Hoàn thiện công nghệ sản xuất enzym phytaza để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi và phục vụ một số ngành công nghiệp

VIỆN CƠ ĐIỆN NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHỆ STH







BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI:

HOÀN THIỆN CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYM PHYTAZA
ĐỂ BỔ SUNG VÀO THỨC ĂN CHĂN NUÔI VÀ PHỤC VỤ
MỘT SỐ NGÀNH CÔNG NGHIỆP


CNĐT: NGUYỄN THÙY CHÂU














8115

HÀ NỘI – 2010




1
I. MỞ ĐẦU

1.1 Sự hình thành dự án
Một trong số những nguyên tố khoáng đa lượng rất cần cho sự phát triển của
người và vật nuôi là photpho, bởi vì nó là thành phần cơ bản tạo nên axit nucleic
và các hợp chất sinh học khác. Ở cơ thể người cũng như cơ thể động vật, photpho
được cung cấp chủ yếu qua con đường thức ăn. Đa số thức ăn cho gia súc có nguồn
g
ốc từ các hạt thực vật đặc biệt là ngũ cốc đều có chứa sẵn photpho. Tuy nhiên,
photpho trong các nguyên liệu này có tới 80% nằm dưới dạng phân tử phytat hoặc
axit phytic rất khó tiêu hóa đối với các loài động vật dạ dày đơn như gia cầm, lợn,
cá [3]… Vì vậy cần phải bổ sung những hợp chất chứa photpho vô cơ vào thức
ăn để đáp ứng đủ nhu cầu của chúng. Lượng axit phytic và phytat không được
tiêu hóa này theo phân củ
a gia cầm thải ra ngoài là nguyên nhân gây ô nhiễm
môi trường và gây ra hiện tượng bùng phát của các vi sinh vật sinh độc tố
[18,19].
Chính vì vậy, để tận dụng nguồn phospho có sẵn trong thành phần của các
nguyên liệu thực vật, tăng hệ số sử dụng thức ăn của vật nuôi, giảm lượng axit
phytic thải ra ngoài môi trường thì việc chuyển các hợp chất phospho ở dạng khó
phân hủy này thành các chất đơn giản hơn là rất quan trọ
ng. Để đạt được điều đó
người ta sử dụng phytaza để thủy phân axit phytic. Phytaza (myo - inositol hexan

photphat photphohydrolaza) là một enzym có khả năng xúc tác phản ứng thủy
phân axit phytic (và các muối của axit này), giải phóng ra một hoặc nhiều gốc
photphat vô cơ tự do và myo - inositol phân tử thấp, là các dạng chất dễ tiêu hóa
hơn các hợp chất ban đầu. Phytaza cũng như tất cả các enzym khác đều có sẵn
trong mô, cơ quan của động, thự
c vật và tế bào vi sinh vật[29, 38, 39]. Tuy nhiên
khi nghiên cứu để tách và sản xuất phytaza, đặc biệt là sản xuất với quy mô công
nghiệp thì nguồn vi sinh vật là nguồn để sản xuất enzym có ưu thế hơn cả. Có
nhiều loài có khả năng sinh tổng hợp phytaza như Aspegillus niger, Aspegillus
ficcum, Aerobacter aerogenes, Bacillus subtilis, Escherrichia coli, Rhizopus
microsporus, Saccharomyces serevisie…[15, 37]
Phytaza được phát hiện đầu tiên vào năm 1907, đến năm 1994 thì những
ứng dụng của phytaza bắt đầu được đẩy mạ
nh. Người ta đã sản xuất enzym

2
phytaza dưới dạng các chế phẩm dạng bột, hoặc dạng nước dùng bổ sung vào
thức ăn gia súc và gia cầm, nhằm tăng hệ số sử dụng thức ăn của vật nuôi. khi
thêm phytaza vào thức ăn chăn nuôi từ 250IU/kg đến 1000IU/kg có thể thay thế
hoàn toàn việc bổ sung photpho. Hiệu quả của việc ứng dụng này đã được kiểm
định. Tại Mỹ, người ta dự tính rằng nếu phytaza đượ
c sử dụng trong thức ăn cho
tất cả các loài động vật dạ dày đơn thì sẽ giải phóng được một lượng photpho
tương ứng với giá trị 168 triệu USD và loại trừ được 8,23x10
4
tấn photphat thải
ra môi trường hàng năm. Ở Hà Lan, phytaza của nấm mốc A. niger được bổ sung
vào thức ăn chăn nuôi đã làm giảm ô nhiễm photphat từ 30 đến 40%. Vì những
tính chất rất ưu việt của phytaza, nên số công trình nghiên cứu về enzym này
hàng năm tăng lên rõ rệt. Trong những năm gần đây việc phân lập và tuyển chọn

các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp phytaza hoạt lực cao cũ
ng như
việc nghiên cứu tạo chủng tái tổ hợp cho năng suất cao và hoàn thiện công nghệ
sản xuất đã được các nhà khoa học của rất nhiều nước trên thế giới như Mỹ,
Nhật Bản, Hàn Quốc, Pháp, Đức…đặc biệt quan tâm.
Ở nước ta, việc nghiên cứu về phytaza còn rất mới mẻ và chưa có nơi nào
sản xuất enzym phytaza. Hàng năm nước ta vẫn phải nhập một l
ượng lớn
phytaza từ các công ty nước ngoài như Novo của Đan Mạch, Roche của Thụy Sĩ.
Năm 1998, Khoa Chăn nuôi, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí
Minh đã tiến hành thử nghiệm sản phẩm phytaza dưới tên thương mại là
Ronozyme P bổ sung vào khẩu phần thức ăn nuôi lợn giống, lợn thịt và nuôi gà
đẻ tại các trại chăn nuôi Bảo Lộc, Đông Hiệp. Kết quả cho thấy Ronozyme P có
tác dụng làm t
ăng khả năng hấp thụ thức ăn của lợn, tăng tỷ lệ đẻ trứng và khối
lượng trứng của gà đẻ. Tác giả Nguyễn Thị Hoài Trâm [1] cũng đã thông báo về
khả năng ứng dụng chế phẩm Ronozyme P do Thuỵ Sĩ sản xuất vào thức ăn chăn
nuôi. Kết quả chế phẩm này đã làm tăng tỷ lệ đẻ trứng lên 2% và tăng n
ăng suất
trứng sau 12 tuần là 1,86-1,99 quả/gà mái. Ngoài ra Viện Khoa học Kỹ thuật
Nông nghiệp Miền Nam cũng đã nghiên cứu đưa phytaza vào thức ăn cho lợn, gà
trong chương trình sản xuất thịt sạch của thành phố Hồ Chí Minh. Chính từ
những nghiên cứu trên, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã quyết định
đưa phytaza vào danh mục các thức ăn chăn nuôi được nhập khẩu vào Việt Nam
thời kỳ 2001 - 2005 theo quyết định s
ố 55/2001/QĐ/BNN-KNKL.

3
Trong khuôn khổ của đề tài cấp Nhà nước KC-04-20 phòng Vi sinh vật
sau thu hoạch, Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã tiến

hành nghiên cứu đề tài nhánh: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzym phytaza
từ nấm mốc”. Hội đồng nghiệm thu đề tài cấp Nhà nước đã có biên bản đề nghị
đề tài nhánh này được chuyển thành dự án sản xuất thử nghiệm.
Kết quả của đề tài là đã tuy
ển chọn được các chủng A. niger có hoạt lực
phytaza cao, hoạt lực của các chủng phân lập dao động từ 9 đến 13IU/ml. Chúng
tôi cũng đã tiến hành nghiên cứu công nghệ sản xuất phytaza theo phương pháp
lên men chìm sục khí. Kết quả cho thấy phương pháp nuôi cấy lên men chìm sục
khí đã cho hoạt lực phytaza là 13,5IU/ml. Chế phẩm đã được đánh giá trên lợn,
gà, và bước đầu đã cho những kết quả tốt.
Xuất phát từ
những vấn đề nêu trên, trong hai năm 2007-2009 Bộ môn
Nghiên cứu công nghệ sinh học sau thu hoạch, Viện Cơ điện Nông nghiệp và
Công nghệ Sau thu hoạch đã được Bộ khoa học công nghệ và môi trường hỗ trợ
dự án: “Hoàn thiện công nghệ sản xuất enzym phytaza để bổ sung vào thức ăn
chăn nuôi và phục vụ một số ngành công nghiệp”
1.2 Xuất xứ của dự án
Là kết quả củ
a đề tài cấp Nhà nước KC-04-20: “Nghiên cứu áp dụng công
nghệ vi sinh hiện đại để sản xuất chế phẩm giàu axit amin và enzim từ nguồn thứ
phẩm nông nghiệp và thủy hải sản ở quy mô bán công nghiệp” được nghiệm thu
cấp Nhà nước ngày 18/4/2006. Hội đồng nghiệm thu đề tài đã đề nghị xây dựng
đề tài nhánh “Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzym phytaza” thành dự án sản
xuất thử nghiệm.
1.3 Mục tiêu của dự
án
 Có được dây chuyền công nghệ và thiết bị sản xuất chế phẩm phytaza qui mô
50 tấn/năm. Hoạt tính phytaza thô hoạt tính đạt 2500IU/g
 Phát triển sản xuất enzym phytaza dùng trong chăn nuôi và một số ngành
công nghiệp khác.

