Nghiên cứu tạo giống bèo tấm mang gen kháng nguyên h5n1 phòng chống bệnh cúm gia cầm

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP






BÁO CÁO TỔNG KẾT KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG BÈO TẤM MANG GEN KHÁNG
NGUYÊN H5N1 PHÒNG CHỐNG BỆNH CÚM Ở GIA CẦM




Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Di truyền Nông nghiệp
Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Lê Huy Hàm
Thời gian thực hiện: 01/2007-06/2011







8908


Hà Nội, 2011
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP
Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng CNSH trong
lĩnh vực Nông nghiệp và PTNT đến 2020
BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI
Nghiên cứu tạo giống bèo tấm mang gen kháng nguyên
H5N1 phòng chống bệnh cúm ở gia cầm
Chủ nhiệm đề tài/ dự án
(ký tên)
Cơ quan chủ trì đề tài/ d
ự án:
(ký tên và đóng dấu)
PGS. TS Lê Huy Hàm
BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D 2,4 Dichlorophenoxyacetic acid
AS Acetosyringone
BAP 6 – Benzylaminopurine
Bp base pair (cặp bazơ)
CH Casein hydrolysate
CL Chọn lọc
CTTN Công thức thí nghiệm
DNA Deoxyribo Nucleic Acid
EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit
Et-Br Ethidium Bromide
Gus -Glucuronidase gene (gen mã hóa -glucuronidase)
H Hutner
Hb Hemoglobin (lượng hemoglobin có trong một thể tích máu)
Hct Hematocrit
Hpt Gen mã hóa hygromycin phosphotransferase

H/2 Môi trường Hutner/2
LG Lemna gibba
LM Lemna minor
MS Murashige and Skoog
MSC Multi - Cloning Site
MCPA 2-methyl – 4 cholorophenoxy acetic acid
MCH Mean corpuscular hemoglobin - giá trị hemoglobin trung bình
MCHC Mean corpuscular hemoglobin concentration - nồng độhemoglobin trung bình
MCV Mean corpuscular volume - thể tích hồng cầu trung bình
MPV Mean platelet volume - thể tích trung bình của tiểu cầu
NAA 2- naphthalen-1-yl acetic acid
NOS Nopalin Sythetase
OD Optical Density (mật độ quang học)
PCR Polymerase Chain Reaction
RBC Red blood cell - số lượng hồng cầu (đơn vị 10
12
tế bào/L)
RDW Red cell distribution width - độ phân bố về kích thước của hồng cầu
SP Spirodela polyrrhiza
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
TAE Tris-Acetate-EDTA
TE Tris-EDTA
T- DNA Transfer DNA
TDZ Thidiazuron
Ti-Plasmid Tumor inducing plasmid (plasmit gây khối u thực vật)
VIR Virulence region (vùng gây độc có khả năng tạo khối u)
WBC White blood cell - số lượng bạch cầu
X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronodase acid
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
MỤC LỤC

Chương 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu 2
1.3. Đối tượng nghiên cứu 2
1.4. Phạm vi nghiên cứu 2
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Tính cấp thiết của đề tài 3
2.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 5
2.2.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 trên thế giới
5
2.2.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 ở Việt Nam
7
2.3. Gen Hemagglutinin 8
2.4. Chuyển gen vào bèo tấm thực tại và triển vọng 11
2.4.1. Bèo tấm và tiềm năng chuyển gen 11
2.4.2. Agrobacterium với quá trình chuyển gen vào thực vật 16
2.4.3. Nâng cao khả năng biểu hiện gen trong thực vật 19
Chương 3: NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
31
3.1. Nội dung nghiên cứu 31
3.2. Vật liệu nghiên cứu 32
3.2.1. Vật liệu thực vật 32
3.2.2. Vật liệu di truyền 32
3.2.3. Các vật liệu khác 32
3.2.4. Hóa chất 32
3.3. Phương pháp nghiên cứu 35
3.3.1. Phương pháp tạo dòng gen mã hóa kháng nguyên và tạo vi sinh vật
biểu hiện gen H5N1 trên bề mặt 36
3.3.2. Phương pháp tạo bèo tấm mang gen protein vỏ virus H5N1 40
3.3.3. Khảo nghiệm sản phẩm chuyển gen 51

