
2. Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh rối loạn lipid máu
Khi quá trình chuyển hóa lipid theo hai chu trình ngoại sinh và nội sinh diễn
ra bình thường thì sẽ không xảy ra tình trạng rối loạn lipid máu. Tình trạng này
chỉ xảy ra khi các yếu tố tạo nên hai chu trình này bị tác động gây thừa hoặc
thiếu [10]. Các yếu tố đó bao gồm:
- Ăn quá nhiều chất béo bão hòa sẽ trực tiếp làm tăng lipid máu, đồng thời
làm tăng acetyl Co-enzym A (là nguyên liệu để tổng hợp lipid tại gan). Chất béo
bão hòa có trong thức ăn có mỡ, đặc biệt là sữa và các sản phẩm từ sữa, thịt mỡ,
bơ động vật, dầu dừa, dầu cọ, các loại bánh như bích quy, ga tô
- Ăn quá nhiều chất béo không bão hòa và không sử dụng các thức ăn chứa
chất béo bão hòa trong thời gian dài sẽ làm giảm nồng độ cholesterol trong máu.
Cơ chế làm hạ lipid máu của các acid béo không bão hòa hiện nay ch
ưa rõ,
nhưng chất xơ sợi của thức ăn làm acid mật không thể tái hấp thu từ ruột vào
máu; thiếu acid mật, gan sẽ dùng cholesterol tạo acid mật, do đó làm giảm
cholesterol.
- Ít vận động dẫn tới tình trạng béo phì: theo Tổ chức Y tế thế giới, béo phì
là tình trạng tích lũy mỡ quá mức và không bình thường tại một vùng cơ thể hay
toàn thân đến mức ảnh hưởng tới sức khỏe. Tình trạ
ng này gây nên sự tăng lipid
một cách bất thường trong máu.
- Uống rượu, hút thuốc lá cũng là những nguyên nhân gây rối loạn lipid
máu.
- Rối loạn lipid máu thứ phát: đái tháo đường, rối loạn chức năng một số
tuyến nội tiết (tuyến yên, tuyến giáp, tuyến thượng thận ).
+ Đái tháo đường có kèm theo rối loạn lipid máu thường gặp ở người
mắc đái tháo đường typ 2: do lượng glucose được
đưa vào cơ thể quá nhiều,

lượng insulin do tụy bài tiết ra không đủ để đáp ứng cho việc vận chuyển
glucose trong cơ thể, gây nên tình trạng đái tháo đường; đồng thời, glucose được
vận chuyển vào cơ thể quá nhiều sẽ tới gan để tham gia vào quá trình tạo thành
acid béo và triglycerid, từ đó gây rối loạn lipid máu.
+ Rối loạn chức năng một số tuyến nội tiết: một số tuyến n
ội tiết như
tuyến yên, tuyến giáp, tuyến thượng thận bài tiết các hormon (GH, ACTH,
tyrosin, corticoid, adrenalin, noradrenalin) có tác dụng tham gia vào quá trình
6
chuyển hóa lipid trong cơ thể. Sự rối loạn chức năng của các tuyến nội tiết sẽ
gây nên tình trạng rối loạn lipid máu.
- Ngoài ra, tình trạng rối loạn lipd máu còn có tính chất gia đình hoặc liên
quan đến gen di truyền. [2], [4], [14], [15], [24]

3. Tình hình nghiên cứu bào chế thuốc điều trị hội chứng rối loạn lipid
máu
3.1. Ngoài nước
Hiện nay y học hiện đại có nhiều công trình nghiên cứu sản xuất thuốc điều
trị hội chứng rối loạn lipid máu và đã tạo ra được các sản phẩm có tác dụng như:
3.1.1. Resin - bản chất là các nhựa trao đổi ion (Cholestyramin, Cholestipol)
[1], [2], [10], [14], [15], [17], [24]
Một số nghiên cứu tiế
n hành với nhựa trao đổi ion như LRC (Lipid Research
Clinic Coronary Primary Prevention Trial, 1984), CLAS (Cholesterol Lowering
Atherosclerosis Study, 1987), SCOR (San Francisco Specialized Center of
Research, 1990), STARS (St Thomas Atherosclerosis Regression Study, 1992)
đã chứng minh hiệu lực của thuốc.
- Tác dụng: thuốc uống không bị hấp thụ qua niêm mạc ruột, không bị các
men tiêu hoá tác động, có khả năng trao đổi ion Cl
-

với acid mật, làm cho acid
mật ở dạng liên kết không bị hấp thu trở lại mà theo phân để thải ra ngoài; cắt
chu trình ruột - gan của acid mật và làm giảm cholesterol, LDL-C, tăng nhẹ
HDL-C. Thuốc có thể làm tăng triglycerid và VLDL.
- Tác dụng không mong muốn: dễ gây đầy bụng, buồn nôn, táo bón, cản trở
hấp thu các vitamin tan trong lipid và một số thuốc khác (digitalis, thuốc chống
đông máu, hormon tuyến giáp) khi qua ruột.
3.1.2. Acid nicotinic (Dilexpal, Novacyl) [1], [2], [10], [14], [15], [17], [24]
Các nghiên cứu chứng minh tác dụng của thuốc: Coronary Drug Protect
(1975), CLAS (Cholesterol Lowering Atherosclerosis Study, 1987), FATS
(Familial Atherosclerosis Treatment Study, 1990).
- Tác dụng: với liều cao 2 - 6g/ngày, acid nicotinic làm giảm VLDL; giảm
triglycerid do ức chế quá trình tiêu lipid ở tổ chức mỡ; làm giảm lượng acid béo
cần thiết cho gan tổng hợp VLDL; tăng chuyển hoá VLDL, qua đó giảm LDL.
Ngoài ra, thuốc còn làm giảm lipoprotein(a), tăng nhẹ HDL.
- Tác dụng không mong muốn: dễ gây rối loạn tiêu hoá, cảm giác nóng rát
dạ dày, suy thận, tăng nhãn áp.
- Do dùng liều cao và có nhiều tác dụng không mong muốn nên thuốc ít
được dùng ở nước ta hiệ
n nay.
7
3.1.3. Các acid béo không no omega-3 (Maxepa) [1], [2], [10], [14], [15],
[17], [24]
Nghiên cứu DART (Diet and Reinfaction Trial, 1989) dùng chế độ ăn nhiều
cá hoặc Maxepa trong 2 năm thấy giảm 16% tái phát nhồi máu cơ tim, 29% tử
vong so với placebo.
- Tác dụng: các acid béo không no họ omega-3 được chiết xuất từ cá biển,
có tác dụng làm giảm triglycerid và VLDL máu là chính; giảm nhẹ cholesterol,
LDL; tăng nhẹ HDL (hiệu lực chưa bằng Fibrat); làm giảm nguy cơ huyết khối
do tác động đến chuyển hoá của prostaglandin.

