Nghiên cứu ứng dụng các hạt nano phát quang vào việc đánh dấu tế bào để xác định số lượng vi khuẩn gây độc trong thực phẩm

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


ĐỀ TÀI ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC


BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI


NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÁC HẠT NANO PHÁT QUANG
VÀO VIỆC ĐÁNH DẤU TẾ BÀO ĐỂ XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG
VI KHUẨN GÂY ĐỘC TRONG THỰC PHẨM


MÃ SỐ ĐỀ TÀI: 14ĐTĐL2009.T/29




Cơ quan chủ trì đề tài/dự án: Viện Công nghệ sinh học
Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Tống Kim Thuần

9008
Hà Nội - 2011

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


ĐỀ TÀI ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC


BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÁC HẠT NANO PHÁT QUANG
VÀO VIỆC ĐÁNH DẤU TẾ BÀO ĐỂ XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG
VI KHUẨN GÂY ĐỘC TRONG THỰC PHẨM

MÃ SỐ ĐỀ TÀI: 14ĐTĐL2009.T/29


Chủ nhiệm đề tài/dự án: Cơ quan chủ trì đề tài/dự án:
(ký tên) (ký tên và đóng dấu)


PGS. TS. Tống Kim Thuần

Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ
(ký tên) (ký tên và đóng dấu khi gửi lưu trữ)



Hà Nội – 2011
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BSA Bovine serum albumin

CFU Colony forming unit - Đơn vị hình thành khuẩn lạc
ĐC Đối chứng
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
E. coli Escherichia coli
E. coli O157:H7 Escherichia coli serotype O157:H7
EDAC 1 - ethyl - 3 - (3- dimethylaminopropyl) carbodimide hydrochloride
EDC 1 - ethyl - 3 - (3- dimethylaminopropyl) carbodimide hydrochloride
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
FITC Fluorescein isothiocyanate
HAT Hypoxanthine-aminopterin-thymidine
HQ Huỳnh quang
IPTG Isopropylthio-β-D-galactoside
KHV HQ Kính hiển vi huỳnh quang
KHV QH Kính hiển vi quang học
KHVĐT Kính hiển vi đồng tiêu
KL Khuẩn lạc
KN Kháng nguyên
KT Kháng thể
KTĐD Kháng thể đơn dòng
LB broth Môi trường canh thang Luria - Bertani
MDHQ Miễn dịch huỳnh quang
MES 2- ( N- morpholino) ethanesulfonic acid monohydrate
ml Millilite
MPN Most probable number
nm Nanomete
NP
s
Hạt nano silica phát quang
OD Optical density - Mật độ quang
OMP Outer Membrane Protein

PBS Phosphate buffered saline
PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp
PEG Polyethylene glycol
PQ Phát quang
QD
s
Chấm lượng tử Quantum dots
RhB hoặc RB Tâm màu hữu cơ Rhodamine B. Phát quang màu đỏ, cam.
RuBpy Tâm màu hữu cơ RuBpy. Phát quang màu đỏ
S. typhimurium Salmonella typhimurium
SEM Scanning Electron Microscope - Kính hiển vi điện tử quét
SMAC Macconkey sorbitol agar – Môi trường thạch Macconkey sorbitol
Stx
Shiga toxin – Độc tố shiga
TB Tế bào
TBL Tế bào lai
TEM Transmission electron microscopy - Kính hiển vi điện tử truyền qua
TN Thí nghiệm
VK Vi khuẩn
VN Việt Nam
WB WESTERN BLOT
XLD Xylose lysine desoxycholate
µl Microlite
µm Micromete
TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam
ORMOSIL Organic modified silica


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng Tên bảng Trang

Bảng 1.1 So sánh các phương pháp phát hiện E. coli 0157:H7 trong
thực phẩm
9
Bảng 1.2 Một số bộ KIT thương mại dựa trên kỹ thuật phân tích kháng
thể dùng trong phát hiện tác nhân gây bệnh và độc tố trong
thực phẩm
11
Bảng 2.1 Phương án kiểm tra tính đặc hiệu của kháng thể kháng vi
khuẩn đích
50
Bảng 2.2 Cách pha loãng các mẫu chứa vi khuẩn E. coli O157:H7 gắn
kết phức hợ
p để xây dựng đường chuẩn
55
Bảng 3.1 Đánh giá kết quả sử dụng hạt silica chứa tâm màu, hạt keo
vàng và chấm lượng tử QD để đánh dấu vi khuẩn E. coli
O157:H7 và S. typhimurium
62
Bảng 3.2 Nghiên cứu sự gắn kết của kháng thể đặc hiệu lên bề mặt hạt
silica chứa các nhóm chức năng khác nhau
64
Bảng 3.3 So sánh mức độ tương đồng của gen fljB với geneBank 69
Bả
ng 3.4 So sánh mức độ tương đồng của gen fliC với geneBank 69
Bảng 3.5 So sánh mức độ tương đồng của gen fljB với geneBank 75
Bảng 3.6 Kết quả tách dòng các tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng 77
Bảng 3.7 Kết quả xác định độ đặc hiệu của các dòng KTĐD với kháng
nguyên H7 của vi khuẩn E. coli O157:H7
78
Bảng 3.8 Số lượng KTĐD kháng E. coli O157:H7 và S. typhimurrium

sản xuất được
85
Bảng 3.9 Ứng dụ
ng KTĐD sản xuất trong nước vào việc phát hiện và
xác định số lượng VK đích gây bệnh bằng hạt nano silica
86
Bảng 3.10 Ảnh hưởng của lượng hoạt động bề mặt lên kích thước hạt
nano ORMOSIL
91
Bảng 3.11 Ảnh hưởng của lượng amine lên kích thước và chất lượng hạt
nano ORMOSIL
92
Bảng 3.12 Kết quả đo pH của các mẫu với lượng amine khác nhau 93
Bảng 3.13 Ảnh hưởng của kích th
ước hạt lên độ chói của hạt ORMOSIL 101
Bảng 3.14 Tổng kết số lượng hạt nano silica sản xuất tại Việt Nam 104
Bảng 3.15 Ứng dụng hạt nano silica và kháng thể sản xuất trong nước 104
vào việc phát hiện và xác định VK đích gây bệnh thực phẩm
Bảng 3.16 So sánh chất lượng phức hợp KT đặc hiệu + hạt nano silica
phát quang được tạo ra từ 2 loại hạt nguyên liệu silica
104
Bảng 3.17 Đánh giá độ bền của phức hợp KT đặc hiệu + hạt silica được
tạo ra từ 2 loại vật liệu silica thương phẩm và trong nước.
105
Bảng 3.18 Ảnh hưởng của chất xúc tác EDAC lên sự tạ
o thành phức hợp
KT + hạt nano silica thông qua số lượng vi khuẩn đích PQ
109
Bảng 3.20 Ảnh hưởng của ánh sáng, nhiệt độ và pH dung dịch đệm chất
xúc tác lên khả năng tạo phức hợp KT + hạt nano silica

