ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ BSA TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY LÊN KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI CHUỘT GIAI ĐOẠN TRƯỚC LÀM TỔ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC



PHẠM THỊ LAN HƯƠNG


ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ BSA (BOVINE SERUM ALBUMIN) TRONG MÔI
TRƯỜNG NUÔI CẤY LÊN KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI CHUỘT GIAI
ĐOẠN TRƯỚC LÀM TỔ




KHĨA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯC





NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
ThS. BS. ĐỖ QUANG MINH

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2004

Mục lục
Trang
Đặt vấn đề 1
Tổng quan tài liệu
I. SINH SẢN TRÊN CHUỘT 2
I.1. Nội tiết sinh sản 2
I.2. Sự phát triển và trưởng thành của trứng 2
I.3. Sự rụng trứng 2
I.4. Sự thụ tinh 3
I.5. Sự phát triển của phôi chuột giai đoạn sau làm tổ 3
I.6. Các giai đoạn phát triển chính của phôi chuột 5
II. QUY TRÌNH TẠO PHÔI - THU NHẬN VÀ NUÔI CẤY …. 6
II.1. Quy trình giao phối tự nhiên 6
II.1.1. Sự thụ tinh trong cơ thể (in vivo) 7
II.1.2. Sự thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro) 7
II.2. Kích thích buồng trứng (superovulation) 8
II.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của kích thích …. 8
II.3.1. Ảnh hưởng của tuổi và trọng lượng 8
II.3.2. Liều kích dục tố 8á
II.4. Thu nhận phôi 9
II.4.1. Block (sự kiềm hãm) ở giai đoạn 2 tế bào 10
II.4.2. Phôi dâu 10
II.4.3. Phôi nang 10
III. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY PHÔI GIAI ĐOẠN TRƯỚC ….. 11
III.1. Lòch sử nghiên cứu môi trường 11
III.2. Các loại môi trường nuôi cấy phôi động vật có vú 12
III.3. Các thành phần chính trong môi trường nuôi cấy phôi chuột 13
III.3.1. Nước 13

III.3.2. Ion 13
III.3.3. Carbohydrate 13
III.3.4. Amino acid 14
III.3.5. Chất bắt giữ kim loại nặng 15
III.3.6. Chất chống oxi hóa 15
III.3.7. Kháng sinh 16
III.3.8. Protein/Các đại phân tử 16
III.3.9. Ammonium 17
IV. THỂ TÍCH Ủ 17
V. KHÔNG KHÍ 18
VI. ALBUMIN HUYẾT THANH BÒ……… 18
VI.1. BSA 18
VI.2. BSA và sự tổng hợp BSA trong cơ thể động vật có vú 19
VI.3. Thành phần amino acid trong BSA 19
VI.4. Đặc tính chức năng của BSA 20
VI.4.1. Tạo bọt 20
VI.4.2. Khả năng đông đặc của BSA 20
VI.4.3. Phối tử kết nối 21
VI.5. Những nghiên cứu về vai trò của BSA trong …. 21
VII. ỨNG DỤNG THỰC TIỄN 23
Vật liệu – Phương pháp
I. ĐỐI TƯNG NGHIÊN CỨU 25
II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
III. DỤNG CỤ – THIẾT BỊ – HOÁ CHẤT 25
IV.1. Dụng cụ 25
IV.2. Thiết bò 26
IV.3. Hoá chất 26
IV. QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM 27
IV.1. Ổn đònh chuột – kích thích buồng trứng – phối 29
IV.2. Mổ chuột – thu nhận phôi 2 tế bào 31

IV.3. Theo dõi sự phát triển của phôi và ghi nhện kết quả 36
V. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ 37
Kết quả – Biện luận
I. KẾT QUẢ 40
I.1. Đặc điểm lô thí nghiệm nghiên cứu 40
I.2. Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ BSA …. 42
I.3. Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của số lượng phôi/ 50µl …. 43
I.4. Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng trong kích thích buồng trứng 45
I.5. Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của nguồn chuột và ….. 45
I.6. Kết quả thí nghiệm kiểm tra vai trò của nút nhầy âm đạo …. 45
II. BÀN LUẬN 47
Kết luận – Đề nghò
I. KẾT LUẬN 51
II. ĐỀ NGHỊ 52
Tài liệu tham khảo 53
Phụ lục 1
Phụ lục 2
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nghiên cứu về nuôi cấy phôi là bước khởi đầu cho rất nhiều lónh vực: chuyển
gen, công nghệ hỗ trợ sinh sản, công nghệ cloning, tế bào mầm, bảo tồn nguồn
gen….Trên thế giới từ năm 1956, Wesley Whitten đã công bố thành công trong nuôi
cấy phôi chuột giai đoạn 8 tế bào và một số phôi chuột 4 tế bào thành phôi nang, và
cũng Whitten vào năm 1957, đã thành công trong nuôi cấy phôi chuột 2 tế bào phát
triển thành phôi nang. Cho tới ngày nay, việc nuôi cấy phôi chuột đã trở nên phổ biến,
và nó chỉ còn là bước khởi đầu cho những nghiên cứu sâu hơn về gen, vi thao tác, tế
bào mầm …
Đối với Việt Nam, mặc dù là một nước có nền nghiên cứu khoa học chỉ mới
phát triển với phương châm đi trước đón đầu, việc nghiên cứu tạo ra một quy trình nuôi
cấy phôi hoàn chỉnh phù hợp với điều kiện trong nước vẫn là một bước khởi đầu cơ bản
cho những thí nghiệm tiếp theo sau trong các lónh vực nghiên cứu trên.

Tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên, một trong những trung tâm đào tạo và
nghiên cứu hàng đầu trong nước, năm 2003 với đề tài nghiên cứu của Phạm Ngọc Thụy
Vi, đã bước đầu thành công trong nuôi cấy phôi chuột 2 tế bào lên phôi nang tuy nhiên
kết quả vẫn còn thấp và chưa ổn đò 1nh. Kết quả này có thể do rất nhiều nguyên
nhân: điều kiện nuôi cấy, môi trường nuôi cấy, chủng chuột …
Có rất nhiều nghiên cứu chứng minh rằng không có môi trường nuôi cấy tối ưu
chung và những phòng thí nghiệm khác nhau có những công thức môi trường khác nhau
để có thể đạt được kết quả nuôi cấy gần với sự phát triển trong cơ thể. Vì vậy với khảo
sát đánh giá trên những thí nghiệm vừa qua cho thấy yếu tố có khả năng ảnh hưởng
cao nhất tới kết quả nuôi cấy là môi trường không phù hợp.
Vì vậy đề tài này được tiến hành với mục tiêu xác đònh nồng độ BSA tối ưu
trong môi trường nuôi cấy phôi chuột từ giai đoạn 2 tế bào lên phôi nang.
Bên cạnh đó, trong thí nghiệm này còn tiến hành khảo sát ảnh hưởng của số
lượng phôi chuột trong một thể tích môi trường nuôi cấy cố đònh lên khả năng phát
triển của phôi chuột 2 tế bào thành phôi nang, và khảo sát điều kiện ổn đònh chuột,
nguồn chuột cũng như vai trò của việc kiểm tra nút nhầy âm đạo trong đánh giá kết
quả thụ tinh.
III. SINH SẢN TRÊN CHUỘT
III.1. Nội tiết sinh sản
Hormone kích thích nang trứng phát triển FSH (follicle stimulating hormone) do
tuyến yên tiết ra kích thích nhóm nang trứng tiếp tục tăng trưởng.
Hormone kích thích rụng trứng LH (Luteinizing hormone) được tuyến yên tiết
ra, phá vỡ sự kiềm hãm phân bào giảm nhiễm, bắt đầu sự phân bào giảm nhiễm đầu
tiên tạo ra thể cực thứ I, sau đó trứng trưởng thành và được phóng thích.
Mặc dù về cơ chế sự rụng trứng vẫn chưa được hiểu rõ, việc trứng được phóng
thích ra khỏi nang trứng là nhờ vào sự tăng kích thích của LH.
III.2.
Sự phát triển và trưởng thành của trứng
[5]
Ở chuột cái 5 ngày tuổi, tất cả trứng ở giai đoạn diplotene (DNA đã nhân đôi)