4
1.4 Luận cứ về tính cấp thiết, khả thi và hiệu quả của Dự án
1.4.1. Làm rõ về công nghệ lựa chọn của Dự án
1.4.1.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất phytaza trên thế giới
1.4.1.2 Những nghiên cứu về axit phytic
Axit phytic là một axit hữu cơ, phân tử của nó có chứa các gốc photphat,
tồn tại chủ yếu trong các loại ngũ cốc và hạt có dầu. Axit phytic có công thức
phân tử C
6
H
18
O
24
P
6
và phân tử lượng là 660,04. Danh pháp quốc tế của axit
phytic được gọi là myo-inositol 1,2,3,4,5,6 - hexan dihydro photphat. Thực tế,
axit phytic thường tồn tại dưới dạng muối của các kim loại hóa trị I, II (thường là
kali- magiê- canxi). Các muối này được gọi là phytat và chúng được xem như là
kho dự trữ photpho lớn trong các hạt thực vật.
Phytaza là một enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân axit phytic (myo-
inositol hexan photphat) thành các myo - inositol photphat phân tử thấp và các
monophotphat vô cơ. Khi phản ứng thủy phân xảy ra hoàn toàn sẽ giải phóng toàn
bộ các g
ốc photphat trong phân tử axit phytic và tạo thành các myo - inositol tự do.

* Ứng dụng của enzim phytaza trong chăn nuôi
Những điều tra đầu tiên về ứng dụng enzim trong dinh dưỡng động vật đã
được thực hiện từ những năm 1920. Tuy nhiên đến năm 1950, ngành công
nghiệp sản xuất enzim mới thực sự được bắt đầu. Tác giả Cromwell G.L.[ 9]
cho rằng trước đây enzim không được sử dụng trong khẩu phần thức ăn gia súc
mà ch
ỉ sử dụng trong thực phẩm cho người nhưng từ giữa thập niên 1990, sản
phẩm enzime sử dụng trong công nghiệp chế biến thức ăn gia súc của thế giới đã
phát triển mạnh. Chúng được sử dụng khá phổ biến ở các nước tiên tiến và được
xem như là một chuẩn mực về dinh dưỡng trong khẩu phần ăn gia súc. Người ta
nhận thấy rằng việc bổ
sung enzim vào thức ăn chăn nuôi làm tăng khả năng hấp
thụ dinh dưỡng từ thức ăn và làm giảm lượng muối khoáng thừa thải ra trong quá
trình chăn nuôi [32]. Để có thể thu được những kết quả tốt như vậy, có một số lý
do chính để giải thích như sau:
+ Enzim có khả năng cắt một số liên kết đặc hiệu trong thức ăn chăn nuôi
để giải phóng các muối khoáng và axit amin. Việc bổ sung m
ột lượng enzim
thích hợp vào thức ăn hàng ngày cho gia súc, gia cầm đã tạo ra các chất dễ tiêu
hóa như là glucoza từ các polysacharit.

5
+ Enzim ngoại bào có thể giúp cho các động vật non tiêu hóa tốt hơn. Bởi
vì cơ thể chúng sản xuất ra một lượng enzim không đáp ứng đủ nhu cầu của bản
thân. Chính vì vậy việc bổ sung thêm các enzim đã giúp cho động vật dễ tiêu hóa
và hấp thu được một lượng lớn dinh dưỡng từ thức ăn.
+ Một số enzim được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi đã phân hủy các tác
nhân kháng dinh dưỡng trong thức ăn và làm tă
ng giá trị dinh dưỡng của thức ăn.
Tóm lại, enzim thức ăn đã làm tăng tỷ lệ tiêu hóa thức ăn và năng suất

động vật theo hai cơ chế:
Một là kết hợp với enzim nội sinh phân giải các hợp chất thành những chất
đủ nhỏ để cơ thể hấp thụ. Hai là enzim thức ăn phải giảm được độ nhớt sinh ra
trong quá trình tiêu hóa thức ăn vì chính độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hóa
c
ản trở sự hấp thu thức ăn. Một vài hợp chất khi giải phóng khỏi vách tế bào đã
hình thành các gel làm tăng độ nhớt trong ruột. Thường các khẩu phần chứa
nhiều polysaccharit không phải tinh bột gây ra hiện tượng này. Động vật non đặc
biệt là gia cầm rất nhạy cảm với sự biến đổi độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu
hóa. Vì vậy để khắc phục được hiện tượng trên, trong phương pháp chă
n nuôi
hiện đại người ta đã bổ sung enzim vào thức ăn chăn nuôi. Enzim này có khả
năng làm tăng sự hấp thụ và tiêu hóa các thành phần chứa năng lượng và protein
của thức ăn, tăng tỷ lệ tăng trọng của đàn gia súc, gia cầm. Điều đó sẽ tiết kiệm
được chi phí sản xuất giảm giá thành sản phẩm.
Một trong số những enzim quan trọng phục vụ cho chăn nuôi là phytaza -
enzim có khả năng phân giải axit phytic trong ruột của động vật dạ dày đơn
thành phân tử photphat.[26] Trên thế giới có nhiều chế phẩm phytaza để bổ sung
vào thức ăn chăn nuôi. Điển hình nhất trong số các chế phẩm được thương mại
hóa là Natuphos của công ty Gist Brocades- Hà Lan. Enzim này được sản xuất
bằng cách biểu hiện gen. Ngoài ra chế phẩm ZY-phytaza II của công ty Lohman
Animal Health cũng được sản xuất từ chủng A. oryzae biến
đổi gen.
Bên cạnh việc sử dụng từng chế phẩm enzim đơn lẻ thì xu hướng chung
hiện nay lại tập trung vào sử dụng các chế phẩm đa enzim (multienzyme) có
chứa hỗn hợp enzim để phân giải đồng thời nhiều hợp chất. Ví dụ: Nếu dùng β-
glucanaza thì chỉ phá vỡ được vách nội nhũ của hạt đại mạch mà không phân
giải được axit phytic có chứa trong nội nhũ của hạt và protein ch
ứa trong tế bào