111
Bảng 3.22 Ảnh hưởng của điều kiện lắc lên khả năng tạo phức hợp KT +
hạt silica
113
Bảng 3.23 Ảnh hưởng của thời gian ủ lên việc tạo phức hợ
p KT đặc
hiệu + hạt silica cho 2 loại vi khuẩn
114
Bảng 3.24 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ lên việc tạo thành phức hợp kháng
thể đặc hiệu + hạt silica của 2 loại vi khuẩn
115
Bảng 3.25 Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm lên khả năng thu hồi phức hợp
KT đặc hiệu + hạt nano silica của 02 loại vi khuẩn đích.
116
Bảng 3.26 Ảnh hưởng của thờ
i gian ly tâm lên khả năng thu hồi phức
hợp kháng thể đặc hiệu + hạt nano silica
117
Bảng 3.27 Kết quả tạo phức hợp KT đặc hiệu + hạt nano silica phát
quang cho 2 loại vi khuẩn đích ở các điều kiện đã lựa chọn
119
Bảng 3.28 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ bền của phức hợp đặc hiệu E.
coli O157: H7 sau 7 ngày bảo quản
120
Bảng 3.29
Độ bền và tỉ lệ tế bào vi khuẩn phát quang theo thời gian bảo
quản phức hợp KT + hạt nano silica
121
Bảng 3.30 Bảng tổng kết số lượng 02 loại phức hợp kháng thể đặc hiệu
+ hạt silica cho 2 loại vi khuẩn E. coli O157:H7 và S.

typhimurium sản xuất được trong 3 năm
126
Bảng 3.31 Đánh giá mức độ gắn kết của KT đặc hiệu lên bề mặt hạt
nano silica thông qua t
ỉ lệ % số lượng VK đích phát quang
128
Bảng 3.32 Đánh giá mức độ gắn kết của KT lên bề mặt hạt nano silica
thông qua xác định hàm lượng protein trước và sau khi rửa và
ly tâm phức hợp
128
Bảng 3.33 Thời gian nhận biết và liên kết với vi khuẩn đích của phức 132
hợp kháng thể đặc hiệu + hạt nano silica
Bảng 3.34 Ảnh hưởng của lượng phức hợp KT + hạt silica : tế bào lên
việc nhận biết và liên kết với vi khuẩn đích E. coli O157:H7
và S. typhimurium
133
Bảng 3.35 Ảnh hưởng mật độ tế bào lên khả năng nhận biết và liên kết
với vi khuẩn đích của phức hợp kháng thể + hạt nano silica
134
Bảng 3.36 Kết quả ly tâm thu vi khuẩn
đích đã gắn kết với phức hợp 135
Bảng 3.37 Phát hiện và xác định tỉ lệ tế bào E. coli O157:H7 phát quang
trực tiếp dưới kính huỳnh quang trên 1 hiển vi trường
137
Bảng 3.38 Tỉ lệ % số lượng vi khuẩn đích trong mẫu được phát hiện và
xác định bằng phương pháp đếm TB phát quang trên 1 HVT
138
Bảng 3.39 Số lượng tế bào E. coli O157:H7 và S. typhimurium gắn phức
hợp trong các dịch pha loãng chuẩn
140

Bả
ng 3.40 Kết quả đo cường độ huỳnh quang của các dung dịch chuẩn
chứa chính xác số lượng E. coli O157:H7 gắn phức hợp
kháng thể đặc hiệu + hạt nano silica
141
Bảng 3.41 Kết quả đo phổ huỳnh quang các dịch chứa chính xác số
lượng vi khuẩn S. typhimurium gắn phức hợp
143
Bảng 3.42 Xác định số lượng vi khuẩn đích bằng phép đo phổ HQ 145
Bảng 3.43 Phát hiện và xác
định vi khuẩn đích trong thịt bò không tăng
sinh bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch đặc hiệu
151
Bảng 3.44 Phát hiện và xác định vi khuẩn đích trong thịt bò tăng sinh 6
giờ bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch đặc hiệu
152
Bảng 3.45 Xác định số lượng vi khuẩn đích trong dịch chiết thịt bò dính
đất bằng phương pháp đo phổ huỳnh quang
154
Bả
ng 3.46 Đánh giá hiệu lực phương pháp đo phổ huỳnh quang 160
Bảng 3.47 Phát hiện vi khuẩn đích trong thịt bò bằng ELISA và PCR 161
Bảng 3.48 Xác định gen độc tố của vi khuẩn E. coli O157:H7 và S.
typhimurium trong thịt bò bằng phương pháp PCR
161
Bảng 3.49 So sánh các phương pháp xác định số lượng vi khuẩn đích E.
coli O157:H7 và S. typhimurium có trong thịt bò
163
Bảng 3.50 So sánh các phương pháp phát hiện vi khuẩn đích E. coli
O157:H7 và S. typhimurium có trong thịt bò

163

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình Tên hình Trang
Hình 1.1a Ảnh vi khuẩn E. coli O157:H7. 7
Hình 1.1b Ảnh vi khuẩn S. typhimurium 7
Hình 1.2 Sơ đồ chế tạo hạt nano silica chứa tâm màu bằng phương
pháp miclle đảo
21
Hình 1.3 Các cách gắn kết phân tử sinh học với hạt nano 22
Hình 1.4 Các cách gắn kết đồng hóa trị thông thường giữa phân tử sinh
học và hạt nano
23
Hình 1.5 Mô tả cách gắn kết đặc hiệu của hạt nano silica với vi khuẩn
lao Mycobacterium tuberculosis
23
Hình 1.6 Ảnh các hạt silica với các tâm mầ
u khác nhau 24
Hình 1.7a Gắn kết trực tiếp thông qua liên kết amine-carboxylic 25
Hình 1.7b Cơ chế gắn kết trực tiếp giữa nhóm amin bậc 1 và nhóm
carboxyl sử dụng chất xúc tác EDAC
25
Hình 1.8 Sự gắn kết nhờ tạo cặp sulfhydryl-amine. 26
Hình 1.9 Gắn kết các nhóm carbon-hydrate bị oxy hóa trên phần Fc
của kháng thể
26
Hình 1.10 Gắn kết các peptide được gắn histidine hoặc các kháng thể
lên các hạt nano silica được Ni-NIA hóa
27

Hình 1.11 Gắn kết không hóa trị giữa hạt nano silica gắn streptavidin
với các kháng thể
được biotin hóa
27
Hình 1.12 Gắn kết không hóa trị giữa hạt nano silica gắn NHS-PEG-
bion được gắn streptavidin với các kháng thể được biotin hóa
27
Hình 2.1 Cấu trúc hóa học của chất precursor và chất hoạt động bề mặt 41
Hình 2.2 Hình ảnh một số thiết bị, máy móc đã sử dụng trong Đề tài 42
Hình 2.3 Sơ đồ khối hệ đo huỳnh quang 56
Hình 3.1 Khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường thạch sau 24h nuôi cấy. 61
Hình 3.2 Ảnh vi khuẩn E. coli O157:H7. 63
Hình 3.3 Hình
ảnh của thực khuẩn thể hình sợi M13 gắn kết với hạt silica 63
Hình 3.4 DNA tổng số của S. typhimurium 65
Hình 3.5 Gen fljB mã hóa H2 của vi khuẩn S. typhimurium 65
Hình 3.6 Gen fljC mã hóa H1 của vi khuẩn S. typhimurium 65
a
Hình 3.7 Kết quả kiểm tra tách dòng gen fliC của S. typhimurium 66
Hình 3.8 Kết quả kiểm tra tách dòng gen fljB của S. typhimurium 66
Hình 3.9 Điện di đồ SDS-PAGE kiểm tra sự biểu hiện protein H1 70
Hình 3.10 Điện di đồ SDS-PAGE các phân đoạn protein sau khi tinh
sạch bằng cột sắc ký ái lực
gắn

Ni2+

70
Hình 3.11 Kết quả WB giữa protein H1 với kháng huyết thanh H1 71
Hình 3.12 Kết quả ELISA trên huyết thanh ở 3 chuột trước và sau khi

gây đáp ứng miễn
dịch
71
Hình 3.13 Hình thái tế bào sau 7 ngày dung
hợp
(200X) 71
Hình 3.14 Kết quả sàng lọc các dòng hydridoma có khả năng tạo kháng
thể
kháng H1 trên 126 giếng tế bào lai ở 15 đĩa 96
giếng.