trong tiền kì của lần phân bào giảm nhiễm thứ nhất. Mỗi trứng chứa trong nang trứng
và được bao bọc bởi lớp tế bào hạt. Hơn một nửa những nang noãn nguyên thuỷ hiện
diện trong buồng trứng lúc sinh ra sẽ thoái hóa trước 3 – 5 tuần tuổi, nguyên nhân của
điều này vẫn chưa biết rõ. Chuột cái thành thục về giới tính vào khoảng 6 tuần đến 4
tháng tuổi, tuỳ thuộc vào chủng chuột và điều kiện môi trường. Khi chuột cái trưởng
thành mỗi buồng trứng chứa khoảng 10
4
trứng ở những giai đoạn phát triển khác nhau.
III.3. Sự rụng trứng
Chu kì rụng trứng bình thường xảy ra 4 ngày một lần. Tuy nhiên, thời gian chu
kì rụng trứng có thể bò ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố và có thể được điều khiển bởi kích
thích bằng hormone (kích thích buồng trứng). Trứng tăng trưởng về kích thước và dần
bước vào giai đoạn cuối của giảm phân khi đáp ứng với sự kích thích của hormone.
Trong một chu kì rụng trứng tự nhiên chỉ có một số nang noãn đáp ứng với sự
tăng FSH do tuyến yên sản xuất. Sự rụng trứng xảy ra khi có sự tăng LH được tuyến
yên sản xuất. Dưới sự kích thích của LH, nhân mất đi màng, nhiễm sắc thể tập trung
trên sợi nhiễm sắc và chia đôi, cuối cùng diễn ra sự phân bào giảm nhiễm thứ nhất và
tạo thể cực thứ I. Trứng được phóng thích khỏi nang noãn.Trứng rụng vào ống dẫn
trứng, vào lúc này đầu ngoại biên của ống dẫn trứng trở nên ứ máu và trương phòng
lên thành đoạn bóng nơi sự thụ tinh sẽ diễn ra. Trong sự rụng trứng tự nhiên, 8 – 12
trứng được phóng thích (tuỳ thuộc vào chủng chuột) nhưng tiến trình này không đồng
bộ và xảy ra trong khoảng thời gian 2- 3 giờ.
III.4. Sự thụ tinh
Khoảng 58x10
6
tinh trùng được phóng vào ống dẫn trứng trong mỗi lần phóng
tinh. Vài tinh trùng tới được đoạn bóng trong khoảng 5 phút và sự thụ tinh xảy ra trong
khoảng 1 giờ.
Sự thụ tinh khởi động quá trình phân bào giảm nhiễm thứ 2 và tạo thể cực thứ 2.
III.5. Sự phát triển của phôi chuột giai đoạn sau làm tổ

[13]




Hình 1: Sơ đồ sự phát triển ban đầu của phôi

Thụ tinh: là sự kết hợp của giao tử đực và giao tử cái tạo thành hợp tử và cũng
là mốc bắt đầu sự phát triển của hợp tử.
Sự phân chia: là chuỗi phân bào nguyên nhiễm nhờ đó một tế bào ban đầu
(hợp tử) phân chia thành nhiều tế bào (phôi bào- blastomeres).
Các đặc điểm của sự phát triển phôi ban đầu ở động vật có vú:
− Sự thụ tinh và phân chia sớm xảy ra ở 2 nhánh vòi trứng
− Sự phân chia xảy ra chậm từ 12 – 24 giờ.
− Sự phân chia ban đầu không đồng bộ.
− Bộ gen được hoạt hóa khi hợp tử bắt đầu phân chia.


Trứng
Thụ tinh
Hợp tử
Phân chia
Phôi bào
Tinh trùng
Hình 2: Sự phát triển của phôi sau khi thụ tinh. A: trứng đã thụ tinh B: phôi 2 tế bào
C: phôi dâu -phôi 8 tế bào D: phôi 16 tế bào E: phôi nang
Khó khăn của việc nghiên cứu ở những loài động vật có vú:
Thể cực
Tiền nhân đực và cáiMàng pellucida
Trứng đã được

thụ tinh
Phôi 2 tế bào
1
1
/
2
ngày
Phôi 8 tế bào
2
1
/
2
ngày
Phôi 16 tế bào
3 n
gày
Phôi nang
4 n
gày
Kết
khối
Khoang
phôi
Ngoại
phôi bì
Khối tế bào
bên trong
A
B
C

D
E
− Trứng của chúng nhỏ nhất trong giới động vật (hợp tử của người có kích
thước là 120µm, của chuột khoảng 80µm).
− Số lượng trứng của động vật có vú được tạo ra ít.
− Phôi của động vật có vú phát triển bên trong thay vì bên ngoài cơ thể.
III.6. Các giai đoạn phát triển chính của phôi chuột
[5,8,9]

Giai đoạn tế bào rời (Cleavage): số lượng tế bào trong phôi có thể đếm được dễ
dàng cho tới lúc xảy ra sự kết khối ở giai đoạn 8 tế bào, làm hình dạng tế bào trở nên
mờ nhạt.
Giai đoạn kết khối (Compaction): xảy ra vào 3,5 – 7,5 giờ sau khi bắt đầu chu
kì tế bào thứ 4, tức ở giai đoạn phôi 8 tế bào.
Phân chia tới giai đoạn 16 tế bào: kết thúc chu kì tế bào thứ 4 và bắt đầu chu kì
tế bào thứ 5, diễn ra sự phân bào nguyên nhiễm sau tách khối và kết khối trở lại sau
khi phân bào nguyên nhiễm kết thúc.
Hình thành khoang phôi (Blastocoel): chu kì tế bào thứ 6, biểu thò sớm nhất của
sự chuyên chở chất dòch xảy ra khi phôi tiến gần tới số lượng 32 tế bào và hình thành
không bào chứa đầy dòch lỏng (hoặc 2 không bào phồng to ra và sau đó hợp nhất lại).
IV. QUY TRÌNH TẠO PHÔI - THU NHẬN VÀ NUÔI CẤY TRONG ỐNG
NGHIỆM
IV.1. Quy trình giao phối tự nhiên
Chuột cái được ổn đònh theo chu kì sáng tối thường rụng trứng theo chu kì 3-4
ngày, 3-4 giờ sau khi bắt đầu chu kì tối. Chuột đực được ổn đònh trong cùng điều kiện
sẽ giao phối với con cái vào chu kì động dục khoảng giữa chu kì tối.


A
B

Hình 3: A: phôi giai đoạn 8 tế bào chưa kết khối; B: phôi đã kết khối-không
nhìn thấy rõ tế bào
Có thể xác đònh chuột cái vào chu kì động dục bằng cách xác đònh màu sắc, độ
nhầy, và sự sưng đỏ của âm đạo.