- Thuốc ít có tác dụng không mong muốn.
3.1.4. Fibrat [1], [2], [10], [14], [15], [17], [24]
- Clofibrat (Misclerduon, Lipavlon), benzafibrat (Bezalip), fenofibrat
(Lipanthyl), gemfibrozil (Lopid)
- Các nghiên cứu về fibrat: BECAIT (Bezafibrat Coronary Atheroclerosis
Intervention Trial, 1996) với bezafibrat; nghiên cứu của Hahmann với fenofibrat
(1991); HHS (Helssinski Heart Study, 1987) với gemfibrozil Các thuốc này
hiện nay đang lưu hành phổ biến ở nước ta.
- Tác dụng: giảm dòng acid béo về gan, giảm tổng hợp VLDL, tăng độ
thanh thải VLDL, giảm hình thành LDL nhỏ và đặc dễ gây vữa xơ động mạch,
giảm oxy hoá LDL. Kết quả là làm giảm cả triglycerid và cholesterol, giảm
VLDL và LDL, tăng HDL; các fibrat còn làm gi
ảm kết tập tiểu cầu, giảm
fibrinogen, acid uric máu. Các fenofibrat còn làm giảm lượng lipoprotein(a).
gemfibrozil còn làm tăng tổng hợp apoproteinAI và AII.
- Tác dụng không mong muốn: đầy bụng, buồn nôn, ỉa lỏng, mẩn ngứa, có
thể tăng men gan, yếu cơ, sỏi mật.
3.1.5. Statin [1], [2], [10], [14], [15], [17], [24]
- Fluvastatin (Lescol), lovastatin (Mevacor), pravastatin (Elisor),
simvastatin (Zocor)
- Các nghiên cứu về statin: 4S (Scandinavian Simvastatin Survival Study,
1994), MASS (Multicentre Anti-Atheroma Study, 1994), PLAC (Pravastatin
Limitation of Atheroclerosis in the Coronary Arrteries, 1993 - 1995) I và II,
WOSCOPS (The West of Scotland Coronary Prevention Statin Study, 1995),
REGRESS (The Regression Growth Evaluation Statin Study, 1995)
- Tác dụng: ức chế men HMGCoA reductase làm cản trở quá trình nội sinh
cholesterol trong tế
bào, tăng tổng hợp các cảm thụ cho LDL để tăng thoái giáng
LDL theo con đường các cảm thụ. Các statin làm giảm cholesterol là chính, làm
8

giảm nhẹ triglycerid và tăng nhẹ HDL.
- Tác dụng không mong muốn: rối loạn tiêu hoá, đau đầu, nổi mẩn, đôi khi
tăng các men gan, yếu cơ.
Tuy nhiên, đa số các sản phẩm trên đều có những tác dụng không mong
muốn, đặc biệt là khi người bệnh cần điều trị trong một thời gian dài. [1], [2],
[10], [14], [15], [17], [24]
Để hạn chế tác dụng không mong muốn của thuốc, giúp cho người bệnh yên
tâm khi sử dụng, các nhà khoa họ
c đã hướng đến việc nghiên cứu các thuốc có
nguồn gốc từ thiên nhiên, trong đó có nghiên cứu sản xuất và sử dụng quả
hướng thiên (Sky fruit) của Larry Brookes (Mỹ). Một số nghiên cứu về việc sử
dụng các sản phẩm của sky fruit kết hợp với tân dược cho thấy hiệu quả hạ lipid
máu, giảm được các hiện tượng lâm sàng gây khó chịu cho người bệnh khi chỉ
dùng tân dược điề
u trị. [18]
Trong lĩnh vực y học cổ truyền, có một số công trình nghiên cứu của Trung
Quốc sử dụng công nghệ bào chế hiện đại để bào chế thuốc cổ truyền điều trị hội
chứng này như: nấu cao, chế thành viên “Giáng chỉ linh phương”; “Trà đa phân”
do tỉnh An Huy, Trung Quốc sản xuất
. [49], [50]
Đa số các trường hợp dùng thuốc y học cổ truyền điều trị hội chứng rối loạn
lipid máu dưới dạng cao lỏng hoặc thang sắc, không tiện lợi cho người sử dụng.
3.2. Trong nước
Nước ta có nguồn dược liệu tự nhiên phong phú, có nền y học cổ truyền lâu
đời và nhiều kinh nghiệm. Đồng thời, liệu trình điều trị hội chứng rối loạn lipid
máu thường kéo dài, các thuốc điều trị có nguồn gốc tổng hợp thường gây nhiều
tác dụng không mong muốn, tạo tâm lý không yên tâm cho người bệnh. Do đó,
việc nghiên cứu sử dụng các vị thuốc, bài thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên, có
tác dụng điều trị hội chứng rối loạn lipid máu, hạn chế các tác dụng không mong
muốn của thuốc và phạm vi chỉ định rộng rãi là một việc hết s

ức cần thiết.
Tại Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu đánh giá tác dụng điều trị
rối loạn lipid máu của thuốc cổ truyền. Tuy nhiên, đa số các nghiên cứu mới
dừng lại ở việc đánh giá tác dụng của các bài thuốc trên thực nghiệm và lâm
sàng như:
3.2.1. Nghiên cứu độc vị
- Nghiên cứu tác dụng dược lý cây ngưu tất về tác dụng hạ cholesterol máu
và h
ạ huyết áp. [22]
- Bước đầu đánh giá tác dụng hạ cholesterol máu của alliso (tỏi). [18]
- Nghiên cứu tác dụng hạ cholesterol máu trên chế phẩm Bidentin bào chế
9
từ rễ cây ngưu tất. [2]
- Bước đầu đánh giá tác dụng điều trị cholesterol máu cao của ngưu tất.
[26]
- Nghiên cứu ứng dụng củ nghệ làm thuốc hạ cholesterol máu. [20]
- Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết và chống tăng lipid máu của cây câu
kỷ tử và nấm linh chi. [24]
- Đánh giá tính an toàn và hiệu quả điều trị hội chứng rối loạn lipid máu
củ
a nấm Hồng chi Đà Lạt (Ganoderma lucidum). [32]
- Nghiên cứu tác dụng hạ lipid máu của nấm Hồng chi Đà Lạt (Ganoderma
lucidum) trên thực nghiệm. [33]
3.2.2. Nghiên cứu bài thuốc
- Nghiên cứu bài thuốc Giáng chỉ ẩm trong điều trị hội chứng rối loạn lipid
máu. [15]
- Nghiên cứu tác dụng của bài thuốc THB94 trong điều chỉnh rối loạn lipid
máu thể đàm thấp. [1]
- Nghiên cứu tác dụ
ng điều chỉnh hội chứng rối loạn lipid máu thể phong