72
Hình 3.15 Kết quả điện di SDS-PAGE KTĐD sau tinh
sạch.
72
Hình 3.16 Kết quả Western blot các KTĐD với protein tái tổ hợp H1 73
Hình 3.17 Kết quả miễn dịch huỳnh quang (488 nm) trên tế bào vi
khuẩn S. typhimurium
với
các KTĐD (100X)
73
Hình 3.18 Gen mã hóa kháng nguyên lông của E. coli O157:H7 74
Hình 3.19 Kết quả điện di SDS-PAGE kiểm tra biểu hiện gen fliC
trên E. coliBL21 và phân đoạn protein sau khi tinh sạch
74
Hình 3.20 Kết quả WB giữa protein H7 của E. coli BL21/pET-H7 với
kháng huyết thanh
76
Hình 3.21 Kết quả ELISA trên huyết thanh ở 3 chuột khi gây đáp ứng
miễn

dịch bằng kháng nguyên tái tổ hợp H7 của
E. coli

BL21/pET-H7
76
Hình 3.22 Dòng tế bào sau 5 ngày tách dòng 77
Hình 3.23 Hình ảnh điện di kháng nguyên E. coli O157:H7 trên gel
SDS-PAGE và Western blot với Mab C3.26.IV
79
Hình 3.24 Quy trình sản xuất KTĐD đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7 80
Hình 3.25 Quy trình sản xuất KT đơn dòng của vi khuẩn S. typhimurium 83
Hình 3.26 Ánh các loại hạt nano silica ORMOSIL chế tạo tại Viện vật
lý, Viện KH & CN VN với kích thước và tâm màu khác nhau
90
Hình 3.27 Ảnh SEM của hạt nano ORMOSIL được chế tạo tại Viện
Vật lý. Chụp trênKHV quét SEM Hitachi-S480
90
Hình 3.28 Sơ đồ quy trình chế t
ạo hạt nano ORMOSIL chứa tâm màu
hữu cơ bằng phương pháp Stober
88
Hình 3.29 Ảnh SEM của các mẫu khi thay đổi lượng hoạt động bề mặt 92
Hình 3.30 Ảnh SEM của các mẫu hạt nano ORMOSIL trong dãy mẫu
thay đổi lượng amine
92
Hình 3.31 Phổ tán xạ Raman của hạt nano ORMOSIL 94
Hình 3.32 Phổ hấp thụ hồng ngoại của hạt nano ORMOSIL 94
Hình 3.33 Cấu trúc hoá học bề mặt của hạt nano ORMOSIL 94
Hình 3.34 Phổ hấp thụ và huỳnh quang của hạt nano ORMOSIL chứa
RB (mẫu 2SB20,kích thước ∼20nm) và của RB

95
Hình 3.35 Sự ph
ụ thuộc của độ hấp thụ RB/Etanol vào nồng độ RB 95
Hình 3.36 Phổ hấp thụ và truyền qua của các mẫu dung dịch hạt nano
ORMOSIL trong dãy mẫu thay đổi lượng hoạt động bề mặt
95
Hình 3.37 Phổ hấp thụ và phổ hấp thụ chuẩn hóa của các mẫu dung dịch
hạt nano ORMOSIL sau khi đã trừ hấp thụ của nền
95
Hình 3.38 Phổ huỳnh quang và phổ huỳnh quang chuẩn hóa của các
mẫ
u dung dịch hạt nano ORMOSIL trong dãy mẫu thay đổi
lượng hoạt động bề mặt (kích thích 532nm)
97
Hình 3.39 Phổ hấp thụ mẫu hạt ORMOSIL khi thay đổi lượng amine 97
Hình 3.40 Phổ huỳnh quang và phổ huỳnh quang chuẩn hóa của các
mẫu hạt nano ORMOSIL trong dãy thay đổi lượng amine
98
Hình 3.41 Cường độ HQ của hạt nano ORMOSIL (màu đỏ) và RhB
(xanh lá cây) phụ thuộc thời gian.
98
Hình 3.42 Biến đổi phổ của hạt nano ORMOSIL chứa tâm màu RB 100
Hình 3.43 Phổ huỳnh quang và phổ huỳnh quang chuẩ
n của các mẫu
dung dịch hạt nano ORMOSIL chứa RB trong dãy mẫu thay
đổi lượng hoạt động bề mặt (kích thích 532nm)
100
Hình 3.44 Ảnh huỳnh quang của E. coli O157:H7 được gắn kết với hạt
nano ORMOSIL chứa RhB. Kích ở 480 nm
102

Hình 3.45 Ảnh TEM của E. coli O157:H7 gắn hạt nano ORMOSIL
chứa tâm màu Rhodamine B.
102
Hình 3.46 Kết quả kiểm tra khả năng tự phát quang của các chủng VK. 107
Hình 3.47 Kiểm tra tính đặc hiệu của kháng thể kháng vi khuẩn E. coli
O157:H7 dướ
i KHV quang học vật kính dầu x 100
108
Hình 3.48 Kiểm tra tính đặc hiệu của kháng thể kháng vi khuẩn S.
typhimurium dưới KHV quang học vật kính dầu x 100
108
Hình 3.49 Ảnh hưởng của EDAC lên sự tạo thành phức hợp KT + hạt
silica đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7
110
Hình 3.50 Ảnh hưởng của EDAC lên sự tạo thành phức hợp KT + hạt
silica đặc hiệu vi khuẩn S. typhimurium
110
Hình 3.51 Ảnh hưởng của nồng độ chất xúc tác EDAC lên việc tạo
thành phức hợp KT đặc hiệu + hạt nano silica
110
Hình 3.52 Ảnh hưởng của tỉ lệ KT : silica lên việc tạo thành phức hợ
p
KT đặc hiệu + hạt nano silica đối với 02 loại vi khuẩn E. coli
O157:H7 và S. typhimurium
112
Hình 3.53 Ảnh hưởng thời gian ủ lên việc tạo phức hợp KT đặc hiệu +
hạt silica cho 2 loại vi khuẩn đích
114
Hình 3.54 Số lượng vi khuẩn cho tín hiệu PQ sau 3 giờ ủ tạo phức hợp. 115
Hình 3.55 Ảnh chụp vi khuẩn E. coli O157:H7 gắn với phức hợp KT +

hạt silica tạo ra trong các điều kiệ
n lựa chọn.
118
Hình 3.56 Ảnh chụp vi khuẩn S. typhimurium gắn với phức hợp KT +
hạt silica tạo ra trong các điều kiện lựa chọn.
118
Hình 3.57 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản phức hợp lên khả năng
nhận biết và liên kết với vi khuẩn đích
121
Hình 3.58 Tế bào E. coli O157:H7 phát quang theo thời gian bảo quản
phức hợp KT + hạt silica (4°C)
122
Hình 3.59 Tế bào vi khuẩn đích S. typhimurium
phát quang theo thời
gian bảo quản phức hợp KT + hạt silica (4°C)
122
Hình 3.60 Quy trình sản xuất phức hợp kháng thể đặc hiệu vi khuẩn E.
coli O157:H7 + hạt nano silica quy mô phòng thí nghiệm
123
Hình 3.61 Sơ đồ khối quy trình sản xuất phức hợp KT đặc hiệu vi khuẩn
S. typhimurium + hạt nano silica quy mô phòng thí nghiệm
124
Hình 3.62a Phức hợp kháng thể đặc hiệu E. coli O157:H7 + hạt silica
dưới KVH HQ x 100.
127
Hình 3.62b Sản phẩm thử nghiệm đặc hiệu
E. coli O157:H7 127
Hình 3.62c Sản phẩm phức hợp KT + hạt silica đặc hiệu S. typhimurium 127
Hình 3.62d Sản phẩm phức hợp được đóng gói 127
Hình 3.63 Vi khuẩn E. coli O157:H7 gắn với phức hợp đặc hiệu dưới