Giai đoạn của chu kì động dục Hình thái của âm đạo
Không động dục Âm đạo có độ mở nhỏ, phần mô
không đỏ và rất nhầy.
Tiền động dục Âm đạo hở, mô đỏ hồng và nhầy,
có nhiều nếp gấp theo chiều dọc hoặc
những nếp nhăn rõ ràng trên cả mép
lưng và mép bụng.
Động dục Âm đạo tương tự như tiền động
dục, nhưng mô hồng sáng hơn và ít
nhầy, và những nếp nhăn rõ ràng hơn.
Sau động dục 1 Mô âm đạo tái nhạt đi và khô;
mép lưng không phù như trong thời
gian động dục.
Sau động dục 2 Tương tự như sau động dục 1
nhưng môi ít nhợt nhạt hơn và lùi lại;
những mảnh vụn tế bào hơi trắng có
thể làm đầy thành trong hoặc lấp đầy
âm đạo).
Bảng 1: Cách xác đònh giai đoạn của chu kì động dục chuột cái dựa vào hình thái của
âm đạo.
Chuột cái (từ 6 tuần đến 4 tháng tuổi) được kiểm tra và cho tiếp xúc với chuột
đực (1 hoặc 2 chuột cái trong một chuồng với 1 chuột đực).
Con đực trưởng thành từ 6-8 tuần tuổi (tuỳ thuộc vào chủng chuột), nên nhốt
trong chuồng riêng.
Buổi sáng sau khi giao phối chuột cái được kiểm tra sự xuất hiện nút giao phối-

tức nút nhầy âm đạo. Nút nhầy gồm protein bò đông lại từ dòch tinh trùng của con đực
và có thể được nhìn thấy dễ dàng trong hầu hết các chủng chuột. Nút nhầy âm đạo
thường tan rã khoảng 12-14 giờ sau khi xảy ra sự giao phối. Thông thường, 50% chuột
cái được chọn sẽ phối.
II.1.1. Sự thụ tinh trong cơ thể (in vivo)
Để sự thụ tinh và sự phát triển tiếp theo sau được đồng bộ, thời gian tiêm
hormone cần đảm bảo cho sự thụ tinh xảy ra trước khi rụng trứng- nghóa là trứng vừa
rụng được thụ tinh ngay lập tức, không trùng lấp với thời gian LH nội sinh. Nếu có sự
khác nhau trong tuổi phát triển của phôi là do sự lệch chế độ tiêm thuốc làm kéo dài
thời gian rụng trứng và thời gian giao phối dẫn đến sự không đồng bộ ở phôi thu nhận.
Trứng đã thụ tinh có thể phân biệt với trứng chưa thụ tinh bằng cách quan sát sự xuất
hiện thể cực thứ 2.
Nên tránh sự thụ tinh với trứng đã rụng quá 12 giờ vì sẽ làm tăng hiện tượng tự
phát hoạt tính sinh sản đơn tính của trứng (tức trứng sẽ phân chia giả và sẽ thoái hóa
dần sau đó). Chuột giao phối hiệu quả nếu sử dụng cân đối và không quá thường
xuyên.
II.1.2. Sự thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro)
Phương pháp này có 2 lợi điểm:
Đồng bộ hơn sự thụ tinh trong cơ thể do sự thụ tinh có thể được thiết lập thời
gian chính xác.
Tiến trình có thể tách khỏi chu kì ngày đêm thông thường, vì vậy cho phép sự
thụ tinh của trứng diễn ra theo thời gian thí nghiệm cho phép.
IV.2. Kích thích buồng trứng (superovulation)
Đối với những thí nghiệm cần nhiều phôi giai đoạn trước làm tổ thì phải tiêm
kích dục tố cho chuột cái trước khi cho phối để tăng số lượng trứng rụng.
Hormone kích thích nang trứng phát triển - FSH được thay thế bằng kích dục tố
thu từ huyết thanh ngựa cái mang thai - PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin).
Hormone kích thích rụng trứng - LH được thay bằng kích dục tố màng đệm ở
người - hCG (human chorionic gonadotropin).
Hiệu quả của việc sử dụng kích dục tố gây kích thích buồng trứng ở chuột tuỳ

thuộc vào nhiều yếu tố: tuổi, trọng lượng chuột, liều kích dục tố, thời gian tiêm kích
dục tố và chủng chuột. Số lượng trứng rụng được thụ tinh tuỳ thuộc vào khả năng sản
xuất tinh trùng của chuột đực.
IV.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của kích thích buồng trứng
II.3.1. Ảnh hưởng của tuổi và trọng lượng
Sự trưởng thành của con cái là yếu tố ảnh hưởng tới số lượng của trứng được
kích thích. Tuổi tốt nhất cho sự kích thích buồng trứng thay đổi tuỳ thuộc vào chủng
chuột. Vào giai đoạn phát triển tốt nhất, sự chín nang noãn tăng đột ngột làm tăng số
lượng nang noãn có khả năng phản ứng với FSH tối đa.
Tuy nhiên, tình trạng dinh dưỡng và sức khoẻ của chuột cái cũng có thể ảnh
hưởng đến sự chín của nang noãn. Những con vật thiếu trọng lượng và bệnh dẫn đến sự
chậm phát triển và giảm số lượng trứng trong việc gây kích thích buồng trứng.
II.3.2. Liều kích dục tố
Hai loại kích dục tố được sử dụng gây kích thích buồng trứng: PMSG và hCG.
Liều tiêm cho chuột từ 5 - 10UI. Thuốc được tiêm vào khoang bụng chuột cái.
Thuốc khi đã pha có thể trữ ở -20
0
C trong khoảng 1 tháng. Thường pha thuốc
sao cho lượng tiêm 1ml có chứa đủ liều cần tiêm.
PMSG là hormone đầu tiên tiêm cho chuột, có tác dụng kích thích sự phát triển
của nang noãn.
hCG là hormone kích dục tố thứ 2 được tiêm cho chuột trong quy trình gây siêu
rụng trứng, có tác dụng làm trứng thoát khỏi nang noãn.
III.4. Thu nhận phôi
Sự phát triển của phôi từ giai đoạn 2 tế bào lên 8 tế bào và 16 tế bào xảy
ra ở vòi trứng trong khoảng thời gian 47 giờ. Chu kì tế bào thứ 2 cũng giống với chu kì
đầu kéo dài khoảng 20 giờ nhưng trái lại chu kì thứ 3 và những chu kì sau lại giống với
chu kì của tế bào sinh dưỡng 12 giờ. Vì vậy, phôi ở từng giai đoạn nên được thu nhận
từ vòi trứng trong thời gian có thể đoán trước sau khi tiêm hCG hoặc thời gian được
phỏng đoán của sự thụ tinh trong cơ thể.

Hình 4: Sự phát triển và di chuyển của phôi trong vòi trứng

III.4.1. Block (sự kìm hãm) ở giai đoạn 2 tế bào
Đối với phần lớn các chủng chuột, trứng và phôi khi nuôi cấy ở bất cứ giai đoạn
nào trước giai đoạn 2 tế bào thường bò kiềm hãm sự phát triển ở pha G
2
của chu kì tế
bào thứ 2 – điều này được cho là sự block ở giai đoạn phôi 2 tế bào. Dù vậy, vẫn có
một vài chủng chuột có trứng và phôi không bò block ở giai đoạn 2 tế bào. (Trong thí
nghiệm so sánh giữa chủng chuột bò block và không bò block cho thấy khả năng phôi
ngừng phát triển ở giai đoạn 2 tế bào được xác đònh chỉ bởi kiểu gen của giao tử cái và
không liên quan đến kiểu gen của giao tử đực.)
Nếu việc thu nhận phôi từ vòi trứng được trì hoãn cho tới giai đoạn phôi 2 tế
bào muộn (khoảng 48 giờ sau khi tiêm hCG) thì sự phát triển trong ống nghiệm với môi
trường thí nghiệm không bò cản trở. Việc thu nhận phôi ở giai đoạn 2 tế bào muộn rất
quan trọng để có thể có được sự phát triển bình thường của chúng lên phôi nang trong
nuôi cấy. Điều này có thể thực hiện bằng cách thu nhận phôi từ 36 – 40 giờ sau khi
tiêm hCG.
III.4.2. Phôi dâu
Phôi dâu là sự kết hợp thành khối của phôi bào, điều này chỉ mang tính chất mô
tả, có thể bao quát tất cả các giai đoạn trong quá trình phát triển từ khối 8 tế bào tới
giai đoạn 16 hoặc 32 tế bào trước khi tiến lên giai đoạn hình thành khoang phôi. Bằng
cách quan sát sự phát triển của phôi nuôi cấy trong ống nghiệm suốt thời gian này
người ta có thể phân chia giai đoạn phát triển của chúng từ khi thành phần phôi bào bắt
đầu kết khối ở giai đoạn phôi 8 tế bào, tách khối suốt sự gián phân đến giai đoạn 16 tế
bào và sau đó thì kết khối trở lại. Giai đoạn phôi dâu muộn được quan tâm khi phôi 16
tế bào tới 32 tế bào, khi vẫn chưa tạo khoang hổng (khoảng 84 giờ sau khi tiêm hCG)
và chúng di chuyển xuống ống tử cung chỗ nối liền vòi trứng với tử cung. Khi thu nhận