Chương 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56
NỘI DUNG A: TẠO DÒNG MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN 56
Nội dung 1: Thu thập, đánh giá nguồn vật liệu ban đầu (vật liệu TV) cho các
nghiên cứu biến nạp di truyền 56
Nội dung 2: Xác định trình tự gen quan tâm, so sánh với các trình tự gen đã
công bố trước đó, xác định những thay đổi về mặt cấu trúc gen 57
Nội dung 3: Tạo dòng các gen mã hóa kháng nguyên HA, NA của virus
H5N1 trên cúm gia cầm tại Việt Nam 61
Nội dung 4: Tạo dòng các gen mã hóa kháng nguyên dạng đột biến mất đoạn
hoặc gen dung hợp các đoạn peptid khác nhau hoặc các epitope khác
nhau 63
4.1. Tách dòng gen HA gắn enzyme giới hạn nhận biết 63
4.2. Tách dòng gen HA1 gắn enzyme giới hạn nhận biết 64
4.3. Cải biến gen HA1 65
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
4.3.1. Cải biến vị trí MD2 trên đoạn gen HA1 bằng phương pháp Megaprimer 65
4.3.2. Cải biến vị trí MD5, MD3 trên gen HA1 bằng phương pháp Quickchange 67
4.3.3. Cải biến vị trí MD4 trên gen HA1 bằng phương pháp Megaprimer 68
4.3.4. Cải biến vị trí M2 trên đoạn gen HA1 sử dụng phương pháp OE-PCR kéo
dài các đoạn gối lên nhau 70
NỘI DUNG B. TẠO VI SINH VẬT BIỂU HIỆN GEN H5N1 TRÊN BỀ MẶT
73
Nội dung 5: Tạo dòng và biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp của virus H5N1
trong E.coli phục vụ mục đích phát triển kháng thể chuyên biệt với
các kháng nguyên của H5N1. 73
NỘI DUNG C. TẠO BÈO TẤM MANG GEN PROTEIN VỎ VIRUS H5N1
77
Nội dung 6: Lựa chọn, sưu tập, định danh, đánh giá khả năng sinh trưởng
phát triển của một số giống bèo tấm đáp ứng yêu cầu là cây chủ để sản
xuất protein tái tổ hợp. 77

Nội dung 7: Nghiên cứu tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo
callus và tái sinh cây bèo tấm (L. gibba, L. minor, S. polyrrhiza) 84
Nội dung 8: Tách chiết phân lập các promotor đặc hiệu ở bèo tấm 88
8.1. Tách dòng đoạn promoter từ loài bèo tấm S. polyrrhiza DB2 88
8.2. Tách dòng đoạn promoter Ubiquitin từ loài bèo tấm Lemna aequinoctialis
DB1 92
8.3. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen HA1 đã cải biến - pPAM- HA1
M
95
8.4. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen HA, HA1 đã cải biến với promoter bèo
tấm (pPAM-Sp-HA1) 97
Nội dung 9: Thiết kế vectơ tái tổ hợp mang gen HA cho chuyển gen bằng
Agrobacterium và bằng súng bắn gen 101
9.1. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen HA cho chuyển gen bằng súng bắn gen
101
9.2. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen HA cho chuyển gen bằng Agrobacterium
103
9.3 Chuyển vector tái tổ hợp chứa gen HA vào chủng A. tumefaciens. Kiểm
tra chủng 111
Nội dung 10: Thử nghiệm các chủng Agrobacterium để xác định được chủng
thích hợp cho chuyển gen vào callus và nguyên cây ở L. gibba, L. minor, S.
polyrrhiza 112
Nội dung 11: Nghiên cứu tối ưu hoá quy trình chuyển gen vào callus và
nguyên cây ở L. gibba, L. minor, S. polyrrhiza bằng súng bắn gen 114
11.1. Ảnh hưởng của tuổi mẫu đến biểu hiện tạm thời của gen gus 114
11.2. Ảnh hưởng khoảng cách bắn và áp lực khí He đến biểu hiện tạm thời
của gen gus 116
11.3. Ảnh hưởng của việc xử lý áp suất thẩm thấu đến hiệu quả chuyển gen tạm
thời 118
11.4. Ảnh hưởng hàm lượng hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus 120