đàm của Bán hạ bạch truật thiên ma thang. [30]
- Nghiên cứu tác dụng của bài thuốc HHKV lên một số chỉ số lipid máu ở
thỏ và chuột. [25]
- Nghiên cứu tác dụng điều chỉnh hội chứng rối loạn lipid máu của bài
thuốc Nhị trần thang gia giảm. [14]
- Nghiên cứu tác dụng điều trị hội chứ
ng rối loạn lipid máu của viên BKC.
[24]
- Đánh giá tác dụng hạ lipid máu và tăng lực của viên Curpenin trên một số
chỉ tiêu lâm sàng và cận lâm sàng. [2]
- Nghiên cứu tác dụng của bài thuốc TTII trên bệnh nhân tăng huyết áp có
rối loạn lipid máu. [1]
- Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng tác dụng của chế phẩm “RUVINTAT”
trên bệnh nhân tăng huyết áp và bệnh nhân rối loạn lipid máu. [32]
- Nghiên cứu tác dụng điều trị rối loạn lipid máu củ
a viên cholestin. [2]
Về các công trình nghiên cứu sản xuất thuốc: hiện nay chỉ có một vài công
trình nghiên cứu sản xuất thuốc hạ lipid máu từ dược liệu như: viên BIDENTIN
của Viện dược liệu, viên Cholestin của công ty Dược phẩm Trung ương V được
cấp số đăng ký sản xuất lưu hành toàn quốc.
10
4. Quan niệm của y học cổ truyền về hội chứng rối loạn lipid máu

Hội chứng rối loạn lipid máu không có trong y văn của y học cổ truyền. Cho
đến nay nhiều nhà chuyên môn vẫn quan niệm đàm ẩm như là một trong những
yếu tố chính gây nên hội chứng này. [1], [2], [14], [15]
Dựa trên nhiều nghiên cứu lâm sàng và cận lâm sàng, người ta thấy giữa hội
chứng rối loạn lipid máu và chứng đàm thấp nội trở có nhiều điểm tương đồng
[2], [10]:
- Yếu tố thể chấ

t do tiên thiên quyết định, thường là tiên thiên bất túc, yếu
tố này có thể hiểu tương tự như yếu tố di truyền của y học hiện đại.
- Yếu tố ăn uống (ẩm thực): do ăn quá nhiều các chất cao lương, thức ăn
ngọt béo làm tổn thương tỳ vị, khiến vận hoá thất điều, đàm thấp nội sinh mà
dẫn đến bệnh tật. Y
ếu tố này tương tự như việc ăn quá nhiều thức ăn giàu mỡ
động vật chứa nhiều acid béo no theo y học hiện đại.
- Yếu tố ít vận động thể lực: sách Tố vấn thiên "Tuyên minh ngũ khí luận",
viết :"Cửu ngọa thương khí, cửu tọa thương nhục" (nằm nhiều hại khí, ngồi
nhiều hại cơ nhục). Thương khí dẫn đến khí hư, th
ương nhục dẫn đến tỳ hư, tỳ
khí hư suy mà gây ra bệnh. Y học hiện đại đã chứng minh vận động luyện tập
thể lực làm giảm LDL-C, tăng HDL-C.
- Yếu tố tinh thần (thất tình): lo nghĩ quá hại tỳ, giận dữ quá hại can, can
mộc vượng khắc tỳ thổ làm tỳ vị rối loạn, hư yếu, công năng vận hoá suy giảm,
đàm trọ
c ứ trệ kinh mạch mà sinh bệnh. Đây chính là yếu tố căng thẳng tinh thần
(stress) của y học hiện đại.
4.1. Nguyên tắc điều trị chứng đàm ẩm
- Vì bệnh có đặc điểm "bản hư tiêu thực" cho nên trong điều trị phải chú ý
cả tiêu lẫn bản.
- Phải chú trọng phép chữa đàm vì đàm trọc có vai trò quan trọng trong cơ
chế bệnh sinh.
- Trị đàm phải chú ý nguyên tắc "Trị đàm tiên trị khí, khí thuận đàm tự
tiêu"(Hải Thượng Lãn ông - Y trung quan kiện) và trong tr
ị đàm "nhất thiết
không nên vét sạch đàm đi" "vì đàm vốn có sẵn từ lúc sơ sinh và cũng là một vật
để nuôi sống nữa" (Hải Thượng Lãn ông) có nghĩa chỉ loại bỏ phần đàm dư thừa
mà thôi. [10], [16]
4.2. Phương pháp điều trị đàm

Có 3 phương pháp: hoá đàm, tiêu đàm và điều đàm.
- Bệnh nhẹ dùng hoá đàm.
- Bệnh nặng dùng tiêu đàm.
11
- Đàm ở một chỗ không ra phải dùng phép điều đàm.
Vì đàm ở hội chứng rối loạn lipid máu là đàm vô hình, lưu hành và ứ đọng ở
huyết mạch nên khi điều trị, dùng phép hoá đàm để điều trị nguyên nhân sinh ra
đàm, làm cho đàm tự hết chứ không dùng đến phép tiêu và điều đàm.
Theo y học cổ truyền, hội chứng rối loạn lipid máu là một chứng do nộ
i đàm
gây ra nên có đặc điểm là "bản hư tiêu thực". Tuỳ theo thế bệnh cấp hay hoãn
mà lấy phù chính làm chủ, khứ tà là phụ; hoặc khứ tà làm chủ, phù chính là phụ;
hoặc vừa phù chính vừa khứ tà, tiêu bản đồng trị. Bản hư chủ yếu là tỳ thận
hư tổn, tiêu thực chủ yếu là đàm trọc, huyết ứ. Trị bản phải chú ý bổ tỳ, ích
thận, trị
tiêu phải chú ý các phép khứ đàm trừ thấp, thanh lý thông hạ, hoạt
huyết hóa ứ. Dựa vào nguyên nhân người ta chia đàm ra làm năm loại: thấp
đàm, táo đàm, nhiệt đàm, phong đàm, hàn đàm. Từ đó tuỳ theo từng loại đàm
mà có pháp điều trị khác nhau. [1], [2], [14], [15], [22], [24], [30, [32]
5. Về thuốc LIPIDAN
Công thức thuốc LIPIDAN được thành lập dựa trên cơ sở lý luận của y học
cổ truyền, đã sử dụ
ng điều trị hội chứng rối loạn lipid máu trên lâm sàng trong
nhiều năm cho kết quả khả quan.
Với mục đích sản xuất thuốc cổ truyền trên dây chuyền công nghiệp đạt tiêu
chuẩn chất lượng theo quy định của Bộ Y tế; tạo điều kiện dễ dàng trong việc
bảo quản và sử dụng thuốc, chúng tôi tiến hành nghiên cứu cải dạng thuốc, xây
dựng quy trình sả
n xuất thuốc ở quy mô pilot đạt tiêu chuẩn và xây dựng tiêu
chuẩn của thuốc LIPIDAN.