phôi ở giai đoạn này nên thu nhận cả ở vòi trứng và phần đầu tử cung.
III.4.3. Phôi nang
Phôi xuống tới tử cung và bắt đầu tạo khoang hổng vào khoảng 94 giờ sau khi
tiêm hCG, khi phôi có khoảng 32 tế bào (nghóa là hầu hết các tế bào tiến tới kết thúc
chu kì tế bào thứ 5). Phôi nang sẽ tiếp tục nở phồng ra khi thành phần tế bào của chúng
phát triển qua chu kì 2 tế bào tiếp theo. Khi chúng chứa khoảng 128 tế bào (khoảng
120 giờ sau khi tiêm hCG) màng zona bắt đầu mỏng dần và phôi nang thoát nang, kết
nối với biểu mô tử cung, bắt đầu tiến trình làm tổ.
Hình 5: Các giai đoạn phát triển của phôi chuột. A-phôi 2 tế bào; B-phôi 4 tế bào; C- phôi
8 tế bào; D-phôi dâu sớm; E-phôi dâu muộn; F-phôi nang
III.5. Môi trường nuôi cấy phôi giai đoạn trước làm tổ
III.5.1. Lòch sử nghiên cứu môi trường
Whitten là người công bố đầu tiên sự phát triển của phôi chuột 8 tế bào thành
phôi nang trong nuôi cấy sử dụng môi trường Krebs-Ringer bicarbonate được bổ sung
glucose và albumin huyết thanh bò (BSA) vào năm 1956. Cùng lúc đó là các nghiên
cứu về những nhân tố ảnh hưởng lên sự làm tổ (implantation) của McLaren và Mitchie
năm 1956; năm 1958 McLaren và Biggers đã thành công khi chuyển phôi nang từ nuôi
cấy trong ống nghiệm vào tử cung của chuột cái được mang thai giả.
Năm 1963, R. Brinster đã phát triển phương pháp giọt nuôi cấy và phương pháp
này được sử dụng rộng rãi tới ngày nay chủ yếu trên nuôi cấy phôi chuột.
Brinster đã nghiên cứu về tính chất của môi trường nuôi cấy, ảnh hưởng của sự
thay đổi áp suất thẩm thấu, pH, thành phần amino acid, những nguồn năng lượng và đã
thiết lập nền móng sự nuôi cấy phôi chuột giai đoạn trước làm tổ. Với những nghiên
cứu vào năm 1968 – 1969, ông đã công bố môi trường căn bản đầu tiên nuôi cấy tế
bào trứng BMOC2. Một vài môi trường khác dựa trên BMOC2 được phát triển tiếp đó,
bao gồm môi trường thay đổi Whitten (do Whitten phát triên năm 1971) và môi trường
M1.
Vào năm 1982 Quinn đã thay thế thành phần đệm bicarbonate bằng đệm
HEPES (hypoxyethyl-1-piperazineenthanesulforic acid) để duy trì pH ổn đònh cho chọn
A

B
C
D
F
E
phôi và cho những thí nghiệm mà phôi được thao tác trong một thời gian dài bên ngoài
tủ CO
2
.
Gần 20 năm phát triển, đã có một vài thay đổi trong điều kiện nuôi cấy phôi
chuột, sự phát triển môi trường nuôi cấy phôi chuột thế hệ thứ 2 được tiến hành dựa
trên những hiểu biết tốt hơn về yếu tố sinh lý học căn bản, sự trao đổi chất, và cũng đã
có nhiều cải tiến trong kó thuật nuôi cấy phôi.
III.5.2. Các loại môi trường nuôi cấy phôi động vật có vú
Môi trường được sử dụng cho nuôi cấy phôi động vật có vú thường thuộc 1 trong
3 loại.
Dung dòch muối đơn giản được bổ sung những chất nền năng lượng (KSOM,
Earle’s, CZB, M16, T6).
Môi trường này được hình thành đầu tiên để cung cấp sự phát triển giao tử
những chủng chuột lai nào đó với chủng lai F1 của chúng. Từ những loại môi trường
này người ta đã tạo ra môi trường dòch ống dẫn trứng ở người (HTF). Sau hơn 30 năm
phát triển, việc tạo ra những loại môi trường này có một số thay đổi: môi trường muối
đơn giản thường được bổ sung thêm huyết thanh hoặc với albumin huyết thanh.
Môi trường nuôi cấy mô phức tạp (Ham’s F-10).
Môi trường này có giá trò về mặt thương mại và được thiết kế cho nuôi cấy tế
bào sinh dưỡng (somatic cell). Loại môi trường này phức tạp hơn nhiều, có chứa amino
acid, vitamin, tiền thân nucleic acid, kim loại chuyển tiếp, thường được bổ sung 5-20%
huyết thanh. Tuy nhiên cần chú ý: nó không được thiết kế cho mục đích nuôi cấy phôi.
Môi trường liên tục.
Môi trường này được phát triển gần đây, dựa trên những thay đổi sinh lý của

phôi và nhu cầu dinh dưỡng khi phôi phát triển từ giao tử tới phôi nang. Ví dụ điển hình
của loại môi trường này là G
1,
G
2
được Gardner (1994) và Barners (1995) xây dựng cho
nuôi cấy phôi trước và sau khi kết khối.
III.5.3. Các thành phần chính trong môi trường nuôi cấy phôi chuột
II.3.1. Nước
Nước luôn là thành phần quan trọng của bất kì môi trường nào, chiếm khoảng
99% thành phần. Nguồn gốc và sự tinh sạch của nước được sử dụng trong môi trường là
yếu tố quan trọng nhất đảm bảo chất lượng môi trường. Khả năng phát triển của phôi
trong nuôi cấy có liên quan tuyệt đối với chất lượng của nước. Whittingham đã chứng
minh rằng sự phát triển của phôi chuột 2 tế bào tới phôi nang trong nuôi cấy tăng khi
môi trường sử dụng nước được chưng cất 3 lần so với môi trường sử dụng nước chưng
cất 1 lần hay 2 lần. Nước được sử dụng nên được kiểm tra nội độc tố và lượng độc tố
phải ít hơn 0,125IUml.
II.3.2. Ion
Vai trò của ion trong suốt quá trình phát triển phôi chuột giai đoạn trước làm tổ
được biết rất ít. Dòch ống dẫn trứng của động vật có vú có nồng độ cao Kali và Clo, và
áp suất thẩm thấu toàn diện cao. Tuy nhiên khi người ta sử dụng dung dòch muối được
cân bằng áp suất thẩm thấu cao và được bổ sung nguồn năng lượng carbohydrate thì lại
không thu được mức phát triển cao của phôi.
II.3.3. Carbohydrate
Carbohydrate hiện diện trong dòch ống sinh sản của con cái, lượng carbohydrate
khác nhau giữa ống dẫn trứng và tử cung, lượng này cũng thay đổi theo chu kì.
Cùng với amino acid, carbohyrate là nguồn năng lượng chính cho sự phát triển
của phôi. Hầu hết môi trường nuôi cấy phôi đều có chứa pyruvate, lactate, và glucose.
Trứng và giao tử chuột sử dụng glucose ít hơn so với pyruvate. Nhưng vào thời gian kết
khối chúng lại tăng hấp thu glucose, và glucose trở thành nguồn năng lượng chính vào