11.5. Ảnh hưởng của kích thước hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus
và khả năng tái sinh 121
Nội dung 12: Nghiên cứu tối ưu hoá quy trình chuyển gen vào callus và
nguyên cây ở L. gibba, L. minor, S. polyrrhiza bằng A. tumefaciens 122
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
12.1. Chọn lọc chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen vào bèo tấm SP
thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 122
12.2. Kết quả nghiên cứu lựa chọn vector thích hợp cho chuyển gen vào bèo
tấm SP thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 123
12.3. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus
ở SP nguyên cây và callus 123
12.4. Ảnh hưởng của thời gian ly tâm chân không tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời
của gen gus ở SP nguyên cây và callus 124
12.5. Ảnh hưởng của thời gian ly tâm chân không tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời
của gen gus ở SP nguyên cây và callus 126
Nội dung 13. Chuyển gen kháng nguyên H5N1 vào bèo tấm 129
13.1. Chuyển gen kháng nguyên H5N1 vào bèo tấm thông qua A. tumefaciens
129
13.2. Chuyển gen kháng nguyên H5N1 vào bèo tấm bằng súng bắn gen 130
Nội dung 14. Phân tích đánh giá cây chuyển gen bằng các phương pháp SHPT
131
14.1. Tách chiết và kiểm tra DNA tổng số của ba loài bèo tấm L. minor, L. gibba,
S. polyrrhiza 131
14.2. Phân tích PCR sự có mặt của gen chuyển trong ba loài bèo tấm L. gibba,
L. minor, S. polyrrhiza chuyển gen 131
14.3. Phân tích cây chuyển gen bằng phương pháp Southern blot 135
14.4. Phân tích Western blot 137
14.4.1. Kết quả điện di protein tổng số 138
14.4.2. Kết quả kiểm tra phản ứng lai miễn dịch với kháng thể H5 bằng kỹ thuật
Western blot 138

Nội dung D. Khảo nghiệm sản phẩm chuyển gen 140
Nội dung 15. Khảo sát khả năng gây đáp ứng miễn dịch của các dòng tế bào trình
diện kháng nguyên trên gà 140
15.1. Thu mẫu máu 140
15.2. Kết quả đáp ứng miễn dịch của các dòng tế bào trình diện kháng nguyên 142
Nội dung 16. Thử nghiệm đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch ở gà trong thực
tế 144
16.1. Kết quả phát hiện kháng thể kháng nguyên H5 bằng phản ứng HI 148
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 148
KẾT LUẬN 148
KIẾN NGHỊ 149
CHƯƠNG 6: TỔNG QUÁT HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU
ĐƯỢC 150
6.1. Kết quả về khoa học 150
6.2. Kết quả đào tạo 152
6.3. Kết quả nổi bật 153
6.4. Trình độ công nghệ 154
6.5. Khả năng áp dụng 154
6.6. Tình hình sử dụng kinh phí 154
6.7. Danh sách các công trình công bố 155
6.8. Hạn chế của đề tài 156
TÀI LIỆU THAM KHẢO 157
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
Tài liệu tiếng Việt 157
Tài liệu tiếng Anh 158
PHỤ LỤC 1 168
PHỤ LỤC 2 169
PHỤ LỤC 3 171
PHỤ LỤC 4 173
PHỤ LỤC 5 179

PHỤ LỤC 6. THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 182
DANH MỤC BẢNG
B
ả
ng 2.1.
Kích thước gen nhân của một số loài bèo tấm 14
B
ả
ng 2.2.
Thành phần và hàm lượng các hợp chất hữu cơ có trong cánh bèo 15
B
ả
ng 2.3.
Codon ưu tiên sử dụng trong bèo tấm, thực vật (một, hai lá mầm) và
virus H5N1 (Dickey et al., 2007, Murray et al., 1989, Zhou et al., 2005)
26
B
ả
ng 3.1.
Trình tự các primer sử dụng để gắn các enzyme cắt đặc hiệu (RE) vào
đầu gen HA, HA1
33
B
ả
ng 3.2.
Trình tự các primer tạo đột biến điểm trên gen HA 33
B
ả
ng 3.3.
Trình tự các primer sử dụng nhân cấu trúc CAMV35Sprom-GUS-