KHV HQ x100, kích ở 480 nm
127
Hình 3.64 Vi khuẩn S. typhimurium gắn với phức hợp đặc hiệu dưới 127
KHV HQ x100, kích 480 nm
Hình 3.65 Ảnh SEM E. coli O157:H7 được bao bọc bởi phức hợp 129
Hình 3.66 Ảnh SEM S. typhimurium được bao bọc bởi phức hợp 129
Hình 3.67 Ảnh huỳnh quang vi khuẩn E. coli O157:H7 gắn phức hợp
KT + silica
129
Hình 3.68 Thời gian nhận biết và liên kết với vi khuẩn đích của phức
hợp KT đặc hiệu + hạt nano silica
133
Hình 3.69 Ảnh TEM hình dáng, kích thước vi khuẩn E. coli O157:H7
sau khi gắn kết với phức hợp KT + hạt silica.
136
Hình 3.70
Đếm tế bào E. coli O157:H7 gắn phức hợp PQ dưới kính HQ 136
Hình 3.71 Đếm tế bào S. typhimurium gắn phức hợp PQ dưới kính HQ 136
Hình 3.72 Phổ huỳnh quang của các mẫu vi khuẩn E. coli O157:H7
đánh dấu bằng phức hợp KT + hạt silica.
142
Hình 3.73 Đường chuẩn biểu thị sự phụ thuộc giữa cường độ huỳnh quang
và số lượng E. coli O157:H7 được gắn kết với phức hợp.
142
Hình 3.74 Đường chu
ẩn biểu thị sự phụ thuộc giữa cường độ HQ và số
lượng vi khuẩn S. typhimurium được gắn kết với phức hợp
kháng thể đặc hiệu + hạt nano silica.
144
Hình 3.75 Quy trình công nghệ xác định số lượng vi khuẩn gây bệnh

trong thực phẩm E. coli O157:H7 bằng các hạt nano silica
phát quang gắn kháng thể quy mô phòng thí nghiệm
147
Hình 3.76 Xác định số lượng vi khuẩn đích trong thịt bò 152
Hình 3.77 Phát hiện S. typhimurium (a và b) và E. coli O157:H7 (c)
trong dịch thịt bò dưới kính HQ kích ở 480 nm, vật kính x100
153
Hình 3.78 Quy trình ứng dụng hạt nano phát quang gắn kháng thể đặc
hiệu để xác định số lượng vi khuẩn E. coli O157:H7 trong
các mẫu thịt bò nhiễm khuẩn tại Hà Nội.
156
Hình 3.79 Quy trình ứng dụng hạt nano phát quang gắn kháng thể đặc
hiệu để xác định số lượng vi khuẩn S. typhimurium trong các
mẫu thịt bò nhiễm khuẩn tại Hà Nội.
158
Hình 3.80 Xác định số l
ượng VK đích E. coli O157:H7 bằng 2 phương pháp 161
Hình 3.81 Xác định số lượng VK đích S. typhimurium bằng 2 phương pháp 161
Hình 3.82 Xác định các gen độc tố của E. coli O157:H7 162
Hình 3.83 Xác định các gen độc tố của S. typhimurium 162
MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
6
1.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN E. COLI O157:H7 VÀ S.
TYPHIMURIUM

6
1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN E. COLI O157:H7 VÀ S.
TYPHIMURIUM
7
1.3 NGUYÊN LÝ CỦA PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG HẠT NANO PHÁT
QUANG VÀO VIỆC ĐÁNH DẤU TẾ BÀO ĐỂ XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG VI
KHU
ẨN GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM
13
1.4 CÁC HẠT NANO SỬ DỤNG TRONG CÁC PHÂN TÍCH SINH HỌC 14
1.4.1 Hạt vàng: Au NP
s
14
1.4.2 Tinh thể nano chấm lượng tử QuantumDots (QD) 14
1.4.3 Các hạt nano silica chứa tâm màu 15
1.4.4 Các hạt từ (Magnetic nanoparticles) 16
1.5 ỨNG DỤNG CÁC HẠT NANO SILICA PHÁT QUANG TRONG Y SINH 16
1.5.1 Các phân tích miễn dịch dựa trên NP silica 17
1.5.2 Hạt nano silica ứng dụng cho hiện ảnh tế bào (cellular imaging) 18
1.5.3 Hạt nano silica cho các phân tích sinh học đa hệ 18
1.5.4 Hạt nano NP
s
cho phân tích ADN 19
1.5.5 Phân tích sinh học dựa trên sơ đồ nhận biết phân tử khác 19
1.6 PHƯƠNG PHÁP TẠO HẠT NANO SILICA CHỨA TÂM MÀU PHÁT
QUANG GẮN CÁC NHÓM CHỨC NĂNG SINH HỌC
20
1.7 CƠ CHẾ GẮN KẾT CỦA HẠT NANO SILICA VỚI PHÂN TỬ SINH HỌC 21
1.7.1 Gắn kết trực tiếp 22
1.7.2 Gắn kết không trực tiếp 23

1.8 CÁC PHƯƠNG PHÁP TẠO PHỨC HỢP KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU +
HẠT NANO SILICA CHỨA TÂM MÀU PHÁT QUANG
24
1.8.1 Gắn kết trực tiế
p thông qua liên kết amine–carboxylic 25
1.8.2 Gắn kết nhờ sự tạo cặp sulfhydryl-amine 26
1.8.3 Gắn kết trực tiếp thông qua các nhóm carbon-hydrate bị oxy hóa trên
phần Fc của kháng thể
26
1.8.4 Gắn kết các peptide được gắn histidine hoặc các kháng thể lên các hạt
nano silica được nickelnitrilotriacetic (Ni-NIA) hóa
26
1.8.5 Gắn kết không hóa trị giữa hạt nano silica gắn streptavidin với các
kháng thể được biotin hóa
27
1.9 SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG ĐẶC HIỆU E. COLI O157:H7
VÀ S. TYPHIMURIUM
28
1.9.1 Cấu trúc kháng nguyên vi khuẩn E. coli O157:H7 28
1.9.2 Cấ
u trúc kháng nguyên vi khuẩn S. typhimurium 29
1.10 PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ HUỲNH QUANG ĐỂ PHÁT HIỆN VÀ
XÁC ĐỊNH NHANH SỐ LƯỢNG VI KHUẨN ĐÍCH GÂY BỆNH
30
1.10.1 Phổ huỳnh quang 30
1.10.2 Kính hiển vi huỳnh quang 31
1.11 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ
TÀI
32
1.11.1 Một số thông tin về các nghiên cứu trong nước 32

1.11.2 Những thành tích và các vấn đề khoa học và công nghệ còn tồn tại, hạn
chế của sản phẩm, công nghệ trong nước
36
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PH
ƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38
2.1 NGUYÊN LIỆU, CHỦNG GIỐNG VI SINH VẬT VÀ HÓA CHẤT 38
2.1.1 Nguyên liệu 38
2.1.2 Chủng giống vi sinh vật, môi trường nuôi cấy và các dung dịch đệm 39
2.1.2.1 Chủng giống vi sinh vật và môi trường nuôi cấy
39
2.1.2.2 Chuẩn bị các dung dịch đệm
40
2.1.3 Hóa chất 40
2.1.4 Dụng cụ máy móc và thiết bị 41
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43
2.2.1 Phương pháp đánh giá chất lượng các hạt nano (hạt keo vàng, chấm lượng
tử QD và hạt silica) ứng dụng trong đ
ánh dấu tế bào E. coli O157:H7
43
2.2.2 Phương pháp gắn kết hạt nano silica có lớp chức năng khác nhau lên bề
mặt vi khuẩn đích
43
2.2.3 Phương pháp gắn kết hạt nano silica lên bề mặt phân tử sinh học 43
2.2.4 Phương pháp tạo hạt nano silica phát quang có lớp chức năng sinh học 43
2.2.5 Phương pháp tạo kháng thể đơn dòng kháng 02 loại vi khuẩn đích 44
2.2.6 Phương pháp vi sinh, sinh hóa, miễn dịch 49
2.2.6.1 Rửa lamen và lam kính
49
2.2.6.2 Làm tiêu bản soi kính
49