giai đoạn phôi nang. Những nghiên cứu về việc hấp thu chất dinh dưỡng trong nuôi cấy
phôi sớm cho thấy rõ ràng pyruvate là nguồn năng lượng chính.
Đối với phôi chuột, lactate có thể được sử dụng như nguồn năng lượng ở giai
đoạn 2 tế bào và hoạt động hiệp lực với pyruvate. Đã có những nghiên cứu đối lập với
nhau về nồng độ tối ưu của lactate trong môi trường nuôi cấy phôi chuột phát triển tới
giai đoạn phôi nang. Cross và Brinster cho nồng độ tối ưu là 30mM cho sự phát triển từ
giao tử tới phôi nang. Trong khi có những nghiên cứu khác cho rằng nồng độ tối ưu là
10mM. Những nghiên cứu tiếp theo cho thấy rằng phôi chuột từ giao tử tới giai đoạn 8
tế bào cần nồng độ lactate cao (20mM), nhưng khi thời gian nuôi cấy kéo dài tới phôi
dâu thì môi trường tối ưu lại có nồng độ lactate thấp hơn.
Điều quan trọng là hầu hết lactate trong môi trường nuôi cấy phôi trộn lẫn
50:50 giữa D- và L-isomer trong dòch sodium lactate. Trong đó chỉ có L-lactate có hoạt
tính sinh học, vì vậy nồng độ lactate trong môi trường chỉ là ½ lượng được cho vào môi
trường. Lactate là một acid yếu có thể vào phôi và gây sụt giảm pH nội bào vì vậy
sodium lactate được sử dụng trong môi trường nuôi cấy phải tránh sự có mặt của D-
isomer, mặc dù nó không có hoạt tính sinh học nhưng nó vẫn có thể gây ra sự sụt giảm
pH và làm ảnh hưởng tới sinh lý tế bào.
Những nghiên cứu gần đây đã chứng minh, glucose hiện diện đồng thời với
phosphate trong môi trường nuôi cấy làm chậm hoặc hãm lại sự phát triển, phân chia
của phôi ở giai đoạn 4 tế bào muộn và 8 tế bào sớm trong nuôi cấy. Tuy nhiên, sự ức
chế của glucose có thể được giảm bớt bởi amino acid và vitamin.
Tóm lại, phôi trong giai đoạn trước làm tổ trải qua sự thay đổi đột ngột trong
việc sử dụng carbohyrate khi phát triển. Pyruvate/lactate lúc đầu là những chất dinh
dưỡng ưu tiên và việc sử dụng glucose tăng rõ rệt vào giai đoạn sau kết khối.
II.3.4. Amino acid
Dòch ống dẫn trứng và tử cung có chứa một lượng đáng kể amino acid tự do
được phôi sử dụng và tổng hợp. Điều này cho thấy amino acid có vai trò sinh lý trước
và trong quá trình làm tổ của phôi động vật có vú.
Những nghiên cứu cho thấy, amino acid trong môi trường nuôi cấy làm tăng sự
phát triển của phôi đến giai đoạn phôi nang. Đối với sự phát triển của phôi chuột,

những amino acid không thiết yếu và glutamine trong môi trường nuôi cấy làm tăng tỉ
lệ phát triển của giao tử lên phôi nang vượt qua sự block ở giai đoạn phôi 2 tế bào
trong nuôi cấy trong ống nghiệm. Những amino acid không thiết yếu, glutamine kích
thích sự phân chia tế bào, hình thành phôi nang và thoát nang trong nuôi cấy phôi
chuột. Amino acid trong môi trường nuôi cấy giúp cho sự hình thành phôi nang cùng
thời gian với trong cơ thể.
Trong khi, việc thêm những amino acid không thiết yếu vào môi trường nuôi
cấy làm tăng số lượng tế bào phát triển lên thành phôi nang, được cho chỉ vào giai
đoạn từ hợp tử tới giai đoạn 8 tế bào. Sau khi kết khối, những amino acid không thiết
yếu và glutamine không kích thích sự phân chia nữa mặc dù chúng làm tăng sự hình
thành khoang phôi và thoát nang. Những amino acid thiết yếu với nồng độ thấp trong
vòi trứng làm giảm số lượng giao tử phát triển lên thành phôi nang trong nuôi cấy.
Việc ức chế sự phát triển này có thể do ảnh hưởng xấu của những amino acid thiết yếu
trong suốt sự phát triển của 4 chu kì tế bào đầu tiên. Tuy nhiên, sau giai đoạn 8 tế bào,
những amino acid thiết yếu lại kích thích sự phân chia và làm tăng sự phát triển của
khối tế bào bên trong phôi nang.
Ở chuột, phôi được nuôi tới giai đoạn 8 tế bào với môi trường có chứa những
amino acid không thiết yếu và chuyển vào con nhận sẽ làm tăng tỉ lệ làm tổ và phát
triển sau khi cấy chuyển. Trái lại nếu phôi được nuôi cấy tới giai đoạn phôi dâu hay
phôi nang rồi chuyển vào con cái thì tỉ lệ phát triển sẽ tăng khi nuôi trong môi trường
có chứa tất cả 20 loại amino acid.
II.3.5. Chất bắt giữ kim loại nặng
Việc thêm những chất bắt giữ kim loại nạêng vào môi trường nuôi cấy làm tăng
sự phát triển của phôi trong giai đoạn trước làm tổ. Thêm EDTA (Ethylenediamine
tetra-acetic acid) vào môi trường nuôi cấy làm tăng sự phát triển của giao tử chuột vượt
qua được giai đoạn phôi 2 tế bào và tăng sự phát triển lên phôi nang. Tuy nhiên, EDTA
chỉ có hiệu quả trong khoảng nồng độ giữa 10µM đến 150µM, nồng độ 200µM sẽ ức
chế sự phát triển lên phôi nang.
Những chất bắt giữ ion kim loại tự do khác như transferrin cũng được chứng
minh làm tăng sự phát triển của giao tử chuột lên phôi nang vượt qua được hiện tượng