Bài thuốc LIPIDAN bao gồm các vị sau:
5.1. Trần bì [6], [7], [23]
- Tên khoa học: Pericarpium Citri reticulatae
- Bộ phận dùng: vỏ quả chín đã phơi hoặc sấy khô của cây quýt (Citrus
reticulata Blanco), họ Cam (Rutaceae).
- Hoạt chất chính: tinh dầu, flavonoid, vitamin A,B
- Tính vị: vị cay, đắng, tính ôn
- Quy kinh: can, thận
- Tác dụng: kiện tỳ, lý khí, táo thấp, hoá đàm
- Ứng dụng lâm sàng:
+ Chữa chứng đau do khí trệ.
+ Kích thích tiêu hóa.
+ Chữa nôn mửa do lạnh.
+ Chữa ỉa chảy do tỳ hư.
12
+ Chữa ho, long đờm do hàn thấp gây ra.
5.2. Bán hạ nam [7], [23], [31]
- Tên khoa học: Rhizoma Typhonii trilobati
- Bộ phận dùng: thân rễ già được chế biến thành phiến khô của cây chóc
chuột Typhonium trilobatum (L.)Schott, họ Ráy (Araceae).
- Hoạt chất chính: tinh bột, alcaloid
- Tính vị: sau khi bào chế còn ít cay, ít ngứa, tính ôn
- Quy kinh: tỳ, vị
- Tác dụng: sau khi chế với gừng có tác dụng: trị ho có đàm, hạ khí
- Ứng dụng lâm sàng:
+ Táo thấp hóa đàm: do tỳ vị không vận hóa thành đàm ẩm gây ho, đờm
nhiều, tức ngự
c, gầy, hoa mắt.
+ Chữa nôn mửa do lạnh, phụ nữ nôn do có thai.
+ Chữa đau họng.

+ Nhuận trường chữa táo bón do hư chứng, do hàn.
+ Tiêu viêm, trừ mủ.
5.3. Bạch linh[6], [7], [23]
- Tên khoa học: Poria
- Bộ phận dùng: thể quả nấm đã phơi hay sấy khô của nấm phục linh (Poria
cocos (Schw.) Wolf, họ Nấm lỗ (Polyporaceae), mọc ký sinh trên rễ một số loài
Thông.
- Hoạt chất chính: đường, chất khoáng, triterpenoid
- Tính vị: vị ngọt, nhạt, tính bình
- Quy kinh: tâm, phế, thận, tỳ, vị
- Tác dụng: lợi tiểu, nhuận táo, bổ tỳ, ích khí, sinh tân, chỉ khát
- Ứng dụng lâm sàng:
+
Lợi niệu thông lâm.
+ Cầm ỉa chảy mạn tính do tỳ hư.
+ An thần, đêm ngủ ít, vật vã.
5.4. Mộc hương nam [23]
- Bộ phận dùng: vỏ rễ phơi khô của cây rụt Ilex, họ Bủi (Aquifoliaceae)
- Tính vị: vị ngọt, đắng
- Quy kinh: tỳ, vị, đại trường
- Tác dụng:
lý khí, hoá thấp
- Ứng dụng lâm sàng:
+ Chữa chứng khí trệ gây đầy bụng, trướng, tức ngực, khó thở
13
+ Trừ đờm nhiều do đàm thấp.
+ Chữa cơn đau dạ dày do tỳ vị hư hàn.
+ Chữa nôn mửa do tỳ vị hư.
5.5. Hậu phác nam [23]
- Bộ phận dùng: vỏ phơi khô của cây quế rừng Cinnamonum, họ Long não

(Lauraceae).
- Tính vị: vị cay, ngọt, tính ấm
- Quy kinh: tỳ, vị, đại trường
- Tác dụng:
hạ khí tán mãn, ôn trung táo thấp
- Ứng dụng lâm sàng:
+ Chữa chứng khí trệ gây đầy bụng, trướng, tức ngực, khó thở
+ Trừ đờm nhiều do đàm thấp.
+ Chữa cơn đau dạ dày do tỳ vị hư hàn.
+ Chữa nôn mửa do tỳ vị hư.
5.6. Ngũ gia bì chân chim [6], [7], [23]
- Tên khoa học:
Cortex Scheflerae heptaphyllae
- Bộ phận dùng: vỏ thân và vỏ cành đã phơi hay sấy khô của cây Ngũ gia bì
chân chim (Schefflera heptaphylla (L.) Frodin), họ Nhân sâm (Araliaceae).
- Hoạt chất chính: saponin, tanin, tinh dầu
- Tính vị: vị cay, đắng, thơm, tính ôn
- Quy kinh: can, thận
- Tác dụng: trừ phong thấp, tráng gân cốt
- Ứng dụng lâm sàng:
+ Lợi niệu.
+ Chữa đau khớp, đau dây thần kinh, đau các cơ do lạnh.
+ Chữa phù do thiế
u vitamin B
1
.
5.7. Sơn tra [6], [7], [23]
- Tên khoa
học: Fructus Mali
- Bộ phận dùng: quả chín đã thái phiến được phơi hay sấy khô của cây sơn