NOSter
34
B
ả
ng 3.4.
Trình tự các primer sử dụng để phân lập promoter bèo tấm 34
B
ả
ng 3.5.
Trình tự các primer sử dụng để gắn các enzyme cắt đặc hiệu (RE) vào
đầu promoter bèo tấm S. polyrhyza
35
B
ả
ng 3.6.
Trình tự các primer sử dụng để kiểm tra trình tự các vị trí nối các
enzyme
35
B
ả
ng 3.7.
Trình tự cặp primer sử dụng để gắn gen HA vào vector biểu hiện 35
B
ả
ng 3.8.
Các chủng A. tumefaciens và vector sử dụng cho nghiên cứu 41
B
ả
ng 3.9.
Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong nghiên cứu 46

B
ả
ng 4.1
. Số trình tự H5 hoàn chỉnh của gà và vịt Việt Nam (đến năm 2007) 56
B
ả
ng 4.2.
Số trình tự N1 hoàn chỉnh của gà và vịt Việt Nam (đến năm 2007) 57
B
ả
ng
4.3.
Các vị trí đã được cải biến trên gen HA1 73
B
ả
ng 4.4.
Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng môi trường đến khả năng sinh
trưởng và phát triển của các loài bèo tấm L. minor, L. gibba, S. polyrrhiza
80
B
ả
ng 4.5.
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh
trưởng và phát triển của bèo tấm L. minor, L. gibba, S. polyrrhiza
82
B
ả
ng 4.6.
Ảnh hưởng của hàm lượng đường lên khả năng sinh trưởng của các
loài bèo tấm

84
B
ả
ng 4.7.
Các vị trí nucleotide khác biệt giữa Sp-Ubi-pin (Mỹ) với
Sp-Ubi-pin 16 (Việt Nam)
93
B
ả
ng 4.8.
Các vị trí nucleotide khác biệt giữa La-Ubi-pin với La-Ubi-10F 97
B
ả
ng 4.9.
Chọn lọc chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen vào bèo tấm SP 116
B
ả
ng 4.10.
Ảnh hưởng của tuổi mẫu đến biểu hiện gen tạm thời của gen gus ở
cánh bèo tấm chuyển gen
119
B
ả
ng 4.11.
Ảnh hưởng của tuổi mẫu đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở callus
bèo tấm L. minor chuyển gen
120
B
ả
ng 4.12.

Ảnh hưởng của khoảng cách bắn và áp lực khí đến biểu hiện gen gus
tạm thời ở cánh bèo tấm chuyển gen
121
B
ả
ng 4.13
. Ảnh hưởng của khoảng cách bắn và áp lực khí đến biểu hiện tạm
thời của gen gus ở callus bèo S. polyrrhiza chuyển gen
122
B
ả
ng 4.14.
Ảnh hưởng của xử lý áp suất thẩm thấu đến biểu hiện gen gus tạm
thời ở bèo nguyên cây chuyển gen
123
B
ả
ng 4.15.
Ảnh hưởng của xử lý áp suất thẩm thấu đến biểu hiện gen gus tạm
thời ở callus bèo S. polyrrhiza chuyển gen
124
B
ả
ng 4.16.
Ảnh hưởng hàm lượng hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở
bèo nguyên cây
125
B
ả
ng 4.17.