block 2 tế bào. Người ta cho rằng transferrin làm tăng sự phát triển của phôi bằng cách
bắt giữ những ion sắt, tuy nhiên lại ngăn chặn triệt để oxy tự do trong môi trường nuôi
cấy là nguyên nhân gây ra stress oxi hoá đối với phôi.
Người ta đã chứng minh với môi trường có chứa EDTA, những amino acid
không thiết yếu và glutamine, việc có thêm transferrin không làm tăng sự phát triển
của phôi chuột lên giai đoạn phôi nang. Vì vậy, khi môi trường đã có EDTA và amino
acid thì transferrin là không cần thiết.
II.3.6. Chất chống oxi hóa
Người ta đã chứng minh rằng một trong những nguyên nhân làm chậm lại sự
phát triển của phôi ở giai đoạn trước làm tổ trong nuôi cấy so với sự phát triển trong cơ
thể là do stress oxi hóa. Nguyên nhân do nồng độ oxy cao, sự phơi bày ra ánh sáng và
sự có mặt của những kim loại chuyển tiếp trong môi trường nuôi cấy. Vì vậy, một vài
nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả của nhữmg chất chống oxi hóa lên sự phát triển
của phôi giai đoạn trước làm tổ, tuy nhiên tới nay vẫn còn rất nhiều tranh cãi.
II.3.7. Kháng sinh
Những kháng sinh như penicillin, streptomycin hoặc gentamycin thường có
trong môi trường nuôi cấy phôi. Khi rửa phôi trong môi trường có chứa kháng sinh có
thể tránh được sự nhiễm khuẩn.
II.3.8. Các đại phân tử
Đại phân tử được bổ sung vào môi trường nuôi cấy thường là albumin huyết
thanh. Bổ sung vào môi trường lượng lớn albumin huyết thanh làm tăng tính căng bề
mặt, giảm xu hướng trôi lơ lửng hoặc dính chặt vào thuỷ tinh hay plastic, giúp cho việc
thao tác với phôi sẽ trở nên dễ dàng hơn.
Albumin huyết thanh có thể hoạt động như chất bắt giữ làm bất hoạt các kim
loại nặng và những độc tố khác.
Albumin huyết thanh là chất đệm làm giảm tối thiểu sự thay đổi pH khi môi
trường được đưa ra khỏi tủ CO
2
.
Tuy nhiên, các đại phân tử xuất phát từ huyết thanh cũng là các nguyên nhân

dẫn đến nhiễm khuẩn và trong mỗi lô sản xuất đều có sự thay đổi đáng kể thành phần
albumin. Vì vậy, cần kiểm tra trước khi sử dụng đối với mỗi lô môi trường albumin
huyết thanh.
Polyvinyl pyrrolidone và polyvinyl alcohol được nghiên cứu cho khả năng trở
thành nguồn cung cấp đại phân tử phi sinh học thay cho albumin huyết thanh bò (BSA)
có nguy cơ gây nhiễm khuẩn. Nhưng những đại phân tử này không có chức năng như
BSA trong việc giảm sức căng bề mặt hoặc bắt giữ độc tố.
Một đại phân tử khác hiện diện trong ống sinh sản con cái là hyaluronan, khối
cao phân tử polysaccharide. Ở chuột, lượng hyaluronan tăng trong thời gian làm tổ.
Người ta đã chứng minh rằng không chỉ hyaluronan có thể thay thế albumin trong hệ
thống nuôi cấy phôi chuột và bò, mà còn làm tăng kết quả đáng kể trong việc chuyển
phôi. Tương tự với những kết quả của albumin tái tổ hợp, sự có mặt của hyaluronan
trong môi trường nuôi cấy làm tăng khả năng tồn tại trong điều kiện đông lạnh phôi
nang. Người ta thấy albumin và hyaluronan cho kết quả hiệp lực với nhau đối với việc
nuôi cấy phôi.
II.3.9. Ammonium
Người ta đã chứng minh khi ủ ở 37
0
C, amino acid tự khử gốc amin phóng thích
ammonium vào môi trường nuôi cấy. Ngoài ra, phôi cũng khử gốc amin của các amino
acid khi chuyển hoá và cũng tạo ra ammonium.
Ammonium không chỉ làm chậm sự phát triển của phôi trong nuôi cấy, mà còn
có thể khiến bào thai chậm phát triển và khiếm khuyết hệ thần kinh ở chuột. Vì vậy
phải thay môi trường sau 48 giờ đến 72 giờ để không bò ảnh hưởng bởi độc tố của
ammonium. Thủ phạm chính liên quan tới sự khử gốc amin và phóng thích ammonium
là glutamine. Tuy nhiên, amino acid có thể được thay thế bằng ananylglutamine
dipeptide, nó ổn đònh ở 37
0
C và giảm rõ rệt sự phóng thích ammonium vào môi trường
nuôi.

III.6. Thể tích ủ
Toàn bộ hệ thống nuôi cấy với mọi yếu tố: không khí, thể tích nuôi cấy, số
lượng phôi, việc bổ sung các đại phân tử … đều tác động lẫn nhau và tác động lên sự
phát triển của phôi.
Việc nuôi cấy phôi động vật có vú trong thể tích nhỏ môi trường và (hoặc) trong
nhóm làm tăng rõ rệt sự phát triển lên phôi nang. Hơn thế, đã có những nghiên cứu
chứng minh rằng nuôi cấy phôi trong thể tích nhỏ làm tăng khả năng tồn tại và phát
triển tiếp tục sau khi chuyển. Người ta cho rằng việc tăng sự phát triển của phôi trong
nuôi cấy với một thể tích nhỏ môi trường và (hoặc) trong nhóm là do phôi tạo ra những
nhân tố actocrine/paracrine đặc biệt sẽ kích thích sự phát triển. Nuôi cấy phôi trong
một thể tích lớn sẽ gây ra sự pha loãng làm giảm các nhân tố trên dẫn đến không đem
lại kết quả mong muốn.










80µl môi trường
Hình 6: Sự pha loãng trong nuôi cấy phôi đơn lẻ với một thể tích lớn môi
trường.

III.7. Không khí
Nồng độ oxy trong lumen của vòi fallope thỏ là 2-6%, và 8% trong vòi trứng
của chuột đồng, nồng độ oxy trong tử cung thấp hơn so với trong vòi trứng. Các nghiên
cứu trên những loài động vật có vú khác nhau đã chứng minh rằng nuôi cấy trong nồng

độ oxy thấp (đặc biệt là phôi của loài nhai lại), làm tăng cao sự phát triển của phôi
nuôi cấy trong ống nghiệm. Một vài nghiên cứu cho thấy nồng độ oxy thấp (giữa 5-8%)
làm tăng cao sự phát triển lên giai đoạn phôi nang ở chuột.
Nồng độ CO
2
trong hệ thống nuôi cấy có ảnh hưởng trực tiếp lên pH môi
trường. Mặc dù hầu hết môi trường hoạt động trên một dãy rộng pH (7,2-7,4), nhưng
tốt hơn là đảm bảo để pH không vượt quá 7,4. Vì vậy, thích hợp nhất là sử dụng nồng
độ CO
2
trong khoảng 5-8%.
VIII. ALBUMIN HUYẾT THANH BÒ – BSA (BOVINE SERUM
ALBUMIN)
VIII.1. BSA
Albumin huyết thanh là một trong những protein được nghiên cứu rộng rãi nhất
và là protein phong phú nhất trong huyết thanh với nồng độ 5g/100ml. Trọng lượng
phân tử: 68000Da (583 amino acid). pH: 7,0 +/- 0,2.
Autocrine
Paracrine
20-50µl môi trường
được phủ dầu
Hình 7: Sự hỗ trợ lẫn nhau khi nuôi cấy nhómphôi trong thể tích môi trường
nhỏ được phủ dầu.
VIII.2. BSA và sự tổng hợp BSA trong cơ thể động vật có vú
Albumin được quan tâm chính là albumin huyết thanh. Từ albumin được sử dụng
để mô tả protein hoặc nhóm protein được xác đònh tính chất bởi tính tan trong nước.
Albumin là protein phổ biến nhất trong hệ tuần hoàn và chiếm 80% áp suất keo của
máu. Người ta đã chứng minh rằng albumin huyết thanh chòu trách nhiệm chính cho
việc duy trì pH máu.
Albumin của động vật có vú được gan tổng hợp ban đầu ở dạng preproalbumin.