6
chất. Theo tác giả Vũ Duy Giảng [2] để phân giải được protein trong lớp tế bào
chất và axit phytic thì cần phải thêm cả phytaza và xellulaza và pentosanaza.
Một số chế phẩm thương mại gồm hỗn hợp các enzim được sử dụng trong
chăn nuôi nhằm giúp cho gia súc, gia cầm tăng tỷ lệ tăng trọng đang có mặt trên
thị trường như: RONOZYME VP, RONOZYME B, RONOZYME A và chế
phẩm AQUAZYME, Allzym SSF của Mỹ. Các chế phẩm này ngoài thành phần
chính là phytaza còn có các enzym khác như amylaza, pectinaza…
đã giúp tăng
cường khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng, khoáng chất và vitamin trong thức
ăn gia cầm, gia súc… Trong đó, chế phẩm Allzym SSF của công ty Altech được
tạo ra khi lên men chủng nấm mốc A. niger tự nhiên ở cơ chất rắn trên môi
trường cám mỳ ngoài enzim phytaza chủ yếu ra còn có 6 enzim khác như:
amylaza, xelulaza, xylanaza, β-glucanaza, pectinaza và proteaza cũng được tạo
ra từ chính chủng nấm mốc trên. Điều đó sẽ tiết kiệ
m được chi phí sản xuất.
Vào cuối thế kỷ XX ngành chế biến đậu tương đã mở rộng thành công trên
thị trường. Theo tác giả O’Quinn [23] đậu tương và các loại ngũ cốc đã được
tăng cường sử dụng làm thức ăn cho động vật nhằm mục đích giảm giá thành
bằng cách thay thế một phần protein động vật trong thức ăn bằng protein thực
vật. Nhưng trong đậ
u tương có chứa một lượng lớn các axit phytic và các chất
kháng dinh dưỡng do đó đã gây hạn chế khi sử dụng chúng làm thức ăn chăn
nuôi.
Đối với động vật nhai lại, sự có mặt phytaza trong hệ enzim tiêu hoá do
các vi sinh vật trong dạ cỏ và ruột kết của chúng sinh ra có khả năng giải phóng
photpho vô cơ từ axit phytic. Tuy nhiên, đối với các loài động vật có dạ dày đơn
như gia cầm, lợn và cá sản xuất rất ít hoặ
c không có mặt phytaza trong hệ tiêu
hoá thì chúng không có khả năng chuyển hoá axit phytic. Vì vậy, photphat vô cơ

đã được bổ sung vào khẩu phần ăn hàng ngày của các động vật này để đảm bảo
lượng photpho cần thiết. Hậu quả đã dẫn đến việc ô nhiễm photpho ở những nơi
chăn nuôi gia cầm và lợn.[11]
Việc sử dụng chế phẩm phytaza để bổ sung vào khẩu phần thức ăn cho
vật nuôi không nhữ
ng cho phép các vật nuôi đồng hoá tốt thành phần photpho
sẵn có trong thức ăn, tăng sự hấp thu protein và các nguyên tố khoáng mà còn
giảm được sự ô nhiễm môi trường, do hạn chế được lượng photphat khó tiêu

7
được thải ra theo phân của động vật (Leesen et al. [14] Lei và Stahl [15],
Mohanna và Nys [17]. Phytaza có khả năng thuỷ phân phytat và khi thêm
phytaza vào thức ăn chăn nuôi từ 250IU/kg đến 1000IU/kg có thể thay thế hoàn
toàn việc bổ sung photpho. Hiệu quả của việc ứng dụng này đã được kiểm định.
Tại Mỹ, người ta dự tính rằng nếu phytaza được sử dụng trong thức ăn cho tất cả
các loài động vật dạ dày đơn thì sẽ giải phóng được m
ột lượng photpho tương
ứng với giá trị 168 triệu USD và loại trừ được 8,23x10
4
tấn photphat thải ra môi
trường hàng năm.[11]
Phytaza Finase R được bổ sung vào thức ăn có chứa đậu tương cho lợn đã
chuyển hoá được một phần ba dạng phosphat không có giá trị thành dạng dễ sử
dụng. Cũng bằng cách như vậy, các thực nghiệm với enzim phytaza R và
Natuphos đã chứng minh rằng phytaza cải thiện được khả năng chuyển hoá
phytat của lợn và gà (Cromwell et al. 1993, Cromwell et al. [11] Cromwell et al.
1995b[11], O’Quinn et al. [22]. Ở Hà Lan, phytaza củ
a nấm mốc A. niger được
bổ sung vào thức ăn chăn nuôi đã làm giảm ô nhiễm photphat từ 30 đến 40%.
Việc sử dụng phytaza trong chăn nuôi cần đòi hỏi một số tính chất như là enzim

phải chịu được nhiệt độ cao, bởi vì thức ăn cho gia cầm và lợn hầu hết ở dạng
viên để đảm bảo rằng động vật có một khẩu phần ăn cân b
ằng và thuận lợi cho
quá trình bảo quản các sản phẩm có chứa enzim trong công nghiệp thức ăn chăn
nuôi. Theo Wyss [43], trong suốt quá trình chế biến viên nhiệt độ có thể lên đến
90
0
C và đó là nguyên nhân giảm hoạt tính của enzim trong quá trình bảo quản.
Chi phí sử dụng phytaza bổ sung vào thức ăn chăn nuôi sẽ giảm đi nếu như tính
chịu nhiệt của enzim tăng lên trong quá trình chế biến thức ăn từ thực vật
Để ứng dụng phytaza vào chăn nuôi ở mức độ công nghiệp, đặc tính quan
trọng nhất của phytaza cần được quan tâm là khả năng hoạt động của nó ở ph
ạm
vi pH thường thấy trong hệ tiêu hoá. Đột biến trực tiếp vị trí đã xác nhận rằng
việc thay đổi Gly-277 và Tyr 282 của phytaza tự nhiên từ chủng nấm mốc A.
fumigatus bằng gốc Lys và His đúng với phytaza của nấm A. niger đã làm tăng
pH hoạt động của nó từ 2,8 lên 3,4. Hơn thế nữa đột biến gốc Arg-274 thành
Gln và Gln 27 thành Leu/Thr/Ile của phytaza A. niger T213 và A. fumigatus đã
lần lượt làm tăng tính đặ
c hiệu của chúng lên nhiều lần.[27]

8
Việc sử dụng chế phẩm enzim phytaza bổ sung vào thức ăn cho chăn
nuôi ngày càng được tăng cường, bởi vì qua các nghiên cứu đã cho thấy rằng
việc bổ sung chế phẩm sinh học nói chung và chế phẩm enzim nói riêng vào thức
ăn cho gia súc, gia cầm đã đưa sản lượng lên rất cao với giá thành hạ. Những
nghiên cứu cho thấy bổ sung tối ưu 227 đơn vị phytaza trên pound thức ăn (1
pound = 0,454 kg) đã thay thế khoảng 0,1% lượng photpho trong b
ột ngô, đậu
tương. Ronozym P = 2500 FYT/g và cho vào 0,4 lb/tấn thức ăn (225 g/tấn thức

ăn).
Những năm gần đây, ngành chăn nuôi của Việt Nam đã có nhiều tiến bộ
đáng kể. Cùng với việc nghiên cứu lai tạo giống và hoàn thiện các quy trình
chăm sóc nuôi dưỡng thì khâu chế biến thức ăn cho chúng cũng là một nhân tố
quyết định đến hiệu quả trong chăn nuôi. Chính vì vậy, người ta đã sử dụng ch
ế
phẩm enzim để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi nhằm tăng khả năng chuyển hoá
thức ăn của chúng.
Xuất phát từ những lợi ích mà phytaza có thể mang lại cho con người đã
khiến cho có ngày càng nhiều những ứng dụng của loại enzim này ở các lĩnh vực
khác nhau. Người ta đã không ngừng nghiên cứu nhằm mục đích nâng cao tính
chất ưu việt của phytaza để những ứng dụ
ng của chúng đạt hiệu quả hơn.
1.4.1.3 Ứng dụng trong sản xuất thực phẩm
Trong khẩu phần ăn hàng ngày của con người cũng rất giàu hàm lượng
ngũ cốc đồng nghĩa với lượng phytat trong thức ăn rất cao. Đặc biệt khẩu phần
thức ăn của những người ăn chay, những người lớn tuổi và người dân ở những
nước nghèo luôn bị ám ả
nh bởi sự mất cân bằng thực phẩm với một lượng ngũ
cốc quá cao. Trong khẩu phần ăn của trẻ em cũng được sử dụng rất nhiều đậu
tương, loại thức ăn này có hàm lượng phytat cao khiến cho trẻ rất khó hấp thu tốt
nguồn dinh dưỡng sẵn có trong thức ăn. ở trẻ con, phytat không được tiêu hoá có
mặt trong ruột đã ngăn cản sự hấp thu các ion kim lo
ại như Zn
2+
, Ca
2+
, Mg
2+
,

Fe
2+
, ngoài ra nó còn kìm hãm protein cũng như các enzim tiêu hoá.
Đứng trước một thực tế như vậy, việc nghiên cứu và ứng dụng phytaza vào
thức ăn cho người nhằm trợ giúp bộ máy tiêu hoá của con người trong quá trình
đồng hoá các thức ăn chứa nhiều phytat cũng đã được đề cập đến. Bên cạnh đó
việc bổ sung phytaza vào thức ăn đã làm tăng giá trị dinh dưỡng của thực phẩm