Ảnh hưởng hàm lượng hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở
callus
125
B
ả
ng 4.18.
Ảnh hưởng kích thước hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus 126
B
ả
ng 4.19.
Lựa chọn vector thích hợp cho chuyển gen vào bèo tấm SP thông
qua vi khuẩn A. tumefaciens
127
B
ả
ng 4.20.
Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen
gus ở bèo SP
128
B
ả
ng 4.21.
Ảnh hưởng của thời gian ly tâm chân không tới tỷ lệ biểu hiện tạm
thời của gen gus ở SP
129
B
ả
ng 4.22.
Ảnh hưởng của hàm lượng AS tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen
gus ở bèo SP

130
B
ả
ng 4.23.
Tổng hợp số thí nghiệm chuyển gen kháng nguyên H5N1 vào bèo
tấm chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
133
B
ả
ng 4.24.
Tổng hợp các thí nghiệm chuyển gen kháng nguyên HA1 vào bèo
tấm bằng súng bắn gen
135
B
ả
ng 4.25.
Danh sách các mẫu máu gà thu được 145
B
ả
ng 4.26.
Kết quả số lượng bạch cầu 146
B
ả
ng 4.27.
Bảng kết quả tổng hợp một số chỉ tiêu của máu 147
B
ả
ng 4.2
8
.

Kết quả phản ứng HI 148
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Cấu trúc protein Hemagglutinin
9
Hình 2.2. Hoa của loài bèo Lemna gibba
13
Hình 2.3. Cây phân loại bèo tấm theo Landolt, 1986
13
Hình 2.4. Bản đồ cấu trúc Ti-plasmid (Lê Thị Thu Hiền, 2003)
17
Hình 2.5. Sơ đồ vector nhị thể (Lê Thị Thu Hiền, 2003)
18
Hình 2.6. Cấu trúc hệ thống điều khiển Ubiquitin ở ngô
22
Hình 2.7. Sơ đồ minh họa phương pháp Megaprimer
29
Hình 3.1. Sơ đồ thí nghiệm thiết kế các vector mang gen HA để chuyển vào
bèo tấm
36
Hình 4.1. Các dòng tái tổ hợp pCR2.1 mang gen HA của virus cúm gà và vịt
được cắt bằng enzyme EcoRV và HindIII.
62
Hình 4.2. Các dòng chứa plasmid pCR2.1 mang gen
63
Hình 4.3. Hình ảnh điện di kết quả tách dòng gen HA trên gel agarose 0,8 %.
64
Hình 4.4. Hình ảnh điện di kết quả tách dòng gen HA1 trên gel agarose 0,8%.
65
Hình 4.5. Sơ đồ một số vị trí cải biến trên gen HA1 (987 bp)
66

Hình 4.6. Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí MD2 trên gel 0,8% agarose.
66
Hình 4.7. Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí MD5 trên gel agarosre 2%
68
Hình 4.8. Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí MD3 trên gel agarosre 2%
68
Hình 4.9. Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí MD4 trên gel 0,8%
69
Hình 4.10. Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí M2 trên gel agarose 0,8%
70
Hình 4.11. So sánh trình tự nucleotide và amino acid giữa gen HA1 và HA1
M
tại vùng cải biến
71
Hình 4.12. Sơ đồ gắn gen HA vào plasmid pET-22b(+)
74
Hình 4.13. Kết quả kiểm tra vector pET22b
(+)
cắt bằng HindIII và NotI (giếng
1) và pCR2.1-H5 cắt bằng EcoRI (giếng 2).
75
Hình 4.14. Minh hoạ thực hiện phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
76
Hình 4.15. Nuôi gà thí nghiệm và gây tối miễn dịch bằng vaccine H5N1, và
lấy máu kiểm tra tối miễn dịch.
77
Hình 4.16. Lấy máu gà trước khi gây tối miễn dịch bằng vaccine H5N1 (trên
trái), sau đó tiêm vaccine H5N1 dưới da cổ để gây tối miễn dịch cho gà (trên
phải) và lấy máu gà 14 ngày tuổi trước khi tiêm vaccine
77

Hình 4.17. Bèo Lemna gibba nuôi trong môi trường H/2+ 10 g/l sucrose, pH
7,0
84
Hình 4.18. Ảnh hưởng của đường sucrose (g/l) tới hệ số nhân cánh ở bèo S.
84
polyrrhiza
Hình 4.19. Sơ đồ cấu trúc đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin
của loài bèo tấm S.polyrrhiza (Mỹ) và vị trí các mồi
89
Hình 4.20. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%
89
Hình 4.21. Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid bằng enzyme giới hạn
91
Hình 4.22. Sơ đồ cấu trúc đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin
của loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và vị trí các mồi
92
Hình 4.23. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%
93
Hình 4.24. Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid bằng enzyme cắt hạn chế
94
Hình 4.25. Hình ảnh điện di sản phẩm promoter SpUbiquitin trên gel agarose
0,8%.
96
Hình 4.26. Hình ảnh điện di kết quả thiết kế pPAM-Sp-HA1 trên gel agarose
0,8%.
98
Hình 4.27. Hình ảnh điện di kết quả thiết kế pPAM-Sp-HA1
M
trên gel agarose
0,8%.