Sau khi loại bỏ chuỗi peptide tín hiệu thành proalbumin và tiếp tục loại bỏ 6
propeptide còn lại để trở thành albumin.
Hình 8: Sự tổng hợp bovine serum albumin (BSA)
VIII.3. Thành phần amino acid trong BSA
Albumin được cấu tạo bởi lượng thấp tryptophan và methionine; lượng lớn
cystine và những amino acid tích điện, aspartic và glutamic acid, lysine, và arginine.
Glycine và isoleucine trong BSA thấp hơn trong protein chuẩn bình thường.
Ala 48 Cys 35 Asp 41 Glu 58
Phe 30 Gly 17 His 16 Ile 15
Lys 60 Leu 65 Met 5 Asn 14
Pro 28 Gln 21 Arg 26 Ser 32
Thr 34 Val 38 Trp 3 Tyr 21

VIII.4. Đặc tính chức
năng của BSA
VIII.4.1. Tạo bọt
Bảng 2: Các thành phần amino acid trong BSA
Preproalbumin H
2
N-M-K-W-V-T-F-L-L-L-L-F-I-S-G-S-A-F-S-R-G-V-F-R-R-E-A-H-K-S-E-




Proalbumin H
2
N-R-G-V-F-R-R-E-A-H-K-S-E-

Albumin H
2
N-E-A-H-K-S-E-
Cắt chuỗi peptide tín hiệu
Cắt bỏ chuỗi propeptide
Tạo bọt được đònh nghóa là sự tạo và giữ ổn đònh bọt khí trong dung dòch.
Protein được khuyếch tán vào mặt phân cách giữa không khí và nước và làm giảm sức
căng bề mặt. Tại mặt phân cách chúng hiện diện và kết hợp để tạo ra màng dính kết
đàn hồi giữa các phân tử. Việc tạo bọt và ổn đònh được cải thiện khi BSA phản ứng với
những protein như lysozyme và clupeine nhờ vào liên kết chéo giữa BSA và lysozyme
tại bề mặt phân cách. BSA tiến tới điểm đẳng điện khi lực đẩy tónh điện ở mức tối
thiểu. Khi nó tương tác với lysozyme, sự giản nở và ổn đònh lớn nhất ở pH 8 và 9, giữa
điểm đẳng điện của BSA (4,7) và lysozyme (10,7) khi các protein mang điện trái nhau.
Clupeine với pH 12 có ảnh hưởng nhiều hơn lysozyme.
Lipid ức chế sự tạo bọt bằng cách chiếm chỗ của các phân tử protein tại bề mặt
phân cách và phá vỡ màng protein. Sự ức chế này của lipid được trung hoà khi BSA
phản ứng với clupeine tại bề mặt phân cách.
VIII.4.2. Khả năng đông đặc của BSA
BSA bò đun nóng tạo thành khối hoà tan thông qua cầu nối disulphide và liên
kết không đồng hóa trò.
Alpha-lactalbumin không tạo thành khối hoà tan nhưng phản ứng với BSA qua
cầu nối disulphide tạo nên khối hoà tan. Khối hoà tan những phân tử polyme hoá được
hình thành trong suốt giai đoạn ban đầu của sự đông protein được đun nóng, và sự
polyme hóa tiếp theo sau dẫn đến sự hình thành mạng lưới gel rắn. Việc thêm alpha-
lactalbumin vào BSA làm giảm khả năng tạo gel của BSA vì bò giới hạn bởi phức hợp
đàn hồi.
Sự đông đặc bao gồm 2 bước: bước khởi đầu gồm sự phơi bày hoặc sự phân ly
những phân tử protein, sau đó là bước kết khối tức xảy ra các phản ứng liên kết. Cuối
cùng là hình thành gel dưới điều kiện thích hợp. Để hình thành được gel với những tiêu

chuẩn cao, bước kết khối cần diễn ra chậm hơn với bước phân ly. Nhiệt độ làm biến
tính của BSA ở 62
0
C và 64
0
C. Nhiệt độ làm biến tính BSA tăng khi kết hợp với acid
béo nhưng giảm khi nó phản ứng với clupeine. Vì vậy, những phản ứng của một
polymer sinh học như acid béo với BSA dẫn đến làm ổn đònh phân tử BSA, trong khi
những phân tử khác như clupeine làm khởi động bước phân ly của BSA.
VIII.4.3. Phối tử kết nối
Khả năng quan trọng nhất của albumin là khả năng kết nối thuận nghòch với
nhiều phối tử. BSA là chất vận chuyển những acid béo không tan trong huyết thanh.
Nó cũng thực hiện nhiều chức năng khác như cô lập các gốc oxygen tự do và bất hoạt
các độc tố như bilirubin. Albumin hút mạnh với các acid béo, hematin, bilirubin và thu
hút chính với những hợp chất thơm nhỏ mang điện tích âm. Nó hình thành các nối đồng
hoá trò với pyridoxyl phosphat, cysteine, glutathione, và nhiều kim loại khác nhau như
Cu (II), Ni (II), Hg (II), Ag (II), và Au (I). Như một protein vận chuyển đa chức năng,
albumin là chất vận chuyển chính hoặc nguồn cung cấp oxid nitric.
VIII.5. Những nghiên cứu về vai trò của BSA trong môi trường nuôi cấy
phôi chuột
Trong thành phần hóa học môi trường nuôi cấy phôi giai đoạn trước làm tổ,
huyết thanh hoặc protein có những chức năng vẫn chưa được xác đònh. Mặc dù, BSA
thường có mặt trong tất cả môi trường nuôi cấy phôi chuột giai đoạn trước làm tổ.
Năm 1949, Hammond đã có những nghiên cứu ban đầu về vai trò của các đại
phân tử trong môi trường nuôi cấy, thấy rằng phôi chuột 8 tế bào phát triển lên thành
phôi nang cần sự kết hợp của lòng trắng trứng trong môi trường. Những nghiên cứu tiếp
theo sau của Whitten (năm 1956), cho là những thành phần thiết yếu trong lòng trắng
trứng không thể phân tích được. Vì thế năm 1956 Whitten đã thay thế lòng trắng trứng
bằng BSA kết tinh, từ lúc đó việc sử dụng lòng trắng trứng trong môi trường nuôi cấy
đã giảm xuống thay vào đó là BSA.

BSA có thể có chức năng dinh dưỡng, như nguồn nitrogen hỗn hợp trong môi
trường nuôi cấy phôi. Một chức năng khác là cung cấp amino acid tự do khi thuỷ phân
protein.
Trong lòch sử nghiên cứu, việc thay thế BSA bằng các đại phân tử không phải là
protein đã xuất hiện đầu tiên khi Brinster (năm 1965) thiết kế những thí nghiệm để
chứng minh nhu cầu của những amino acid ngoại sinh trong sự phát triển của phôi
chuột giai đoạn trước làm tổ. Trong những nghiên cứu về những chất tổng hợp thay thế
cho BSA, Brinster (năm 1965) đã tìm ra một số chất thay thế cho BSA nhưng vẫn
không chứng minh được vai trò dinh dưỡng của BSA trong sự phát triển của phôi chuột
2 tế bào thành phôi nang. Ông cho rằng “một số ảnh hưởng có lợi của BSA và những
amino acid nào đó có thể nhờ vào hoạt động của chúng như những tác nhân bắt giữ,
điều hoà quá trình oxi hóa, chất bảo vệ bề mặt tế bào, hoặc chất bảo vệ enzym”.
Những nghiên cứu tiếp sau đó đã chứng minh rằng BSA là một sản phẩm rất
hay thay đổi về mặt hóa học, thành phần của chúng tùy thuộc vào sự khác biệt của các
phối tử kết hợp với các đại phân tử.
Những thí nghiệm với môi trường thay thế BSA đã thu được những kết quả
không phùø hợp. Từ những thí nghiệm sử dụng PVP
150
(polyvinylpyrrolidone –
mol.trọng lượng phân tử 150 000) thay thế BSA, năm 1965 của Brinster đã tìm ra rằng
phôi chuột 2 tế bào F
1
lai xa đòi hỏi nguồn nitrogen hỗn hợp để có thể phát triển lên
phôi nang. Nguồn nitrogen này là BSA, hỗn hợp amino acid là thành phần của BSA bò
thuỷ phân do Brinster chứng minh vào năm 1965, hoặc glutathionine do Brinster chứng
minh vào năm 1968.
Trái lại, năm 1970 Cholewa và Whitten cũng sử dụng PVP thay thế cho BSA đã
không thể chứng minh được sự cần thiết của nguồn nitrogen hỗn hợp trong nuôi cấy
phôi chuột 2 tế bào lai F
1