tra (Malus doumeri Bois. A. Chev.) họ Hoa hồng (Rosaceae).
- Hoạt chất chính: đường, acid hữu cơ, vitamin, tanin
- Tính vị: vị chua, tính hàn
- Quy kinh: tỳ, vị, can
- Tác dụng: phá khí, tán ứ, hoá đàm, chỉ huyết
- Ứng dụng lâm sàng:
+ Chữa đầy bụng do ăn thịt, ăn dầu nhiều.
14
+ Cầm ỉa chảy do ứ đọng thức ăn, ảnh hưởng đến tỳ vị gây ỉa chảy, bụng
trướng đầy.
5.8. Xa tiền tử [6], [7], [23]
- Tên khoa học: Semen Plantaginis
- Bộ phận dùng: hạt đã phơi hay sấy khô của cây mã đề (Plantago major
L.), họ Mã đề (Plantaginaceae).
- Hoạt chất chính: chất nhầy, acid uronic, dầu béo
- Tính vị: vị ngọt, tính hàn
- Quy kinh: can, thận, tiểu trường
- Tác dụng: lợi niệu, thanh nhiệt, thanh can, hoạt thai
- Ứng dụng lâm sàng:
+ Chữa viêm bàng quang, đái buốt, đái rắt, chữa phù do viêm thận.
+ Cẩm ỉa chảy.
+ Chữa đái đỏ, ít.
+ Hoạt thai chữa phụ nữ đẻ khó.
5.9. Sinh khương [6], [7], [23]
- Tên khoa học: Rhizoma Zingiberis
- Bộ phận dùng: thân rễ tươi của cây Gừng (Zingiber officinale Rose.), họ
Gừng (Zingiberaceae).
- Hoạt chất chính: tinh dầu
- Tính vị: cay, hơi ấm
- Quy kinh: phế, vị, tỳ

- Tác dụng: giải biểu, phát hãn, chữa nôn do lạnh, chỉ khái, giải độc
- Ứng dụng lâm sàng:
+ Chữa cảm mạo, nôn mửa, ho do lạnh.
+ Kích thích tiêu hóa, chống đầy, ợ hơi.
+ Giải độc và hạn ch
ế độc tính của các vị thuốc bán hạ, nam tinh, phụ tử.

15
CHƯƠNG 2
NGUYÊN LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Nguyên liệu nghiên cứu
1.1. Công thức bài thuốc LIPIDAN (dùng trong 2 ngày - theo kinh nghiệm
điều trị).
Trần bì 08g Bán hạ chế 08g
Bạch linh 16g Hậu phác nam 06g
Mộc hương nam 10g Sơn tra 08g
Ngũ gia bì 08g Sinh khương 02g
Xa tiền tử 08g
Các tá dược sử dụng trong nghiên cứu:
- Bột Talc
- Tricalciphosphat
- PVP K30
- Cồn 96%
1.2. Hỗn dịch và dung dịch sử dụng trong nghiên cứu
1.2.1. Hỗn d
ịch thuốc từ công thức bài thuốc LIPIDAN
Từ công thức bài thuốc LIPIDAN đã nêu ở trên, tiến hành sắc theo phương
pháp cổ truyền.
- Trần bì, hậu phác tán bột.
- Sinh khương: ép lấy nước.

- Các vị thuốc còn lại: đổ 300ml nước, sắc còn 100ml. Làm ba lần như vậy
rồi tiến hành hoà chung nước sắc của ba lần với nhau, ta có 300ml nước sắc.
Như vậy, 1ml nước sắc chứ
a 0,19g dược liệu.
- Hoà bột trần bì, hậu phác, nước sinh khương vào nước sắc ở trên, ta được
hỗn dịch thuốc (tạm gọi là hỗn dịch Lipidan). Hỗn dịch này dùng để đối chiếu
tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu với viên nang LIPIDAN.
Do lượng thuốc sử dụng điều trị trên lâm sàng (theo kinh nghiệm) là
150ml/ngày nên chúng tôi tiến hành tính toán và đề ra lượng thuốc sử dụng trên
động vật thí nghiệ
m là 2,5ml/kg thể trọng.
1.2.2. Dung dịch cholesterol 10%
Cân 10g cholesterol. Đun nóng cách thuỷ 50ml dầu lạc. Cho cholesterol vào,
khuấy đều cho tan hết cholesterol. Để nguội, thêm dầu lạc vừa đủ 100ml. Như
vậy, 1ml dầu chứa 0,1g cholesterol.
1.2.3. Dung dịch Tween80 nồng độ 20%
Cân 20g Tween80, cho vào cốc có mỏ. Cho 50ml dung dịch NaCl 9‰ vào.
Đun cách thuỷ, khuấy đều cho tan hết Tween80, sau đó đổ vào cốc có chân
16
100ml. Thêm NaCl 9‰ vào cho vừa đủ 100ml, lắc đều. Như vậy ta được dung
dịch Tween80 nồng độ 20%.
2. Đối tượng nghiên cứu
Súc vật nghiên cứu:
- Thỏ: cả hai giống, khoẻ mạnh, nặng từ 1,8kg - 2,5kg/con.
- Chuột cống trắng: chuột đực khoẻ mạnh, trọng lượng 180g - 240g/con.
- Chuột nhắt trắng chủng Swiss: cả hai giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 20g
± 2g/con.
Chu
ột do Trung tâm nghiên cứu ứng dụng y sinh dược, Học viện Quân y
cung cấp.

Súc vật được nuôi trong phòng thí nghiệm với cùng điều kiện nhiệt độ, độ
ẩm, thời gian sáng - tối 12/12h. Thức ăn do Ban chăn nuôi động vật thí nghiệm
Học viện Quân y sản xuất, đảm bảo theo đúng tiêu chuẩn dinh dưỡng. Nước
uống được cung cấp đầy đủ.
3. Phương pháp nghiên cứu
3.1. Nghiên cứu bào chế
viên nang LIPIDAN
3.1.1. Bào chế cao khô LIPIDAN [6], [7], [8]
- Giai đoạn 1: sắc với nước đã khử khoáng (tỷ lệ nước:dược liệu = 4:1) theo
phương pháp truyền thống, thuốc được sắc 3 lần:
+ Lần 1, đun sôi (kể từ lúc sôi) 20 - 30 phút, lọc nóng qua rây 150.
+ Lần 2, đun sôi 40 phút, lọc nóng qua rây 150.
+ Lần 3, đun sôi 1 giờ, lọc nóng qua rây 150.
- Giai đoạn 2:
+ Dịch chiết lần 2 và lần 3 được gộp lại, cô trực tiếp thành cao lỏng (cao
lỏng lần 1)
+ Gộp dịch chiết lần 1 và cao lỏng lần 1, cô trực tiếp thành cao lỏng (cao
lỏng lần 2) rồi dùng cồn cao độ với tỉ lệ 1:1 để loại tạp.
+ Sau đó cao lỏng lần 2 đã loại tạp được cô đặc để đạt được thể chất quy
định, quá trình cô đặc và sấy khô dịch chiết được tiến hành trong các thiết bị
dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 60
0
C.
3.1.2. Bào chế viên nang LIPIDAN [6], [7], [8], [9]
Bào chế viên nang LIPIDAN theo phương pháp xát hạt ướt:
- Cao khô LIPIDAN + bột dược liệu và tá dược độn, tá dược dính
- Xát hạt ướt, sửa hạt
- Hạt thuốc + tá dược trơn
- Đóng nang
- Ép vỉ