9
có nguồn gốc từ thực vật bằng cách làm tăng sự tiêu hoá của protein và khả năng
hấp thụ các vitamin trong quá trình thuỷ phân phytat khi tiêu thụ hoặc chế biến
thức ăn [35].
Ngoài những ứng dụng đã nêu trên, công nghiệp thực phẩm cũng quan tâm
đến việc sử dụng phytaza một mặt để thúc đẩy sự hấp thu muối khoáng hoặc
bằng việc làm giảm phytat có trong thành phần thực phẩm, mặt khác để s
ản xuất
thức ăn chức năng. Theo tác giả Sandberg [36] các nấm mốc sử dụng trong lên
men sản phẩm truyền thống có khả năng sinh phytaza. Tempeh là thức ăn lên
men truyền thống bằng cách nuôi cấy nấm Rhizopus oligosporus trên đậu tương
và chính bản thân chủng nấm mốc này đã sinh phytaza và làm cho sản phẩm đậu
tương lên men trở nên dễ tiêu hoá hơn. Anno và đtg [3] đã loại bỏ phytat trong
sữa đậu nành trước khi sử dụ
ng bằng việc bổ sung phytaza của lúa mỳ của hãng
Sigma. Phytaza Finase S đã được sử dụng để sản xuất sữa đậu nành không có
phytat. Phytat trong sữa đậu nành đã được thủy phân thành công bằng việc sử
dụng phytaza của lúa mỳ được cố định.
Khi sử dụng phytaza ngoại bào từ nấm A. ficuum NRRL 3135 cũng đã
tạo ra các sản phẩm không có phytat từ các loại đậu. Theo tác giả Han thì 78%
phytat trong bột đậu tương b
ị mất đi khi cho phytaza của nấm A. niger vào sản

phẩm. Bổ sung photphataza axit dạng thô từ nấm A. niger vào đậu tương và ủ
vài giờ đã làm giảm đáng kể lượng phytat.Và khi thêm phytaza của nấm mốc A.
niger vào bột mỳ cũng đã làm tăng khả năng hấp thụ ion trong cơ thể người
[35,36]
Tuy nhiên việc thêm phytaza vào thực phẩm cần phải trải qua nhiều thử
nghiệm và chứ
ng minh những tác dụng của nó đối với cơ thể con người, đồng
thời cũng phải chứng minh được nó không có nhưng tác dụng phụ có hại cho con
người hoặc ảnh hưởng đến vị của thức ăn trước khi nó được chấp nhận như là
chất phụ gia thực phẩm.
1.4.1.4 Trong sản xuất myo-inositol trisphotphat
Myo-inositol trisphotphat được đề xuất ứng dụng vào dược phẩm nhằm
mụ
c đích giảm những mối nguy hiểm của bệnh tim mạch, sự tạo thành sỏi thận
và một số dạng ung thư [42, 20]. Tuy nhiên để tổng hợp các myo-inositol
trisphotphat bằng phương pháp hoá học thường gặp nhiều khó khăn vì quy trình

10
được thực hiện ở nhiệt độ và áp suất rất cao. Từ khi phytaza được phát hiện có
hoạt tính thuỷ phân myo-inositol hexan photphat thành các dẫn xuất khác nhau
thì việc sản xuất myo-inositol trisphotphat được thực hiện bằng con đường sinh
học để tạo ra các sản phẩm có độ tinh khiết cao thay thế cho phương pháp tổng
hợp hoá học (Richardson et al [31], Ohkwa et al [25]
1.4.1.5 Tiềm năng trong nuôi trồng thủy sản
Có rất nhiều nghiên cứu đã hướ
ng dẫn sử dụng đậu tương làm thức ăn
cho các loài thuỷ sản như là cho cá hồi Nguồn thức ăn này được sử dụng để
thay thế nguồn protein đắt tiền từ cá. Tuy nhiên cũng giống như gia cầm và lợn,
trong hệ tiêu hoá của cá không có mặt phytaza để sử dụng có hiệu quả axit phytic
(hay phytat) có trong thức ăn này, chính điều đó đã dẫn đến một lượng lớn phytat

bị
thải ra ngoài theo phân. Hơn nữa đây là những loài động vật sống dưới nước
vì vậy lượng photpho thải vào trong nước sẽ làm ô nhiễm nguồn nước gây hậu
quả rất nghiêm trọng. Bởi vậy việc thêm phytaza vào thức ăn cho cá đã làm giảm
lượng phytat thải vào trong nước tới mức cho phép đồng thời đảm bảo giá thành
thấp trong ngành công nghiệp nuôi trồng thuỷ sản. Đã có một số nghiên cứu về
ảnh hưởng của phytaza trong thức ăn cho cá có nguồn gốc từ thực vật [33]
Chamberlain [7] đã nghiên cứu và cho rằng việc tiêu thụ hải sản toàn
cầu sẽ tăng 35% vào năm 2025. Ngành công nghiệp nuôi trồng thuỷ sản sẽ ngày
càng phát triển để đáp ứng nhu cầu về hải sản của toàn thế giới. Điều này cho
thấy một tiềm năng lớn để mở rộng thị trườ
ng phytaza vào sản xuất thức ăn sử
dụng cho nuôi trồng thuỷ sản. Trong khi hiện nay thị trường chủ yếu của
phytaza là sử dụng như chất phụ gia thực phẩm để bổ sung cho thức ăn gia cầm
và lợn.
1.4.1.6 Tình hình nghiên cứu, sản xuất phytaza và ứng dụng ở Việt Nam
Ở Việt Nam, cho đến nay chưa có nơi nào sản xuất enzim phytaza. Hàng
năm nước ta vẫn phải nhập mộ
t lượng lớn phytaza từ các công ty nước ngoài như
Novo của Đan Mạch, Roche của Thụy Sĩ. Nguồn phế phụ phẩm nông sản của
nước ta rất dồi dào là cơ sở thuận lợi cho việc sản xuất enzym này ở trong nước.
Việc nghiên cứu sản xuất phytaza ở Việt Nam là rất cần thiết nhằm giảm giá
thành enzim này.

11
Việc sử dụng enzym chăn nuôi ở nước ta mới chỉ được ứng dụng trong
một vài năm gần đây với việc sử dụng các chế phẩm enzim của nước ngoài ở các
đơn vị sản xuất lớn như công ty Liên doanh thức ăn gia súc Mỹ, Công ty thức ăn
gia súc con cò.
Năm 1998, Khoa Chăn nuôi, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí

Minh đã tiến hành thử nghiệm sản phẩm phytaza dướ
i tên thương mại là
Ronozyme P bổ sung vào khẩu phần thức ăn nuôi lợn giống, lợn thịt và nuôi gà
đẻ tại các trại chăn nuôi Bảo Lộc, Đông Hiệp. Kết quả cho thấy Ronozyme P có
tác dụng làm tăng khả năng hấp thụ thức ăn của lợn, tăng tỷ lệ đẻ trứng và khối
lượng trứng của gà đẻ [2]. Tác giả Nguyễn Thị Hoài Trâm [1] cũng đã thông báo
về kh
ả năng ứng dụng chế phẩm Ronozyme P do Thuỵ Sĩ sản xuất vào thức ăn
chăn nuôi. Kết quả chế phẩm này đã làm tăng tỷ lệ đẻ trứng lên 2% và tăng năng
suất trứng sau 12 tuần là 1,86-1,99 quả/gà mái. Ngoài ra Viện Khoa học Kỹ thuật
Nông nghiệp Miền Nam cũng đã nghiên cứu đưa phytaza vào thức ăn cho lợn, gà
trong chương trình sản xuất thịt sạch của thành phố
Hồ Chí Minh. Chính từ
những nghiên cứu trên, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã quyết định
đưa phytaza vào danh mục các thức ăn chăn nuôi được nhập khẩu vào Việt Nam
thời kỳ 2001 - 2005 theo quyết định số 55/2001/QĐ/BNN-KNKL.
Trong khuôn khổ của đề tài cấp Nhà nước KC-04-20 phòng Vi sinh vật
sau thu hoạch, Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã tiến
hành nghiên cứu đề tài nhánh: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzym phytaza
t
ừ nấm mốc”. Hội đồng nghiệm thu đề tài cấp Nhà nước đã có biên bản đề nghị
đề tài nhánh này được chuyển thành dự án sản xuất thử nghiệm.
Kết quả của đề tài là đã tuyển chọn được các chủng A. niger có hoạt lực
phytaza cao, hoạt lực của các chủng phân lập dao động từ 9 đến 13IU/ml. Chúng
tôi cũng đã tiến hành nghiên cứu công nghệ sản xuất phytaza theo phương pháp
lên men chìm sục khí. Kết quả cho thấy phương pháp lên men chìm sục khí đã
cho hoạt lực phytaza là 13,5IU/ml. Tuy nhiên phương pháp lên men bề mặt là
phương pháp cho sản lượng phytaza cao hơn so với phương pháp lên men chìm
sục khí nhưng chưa được nghiên cứu trong khuôn khổ của đề tài câp Nhà nước
KC-04-20. Vì vậy việc nghiên cứu và hoàn thiện công nghệ sản xuất phytaza