. Brinster và Thomson vào năm 1966 đã chứng minh phôi
chuột 8 tế bào lai xa không đòi hỏi nguồn nitrogen hỗn hợp để phát triển lên thành
phôi nang.
Kết quả thí nghiệm của Biggers, Summers, và Ginnis vào năm 1997 cho thấy:
hợp tử CF
1
lai xa phát triển thành phôi nang trong môi trường KSOM được thay thế
BSA bằng PVA (polyvinyl alcohol), dưới điều kiện này nguồn nitrogen chỉ là
glutamine. Kết quả này khác với kết luận của Brinster năm 1965 cho rằng có sự phân
chia của phôi giai đoạn 2 tế bào nhưng không có sự hình thành phôi nang khi glutamine
được bổ sung vào môi trường với PVP thay thế cho BSA. Liệu sự khác biệt này là do
sự khác nhau trong thành phần của 2 loại môi trường vẫn chưa được kết luận.
Kết quả thu được từ thí nghiệm này cũng cho thấy rằng năng suất của phôi nang
nuôi cấy trong môi trường KSOM với PVA thay thế cho BSA thấp hơn rõ ràng so với
môi trường KSOM với BSA. Như thế BSA được bổ sung vào môi trường KSOM làm
tăng sự tác động hình thành phôi nang. KSOM với PVA thay thế cho BSA được bổ
sung amino acid cũng làm tăng sự hình thành phôi nang.
Fissore vào năm 1989 đã chứng minh rằng có thể loại BSA ra khỏi môi trường
nuôi cấy thay vào đó là EDTA. Lý do BSA làm tăng sự phát triển phôi vẫn không được
biết rõ ràng, có thể có ít nhất 3 khả năng:
(1) BSA làm tăng amino acid được bổ sung
(2) BSA cung cấp những phân tử không phải amino acid được kết hợp kích
thích sự phát triển
(3) BSA cung cấp những chức năng bắt giữ.
Năm 1992, Kiernan và Bavister đã chứng minh một số lô BSA kích thích sự
phát triển của phôi chuột 2 tế bào trong nuôi cấy, trong khi một số lô khác lại ức chế.
Những nghiên cứu của Evecen, Alkan năm 2002 thấy rằng trong nuôi cấy phôi
chuột từ phôi chuột 2 tế bào: với môi trường M16 và môi trường Whitten nồng độ BSA
được bổ sung là 1mg/ml và 3 mg/ml là tối ưu cho sự phát triển của phôi chuột 2 tế bào
lên phôi nang và khi nồng độ BSA vượt quá 10 mg/ml ức chế sự phát triển của phôi

chuột.
VII. ỨNG DỤNG THỰC TIỄN
Đây là nghiên cứu với mục đích cuối cùng là tạo được một quy trình nuôi cấy
phôi tối ưu với điều kiện thực tiến hiên tại. Nghiên cứu này ngoài ý nghóa khoa học
đơn thuần còn có một số ứng dụng thực tế trong Nhân giống động vật, sinh sản vô tính,
bảo tồn nguồn gen …
Nhân giống động vật
Một quy trình nuôi cấy phôi hoàn chỉnh là tiêu chuẩn cần hoàn thiện đầu tiên
trong công nghệ nhân giống động vật với các mục đích thương mại hay bảo tồn giống
loài với các kó thuật tiên tiến hơn như vi thao tác, đông lạnh …
Có được môt quy trình nuôi cấy phôi hoàn chỉnh ứng dụng trong nhân giống gia
súc đối với nền chăn nuôi Việt Nam sẽ mang đến một nguồn lợi kinh tế to lớn, chấm
dứt đượ c vấn đề lệ thuộc nguồn giống nước ngoài, cũng như tạo được nguồn giống gia
súc dồi dào trong nước, chủ động chọn lựa được những đặc tính tối ưu của những giống
gia súc nội đòa. Cũng như bảo tồn được nguồn giống trong nước.
Khai thác tế bào mầm
Ngày nay, ứng dụng tế bào mầm là vô cùng to lớn, tất cả các nước trên thế giới
đã và đang ngày càng đẩy mạnh lợi ích trong lónh vực này. Việc tạo nguồn tế mầm từ
phôi được nuôi cấy là một lónh vực rất khả quan và nằm trong tầm tay nếu có được một
quy trình nuôi cấy phôi hoàn chỉnh.
Chuyển gen ở động vật
Để nâng cao chất lượng gia súc thì lónh vực chuyển gen chiếm ưu thế rất mạnh
khi kết hợp với kó thuật thụ tinh trong ống nghiệm và nuôi cấy phôi. Đồng thời lónh vực
này cũng có ý nghóa to lớn trong y học và tạo ra các sản phẩm thay thế trong cấy ghép
nội tạng cho người.
Mô hình thực tập - giảng dạy về phôi học
Có được một quy trình nuôi cấy phôi hoàn chỉnh để ứng dụng vào việc giảng
dạy thực tập sẽ giúp cho học sinh – sinh viên tiếp cận với công nghệ trên phôi học dễ
dàng hơn, sẽ tạo được một nền tảng cơ bản cho thế hệ các nhà khoa học quan tâm tới
lónh vực này có thể tiến xa hơn.

VI. ĐỐI TƯNG NGHIÊN CỨU
Gồm 599 phôi chuột giai đoạn 2 tế bào được thu nhận từ chuột nhắt trắng (Mus
musculus var. Albino) khoảng 2-3 tháng tuổi, nặng khoảng 20-30g. Chuột được mua tại
viện Pasteur theo tiêu chuẩn trong lượng, ổn đònh theo điều kiện thí nghiệm một tuần
trước khi tiêm thuốc kích dục tố, và chuột được mua từ viện Pasteur ở dạng chuột ổ (1
- 2 tuần tuổi), ổn đònh theo điều kiện thí nghiệm tới độ tuổi yêu cầu.
VII. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm mô tả: chuột được ổn đònh theo chu kì
sáng – tối, sau đó tiêm kích dục tố, cho phối và thu nhận phôi 2 tế bào, tiến hành nuôi
phôi với các điều kiện thí nghiệm ở 3 nồng độ BSA 0,4%, 0,8%, 1,2% và nuôi phôi với
số lượng phôi khác nhau: 10 phôi và 6 phôi trong 50µl môi trường IVF. Quan sát và ghi
nhận kết quả.
Phương pháp thống kê: Ghi nhận tỉ lệ % sự phát triển lên các giai đoạn phôi 4
tế bào, phôi dâu, phôi nang so với phôi 2 tế bào thu nhận ban đầu. Dùng phần mềm
thống kê Statgraf để xác đònh độ khác biệt ý nghóa và các số trung bình khác.
VIII. DỤNG CỤ – THIẾT BỊ – HÓA CHẤT
IV.1. Dụng cụ
STT Tên Hãng Nước sản xuất
1 Ống tiêm 1ml Vinahankook Medical Supplies Việt Nam