2.2.6.3 Phương pháp soi kính 50
2.2.6.4 Nghiên cứu đặc điểm tự phát quang của 03 chủng vi khuẩn
50
2.2.6.5 Xác định số lượng vi khuẩn đích trong dịch mẫu và trong thịt bò bằng
phương pháp đếm khuẩn lạc
50
2.2.6.6 Phương pháp nghiên cứ
u đặc điểm sinh học của 03 chủng vi khuẩn E.
coli O157:H7, S. typhimurium và chủng vi khuẩn đối chứng E. coli
50
2.2.6.7 Phương pháp kiểm tra tính đặc hiệu của kháng thể 50
2.2.6.8 Nghiên cứu một số điều kiện ảnh hưởng đến việc tạo phức hợp
51
2.2.6.9 Phương pháp bảo quản sản phẩm phức hợp KT + hạt nano silica
52
2.2.6.10 Sản xuất phức hợp KT đặc hiệu + hạt nano silica quy mô phòng thí
nghi
ệm
53
2.2.6.11 Ứng dụng phức hợp KT + hạt nano silica như chất đánh dấu huỳnh
quang trong kỹ thuật miễn dịch để phát hiện và xác định vi khuẩn đích trong
phòng thí nghiệm
53
2.2.6.12 Ứng dụng phức hợp KT + hạt silica để phát hiện và xác định vi
khuẩn đích E. coli O157:H7 và S. typhimurium trong thịt bò
58
2.2.6.13 Đánh giá hiệu lực của phương pháp đo phổ huỳnh quang với các
phương pháp thông thường và phương pháp phát hiệ
n nhanh để phát hiện và
xác định số lượng vi khuẩn đích gây ngộ độc

59
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 61
3.1 NGHIÊN CỨU GẮN KẾT CÁC NHÓM CHỨC NĂNG SINH HỌC
TRÊN BỀ MẶT HẠT NANO SILICA THƯƠNG PHẨM VỚI CÁC PHÂN
TỬ SINH HỌC
61
3.1.1 Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái của 02 chủng vi khuẩn E. coli
O157:H7, S. typhimurium và chủng ĐC E. coli
61
3.1.2 Nghiên cứu ứng d
ụng 1 số loại hạt nano (hạt silica chứa tâm màu phát
quang, hạt keo vàng, QD) để phát hiện vi khuẩn gây ngộ độc ở thực phẩm.
62
3.1.3 Gắn kết hạt nano silica phát quang với các phân tử sinh học 63
3. 2 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO KHÁNG THỂ ĐƠN 64
DÒNG CÓ KHẢ NĂNG NHẬN BIẾT VÀ GẮN KẾT ĐẶC HIỆU VI
KHUẨN ĐÍCH E. COLI O157:H7 VÀ S. TYPHIMURIUM.
3.2.1 Nghiên cứu tách dòng gen và xác định trình tự gen mã hóa kháng
nguyên đặc hiệu của vi khuẩn đích S. typhimurium
65
3.2.2 Giải trình tự plasmid tái tổ hợp pBT-fljB và
pBT-fliC
67
3.2.3 Nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu với vi khuẩn S.
typhimurium và E. coli O157:H7
69
3.2.3.1 Nghiên cứu sản xuất KTĐD đặc hiệu với vi khuẩn S. typhimurium
69
3.2.3.2 Nghiên cứu sản xuất KTĐD đặc hiệu với E. coli O157:H7
74

3.3 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CÁC LỚP CHỨC NĂNG SINH HỌC TRÊN
HẠT NANO SILICA PHÁT QUANG
87
3.3.1 Quy trình chế tạo hạt nano silica ORMOSIL chứa tâm mầu hữu cơ có lớp
chức n
ăng sinh học quy mô phòng thí nghiệm theo phương pháp Stober
87
3.3.2 Nghiên cứu hình thái, cấu trúc hóa học của hạt nano silica chế tạo tại
Việt Nam
90
3.3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của lượng hoạt động bề mặt tới kích thước và
chất lượng hạt nano ORMOSIL.
91
3.3.2.2 Ảnh hưởng của lượng amine lên kích thước và chất lượng hạt nano
ORMOSIL
92
3.3.2.3 Cấu trúc hóa học của hạt nano ORMOSIL chế tạo tại Việt Nam
93
3.3.3 Đ
ánh giá độ bền quang, độ chói và độ bền trong MT sinh học của hạt
nano silica chứa tâm màu chế tạo ở Việt Nam
94
3.3.3.1 Phổ hấp thụ và huỳnh quang
94
3.3.3.2 Đánh giá độ bền quang của hạt nano ORMOSIL chế tạo tại Việt Nam
99
3.3.3.3 Độ chói và độ bền của hạt nano ORMOSIL chế tạo tại VN
100
3.3.3.4 Độ bền quang của hạt nano silica trong môi trường sinh học
101

3.4 NGHIÊN CỨU TẠO PHỨ
C HỢP KHÁNG THỂ VỚI HẠT NANO
SILICA CÓ KHẢ NĂNG NHẬN BIẾT VÀ LIÊN KẾT ĐẶC HIỆU VỚI
KHÁNG NGUYÊN VI KHUẨN ĐÍCH E. COLI O157:H7 và S.
TYPHIMURIUM
107
3.4.1 Đánh giá khả năng tự phát quang của các vi khuẩn nghiên cứu 107
3.4.2 Kiểm tra tính đặc hiệu của kháng thể S. typhimurium và E. coli O157:H7 108
3.4.3 Lựa chọn các điều kiện thích hợp để tạo phức hợp KT + hạt silica 109
3.4.3.1 Ảnh hưởng của chất xúc tác EDAC và nồng độ của chúng lên việc tạo
phức hợp KT + hạt silica phát quang
109
3.4.3.2 Ảnh hưởng của pH dung dịch đệm, nhiệt độ phản ứng, ánh sáng lên
việc gắn kháng thể đặc hiệu lên bề mặt hạt nano silica
111
3.4.3.3 Ảnh hưởng tỉ lệ kháng thể : hạt silica lên việc tạo thành phức hợp
111
3.4.3.4 Ảnh hưởng của điều kiện ủ l
ắc, thời gian và nhiệt độ ủ 112
3.4.3.5 Ảnh hưởng của thời gian và tốc độ ly tâm lên việc thu hồi phức hợp
116
3.4.4 Nghiên cứu tạo phức hợp KT + hạt silica trong các điều kiện lựa chọn 118
3.4.5 Nghiên cứu bảo quản phức hợp 119
3.4.5.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ bảo quản lên độ bền của phức hợp
119
3.4.5.2 Ảnh hưởng của thời gian bả
o quản lên độ bền của phức hợp
120
3.4.6 Xây dựng quy trình sản xuất phức hợp KT đặc hiệu + hạt nano silica
quy mô phòng thí nghiệm