12
bằng phương pháp lên men bề mặt là rất cần thiết trong khuôn khổ của dự án sản
xuất thử nghiệm này.
1.4.1.7 Những xu hướng mới trong lên men cơ chất rắn
Các tác giả Ashok Pandey[ 4], Author B. Bogar [ 5] đã nghiên cứu và kết
luận rằng lên men cơ chất rắn có thể tiến hành trực tiếp với các nguyên liệu rẻ
tiền như tinh bột, cellulose, lignin, hemicellulose và chitin đã xử lý hoặc tiền xử
lý. Quá trình lên men cơ chất rắn là t
ương đối đơn giản, ít sử dụng năng lượng và
nó có thể cung cấp vi môi trường đồng nhất thuận lợi cho sự phát triển của vi
sinh vật và các hoạt tính trao đổi chất. Hiện nay lên men cơ chất rắn đang được
các nhà khoa học hết sức quan tâm và xem như là một sự đổi mới trong nghiên
cứu các quá trình lên men sinh học, trước tiên là do lên men cơ chất rắn có nhiều
thuận lợi.
Các công trình nghiên cứu của các tác giả
Ashok Pandey[4], Author B.
Bogar [ 5] đã có bài viết tổng quan về lên men cơ chất rắn cho sản xuất các
enzym công nghiệp. Các tác giả này đã kết luận rằng lên men cơ chất rắn giữ vị
trí quan trọng trong việc sản xuất các enzym ở qui mô công nghiệp. Điều đặc
biệt quan tâm trong quá trình này là các sản phẩm lên men thô có thể sử dụng
trực tiếp như các nguồn enzym .
Author B. Bogar B. et al [5] đã nghiên cứu sản xuất phytaza bởi 3 loại nấm
bất toàn (A. ficuum NRRL 3135, Mucor racemosus NRRL 1994 và Rhizopus
oligosporus NRRL 5905) trên 4 thành phần thức ăn gia súc tự nhiên (bột hạt cải,
bột ngô, bột đậu tương, cám mì) đã được lên men bằng phương pháp lên men cơ
chất rắn (solid state fermentation-SSF) làm thức ăn gia súc. Chủng A. ficuum có
sản lượng cao nhất (15 IU phytaza/g chất khô trên môi trường cám mì. Ngoài ra,
việc kết hợp giữa cám gạo và tinh bột với (NH
4

)
2
SO
4
sản lượng phytaza đã nâng
lên 25 IU/g chất khô. Việc tối ưu hoá môi trường đã được tiến hành để nâng cao
sản lượng phytaza. Chủng nấm mốc A. ficuum khi lên men trên khay bằng
phương pháp SSF đã tạo ra ngoài enzym phytaza với hoạt tính đạt 20 IU/g còn
tạo ra một số enzym khác như: phytaza, phophatase, alpha-amylase và
xylanase[27]. Author Sarvesh Kumar [6] đã chỉ ra được hoạt tính tối đa của
enzym là 41,47 IU/ml ở pH 2.5 và 10,71 IU/ml ở pH 4. Hoạt tính tăng gần 13 lần
khi bổ sung phosphate ở dạng KH
2
PO
4
(0,004g/100ml). Hoạt tính enzym giảm từ

13
451 còn 187IU/kg (58,5%) và từ 287 còn 165IU/kg.Việc bổ sung các ion canxi
vào môi trường lên men đã làm tăng hoạt tính phytaza [ 24, 40]. Việc tạo cầu nối
disulfide ở chủng có gắn gene mangan peroxidase đã làm tăng tính chịu nhiệt của
các chủng sinh phytaza [41]. Sajidan A. et al đã nghiên cứu tách dòng phân tử và
xác định tính chất của 3-phytaza từ vi khuẩn KlebsiellaASR1[34]
Hai chế phẩm phytaza đã được thương mại hoá và sử dụng rộng rãi đó là
Natuphos và Ronozym P. Trong đó Natuphos là phytaza từ Aspergillus niger và
là 3-phytaza, có hoạt tính từ pH 6,5 đến 5,5. Ronozym P là phytaza từ
Peniophora lycii
và là 6-phytaza của hãng Roche, có hoạt tính tối ưu ở pH
4,5[21] Phytaza ngoại bào sản sinh bởi chủng Aspergillus niger ATCC 9142 có
hoạt tính chịu nhiệt ở 80

0
C hơn 2 phytaza thương mại.
Chủng A. niger chịu nhiệt được sử dụng cho sản xuất phytaza ngoại bào
trên các phế phụ phẩm nông nghiệp: cám mì, khô đậu tương, khô dừa, khô bông,
bột đậu đen bằng công nghệ lên men cơ chất rắn (solid state fermentation
phytaza). Hoạt tính cực đại đạt 108IU/g cám mốc khô khi lên men trên khô đậu
đũa [16] Trong quá trình lên men, axit phytic được thuỷ phân hoàn toàn đi kèm
với sự tăng sinh khối và hoạt tính phytaza trong 7 ngày. Trong các hoạt tính bề
mặt bổ sung, Trixton X-100
ở liều 0,5% đã làm tăng hoạt tính phytaza 30%.
KH
2
PO
4
(10 mg/100g môi trường phế phụ phẩm nông sản) đã làm tăng hoạt tính
phytaza. pH và nhiệt độ tối ưu của enzym thô là 5,0 ở nhiệt độ 50
0
C. Hoạt tính
phytaza (86%) còn lại trong dung dịch đệm ở pH 3,5 trong 24 giờ. Enzym còn lại
75% hoạt tính của nó khi ủ ở 55
0
C trong 1 giờ. Trong sự có mặt của 1 mM K
+
và
Zn
2+
hoạt tính của enzym còn lại 95% và 55% theo thứ tự. Ngoài việc lên men cơ
chất rắn không đòi hỏi yêu cầu trang thiết bị đắt tiền và có thể tận dụng được các
phế phụ phẩm nông nghiệp, thì các tác giả Park, J.S , Lachman M.D., Carter SD
[28] còn thấy rằng phytaza được sản xuất bằng lên men cơ chất rắn đã nâng cao

hiệu suất phát triển của lợn, sử dụng có hiệu quả lượng photpho trong thức ăn có
chứ
a ngô, đậu tương và giảm lượng photpho thải ra ngoài môi trường.
1.4.1.8 Tạo chế phẩm enzym
Tạo chế phẩm enzym là một vấn đề quan trọng sau quá trình lên men sinh
tổng hợp enzym. Công nghệ sấy phun enzym đã được miêu tả trong một số
patent của Mỹ như patent 4233405 của tác giả Cliffort E. Neuberck [8], patent

14
của Mỹ số 4617272 của tác giả Kirkwood K. Marda và Ưhite Bear, 1986 [13].
Hoạt tính enzym, bao gồm cả phytaza được ổn định bằng việc bổ sung một số
chất phụ gia như polyalkylene glycols, polyvinylpyrrolidone,
polyoxylenethylene, vinylpyrolidone. Hỗn hợp enzym và các chất phụ gia được
sấy phun ở nhiệt độ xung quanh 55
0
C, hàm ẩm của sản phẩm đạt 5,0%, trong đó
nhiệt độ đầu vào ở vòi phun là 140
o
C và đưa vào buồng phun qua đầu phun quay
vòng. Bên cạnh đó trong patent quốc tế WO 2006056469, công nghệ tạo chế
phẩm phytaza lại được thực hiện bằng cách trộn dịch lỏng chứa enzym với
protein đơn bào (nấm men) và sấy phun hoặc ép đùn ở áp suất thấp[12]
1.4.1.9 Lợi ích kinh tế, khả năng thị trường và cạnh tranh của sản phẩm Dự
án
Các nguyên liệu chính cho sản xuất phytaza là các phế phụ phẩ
m nông
nghiệp như cám gạo, cám mì, bột ngô Ở Việt Nam, những nguyên liệu này rất
dồi dào và có giá rất rẻ. Giá nhân công ở Việt Nam là rất thấp so với các nước
phát triển như Thụy Sĩ, Đan Mạch… mặt khác do sản xuất trong nước nên sẽ
giảm chi phí vận chuyển hơn so với sản phẩm cùng loại phải nhập từ nước ngoài.