98
Hình 4.28. Sơ đồ vector pPAMSpHA1
99
Hình 4.29. Sơ đồ thiết kế vector pPAM mang gen HA1
101
Hình 4.30. Hình ảnh điện di kết quả thiết kế pPAM-HA1 trên gel agarose
0,8%.
103
Hình 4.31. Hình ảnh điện di kết quả thiết kế pPAM-HA, pPAM- HA1
M
trên
gel agarose 0,8%
103
Hình 4.32. Sơ đồ thiết kế vector pCAMBI-HA1 và pCAMBIA-Sp-HA1
104
Hình 4.33. Sơ đồ cấu trúc SHA1N trong plasmid pJET-SHA1N
106
Hình 4.34. Hình ảnh điện di kết quả thiết kế và kiểm tra pJET-SHA1N, pJET-
SHA1
M
N trên gel agarose 0,8%.
107
Hình 4.35. Hình ảnh điện di các sản phẩm trong quá trình thiết kế và kiểm tra
108
Hình 4.36. Hình ảnh điện di kết quả thiết kế pCAMBIA-Sp-HA1, pCAMBIA-
Sp-HA1
M
trên gel agarose 0,8%.
110
Hình 4.37. Sơ đồ vector pCAMBIA-Sp-HA1

110
Hình 4.38. Biểu hiện tạm thời của gen gus trên SP nguyên cây sau khi lây
nhiễm với các chủng A. tumefaciens
113
Hình 4.39. Biểu hiện tạm thời của gen gus trên callus SP sau khi lây nhiễm các
chủng vi khuẩn khác nhau
114
Hình 4.40. Mô đích sử dụng cho bắn gen
116
Hình 4.41. Ảnh hưởng của hàm lượng AS tới biểu hiện tạm thời của gen gus ở
bèo SP chuyển gen
127
Hình 4.42. Chọn lọc các dòng bèo chuyển gen
130
Hình 4.43. Kết quả điện di kiểm tra mẫu DNA tổng số tách từ bèo tấm S.
polyrrhiza chuyển gen trên gel agarose 0,8 %.
132
Hình 4.44. Kết quả phân tích PCR gen HA1các dòng bèo tấm Lemna gibba
chuyển gen
132
Hình 4.45. Kết quả phân tích PCR gen HA1các dòng bèo tấm LM chuyển gen
133
Hình 4.46. Kết quả phân tích PCR gen HA1các dòng bèo tấm LM chuyển gen
133
Hình 4.47. Kết quả phân tích PCR gen hpt các dòng bèo tấm SP chuyển gen
134
Hình 4.48. Kết quả phân tích PCR gen HA1các dòng bèo S. polyrrhiza
chuyển gen
135
Hình 4.49. DNA tổng số được cắt bằng BamHI