17
3.1.3. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu bào chế thuốc LIPIDAN
- Motor vạn năng Kalweka VDM 4SP
- Đầu nghiền bột
- Đầu trộn bột
- Đầu tạo hạt ướt
- Máy đóng nang tự động NJP 1200
- Máy ép vỉ tự động DPP-150C
- Máy đo độ rã Erweka DT
- Cân phân tích điện tử XB 220A Precisa
- Cân kỹ thuật điện tử Sartorius TE 3102S
- Hệ thống s
ắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1100
- Tủ vi khí hậu Climen
-
Cân xác định độ ẩm Sartorius MA 30
3.2. Đánh giá các chỉ số kỹ thuật của viên nang LIPIDAN [6], [7]
3.2.1. Tính chất: cảm quan.
3.2.2. Độ rã: thử theo phụ lục 11.6, DĐVN IV.
3.2.3. Độ đồng đều khối lượng: thử theo phụ lục 11.3, DĐVN IV.
3.2.4. Mất khối lượng do làm khô: trộn đều bột thuốc của 20 nang. Cân chính
xác 1g bột thuốc, tiến hành thử theo phụ lục 9.6, DĐVN IV, phương pháp sấy
trong tủ
sấy ở 85
0
C, áp suất thường trong 5 giờ.
3.2.5. Định tính
Chế phẩm phải thể hiện phép thử định tính của trần bì, ngũ gia bì chân chim,
bán hạ chế.
∗ Trần bì: Phương pháp sắc ký lớp mỏng (phụ lục 5.4, DĐVN IV)

- Dụng cụ, thuốc thử:
+ Bản mỏng silicagel G tráng sẵn của Merck, hoạt hóa ở 110
0
C trong 30
phút.
+ Ethyl acetat, ethanol (TT).
+ Dung môi triển khai sắc ký: Toluen - ethyl acetat - acid formic (5:4:1).
+ Đèn tử ngoại UV 366nm.
- Cách thử:
+ Dung dịch mẫu thử: lấy bột thuốc của 5 nang, thêm 70ml nước nóng,
khuấy kỹ, để nguội, ly tâm. Chuyển dịch ly tâm vào bình gạn, lắc kỹ với 30ml
ethyl acetat. Sau khi tách lớp, gạn lấy dịch chiết ethyl acetat, cô trên cách thủy
đến cạn. Hòa cắn trong 1ml ethanol được dung dịch chấm sắc ký.
+ Dung dịch mẫu
đối chiếu: lấy 2g trần bì đã cắt nhỏ, thêm 10ml nước,
đun sôi nhẹ 1 giờ, để nguội, lọc. Chuyển dịch lọc vào bình gạn, lắc kỹ với 30ml
ethyl acetat. Gạn lấy dịch chiết ethyl acetat, cô trên cách thủy đến cạn. Hòa cắn
18
trong 1ml ethanol được dung dịch chấm sắc ký.
Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối
chiếu tại hai điểm A và B. Triển khai sắc ký cho đến khi dung môi di chuyển
được khoảng 12 - 13cm. Lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng, quan sát
bản mỏng dưới đèn tử ngoại, bước sóng 366nm.
Kết quả: mẫu thử phải có các vết phát quang cùng màu, cùng R
f
với các vết
của mẫu đối chiếu.
∗ Ngũ gia bì chân chim: phương pháp sắc ký lớp mỏng (phụ lục 5.4,
DĐVN IV)
- Dụng cụ, thuốc thử:

+ Bản mỏng silicagel G tráng sẵn của Merck, hoạt hóa ở 110
0
C trong 30
phút.
+ Cloroform, ethanol (TT).
+ Dung dịch acid hydrocloric đặc (TT)
+ Dung môi triển khai sắc ký: Cloroform, methanol (9:1).
+ Hiện màu: dung dịch vanilin 1% trong hỗn hợp acid phosphoric-
methanol (1:1).
- Cách thử:
+ Dung dịch mẫu thử: lấy bột thuốc của 5 nang, thêm 30ml hỗn hợp
methanol - nước (4:1), đun sôi hồi lưu trên cách thủy 30 phút, để nguội, lọc. Cô
dịch lọc trên cách thủy đến cạn. Hòa cắn trong 25ml nước, thêm 25ml acid
hydrocloric đặc, đun sôi hồi lưu trong 3 giờ,
để nguội, lọc. Rửa cắn bằng nước
cho hết acid và sấy khô ở 60
0
C. Hòa cắn trong 20ml cloroform bằng cách đun
nóng nhẹ trên cách thủy, lọc. Cô dịch lọc trên cách thủy đến cạn. Hòa cắn trong
1ml ethanol được dung dịch chấm sắc ký.
+ Dung dịch mẫu đối chiếu: lấy 2g ngũ gia bì chân chim đã cắt nhỏ, thêm
100ml nước cất, đun sôi nhẹ 1 giờ, để nguội, lọc. Cô dịch lọc đến cạn, hòa cắn
trong 30ml hỗn hợp methanol - nước (4:1), đun sôi hồi lưu trên cách thủy 30
phút, để
nguội, lọc. Cô dịch lọc trên cách thủy đến cạn. Hòa cắn trong 25ml
nước, thêm 25nm acid hydrocloric đặc, đun sôi hồi lưu trong 3 giờ, để nguội,
lọc. Rửa cắn bằng nước cho hết acid và sấy khô ở 60
0
C. Hòa cắn trong 20ml
cloroform bằng cách đun nóng nhẹ trên cách thủy, lọc. Cô dịch lọc trên cách

thủy đến cạn. Hòa cắn trong 1ml ethanol được dung dịch chấm sắc ký.
Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối
chiếu tại hai điểm A và B. Triển khai sắc ký cho đến khi dung môi di chuyển
được khoảng 11 - 12cm. Lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng, phun dung
dịch vanilin 1% trong hỗn hợp acid phosphoric-methanol (1:1), sấy ở
120
0
C cho
đến khi hiện rõ vết.
19
Kết quả: mẫu thử phải có các vết cùng màu, cùng R
f
với các vết của mẫu đối
chiếu.
∗ Bán hạ chế: phương pháp sắc ký lớp mỏng (phụ lục 5.4, DĐVN IV)
- Dụng cụ, thuốc thử:
+ Bản mỏng silicagel G tráng sẵn của Merck, hoạt hóa ở 110
0
C trong 30
phút.
+ Cột sắc ký trao đổi ion (cột thủy tinh hình trụ, đường kính trong 1,5 -
2cm, dài 20 - 25cm, phía dưới có vòi khóa, bên trong đã được nhồi nhựa trao đổi
cation loại H
+
.