Vì vậy, theo tính toán của chúng tôi enzim phytaza thô dùng trong chăn nuôi do
dự án sản xuất s
ẽ có giá khoảng 60.000 đồng/kg, trong khi đó giá phytaza
Ronozym của hãng Novozymes hiện bán trên thị trường Việt nam có giá
72000đ vì vậy giá enzim phytaza thô của dự án có khả năng cạnh tranh với
enzim phytaza dùng trong chăn nuôi ngoại nhập.
Những điều kiện trên đây là cơ sở quan trọng cho việc triển khai sản xuất
thử và tiến tới sản xuất qui mô công nghiệp enzim phytaza để cung cấp cho chăn
nuôi và các ngành công nghiệp khác và dự án là hoàn toàn có tính khả thi.
Ở nước ta nhu cầu th
ức ăn gia súc trong những năm qua là 8 triệu tấn/năm,
vậy lượng chế phẩm enzim cần bổ sung vào thức ăn chăn nuôi là 160 nghìn
tấn/năm (với liều là 200g/ 1tấn thức ăn). Riêng nhu cầu sử dụng enzim phytaza
trong thức ăn chăn nuôi ước khoảng 500 tấn mỗi năm nhưng enzim này đang
phải nhập toàn bộ từ nước ngoài. Chính vì vậy, để đáp ứng được nhu cầu phytaza
bổ sung vào th
ức ăn chăn nuôi nói trên thì dự án cần được mở rộng ra gấp nhiều
lần.


15
* Chỉ tiêu chất lượng của chế phẩm phytaza nước ngoài
- Tên sản phẩm: Ronozym của hãng Novozymes hiện bán trên thị trường Việt
nam
Chỉ tiêu Yêu cầu Kết quả
Dạng bột đạt
Màu sắc màu be đạt
Độ ẩm (%) Không quá 10,0 9,5
Hoạt tính, FTU/g không thấp hơn 2500 2950
Các chỉ tiêu vi sinh

Vi sinh vật tổng số, CFU/g
không vượt quá 5.10
4
4,5 x 10
4

Salmonella, CFU/25 g
âm tính đạt
Ecoli, CFU/25 g
âm tính đạt
Coliforms, CFU/g
không vượt quá 30 <30

1.4.1.10 Tác động của kết quả Dự án đến kinh tế-xã hội, an ninh, quốc
phòng
Sau khi dự án kết thúc và được triển khai nhân rộng sẽ có tác động rất lớn
đến việc tạo thêm công ăn việc làm cho hàng trăm người, tăng thu nhập cho các
cơ sở chế biến thức ăn chăn nuôi do tận dụng được các phế phụ phẩm nông
nghiệp để sản xuất phytaza một sản phẩm có giá tr
ị kinh tế cao. Dự án có ý nghĩa
trong việc làm tăng một cách đáng kể nguồn dinh dưỡng bổ sung vào thức ăn
chăn nuôi cho ngành chăn nuôi, mặt khác có tác động lớn đến việc giảm thiểu ô
nhiễm môi trường.
1.5 Nội dung của dự án
1. Xác định tính chất của enzym phytaza của tập đoàn vi sinh vật sinh enzym do
đề tài chọn tạo và sưu tập
- Xác định tính chất của phytaza từ chủng Aspergillus niger ATCC 9142 (pH tố
i
ưu, khả năng chịu nhiệt, khả năng thủy phân bằng pepsin, trypsin)

- Xác định tính chất của phytaza từ chủng Aspergillus ficcuum NRRL 3135 (pH
tối ưu, khả năng chịu nhiệt, khả năng thủy phân bằng pepsin, trypsin)

16
- Xác định tính chất của phytaza từ chủng Aspergillus niger MP2 (pH tối ưu, khả
năng chịu nhiệt, khả năng thủy phân bằng pepsin, trypsin)
- Xác định tính chất của phytaza từ chủng Aspergillus niger NCIM 563 (pH tối
ưu, khả năng chịu nhiệt, khả năng thủy phân bằng pepsin, trypsin)
- Xác định tính chất của phytaza từ chủng Rhizopus microsporus (pH tối ưu, khả
năng chịu nhiệt, khả năng thủy phân bằng pepsin, trypsin)
2. Hoàn thiện qui trình nhân giống cho sản xuất phytaza qui mô 1000l/mẻ.
3. Hoàn thiện qui trình lên men cơ chất rắn sản xuất phytaza qui mô 1,4 tấn/mẻ
(50 tấn/năm).
- Kỹ thuật khử trùng phòng nuôi cấy bề mặt bằng hóa chất.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của pH dịch khoáng đến khả năng sinh phytaza
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất cảm ứng đến khả năng sinh phytaza
- Nghiên cứu ảnh hưởng của m
ột số nguồn cơ chất khác nhau đến quá trình lên
men cơ chất rắn thu nhận phytaza
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh phytaza
- Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh phytaza
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nitơ đến khả năng sinh phytaza
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh phytaza
- Tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp phytaza bằng phương pháp lên men cơ chất
rắn
4. Hoàn thiện qui trình công nghệ tách chiết phytaza dạng thô 1,4 tấn/mẻ (50
tấn/năm)
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các dung dịch đệm đến khả năng chiết enzym
- Xây dựng quy trình tách chiết phytaza từ cơ chất lên men
5. Hoàn thiện qui trình công nghệ tạo chế phẩm phytaza dạng bột

- Nghiên cứu tuyển chọn các chất phụ gia thích hợ
p để tạo chế phẩm
- Nghiên cứu ổn định hoạt tính của enzym
- Nghiên cứu khả năng chịu nhiệt của enzym
- Nghiên cứu tạo chế phẩm bằng sấy phun
- Nghiên cứu tạo chế phẩm bằng ép đùn
6. Đánh giá chất lượng phytase do dự án sản xuất được( hoạt tính enzym, độ ổn
định của enzym)

17
7. Sản xuất thử phytaza thô qui mô 50 tấn/năm.
8. Đánh giá hiệu quả sử dụng enzim phytaza sản xuất được trên lợn, gà
- Đánh giá hiệu quả sử dụng chế phẩm phytaza trên lợn
- Đánh giá hiệu quả sử dụng chế phẩm phytaza trên gà
9. Đào tạo cán bộ và công nhân kỹ thuật để nắm vững thành thạo qui trình tạo
chủng giống có hoạt lực cao và qui trình sản xuất enzim phytaza ở
qui mô 50
tấn/năm
10. Tập huấn cho nông dân và các cơ sở chăn nuôi biết sử dụng enzim phytaza
vào chăn nuôi một số gia súc, gia cầm như lợn, gà.