122
3.4.6.1 Quy trình sản xuất phức hợp kháng thể đặc hiệu vi khuẩn E. coli
O157:H7 + hạt nano silica quy mô phòng thí nghiệm (5ml)
123
3.4.6.2 Quy trình sản xuất phức hợp KT đặc hiệu vi khuẩn S. typhimurium +
hạt nano silica quy mô phòng thí nghiệm
124
3.5 SẢN XUẤT PHỨC HỢP KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU + HẠT NANO
SILICA PHÁT QUANG QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHI
ỆM
125
3.5.1 Sản xuất phức hợp đặc hiệu cho 02 loại vi khuẩn đích 125
3.5.2 Đánh giá mức độ gắn kết của phức hợp kháng thể + hạt nano silica sản
xuất được lên bề mặt vi khuẩn đích.
127
3.5.2.1 Thông qua tỉ lệ % tế bào vi khuẩn đích phát quang dưới kính HVHQ
trên 1 hiển vi trường
127
3.5.2.2 Thông qua hàm lượng protein trước và sau khi rửa, ly tâm phức hợp
128
3.5.2.3 Thông qua việc phân tích ảnh KHV quét (SEM) và ảnh KHV đồng tiêu
tế
bào vi khuẩn đích được gắn kết với phức hợp
128
3.5.3 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cơ sở của sản phẩm 130
3.5.3.1 Tiêu chuẩn chất lượng cơ sở của “Phức hợp kháng thể đặc hiệu + hạt
nano silica” để phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7
130
3.5.3.2 Tiêu chuẩn chất lượng cơ sở của “Phức hợp kháng thể đặc hiệu + hạt
nano silica” để phát hiện vi khuẩ

n S. typhimurium
130
3.6 NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG PHỨC HỢP KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU +
HẠT SILICA NHƯ CHẤT ĐÁNH DẤU HUỲNH QUANG TRONG KỸ
132
THUẬT MIỄN DỊCH ĐỂ PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG VI
KHUẨN E.COLI O157:H7 và S. TYPHIMURIUM
3.6.1 Nghiên cứu một số điều kiện ảnh hưởng lên việc gắn kết phức hợp với
vi khuẩn đích (phản ứng miễn dịch huỳnh quang)
132
3.6.1.1 Nghiên cứu thời gian nhận biết và liên kết với vi khuẩn đích
132
3.6.1.2 Nghiên cứu tỉ lệ phức hợp KT + hạt silica : mậ
t độ vi khuẩn lên việc
nhận biết và liên kết với vi khuẩn đích
133
3.6.1.3 Ảnh hưởng của mật độ tế bào lên khả năng nhận biết và liên kết với vi
khuẩn đích
134
3.6.1.4 Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm lên việc thu hồi vi khuẩn đích
134
3.6.1.5 Ảnh hưởng của phức hợp lên hình dáng và kích thước tế bào VK
135
3.6.2 Phát hiện và xác định số lượng vi khuẩn đích s
ử dụng phức hợp KT +
hạt nano silica như chất đánh dấu huỳnh quang trong kỹ thuật miễn dịch trong
phòng thí nghiệm
136
3.6.2.1 Phương pháp đếm tế bào phát quang trên 1 hiển vi trường
136

3.6.2.2 Phương pháp đo cường độ huỳnh quang của VK đích gắn phức hợp
139
3.6.2.3 Xác định số lượng vi khuẩn đích bằng thiết bị đếm tế bào tự tạo
146
3.6.3 Quy trình công nghệ xác định số lượ
ng vi khuẩn gây ngộ độc trong thực
phẩm E. coli O157:H7 và S. typhimurium bằng các hạt nano silica phát quang
gắn kháng thể quy mô phòng thí nghiệm
146
3.6.3.1 Quy trình phát hiện xác định số lượng vi khuẩn E. coli O157:H7
147
3.6.3.2 Quy trình phát hiện và xác định số lượng vi khuẩn S. typhimurium
149
3.7 ỨNG DỤNG PHỨC HỢP KHÁNG THỂ + HẠT NANO SILICA VÀO
VIỆC PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG VI KHUẨN ĐÍCH
TRONG THỊT BÒ TƯƠI SỐNG Ở HÀ NỘI
150
3.7.1 Chuẩn bị các dịch chi
ết thịt bò 150
3.7.2 Xác định số lượng VK S. typhimurium và E. coli O157:H7 trong các
mẫu thịt bò bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch đặc hiệu
150
3.7.3 Phát hiện và xác định số lượng vi khuẩn đích trong thịt bò bằng phương
pháp đếm tế bào phát quang và đo phổ huỳnh quang
153
3.7.3.1 Đếm tế bào vi khuẩn đích gắn với phức hợp phát quang
153
3.7.3.2 Đo phổ huỳnh quang
154
3.7.4 Quy trình ứng dụng h

ạt nano phát quang gắn kháng thể đặc hiệu để xác
định số lượng vi khuẩn E. coli O157:H7 trong các mẫu thịt bò nhiễm khuẩn
155
tại Hà Nội
3.7.5 Quy trình ứng dụng hạt nano phát quang gắn kháng thể đặc hiệu để xác
định số lượng vi khuẩn S. typhimurium trong các mẫu thịt bò nhiễm khuẩn tại
Hà Nội
158
3.8 ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ HUỲNH
QUANG VÀ SO SÁNH VỚI MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP KHÁC
160
3.8.1 So sánh hiệu lực của phương pháp huỳnh quang với phương pháp thông
thường (đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch
đặc hiệu)
160
3.8.2 So sánh hiệu lực của phương pháp huỳnh quang với các phương pháp
khác trong thí nghiệm phát hiện vi khuẩn đích trong thịt bò
160
3.8.3 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho phương pháp phát hiện và xác định số
lượng vi khuẩn gây bệnh thực phẩm sử dụng hạt nano phát quang trong kỹ
thuật miễn dịch
163
CHƯƠNG 4: CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 167
4.1 Hoàn thành các nội dung nghiên cứu đầy đủ với mức độ
tin cậy cao 167
4.2 Sản phẩm của đề tài 167
4.3 Tác động đối với kinh tế, xã hội và môi trường 173
4.4 Một số hạn chế của đề tài 174
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 176
TÀI LIỆU THAM KHẢO 179

1

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
__________________
CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà Nội, ngày tháng năm 2011


BÁO CÁO THỐNG KÊ
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI/DỰ ÁN SXTN

I. THÔNG TIN CHUNG
1. Tên đề tài/dự án: Nghiên cứu ứng dụng các hạt nano phát quang vào việc
đánh dấu tế bào để xác định số lượng vi khuẩn gây độc trong thực phẩm
Mã số đề tài, dự án: 14 ĐTĐL.2009T/29
Thuộc: Đề tài độc lập cấp Nhà nước.
2. Chủ nhiệm đề tài/dự án:
Họ và tên: Tống Kim Thuần
Ngày, tháng, năm sinh: 11/12/1950 Nam/ Nữ
: Nữ
Học hàm, học vị: Phó giáo sư, tiến sĩ
Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên cao cấp.
Chức vụ: Nguyên trưởng phòng n/c các chất có hoạt tính sinh học từ VSV.

