môi trường nuôi cấy nấm men

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Phương tiện thí nghiệm:
2.2.1. Địa điểm thí nghiệm:
Thí nghiệm được tiến hành tại phịng thí nghiệm lên men, Khoa Cơng Nghệ
Sinh Học và Kỹ Thuật Môi Trường, Cơ Sở 1, Trường Đại Học Công Nghiệp Thực
Phẩm, TP.HCM.
2.2.2. Thời gian thực hiện:
Thời gian thực hiện từ ngày 09/05/2011
2.2.3. Thiết bị và dụng cụ:
Các thiết bị và dụng cụ cần thiết cho thí nghiệm:
2.2.3.1. Thiết bị:
- Máy ép nho
- Máy đo pH
- Máy đo Bx
- Thiết bị hấp khử trùng tự động
- máy sấy
2.2.3.2. Dụng cụ:
Cốc thủy tinh 500, Cốc thủy tinh 50, Thau nhựa, Rổ nhựa
a. Hóa chất sử dụng:
-

Cồn thực phẩm

-

Cồn cơng nghiệp

-

Hóa chất thanh trùng: NaHSO3

-

Tanin

-

Muối amon

-

Acid sobic


-

5-Nitrofurylacrinlic (5-NFA)

b. Nguyên liệu:
Nho, Đường, Nấm men.
2. Phương pháp thí nghiệm
2.1. Sơ đồ thí nghiệm
Đề tài này được tổng hợp trên sự nghiên cứu của các nhà đi trước.


2.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy nấm men
a. Nguyên tắc của việc chế tạo môi trường:


Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa các chất
dinh dưỡng của từng loại vi sinh vật. Để đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu

giữa môi trường và tế bào vi sinh vật nên cần điều chỉnh tỉ lệ và nồng độ các chất
trong thành phần môi trường.
Đảm bảo các điều kiện lý hóa cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi
sinh vật.
b. Sơ đồ thực hiện:

Bột mơi trường

Cân

Bình tam giác

Nước cất

Nấu cách thủy

Khử trùng
(1210C, 15 phút

Bảo quản và kiểm tra
mơi trường

Hình III.5. Sơ đồ chuẩn bị môi trường nuôi cấy nấm men.
c. Thuyết minh sơ đồ:
Môi trường sử dụng nuôi cấy nấm men là môi trường Sabouraud, có cơng thức
chế tạo như sau:
peptone

10g/l

Glucose 40g

Thạch

20g/l

pH (250C)

Nước

1 lít

5.6-6.0
Lượng Nguyễn Đức,2002

- Cân mơi trường ni cấy và hịa tan trong nước cất với hàm lượng xác định


- Cho hỗn hợp trên vào bình tam giác và nấu cách thủy để các thành phần
trong mơi trường hịa tan trong nước.
- Dùng bơng gịn bịt kín miệng bình tam giác.
- Rửa sạch các đĩa Petri, ống nghiệm, pipette. Sau đó dùng giấy bịt kín để
thanh trùng.
- Tiệt trùng môi trường, dụng cụ ở nhiệt độ 1210C trong thời gian 15 phút.
- Lấy môi trường và dụng cụ ra khỏi nồi tiệt trùng.
- Phân phối mơi trường từ bình tam giác và dụng cụ. Đối với đĩa petri lượng
môi trường phân phối vào có độ dày khoảng 2mm. Đối với ống nghiệm lượng môi
trường cho vào bằng 1/3 chiều cao của ống.
- Q trình phân phối mơi trường vào dụng cụ chứa phải tuân thủ một số
nguyên tắc cơ bản sau:

+ Môi trường khi được phân phối phải ở trạng thái lỏng.
+ Các thao tác phân phối cần phải nhanh, gọn, khéo léo để mơi trường khơng
bị dính lên miệng hay thành của dụng cụ chứa và phải hoàn thành trước khi mơi
trường hóa rắn.
- Bảo quản và kiểm tra môi trường;
+ Đối với môi trường chưa sử dụng, cần được bảo quản ở chỗ mát, nhiệt độ
thấp(khoảng 20-25 0C), hạn chế tác dụng của ánh sáng và không để môi trường bị
khô.
+ Trước khi sử dụng lại để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường, ta thường đặt chúng
vào chỗ ấm ở nhiệt độ 370C trong 42-48 giờ, sau đó lấy ra quan sát, loại bỏ các ống có
vi sinh vật phát triển.
2.3. Bố trí thí nghiệm
2.3.1. Thí nghiệm 1: Phân lập kiểm tra hình thái tế bào và đo kích thước
Trong dịch lên men, vi sinh vật tồn tại ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác
nhau (nấm men, nấm mốc, vi khuẩn). Muốn nghiên cứu những đặc tính sinh lý, sinh
hóa hoặc sử dụng một lồi nào đó thì cần phải đưa chúng về dạng thuần khiết.
Phân lập nấm men là quá trình tách riêng các chủng nấm men từ quần thể ban
đầu và đưa về dạng thuần khiết. Nấm men ở dạng thuần khiết là giống nấm men được
tạo ra từ một tế bào ban đầu. Đồng thời, xác định được chủng nấm men có khả năng
lên men tối ưu.