18
II. NỘI DUNG KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐÃ THỰC HIỆN
2.1. Mô tả công nghệ, sơ đồ quy trình công nghệ (là xuất xứ của Dự án) để
triển khai trong Dự án
QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ NHÂN GIỐNG ĐỂ SẢN XUẤT ENZIM
PHYTAZA

Chủng A. niger giữ giống trên ống
thạch nghiêng
Nhân giống trên bình tam giác nuôi cấy lắc
ở vận tốc 200 v/phút trong 20 giờ trên môi
trường PDA, nhiệt độ 30

0
C


Nhân giống trên hệ thống lên men 100l/mẻ
trong 20 giờ trên môi trường PDA, pH=5,5,
nhiệt độ 30
0
C, vận tốc cánh khuấy 200V/phút,
DO=90%


Lên men trên hệ thống lên men 1000 l/mẻ
trong 24 giờ trên môi trường PDA pH=5.5,
nhiệt độ 30
0
C, vận tốc cánh khuấy 200V/phút,
DO=90%

19
QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN BỀ MẶT VÀ TẠO CHẾ PHẨM
PHYTAZA THÔ Ở QUY MÔ CÔNG NGHIỆP

Giống A. niger đã được nhân giống trên
hệ thống lên men chìm sục khí 1000
lit/mẻ trong 48 giờ
Lọc thu dịch nổi chứa hỗn hợp enzym
Cô đặc enzym bằng thiết bị lọc luân
hồi qui mô 1000 l/ mẻ

Phối trộn để ổn định và bảo
quản hỗn hợp enzym

Sấy phun hoặc sấy chân
không
lên men bề mặt trong 7 ngày ở
nhi
ệ
t đ
ộ
28-30
0
C
Chiết xuất phytaza bằng dung dịch
đệm như Axetat, citrat pH 5.5
Cám gạo, cám
ngô, các khoáng
vi lượng

Phụ gia
Chế phẩm phytaza
dạng thô

20
2.2 Phân tích những vấn đề mà Dự án cần giải quyết về công nghệ
Để sản xuất enzim phytaza, trong khuôn khổ của đề tài KC- 04-20 chúng
tôi đã phân lập và tuyển chọn được một số chủng A. niger có khả năng sinh tổng
hợp phytaza. Tuy nhiên hoạt lực của các chủng tự nhiên còn chưa ổn định và có
xu hướng giảm đi trong quá trình bảo quản, vì vậy chưa đáp ứng cho nhu cầu sản
xuấ
t enzim phytaza ở qui mô công nghiệp cho các cơ sở sản xuất.
Chúng tôi cũng đã nghiên cứu công nghệ lên men chìm sục khí và thu hồi
phytaza bằng thiết bị li tâm liên tục và kết tủa enzim bằng sunfat amon để sản

xuất phytaza ở qui mô 1000 lít/ mẻ. Nhưng qui mô này còn nhỏ, giá thành sản
phẩm còn cao và công nghệ tạo chế phẩm phytaza ở dạng bột mới chỉ giữ được
hoạt tính enzim trong thời gian từ 3 đến 6 tháng cho nên chưa đáp ứng được nhu
c
ầu sử dụng phytaza trong chăn nuôi của nước ta.
Để có thể tận dụng được nguồn nguyên liệu là phế phụ phẩm nông nghiệp
như là cám gạo, bột ngô… phương pháp lên men bề mặt (lên men cơ chất rắn)
sản xuất phytaza được sử dụng trong dự án này.
* Những vấn đề cần hoàn thiện trong khuôn khổ của dự án sản xuất
thử
+Về chủng giống
Để có được b
ộ chủng giống A. niger có hoạt tính cao và ổn định phục vụ
cho sản xuất enzim phytaza ở quy mô công nghiệp, chúng tôi thấy cần tiếp tục
tuyển chọn các chủng A. niger có hoạt tính phytaza cao, có khẳ năng chịu nhiệt
cao và có độ ổn định cao để có thể sản xuất phytaza ở mức độ thương mại
+Về công nghệ lên men
Để sản xuất phytaza ở lượng lớn phục vụ s
ản xuất, chúng tôi thấy cần hoàn
thiện công nghệ lên men bề mặt (lên men cơ chất rắn) cho sản xuất phytaza thô
qui mô 120 tấn/năm.
+ Về công nghệ thu hồi và tạo chế phẩm
Để có thể sản xuất phytaza ở lượng lớn phục vụ sản xuất, chúng tôi thấy cần
nâng cao công suất của hệ thống thu hồi enzim bằng việc sử dụng thiết bị lọc
luôn hồi công suấ
t 1000l/ mẻ. Đây là thiết bị hiện đại dùng để cô đặc enzim ở qui
mô công nghiệp, vì vậy chúng tôi thấy cần phải đầu tư kinh phí và thời gian để

21
nắm vững phương pháp sử dụng và rút ra các thông số kỹ thuật cho công nghệ cô

đặc enzim bằng hệ thống này.
Một vấn đề nữa cần hoàn thiện trong dự án là hoàn thiện công nghệ tạo chế
phẩm phytaza dạng bột nhằm kéo dài thời gian bảo quản trên 1 năm .
Việc nghiên cứu các thiết bị thích ứng để cơ giới hóa sản xuất nhằm đáp
ứng được sản xuất enzim phytaza
ở qui mô sản xuất 12 tấn mẻ (tức là 120
tấn/năm) trở lên là vấn đề rất cần được hoàn thiện trong khuôn khổ của dự án.
2.3. Phương pháp
2.3.1. Phương pháp nhân giống chủng A. niger DL1 quy mô 1000l/mẻ
Tiến hành theo phương pháp của phòng Công nghệ sinh học sau thu hoạch -
Viện Cơ điện NN và Công nghệ STH.
¾ Quá trình khử trùng toàn bộ hệ thống lên men
Trước khi khử trùng, toàn bộ tăng lên men và hệ thống ố
ng dẫn khí, dẫn hơi
được làm sạch, sau đó đóng chặt nắp tăng và cho hơi dẫn trực tiếp vào tăng. Hơi
dẫn vào khử trùng tăng phải đảm bảo sạch và áp suất nồi hơi luôn giữ ở 2 atm.
áp suất trong tăng khi khử trùng là 1,5 atm, khi bắt đầu dẫn hơi vào tăng thì phải
hé mở tất cả các van để hơi được lưu thông, đồng thời kết hợp khử
trùng hệ
thống phin lọc khí và hệ thống trục chèn kín với chế độ khử trùng giống khử
trùng tăng là 1,5 atm. Khi kim đồng hồ trong tăng chỉ 1,5 atm thì bắt đầu tính giờ
và áp suất này được giữ trong suốt thời gian khử trùng là 1 giờ.
¾ Quá trình điều chế môi trường
Sau khi kết thúc quá trình khử trùng toàn bộ hệ thống lên men chúng tôi
tiến hành bơm nước lạnh vào vỏ áo của tăng lên men để làm nguội môi trườ
ng.
Bơm nước vào tăng và cân đầy đủ các hóa chất trong thành phần môi trường lên
men đồng thời bổ sung dầu phá bọt. Đóng nắp tăng và mở van dẫn hơi vào vỏ
tăng đồng thời bật cánh khuấy với tốc độ là 250 vòng/phút để đảo trộn đều môi
trường nuôi cấy. Khử trùng môi trường ở 1 atm trong 1 giờ. Sau khi khử trùng

xong thì ngắt hơi và bơm nước từ bể lạnh để làm nguộ
i môi trường, khi nhiệt độ
môi trường trong tăng giảm xuống còn 30
0
C thì tiến hành tiếp giống.
¾ Quá trình tiếp giống
Chủng A.niger DL1 nghiên cứu được nhân giống trên máy lắc trên môi
trường nhân giống sau 24 giờ, giống được truyền vào tăng nuôi cấy với tỷ lệ

22
7 %- 10 %.
¾ Điều khiển oxy hòa tan, nhiệt độ và pH trong quá trình nhân giống
chủng A.niger ở qui mô 3000l/mẻ
Lượng oxy hòa tan trong môi trường nuôi cấy chìm sục khí được giữ ở
nồng độ 90 - 100% tùy vào thời các điểm nuôi cấy. Nồng độ oxy hòa tan trong
tăng nuôi cấy được điều khiển bằng hệ thống điều khiển oxy hòa tan tự động.
Nhiệt độ nuôi cấy được điều khiển b
ằng hệ thống điều khiển nhiệt độ đến nhiệt
độ thích hợp cho chủng A. niger. pH của môi trường nuôi cấy được điều khiển
bằng hệ thống điều khiển pH tự động đến pH 6 thích hợp cho chủng A. niger.