+ Ethanol 50% (TT).
+ Dung môi triển khai sắc ký: n-butanol - acid acetic - nước (4:1:5).
+ Hiện màu: dung dịch ninhydrin 3% ethanol.
- Cách thử:

+ Dung dịch mẫu thử: lấy bột thuốc của 5 nang, thêm 50ml nước nóng,
khuấy kỹ, để nguội, ly tâm. Gạn lấy dịch ly tâm cho chảy qua cột sắc ký trao đổi
ion (đã được xử lý theo DĐVN I, tập 1 - Phương pháp định lượng bằng trao đổi
ion, trang 692), tốc độ chảy 20 - 25 giọt/phút. Bỏ phầ
n dung dịch chảy qua cột.
Thêm nước cất để giữ cho cột không bị khô. Tiếp tục rửa cột bằng nước cất cho
tới khi nước chảy qua cột có phản ứng trung tính (thử bằng chỉ thị Heliantin).
Cho dung dịch amoniac 10% chảy qua cột với tốc độ như trên. Khi dung dịch
chảy qua cột bắt đầu có phản ứng kiềm thì hứng và bỏ đi khoảng 10ml dịch chiết
đầu tiên. H
ứng lấy 30 - 40ml dịch chiết tiếp theo, cô trên cách thủy đến cạn. Hòa
cắn trong 2ml ethanol 50% được dung dịch chấm sắc ký.
+ Dung dịch mẫu đối chiếu: lấy 1g bán hạ nam đã cắt nhỏ, thêm 100ml
nước, đun sôi nhẹ 1 giờ, để nguội, lọc. Lấy dịch lọc cho chảy qua cột sắc ký trao
đổi ion (đã được xử lý theo DĐVN I, tập 1 - Phương pháp định lượng bằng trao
đổi ion, trang 692) rồi tiế
n hành tiếp như với dung dịch mẫu thử, bắt đầu từ “tốc
độ chảy 20 - 25 giọt/phút Hòa cắn trong 2ml ethanol 50% được dung dịch
chấm sắc ký.”.
Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối
chiếu tại hai điểm A và B. Triển khai sắc ký cho đến khi dung môi di chuyển
được khoảng 12 - 13cm. Lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng, phun dung
dịch ninhydrin 3% ethanol, sấy ở 120
0
C cho đến khi hiện rõ vết.
Kết quả: mẫu thử phải có các vết cùng màu, cùng R
f
với các vết của mẫu đối
chiếu.
3.2.6. Độ nhiễm khuẩn

Cân 5g bột thuốc vào bình nón nút mài 200ml đã được tiệt trùng và đã biết
khối lượng. Thêm một lượng vừa đủ dung dịch natri clorid 0,9% vô trùng để thu
20
được dung dịch có nồng độ 10
-1
, lắc đều. Từ dung dịch trên, pha loãng thành các
nồng độ 10
-2
, 10
-3
và tiếp tục tiến hành thử theo phụ lục 13.6, DĐVN IV.
3.3. Theo dõi độ ổn định của thuốc [6], [7], [11]
Theo dõi tuổi thọ của 3 lô sản phẩm lưu ở điều kiện tủ vi khí hậu.

- Thời gian lưu: 4 tháng tính từ ngày sản xuất.
- Điều kiện bảo quản:
+ Nhiệt độ: 40
0
C ± 2
0
C
+ Độ ẩm: 70% ± 5%
- Chu kỳ lấy mẫu (tính cho mỗi lô sản phẩm): trước nghiên cứu, sau đó lấy
mẫu 1 tháng/lần x 4 lần.
Đánh giá độ ổn định của thuốc theo các tiêu chí sau: cảm quan, độ rã, định
tính, độ nhiễm khuẩn.

+ Hình thức cảm quan (theo TCCS)
+ Độ rã (theo phụ lục 11.6, DĐVN IV)
+ Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (phụ lục 5.4, DĐVN IV),

chế phẩm phải có phản ứng định tính của trần bì, ngũ gia bì chân chim, bán hạ
chế.
+ Độ nhiễm khuẩn (theo phụ lục 13.6, DĐVN IV)
Cách xác định và dự đoán tuổi thọ của thuốc bằng phương pháp lão hóa cấp
tốc: thực hi
ện theo nguyên lý Vant-Hoff với cách tính tuổi thọ thuốc như sau:
C = C
NT
x K

Trong đó:
- C: tuổi thọ (tính bằng ngày) ở nhiệt độ bảo quản bình thường (t
BT
= 20
0
C)
- C
NT
: tuổi thọ thực nghiệm ở nhiệt độ nâng cao (t
TN
= 40
0
C)
- K: hệ số, K = 2
(t
TN
-t
BT
)/10

3.4. Xác định độ an toàn của thuốc [5], [37], [46], [47]
3.4.1. Xác định độc tính cấp [5], [37], [38], [43]
Xác định liều LD
50
của thuốc LIPIDAN trên chuột bằng đường uống theo
phương pháp Lichfield - Wilcoxon.
Chuột nhắt trắng nhịn đói 16 giờ, được chia thành 12 lô, mỗi lô 10 con.
Chuột được cho uống thuốc với các liều khác nhau tăng dần, từ liều cao nhất
không gây chết (g/kg) đến liều thấp nhất gây chết 100% chuột nhắt trắng, trong
cùng một thể tích là 2ml thuốc/100g trọng lượng cơ thể chuột, cho uống 3 lần
trong 24 giờ.
Chuộ
t được theo dõi tình trạng chung trong suốt 7 ngày và tỷ lệ chết trong 72
giờ của từng lô để xác định liều LD
50
.
21
3.4.2. Thử độc tính bán cấp [5], [34]
LIPIDAN đã được dự kiến liều điều trị sử dụng trên người, nên chúng tôi đã
ngoại suy từ liều trên người cho các thử nghiệm độc tính, có tham khảo liều chết
50% (LD
50
).
Thỏ được chia ngẫu nhiên thành 3 lô khác nhau, mỗi lô 12 con.
- Lô chứng uống nước lọc
- Lô uống viên nang LIPIDAN liều I: 100mg/100g trọng lượng cơ thể/ngày
(gấp 10 lần liều điều trị theo LD
50
)
- Lô uống viên nang LIPIDAN liều II: 150mg/100g trọng lượng cơ thể/ngày