b. Sơ đồ thực hiện:

Hình III.6. Sơ đồ quá trình phân lập kiểm tra hình thái và kích thước nấm men
c.1. Thuyết minh sơ đồ:
- Nho sau khi xử lí rửa sạch, dùng dao cắt đôi thành hai miếng.
- Để một nửa trái trên bề mặt của đĩa petri đã được phân phối môi trường vào,
lắc nhẹ cho nửa quả nho chạy đều trên bề mặt đĩa.
- Lấy nửa trái nho ra.

- Lật úp đĩa và đặt vào tủ ủ vi sinh ở nhiệt độ 37 0C trong 24 đến 48 giờ cho
khuẩn lạc xuất hiện.
- Xác định các chủng nấm men bằng cách quan sát;
Để quan sát tế bào nấm men chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm tế
bào có các thuốc nhuộm : xanh methylen,lugol ,fucsin cacbolic.
Thành phần dung dịch logul:
-Iot

2g

-Iodua Kali

4g

-Nước cất

100ml

Thành phần dung dịch xanh methylen (loeffler’s) :
Dung dịch A :
-

Xanh methylen

0.3 g


-

Cồn 95%

30 ml

Dung dịch B :
-

KOH loãng (0.01% (w/v))

100ml (khoảng 1viên KOH trong 1lít )

Trộn A và B lại với nhau.
Dùng que cấy lấy sinh khối nấm men và nhỏ 1 giọt nước để tạo huyền phù
lên phiến kính. Sau đó làm khơ, cố định và nhuộm đơn bằng xanh methylene
rồi dùng lamelle để quan sát tế bào nấm men. Căn cứ vào độ đậm nhạt để phân
biệt được tế bào sống chết. Quan sát các hạt glycogen trong tế bào nấm men
bằng nhuộm dung dịch lugol thì tế bào có màu vàng nhạt và các hạt glicogen
có màu đỏ nâu.
+ Hình dạng, kích thước và màu sắc của khuẩn lạc (bằng mắt thường).
+ Quan sát hình dạng và kích thước của tế bào nấm men dưới kính hiển vi.
- Chọn ra giống nấm men tiêu biểu đem cấy vào ống nghiệm là giống có khuẩn
lạc trắng trong, tế bào hình trứng lớn.
Lưu ý : Mọi thao tác trên phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng:
+ Tay và bề mặt tiếp xúc trong tủ cấy được khử trùng bằng cồn.
+ Khơng khí trong tủ được khử trùng bằng tia UV.
+ Dụng cụ phải được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn.
- Kiểm tra độ thuần khiết của giống mới vừa phân lập bằng cách kiểm tra vết
cấy, kiểm tra độ thuần chủng của các khuẩn lạc và kiểm tra tế bào nấm men dưới kính
hiển vi.
- Cấy truyền để bảo tồn giống vừa phân lập: Tay trái cầm hai ống nghiệm (một
ống giống và một ống môi trường), tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn đèn

cồn cho đến khi nóng đỏ que cấy. Sau đó, dùng ngón cái và ngón trỏ xoay nhẹ nút
ống nghiệm ra . Tiếp theo hơ nóng để khử trùng khơng khí ở miệng hai ống nghiệm.
Đợi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống
nghiệm. Kế tiếp rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa
vào ống nghiệm chứa môi trường, lướt que cấy trên mặt thạch theo kiểu hình chữ chi.
Cuối cùng, rút que cấy ra, khử trùng lại phần khơng khí nơi miệng hai ống nghiệm rồi
đậy nắp ống lại và khử trùng lại que cấy sau khi sử dụng xong.
- Nhân giống trong ống nghiệm và trong bình tam giác để phát triển thu sinh
khối giống nấm men và để giữ giống.
2.3.1. Thí nghiệm 2: lên men bằng giống Saccharomyces.
- Sơ đồ thí nghiệm



- Phương pháp thực hiện:

Chất lượng rượu nho, có thể nói 60% là do nguyên liệu quyết định, 40% là do
công nghệ, do vậy nguyên liệu tốt sẽ cho sản phẩm tốt, nói chung muốn có ngun
liệu tốt phải:
• Chọn loại quả thích hợp
• Tạo điều kiện thuận lơi để quả có chất lượng cao
• Kiểm tra bổ sung thành phần nước quả trước khi lên men
 Xử lý nguyên liệu

a. Tiếp nhận, phân loại:
- Nguyên liệu là nước quả có lẫn xác quả: vỏ, hạt, màng, xơ, và có khi cả cuống quả
nữa, không thể lên men quả nguyên dạng vì có vỏ, màng bảo vệ phải phá huỷ để cho các
enzyme dễ trộn vào nước quả.
- Trước hết phải chọn quả, loại bỏ những quả thối, quả bệnh sẽ mang vào nước quả
những bào tử nấm, vi khuẩn cản trở hoạt động của quá trình lên men. Khác với trường hợp

chỉ lên men nước quả, xác quả cũng tham gia vào việc hình thành rượu. Ở nhiều quả như
nho, mơ, táo,...mùi thơm chủ yếu ở vỏ, muốn cho rượu vang có mùi thơm phải đợi cho quả
chín tốt, vỏ quả chứa nhiều chất thơm. Có những quả như dâu, nho cuống quả chứa nhiều
tanin, muốn cho rượu vang có chất chát người ta để lại trong nước quả lượng cuống vừa đủ
để cho rượu có vị nồng đượm nhưng không quá chát.
- Nho phải được thu hoạch đúng thời điểm đạt độ chín kỹ thuật. Tại thời điểm này, trong
trái nho phải có hàm lượng đường và acid theo một tỷ lệ cân đối và thích hợp nhất cho mục
đích xuất vang nho, loại bỏ những quả thối, quả bệnh mang vào những bào tử nấm, vi khuẩn
cản trở hoạt động của men

b. Rửa:
Mục đích làm sạch nho, bước này có thể tiến hành trước hay sau khi phân loại
nguyên liệu.
c. Tách cuống:
Nho sau thu hái vẫn còn cả cuống và cành. Thường thì người ta tách rời những
thứ đó ra để rượu khỏi bị đắng quá chát.
d. Làm dập, nghiền xé:
Quá trình làm dập, nghiền xé cho phép lấy các phần ép khác nhau theo quy định
nghiệm ngặt của quy trình cơng nghệ. Giai đoạn này cần tiến hành cẩn thận, khơng
làm dập hạt nho vì nếu hạt nho dập các chất độc có trong hạt nho sẽ thốt ra ngồi
vậy người dùng sẽ bị ngộ độc, hạn chế gia tăng chất chát trong dịch nước nho. Ngoài


ra trong hạt cịn có tannin làm tủa protein, sẽ làm giảm chát lượng rượu vang. Phần
thịt quả phải được xé nhuyễm. Thu dịch cháo thực chất là dịch quả chứa đường từ quả
nho. Để sản xuất rượu vang tốt quá trình nghiền phải được tiến hành ngay sau khi thu
hoạch nho để tạo vị đặc trưng.
e. Sulfit hóa:
Sau khi làm nát nguyên liệu, người ta không tiến hành đun sôi dịch len men. Để
tiêu diệt vi sinh vật người ta dùng SO2. Lượng SO2 trong dịch lên men không được

quá nhiều vì sẽ gây ức chế sự phát triển và hoạt động chuyển hóa đường thành rượu,
lượng sử dụng khoảng 30-120 mg/l.
Các nước sản xuất rượu vang thường dùng SO2 vì có tác dụng nhiều mặt: chống
oxy hóa, làm giảm hoặc tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn có hại. Tuy nhiên , nếu dùng
SO2 khơng đúng liều lượng có thể làm rượu vang có mùi khó chịu, tiêu diệt vi khuẩn
có lợi, đồng thời cũng là tác nhân gây ngộ độc trong rượu vang.
f. Ép:
Ép xác quả với các thiết bị thép không rỉ, thép inox không bị acid ăn mịn, khơng
có vết sắt hoặc đồng.
g. Lọc – Làm trong:
lọc cuống với vang đỏ. Ở giai đoạn này thường xẩy ra quá trình lên men tự phát. Một
số kỹ thuật để ngăn ngừa hiện tượng trên là sử lý nước nho với SO 2 (Sulfit hóa) kéo
dài 12 – 24h, liều lượng 15 – 29g SO2/100 lít nho. Tuy nhiên, nếu dùng quá liều
lượng cho phép, SO2 sẽ gây ngộ độc cho người tiêu dùng (lượng SO2 cho phép khơng
vượt q 450 mg/l).
 Giai đoạn lên men chính

h. Lên men - ủ:
Lên men rượu vang chia thành các giai đoạn:


Trong q trình lên men có bổ sung tannin 10g/100 lít dịch nước nho, nhằm kết
tủa các protein giúp nho trong hơn.
Trong sản xuất rượu vang không khi nào dùng chất màu nhân tạo để tạo màu cho
rượu vang, màu của rượu phải hoàn toàn tự nhiên của trái cây dùng để sản xuất rượu
vang. Lên men ở nhiệt độ 20-22 0C kéo dài trong 10-20 ngày, nhiệt độ cao 25-28 0C,
trong khoảng 6-7 ngày. Cuối giai đoạn lên men chính dịch lên men trong dần vì
protein và pectin lắng xuống, kết thúc quá trình lên men rượu đạt khoảng 8-10% cồn.
Để rượu đạt được sự hài hòa và ổn định của mùi vị và chất lượng thì rượu phải
được ủ nhằm làm cho khí ơxi tác động thật chậm.