2.3.2. Các phương pháp khử trùng phòng nuôi cấy bề mặt
- Xông hơi Formon nồng độ 1lít dịch trong phòng lên men bề mặt thể tích 10m
3

thời gian xông hơi 24h.
- Dùng dung dịch Javen nồng độ 8% để lau hoặc phun lên bề mặt phòng nuôi cấy
(bao gồm sàn nhà, tường nhà, bề mặt các đồ dùng và trang thiết bị, cửa, …)
- Dùng dung dịch Cloramin B nồng độ 5% (pha 5g bột cloraminB trong 1 lít
nước) để lau hoặc phun lên bề mặt bị ô nhiễm (bao gồm sàn nhà, tường nhà, bề

mặt các đồ dùng và trang thiết bị, cửa, bồn rửa ). Lượng dung dịch hóa chất
phun lên tường cần tính đến sứ
c hấp thụ của tường đó (trong đó từ 150 ml – 300
ml/m2 đối với loại tường đất, 100ml/m2 đối với các loại tường xi măng, tường
gỗ và tường vôi). Dung tích thích hợp đối với sàn nhà là 200 ml – 300 ml/m2.
Đối với sàn nhà, trước hết phun/lau từ ngoài vào trong, rồi sau đó từ trong ra
ngoài. Thời gian tiếp xúc với hóa chất để có tác dụng diệt vi trùng không dưới 60
phút.
- Dùng đèn cực tím để khử trùng không khí trong các phòng nuôi cấy bề mặt
trong thời gian 24 gi
ờ. Đặt bề mặt khử trùng vuông góc với tia chiếu của đèn,
duy trì khoảng cách giữa đèn và vật được chiếu không quá 2,5m
- Trước khi khử trùng và sau khi khử trùng bằng các phương pháp khử trùng ở
trên để hộp petri có chứa môi trường thạch thường- glucoza đặc vô trùng trong
phòng nuôi cấy bề mặt trong thời gian 30 phút sau đó đậy nắp hộp lại. Để các
hộp peptri trên vào tủ ấm 30
0
C, sau 48 giờ đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch.
Từ đó tính ra số vi sinh vật trong 100 cm
2
không khí của phòng nuôi cấy bề mặt

23
2.3.3. Phương pháp lên men bề mặt chủng A.niger DL1
Môi trường P3 gồm cám gạo, cám ngô, và trấu được làm ẩm đến 65% bằng
dung dịch khoáng, cho môi trường vào túi nilon (4kg môi trường/túi nilon), hấp
khử trùng 1at trong 60 phút. Để nguội môi trường, phân môi trường vào khay
nhựa kích thước 50cmx40cmx10cm, độ dày môi trường khoảng 5cm. Chủng A.
niger DL1 được lên men hiếu khí trên môi trường P3 tại nhiêt độ 28
0C

– 30
0
C,
với tỷ lệ tiếp giống là 8%, lên men cho sản xuất phytaza trong thời gian từ 7
ngày đến 10 ngày đến khi các bào tử của chủng A. niger xuất hiện dày trên mặt
khay lên men.
2.3.4. Xác định hoạt độ phytaza theo phương pháp của F.C. Van der Heeft
Nguyên tắc :
Phương pháp dựa trên cơ sở sự thuỷ phân phytat natri (cơ chất của
phytaza) bằng dịch chế phẩm phytaza rồi sau đó làm vô hoạt enzym và tạo phản
ứng màu bằng hỗn hợp dung dị
ch Amoni heptamolybdat tetrahydrat và amoni
monovanadat. Định lượng sản phẩm – các gốc photphat vô cơ - được tạo thành
trong phản ứng thuỷ phân bằng phản ứng tạo phức có màu vàng với thuốc thử là
hỗn hợp dung dịch trên. Cường độ màu của phức tạo thành được xác định bằng
phương pháp đo quang phổ ở bước sóng λ = 415 nm. Sau đó dựa vào đồ thị
đường cong chuẩn của natri dihydrophotphat để tính lượng sản phẩm tươ
ng ứng
do enzym xúc tác tạo nên.
Hoạt độ phytaza (tạm ký hiệu là: HđF) của chế phẩm enzym đặc trưng cho
khả năng xúc tác phân giải hợp chất phytat (myo – inositol hexakis photphat)
thành các myo – inositol photphat phân tử thấp hơn và các gốc photphat vô cơ.
Hoạt độ phytaza được biểu thị bằng số đơn vị hoạt độ trong một 1 ml (hay 1g)
chế phẩm.
Định nghĩa đơn vị hoạt độ enzym: Một đơn vị hoạt độ phytaza là l
ượng enzym
xúc tác phản ứng thuỷ phân để giải phóng ra 1µmol phosphat vô cơ trong thời
gian một phút từ dung dịch phytat – natri ở 37°C, pH = 5,5 và trong các điều
kiện của phương pháp này.
2.3.5. Phương pháp xác định tính chất của phytaza

Enzym dùng trong nghiên cứu tính chất là enzym đã được cô đặc bằng cồn
nhằm loại bỏ một số tạp chất và được hòa trong nước cất.

24
a) Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của phytaza: Dung dịch
cơ chất natri phytat 3 mM được pha trong các dung dịch đệm có pH khác nhau
như sau: đệm 0,1M Glycin-HCl (pH 2,0 ; 2,5 ; 3,0), đệm 0,1M natri axetat (pH
3,0 ; 3,5 ; 4,0 ; 4,5 ; 5,0 ; 5,5 ; 6,0); đệm Tris-HCl 100 mM (pH 6,0 ; 6,5 ; 7,0 ;
8,0). Sau đó hoạt độ enzym được xác định với dung dịch cơ chất trên ở 50
o
C
trong 20 phút. Hoạt độ enzym thể hiện mạnh nhất ở pH nào thì coi đó là pH tối
thích cho hoạt độ enzym và được tính là 100%. Hoạt tính ở các pH khác được
tính theo pH tối thích.
b) Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của phytaza :
Enzym phản ứng với cơ chất ở các nhiệt độ khác nhau: 50; 55, 60; 65; 70 ; 75 ;
80
o
90
o
C trong thời gian 20 phút ở pH 5,5, sau đó xác định hoạt độ enzym để
tìm ra nhiệt độ thích hợp nhất cho enzym hoạt động.
c) Nghiên cứu ảnh hưởng của pepsin, tripsin đến phytaza
ủ pepsin và phytaza với tỷ lệ 0,1%, 1% (w/w) trong dung dịch HCl 0,1 N;
trypsin với phytaza cũng với tỷ lệ trên, ở 37
o
C trong 2 giờ. Các hỗn hợp enzym
trên sau đó được bổ sung cơ chất natri phytat rồi xác định lượng photpho vô cơ
giải phóng ra và hoạt độ còn lại của enzym.
2.3.6. Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH dịch khoáng của môi

trường lên men đến khả năng sinh phytaza của chủng A.niger DL1
Cám gạo, cám ngô, trấu được làm ẩm đến 65% bằng những dung dịch
khoáng có giá trị pH khác nhau từ 3.0 – 7.0. Sau khi thanh trùng kiểm tra lại pH
nhằm tìm ra giá trị pH thực củ
a môi trường rồi tiến hành lên men chủng A. niger
DL1 trong các khay nhựa kích thước 50cmx40cmx10cm, độ dày môi trường
khoảng 5cm , tỉ lệ tiếp giống là 8% ở 28- 30
0
C trong 7 ngày. Sau 7 ngày tiến
hành chiết cơ chất lên men rắn bằng đệm natri axetat đệm 0,1M; theo tỉ lệ 1 : 1,5.
Sau 24 giờ dùng vải màn vắt kiệt thu dịch enzym phytaza. Dịch thu được sau đó
được ly tâm 14000v/p trong 20 phút để loại xác tế bào, thu dịch nổi để xác định
hoạt độ enzym phytaza sinh tổng hợp được.
2.3.7. Phương pháp xác định ảnh hưởng của chất cảm ứng đến khả năng
sinh phytaza từ chủng A. niger DL1
Chất cảm
ứng Na- phytat được pha ở các nồng độ khác nhau từ 0 -
200µmol/l (bước nhảy 50µmol/l).