Điện thoại: Tổ chức: 043.7567103 Nhà riêng: 04. 8432247 Mobile: 0988.743050
Fax: 04. 8363144 E-mail:

Tên tổ chức đang công tác: Viện công nghệ Sinh học
Địa chỉ tổ chức: 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
Địa chỉ nhà riêng: số 5, ngách 294/30, Kim mã, Ba Đình, Hà Nội
3. Tổ chức chủ trì đề tài/dự án:
Tên tổ chức chủ trì đề tài: Viện Công nghệ Sinh học
Điện thoại: : 04.8362599 Fax: 04. 8363144 E-mail: Website:
04. 8363144 Địa chỉ: 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
Họ và tên thủ trưởng tổ
chức: PGS.TS. Trương Nam Hải
Số tài khoản: 931.01.064
Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước Ba Đình, Hà Nội
Tên cơ quan chủ quản đề tài: Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
II. TÌNH HÌNH THỰC HIỆN
1. Thời gian thực hiện đề tài/dự án:
- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ 15/1/2009 đến tháng 31/12/2011

2
- Thực tế thực hiện: từ tháng 1/2009 đến tháng 31/12/2011
2. Kinh phí và sử dụng kinh phí:
a) Tổng số kinh phí thực hiện: 3255 triệu đồng, trong đó: Kinh phí từ Ngân sách sự
nghiệp khoa học 3255 triệu đồng.
b) Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH:
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
Số
TT
Thời gian

Kinh phí
(Tr.đ)
Thời gian

Kinh phí
(Tr.đ)
Ghi chú
(Số đề nghị
quyết toán)
1
2009 1.400.000.000 2009 1.283.000.000 1.283.000.000
2
2010 1.200.000.000 2010 990.304.000 990.304.000
3
2011 655.000.000 2011 981.696.000 981.696.000
c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:
Đối với đề tài:
Đơn vị tính: Triệu đồng
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
Số
TT
Nội dung
các khoản chi
Tổng SNKH Nguồn
khác
Tổng SNKH Nguồn
khác
1 Trả công lao động
1265 1265 0 1265 1265 0
2 Nguyên, vật liệu,

năng lượng
1500 1500 0 1500 1500 0
3 Thiết bị, máy móc
200 200 0 200 200 0
4 Chi khác
290 290 0 290 290 0

Tổng cộng
3255 3255 3255 3255
3. Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án:
Số
TT
Số, thời gian ban
hành văn bản
Tên văn bản
Ghi
chú

Quyết định, văn bản của cơ quan quản lý
1
QĐ số 106/QĐ-
BKHCN ngày 10
tháng 6 năm 2008
Về việc thành lập Hội đồng KH&CN xét duyệt
thuyết minh Đề tài ĐLNN tuyển chọn bắt đầu
thực hiện trong kế hoạch năm 2009

2
QĐ số 1456/QĐ-
BKHCN 15 /7 /2008

Về việc thành lập Tổ thẩm định Đề tài KHCN
độc lập cấp Nhà nước.

3
QĐ số 1412/QĐ-
BKHCN 9 / 7 / 2008
Về việc phê duyệt tổ chức và cá nhân chủ trì đề
tài Độc lập cấp Nhà nước thực hiện trong kế
hoạch năm 2009

4
Quyết định số
1989/QĐ- BKHCN
Về việc phê duyệt kinh phí đề tài độc lập cấp


3
12 / 9 /2008 Nhà nước thực hiện trong kế hoạch năm 2009

Văn bản của Tổ chức chủ trì đề tài
1 QĐ số 173/QĐ-
CNSH
Ngày 15 / 5 / 2009
Về việc phê duyệt kế hoạch đấu thầu mua sắm
vật tư, hóa chất phục vụ nghiên cứu năm 2009
của đề tài ĐLNN mã số 14ĐTĐL. 2009T/29

2 QĐsố 179/QĐ-
CNSH ngày 18 /5 /
2009

Về việc thành lập Hội đồng đấu thầu mua vật tư,
hóa chất của đề tài, mã số 14ĐTĐL. 2009T/29

3 QĐ số 203/QĐ-
CNSH ngày 4 / 6
/2009
Về việc phê duyệt kết quả đấu thầu gói thầu mua
hóa chất vật tư năm 2009 của đề tài, mã số
14ĐTĐL. 2009T/29

4 QĐ số 148/QĐ-
CNSH ngày 5 /4
/2010
Về việc phê duyệt kế hoạch đấu thầu mua sắm
vật tư, hóa chất phục vụ nghiên cứu năm 2010
của đề tài, mã số 14ĐTĐL. 2009T/29

5 QĐ số 149/QĐ-
CNSH ngày 5 / 4 /
2010
Về việc thành lập Hội đồng đấu thầu mua vật tư,
hóa chất của đề tài, mã số 14ĐTĐL. 2009T/29

6 QĐ số 150/QĐ-
CNSH ngày 5 / 4 /
2010
Về việc phê duyệt Hồ sơ đấu thầu mua sắm vật
tư, hóa chất năm 2010 của đề tài, mã số
14ĐTĐL. 2009T/29

7 QĐ số 166/QĐ-
CNSH ngày 4 / 6
/2010
Về việc phê duyệt kết quả đấu thầu gói thầu mua
hóa chất vật tư năm 2010 của đề tài, mã số
14ĐTĐL. 2009T/29

8 QĐ số 78/QĐ-
CNSH ngày 14 / 3 /
2011
Về việc phê duyệt kế hoạch đấu thầu mua sắm
vật tư, hóa chất phục vụ nghiên cứu năm 2011
của đề tài, mã số 14ĐTĐL. 2009T/29

9 QĐ số 83/QĐ-
CNSH ngày 15 /3
/2011
Về việc phê duyệt Hồ sơ đấu thầu mua sắm vật
tư, hóa chất năm 2011 của đề tài, mã số
14ĐTĐL. 2009T/29

10 QĐsố 84/QĐ-
CNSH ngày 15 / 3 /
2011
Về việc thành lập Hội đồng đấu thầu mua vật tư,
hóa chất của đề tài, mã số 14ĐTĐL. 2009T/29

11 QĐ số 124/QĐ-
CNSH ngày 31 / 3
/2011

Về việc phê duyệt kết quả đấu thầu gói thầu mua
hóa chất vật tư năm 2011 của đề tài, mã số
14ĐTĐL. 2009T/29

12 QĐ số 526/QĐ-
CNSH ngày
01/12/2011
Về thành lập Hội đồng nghiệm thu cấp cơ sở Qui
trình khoa học công nghệ của đề tài mã số
14ĐTĐL. 2009T/29.

13 QĐ số 548/QĐ-
CNSH ngày
12/12/2011
Về Về thành lập Hội đồng nghiệm thu cấp cơ sở
đề tài ĐLNN mã số 14ĐTĐL. 2009T/29.

14 QĐ Công văn của Viện CNSH gửi Bộ KHCN đề nghị
nghiệm thu cấp nhà nước số , ngày



4

4. Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài, dự án:
S
T
T
Tên tổ
chức

đăng ký
theo
Thuyết
minh
Tên tổ
chức đã
tham gia
thực hiện
Nội dung
tham gia chủ yếu
Sản phẩm chủ yếu
đạt được
Ghi
chú
*
1 Viện
CNSH
và Viện
vật lý
Viện
CNSH;
Viện Vật
Lý (đã đổi
tên Viện)
Nghiên cứu gắn kết
các nhóm chức năng
sinh học trên bề mặt
hạt nano silica thương
phẩm với phân tử SH.
Tìm được các điều

kiện tối ưu để gắn kết
được các nhóm chức
năng trên bề mặt hạt
nano silica với PTSH.

2 Viện
CNSH,
Viện
Đại học
Mở Hà
Nội
Viện
CNSH,
Viện Đại
học Mở Hà
Nội
Nghiên cứu quy trình
tạo kháng thể đơn
dòng tái tổ hợp có khả
năng nhận biết và gắn
kết đặc hiệu VK gây
bệnh E.coli O157:H7
và Salmonella
-Xây dựng được quy
trình tạo KT đặc hiệu
với 2 loại VK gây
bệnh .
-Sản xuất đượ
c 10 mg
kháng thể đặc hiệu

với mỗi loại VK.