136
Hình 4.50. Kết quả lai DNA của các dòng bèo tấm chuyển gen
137
Hình 4.51. Kết quả điện di protein tổng số các dòng bèo chuyển gen
138
Hình 4.52. Kết quả phân tích Western blot các dòng bèo chuyển gen
139
Hình 4.53. A. Gà nuôi trong chuồng; B. Cho gà ăn bèo chuyển gen
140
Hình 4.54. Lấy máu gà
141
Hình 4.55. (A) Tế bào hồng cầu và bạch cầu Eosinophil; (B) Tế bào hồng cầu
và bạch cầu neutrophil; (C) Tế bào hồng cầu và bạch cầu lympho
144
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
1
Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Thập niên cuối thế kỷ 20 đầu thế kỷ 21 thế giới chứng kiến những thành tựu vượt
bậc trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Một trong những thành tựu đó là tạo
ra các giống cây trồng chuyển gen có các đặc tính khác biệt như chống chịu sâu, bệnh,
kháng thuốc diệt cỏ Đến năm 2010 diện tích cây chuyển gen toàn cầu đạt 148 triệu
ha. Một loạt các giống cây trồng với các đặc tính hoàn toàn mới như: chịu hạn, mặn,
tăng cường khả năng hấp thụ nitơ, chịu úng, tăng cường sinh trưởng, hoặc tăng cường
chất lượng dinh dưỡng, chất lượng chế biến, tăng cường hoạt chất sinh học đã được
nghiên cứu và đang chuẩn bị đưa vào ứng dụng trong sản xuất (www.isaaa.org).
Sự phát triển hứa hẹn sáng sủa nhất của công nghệ sinh học thực vật là sử dụng
cây chuyển gen để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học như: vitamin, các hợp chất
chữa bệnh, các hoá chất sử dụng trong công nghiệp, trong y tế như: kháng nguyên,

kháng thể, interferon, vaccine (Mason et al, 1998).
Có nhiều hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp cần thiết cho các mục đích khác
nhau của con người. Đó là hệ thống sử dụng tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn, nấm
men Gần đây tế bào côn trùng, thực vật biến đổi gen được sử dụng để khắc phục
các nhược điểm của hệ thống sản xuất protein từ tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn và
nấm men. Do đó nhiệm vụ to lớn đặt ra cho các nhà khoa học là tìm kiếm hệ thống
sản xuất protein tái tổ hợp khác, rẻ tiền, dễ sử dụng và không mang nguy cơ lây
nhiễm các bệnh có nguồn gốc virus. Hệ thống đó là thực vật. So với các hệ thống
truyền thống, thực vật có nhiều lợi thế hơn trong việc sản xuất protein tái tổ hợp.
Vaccine do thực vật sản xuất ra thông qua kỹ thuật di truyền được gọi là "Vaccine sản
xuất bằng thực vật" (Rowlandson & Tackaberry, 2003). Vaccine này có thể được sử
dụng ở dạng tinh khiết hay dưới dạng dịch chiết thực vật hoặc nguyên liệu thực vật.
Vaccine tái tổ hợp có thể được đưa vào những thực vật ăn được đối với người và
động vật, tạo khả năng đưa vaccine vào qua đường miệng, gây miễn dịch cho hệ
thống màng nhầy và miễn dich toàn cơ thể (Hansson et al, 2000; Fishcher et al, 2003).
Ý tưởng sử dụng thực vật làm hệ thống sản xuất loại vaccine này (edible vaccine) đã
lôi cuốn các nhà khoa học của nhiều nước tham gia vào nghiên cứu trong thập niên
vừa qua và đã thu được nhiều kết quả khả quan (Rowlandson & Tackaberry, 2003).
Cúm gà (avian influenza-AI) là bệnh truyền nhiễm cấp tính của các loại gia cầm,
thủy cầm, các loại chim bị gây ra bởi virus cúm týp A, một trong 4 nhóm virus thuộc
họ Orthomyxoviridae. Trong họ này có 4 nhóm: virus cúm týp A (influenza A virus);
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
2
virus cúm týp B (influenza B virus); virus cúm týp C (influenza C virus) và nhóm
Thogotovirus. Chỉ có virus cúm A và B là gây dịch cúm nguy hiểm, còn virus cúm C
chỉ gây cảm cúm thông thường. Cúm A/H5N1 là một virus có độc lực cao và gây
bệnh trên người trong những năm 1996-2008. Chủng virus cúm A/H5N1 được phát
hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959. Sau đó, cúm
A/H5N1 đã tái xuất hiện tại Quảng Đông (1996) và Hồng Kông (1997) với biến đổi
sâu sắc, không những gây chết gia cầm mà còn thích ứng và gây chết người bệnh. Có