(gấp 15 lần liều điều trị theo LD
50
)
- Thuốc được nghiền mịn và hòa trong nước lọc. Các thỏ uống cùng một thể
tích là 0,5ml/100g TLCT thỏ, liên tục trong 42 ngày, tiến hành quan sát tất cả
các thỏ, đánh giá các chỉ tiêu gồm :
- Sinh lý - dược lý: tình trạng chung, hoạt động, ăn uống, trọng lượng cơ
thể, ghi điện tim.
- Huyết học: hồng cầu, hemoglobin, bạch cầu, công thức bạch cầu, tiểu cầu
-
Sinh hóa: AST, ALT, ure, creatinin,
- Mô bệnh học: vào ngày thứ 42 thỏ được phẫu thuật, quan sát hình ảnh đại
thể gan, lách, thận. Sau đó sinh thiết các tạng để nghiên cứu hình ảnh mô bệnh
học của 5 thỏ thực nghiệm ở mỗi lô. Các mẫu mô bệnh học được nhuộm H.E,
đọc trên kính hiển vi ánh sáng thường với độ phóng đại HE 400.
* Thời điểm xét nghiệm: lấy máu xét nghiệm các chỉ số sinh hóa, huyết
h
ọc, ghi điện tim, tại 3 thời điểm: xuất phát điểm, sau 3 tuần, sau 6 tuần nghiên
cứu.
3.4.3. Ảnh hưởng lâu dài của thuốc trên di truyền và sinh sản [5], [34], [35],
[40], [41], [42], [48]
3.4.3.1. Ảnh hưởng của LIPIDAN đến quá trình sinh sản
Chuột nhắt trắng Mus musculus L. 500 con, dòng Swiss, trọng lượng từ 20 -
25g, khoẻ mạnh, đủ tiêu chuẩn thí nghiệm.
Trong quá trình thí nghiệm, chuột được nuôi dưỡng, chăm sóc và theo dõi
hàng ngày.
Thế hệ chuột nhắ
t trắng bố mẹ gọi là thế hệ P.
Các chuột nhắt trắng con sinh ra từ thế hệ P gọi là thế hệ F
1

.
Chuột nhắt trắng con được sinh ra từ thế hệ F
1
gọi là thế hệ F
2
.
Dùng LIPIDAN nghiền mịn, hòa trong nước lọc, cho chuột nhắt trắng thí
nghiệm uống qua kim cong tày đầu, mỗi con chuột nhắt trắng uống với thể tích
giống nhau là 2ml/100g trọng lượng cơ thể.
22
Căn cứ vào kết quả nghiên cứu độc tính cấp (LD
50
), chúng tôi đã sử dụng
mức liều cho chuột nhắt trắng là 30mg/100g trọng lượng cơ thể/24h (gấp 3 lần
liều điều trị theo LD
50
).
Quy trình cho uống LIPIDAN: chuột nhắt trắng 160 con (gồm 40 con đực và
120 con cái), tách riêng đực - cái, nuôi 2 tuần trước khi nghiên cứu. Khi trọng
lượng cơ thể chuột nhắt trắng đạt đến 30g ± 3,0g, các chuột nhắt trắng được chia
một cách ngẫu nhiên vào các lô, đánh dấu, cân trọng lượng cơ thể và vẫn tách
riêng đực - cái, cho uống LIPIDAN vào buổi sáng hàng ngày trong 14 ngày,
thuốc được đưa vào dạ dày chuột qua kim cong tày đầu.
+ Lô chứng: cả chuột nh
ắt trắng đực và cái đều uống nước lọc.
+ Lô nghiên cứu I: chuột đực được uống LIPIDAN liều 30mg/100g trọng
lượng cơ thể chuột/24h, chuột cái không uống thuốc.
+ Lô nghiên cứu II: chuột đực không uống thuốc, chuột cái được uống
LIPIDAN liều 30mg/100g trọng lượng cơ thể chuột/24h.
+ Lô nghiên cứu III: cả chuột đực và chuột cái đều được uống LIPIDAN

liều 30mg/100g trọ
ng lượng cơ thể chuột/24h.
Sau 14 ngày, ghép chuột ở các lô vào một chuồng theo tỷ lệ 1 chuột đực : 3
chuột cái, tiếp tục cho uống nước lọc hoặc uống thuốc LIPIDAN trong 16 ngày.
Theo dõi sự thụ thai của chuột. Khi thụ thai thành công (chuột nhắt trắng cái có
chửa), nuôi đến 2 tuần (14 ngày) và chia thành 2 nhóm:
- 1/3 số chuột nhắt trắng cái được phẫu thuật để đánh giá số thai phát triển
bình thường, số thai chế
t sớm/chết muộn.
- Còn 2/3 số chuột nhắt trắng cái được nuôi đến khi chuột đẻ, đánh giá số
chuột nhắt trắng con trong mỗi lứa đẻ, trọng lượng trung bình trong mỗi lứa đẻ,
đếm số chuột con có dị tật bẩm sinh .
- Thế hệ F
1
sinh ra được nuôi lớn đến 20g ± 2,0g/chuột nhắt trắng. Tách
riêng đực, cái. Nuôi tiếp đến khi đạt trọng lượng cơ thể 30g ± 3,0g/chuột nhắt
trắng, tiến hành ghép đôi như trên.
- Thế hệ F
2
sinh ra cũng được xử lý hoàn toàn tương tự.
Các chỉ tiêu đánh giá tác dụng trên sinh sản - phát triển
- Tỷ lệ chuột nhắt trắng thụ thai so với tổng số (tính bằng %).
- Số thai của mỗi chuột mẹ có chửa đã được phẫu tích (autopsy).
- Số thai chết (sớm/muộn), số thai dị tật (nếu có).
- Số chuột nhắt trắng con trung bình trong một lứa đẻ
.
- Trọng lượng trung bình một con (tính bằng gam).
- Số ngày trung bình cần thiết nuôi để đạt trọng lượng cơ thể là 20g ± 2,0g,
đối với các thế hệ P, F
1

, F
2
.
- Các loại dị tật bẩm sinh quan sát được.