3 Viện
CNSH;
Viện
Vật lý
Viện
CNSH;
Viện Vật lý
(đã đổi tên)
- Nghiên cứu tạo các
nhóm chức năng sinh
học trên bề mặt hạt
nano silica
- Xây dựng phương
pháp quang phổ
huỳnh quang xác định
số lượng vi khuẩn
đích gắn hạt nano.
- Tạo được các nhóm
chức năng SH trên bề
mặt hạt nano PQ có
thể phản ứng gắn kết
với các phân t
ử SH.
- Xây dựng được
phương pháp đo
cường độ PQ của VK
gắn hạt nano.

4 Viện
CNSH;
Viện
Vật lý
Viện
CNSH;
Viện Vật lý
Nghiên cứu tạo phức
hệ kháng thể với các
hat nano silica PQ có
khả năng nhận biết và
liên kết đặc hiệu với
kháng nguyên VK
đích gây bệnh E.coli
0157:H7 và
Salmonella
-Các hạt nano hợp
sinh phải gắn kết
được KT đặc hiệu với
tỉ lệ cao trong điều
kiện tối ưu.
- KT + hạt nano có
khả
năng nhận biết và
liên kết đặc hiệu với
KN vi khuẩn đích.


5
5 Viện

CNSH;
Viện
Vật lý
Viện
CNSH;
Viện Vật lý
N/c SX phức hợp KT
đặc hiệu VK đích gây
bệnh E.coli 0157:H7
và Salmonella gắn
hạt nano silica PQ.
SX được 10 ml phức
hợp KT đặc hiệu +
hạt nano có khả năng
nhận biết và liên kết 2
loại VK đích.

6 Viện
CNSH;
Viện
Vật lý
Viện
CNSH;
Viện Vật lý
N/C QTCN xác định
nhanh, nhậy, chính
xác SLVK đích gây
bệnh E.coli 0157:H7
và Salmonella bằng
phức hợp KT đặc hiệu

+ các hạt nano silica
PQ qui mô PTN.
Đưa ra được qui trình
xác định nhanh, nhậy
số lượng vi khuẩn
đích gây bệnh bằng
hạt nano silica phát
quang qui mô phòng
thí nghiệm. Qui trình
ổn định.

7 Trường
ĐH
Nông
nghiệp
I; Viện
Thú y
Hà Nội
Trường
ĐH Nông
nghiệp I;
Viện Thú y
Hà Nội,
Khoa
CNSH, Đại
học mở Hà
Nội
N/C ứng dụng thử
nghiệm qui trình xác
định nhanh, nhậy,

chính xác SLVK đích
gây bệnh E. coli
0157:H7 và
Salmonella sp. trong
các mẫu thịt bò tươi
sống tại HN bằng sử
dụng phức hệ KT đặc
hiệu + hạt nano PQ.
Đưa ra được qui trình
ứng dụng hạt nano
silica phát quang vào
việc xác định số
lượng vi khuẩn E.
coli 0157:H7 trong
các mẫu thịt bò tươi
sống tại Hà Nội


5. Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án:
S
T
T
Tên cá
nhân
theo
đăn
g
k
ý

Tên cá
nhân đã
tham gia
thực hiện
Nội dung tham gia chính
Sản phẩm chủ yếu
đạt được
1 Tống
Kim
Thuần
Tống
Kim
Thuần
- N/C gắn kết các nhóm chức năng
trên bề mặt hạt nano với PTSH
- N/C gắn kết KT +hạt nano.
- N/C tạo phức hợp KT + hạt nano
có khả năng nhận biết và liên kết
đặc hiệu với KN vi khuẩn đích.
- N/C xây dựng qui trình xác định
nhanh, nhậy số lượng VK đích gây
độc bằng hạt nao silica phát quang.
- N/C ứng dụng qui trình xác định
số lượ
ng VK gây bệnh thực phẩm
ở địa bàn Hà Nội và đánh giá hiệu
- Đã tạo được PHKT
+ hạt nano silica bền
vững 7 ngày. Có khả
năng nhận biết và liên

kết với VK đích.
- Đã XD được qui
trình phát hiện và xác
định nhanh nhậy VK
gây bệnh.
- Đã ƯD được QT
vào việc XĐ SLVK
gây bệnh trong thịt bò
HN. Đã đánh giá

6
lực của phương pháp. được hiêu lực của PP.
2 ThS.
Trần
Thanh
Thủy
ThS.
Trần
Thanh
Thủy
- N/C gắn kết các nhóm chức năng
trên bề mặt hạt nano với PTSH
- N/C gắn kết KT +hạt nano.
- N/C tạo phức hợp KT + hạt nano
có khả năng nhận biết và liên kết
đặc hiệu với KN vi khuẩn đích.
- N/C xây dựng qui trình xác định
nhanh, nhậy số lượng VK đích gây
độc bằng hạt nao silica phát quang.
- N/C ứng dụng qui trình xác định

số lượ
ng VK gây bệnh thực phẩm
ở địa bàn Hà Nội và đánh giá hiệu
lực của phương pháp.
- Đã tạo được PHKT
+ hạt nano silica bền
vững 7 ngày. Có khả
năng nhận biết và liên
kết với VK đích.
- Đã XD được qui
trình phát hiện và xác
định nhanh nhậy VK
gây bệnh.
- Đã ƯD được QT
vào việc XĐ SLVK
gây bệnh trong thịt bò
HN. Đã đánh giá
được hiêu lực của PP.
3 Đặng
Thị Mai
Anh
Lê Thị
Thanh
Xuân,
Phạm Thị
Ngọc
Lan,
Đặng Thị
Mai Anh.
- N/C gắn kết các nhóm chức năng

trên bề mặt hạt nano với PTSH
- N/C gắn kết KT +hạt nano.
- N/C tạo phức hợp KT + hạt nano
có khả năng nhận biết và liên kết
đặc hiệu với KN vi khuẩn đích.
- N/C xây dựng qui trình xác định
nhanh, nhậy số lượng VK đích gây
độc bằng hạt nao silica phát quang.
- N/C
ứng dụng qui trình xác định
số lượng VK gây bệnh thực phẩm
ở địa bàn Hà Nội và đánh giá hiệu
lực của phương pháp.
- Đã tạo được PHKT
+ hạt nano silica bền
vững 7 ngày. Có khả
năng nhận biết và liên
kết với VK đích.
- Đã XD được qui
trình phát hiện và xác
định nhanh nhậy VK
gây bệnh.
- Đã ƯD được QT
vào việc XĐ SLVK
gây bệnh trong thịt bò
HN. Đã đ
ánh giá
được hiêu lực của PP.
4 Lê
Quang

Huấn
PGS. TS
Lê Quang
Huấn
- Nghiên cứu tạo gen mã hóa
kháng thể đặc hiệu vi khuẩn gây
bệnh E.coli O157:H7
Đã tạo gen mã hóa
KT đặc hiệu VK gây
bệnh E.coli O157:H7
5 ThS. Lã
Thị
Huyền
ThS. Lã
Thị
Huyền
- Nghiên cứu tạo gen mã hóa
kháng thể đặc hiệu vi khuẩn gây
bệnh E.coli O157:H7
Đã tạo gen mã hóa
KT đặc hiệu VK gây
bệnh E.coli O157:H7
6 Trần
Hồng
Nhung
Trần
Hồng
Nhung
- Phụ trách PP và thiết bị đo tín
hiệu huỳnh quang của hạt nano.

- N/C chế tạo nhóm chức năng
sinh học trên mặt hạt nano silica.
- N/C xây dựng PP quang phổ HQ
để xác định số lượng vi khuẩn.
- Đã chế tạo được
nhóm NH
2
, COOH
trên hạt nano silica
-Đã xây dựng PP
quang phổ HQ để xác
định SLVK.