Rượu vang ủ trong bồn thép lớn sẽ phải ủ lâu hơn rượu vang để trong các bồn
hoặc trong các thùng bằng gỗ.
Ủ ở nhiệt độ 4 – 100C để rượu vang hồn thiện hương vị đặc trưng. Thời gian
ủ có thể là vài tháng, vài năm, thậm chí hàng chục hoặc hàng trăm năm.

 Lên men phụ
Giai đoạn này cần làm cho độ cồn của rượu đạt 12- 14 0. Nếu khơng đạt có thể bổ
sung thêm cồn, sau đó tồn trữ 100C trong ít nhất 10 ngày, sau khi tách cặn tiếp tục trữ.
- Trường hợp sau khi lên men, lượng cồn tạo thành quá thấp sẻ xảy ra hiện tượng chua
rượu do quá trình lên men axit axetic, người ta bổ sung thêm cồn để triệt tiêu quá trình lên
men axit axetic và tăng lượng cồn. Cồn được sử dụng phải là cồn thực phẩm.
Lưu ý:
Một số nơi cho loại cồn công nghiệp vào để tăng độ cồn của rượu. Cồn công nghiệp chứa
một lượng lớn methanol nhất định có độc tính lớn nếu uống từ 5 – 10 ml methanol sẽ dẫn
đến ngộ độc. Nếu trên 10 ml sẽ gây mù, 30 ml gây tử vong.
Theo luật pháp của các nước sản xuất rượu vang, chỉ được phép cho thêm đường, một số
các chất kích thích đã được xác định vào nước quả trước khi lên men, sau khi lên men xong
gạn lọc và ổn định rượu, khơng được phép cho thêm bất kỳ chất gì vào (đường, cồn, axit,
chất màu, chất thơm,…)
 Một số điểm lưu ý trước khi tiến hành lên men:

-

Nghiền nho, nếu nghiền kỹ giúp hòa tan các chất màu, tannin, chất

thơm được triệt để nhưng nó lại làm cho rượu khó trong sau này, do đó khuynh hướng


là nghiền nhẹ quả, không nát hết, đủ để cho q trình lên men tốt rượu vẫn trong,
khơng q chát.

-

Bổ sung đường: độ đường của nước quả thường thay đổi trong giới hạn

rộng, việc điều chỉnh độ đường là rất cần thiết, độ đường 10-150 Bx thì dễ lên men, độ
cồn hình thành khoảng 7-80, rượu lạt thường độ đường 20-220 Bx là thích hợp.
-

Điều chỉnh độ chua: pH tự nhiên của nước quả thích hợp cho lên men là

2,8-3,8, tối thích 3,2-3,5, pH thấp q có thể điều chỉnh bằng cách them caxi
cacbonat, độ chua chưa đủ có thể bổ sung thêm acid tactric, acid xitric,… Trong sản
xuất rượu vang theo kinh nghiệm có thể trộn quả xanh và quả chín với tỷ lệ thích hợp
để đạt độ chua.
-

Bổ sung chất kích thích lên men: đa số quả nhiệt đới nhiều nước, chín

nhanh, việc bổ sung muối amon và một số vitamin như B 1 có tác dụng giúp quá trình
lên men nhanh hơn, lượng cồn tạo thành nhiều hơn, đối với muối amon liều lường
dùng là 0,05-0,1 g/l, nếu cho hỗn hợp vitamin càng tốt, cịn khơng bổ sung vitamin B 1
0,5 mg/l.
Thiết bị lên men tránh các thiết bị bằng kim loại như: Fe, Cu,… Vì tannin cùng
các acid trong dịch sẽ oxy hóa Fe, Cu tạo thành các muối kim loại, gây ra mùi khó
chịu và gây ngộ độc, đặc biệt là muối đồng (tình trạng này thường xảy ra ở những
nơi sản xuất rượu quy mơ nhỏ, thiết bị thiếu và khơng đủ trình độ).

Giai đoạn đầu của q trình lên men có thể nhiễm một số loại nấm mốc:
-

Pichia oxy hóa rượu thành acid hữu cơ

-

Zygopichia sinh ra acid citric và acid axetic cũng như nhiều acid

khác
-

Penicillin (mốc xanh) có khả năng tiết độc

CHƯƠNG IV

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
CHƯƠNG V
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Phụ lục
-hình thao tác lên men rv
-1 số sản phẩm rv o vn
-


Tài liệu tham khảo