thể coi dòng virus cúm A/H5N1 từ 1996 đến nay là cúm A hiện đại mới xuất hiện.
Virus H5N1 gây ra dịch cúm trên gia cầm tại Hồng Kông, Trung Quốc và lây lan
sang hàng chục quốc gia của nhiều châu lục trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Cơ
bản về cấu trúc virus cúm vẫn như trước đó, nhưng xét về độc lực,loài vật chủ nhiễm
bệnh, tính kháng nguyên - miễn dịch và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn
và khác với những biến chủng H5N1 trước đây. Các chủng virus cúm A/H5N1 thuộc
phân dòng Thanh Hải (nguồn gốc vùng Bắc Trung Quốc) xuất hiện cuối năm 2005,
bắt đầu lan sang một số nước vùng Trung Á, trong đó có Nga, rồi tràn ngập vào các
nước vùng Tiểu Á, bao gồm Thổ Nhĩ Kỳ, các nước Bắc-Trung Phi, đặc biệt Ai Cập
và Nigeria là các nước chịu thiệt hại nhiều nhất (Hulse-Pot et al., 2005, Subbarao,
Luke, 2007, Zhao et al., 2008). Ở Việt Nam, đại dịch bùng phát từ năm 2003, tái phát
vào năm 2004, 2005. Mặc dù đã áp dụng nhiều biện pháp phòng chống, cho đến nay
vẫn còn những ổ dịch nhỏ (www.cucthuy.gov.vn).
Xuất phát từ những cơ sở khoa học và đòi hỏi của thực tế trên, Viện Di truyền
Nông nghiệp đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cho phép thực hiện đề
tài “Nghiên cứu tạo giống bèo tấm mang gen kháng nguyên H5N1 phòng chống
bệnh cúm ở gia cầm” thuộc Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công
nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Tạo giống bèo tấm mang gen biến nạp HA và NA có khả năng gây miễn dịch
bệnh cúm gia cầm thông qua đường tiêu hoá.
1.3. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu trong đề tài này là ba loài bèo tấm L. gibba, L. minor, S.
polyrrhiza; gen kháng nguyên HA1 của virus H5N1.
1.4. Phạm vi nghiên cứu
Các nghiên cứu tái sinh, tạo callus và chuyển gen kháng nguyên HA1 của virus
H5N1ở các loài bèo tấm L. gibba, L. minor, S. polyrrhiza trong điều kiện phòng thí
nghiệm
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
3

Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tính cấp thiết của đề tài
Hiện nay số lượng các tác nhân gây bệnh cho người và gia súc gia cầm ngày
càng tăng, hiện tượng nhờn thuốc đối với các tác nhân gây bệnh cũ bắt buộc con
người phải ưu tiên quan tâm trước hết đến các phương pháp phòng bệnh so với việc
chữa bệnh. Vì vậy việc phòng bệnh bằng vaccine đã trở thành hoạt động quan trọng
và là mục tiêu hàng đầu của ngành bảo vệ sức khoẻ và thú y của các nước (Walmsley
& Arntzen, 2000). Tuy vậy, nhiều nước trong số các nước đang phát triển không có
đủ điều kiện để cung cấp đầy đủ vaccine để phòng ngừa các loại bệnh nguy hiểm nhất,
phổ thông nhất cho dân mình. Chỉ nhờ vào sự giúp đỡ của chương trình y tế thế giới,
người dân các nước đang phát triển mới có thể tham gia chương trình tiêm chủng mở
rộng gồm 6 loại vaccine. Trong khi đó tại các nước phát triển, trẻ em được tiêm
chủng phòng 10 loại bệnh nguy hiểm đã từ nhiều thập kỷ nay. Một trong những
nguyên nhân chủ yếu dẫn đến hiện tượng trên là do giá thành vaccine sản xuất ra rất
cao, không phù hợp với khả năng thanh toán của các nước đang phát triển (Walmsley
& Arntzen, 2000). Tương tự như vậy đối với lĩnh vực chăn nuôi gia súc, gia cầm, do
giá thành vaccine cao, ngành chăn nuôi tại các nước đang phát triển gặp nhiều rủi ro
hơn nhiều so với các nước phát triển. Vì vậy việc tìm ra phương pháp sản xuất
vaccine mới, với giá thành hạ là một trong những tìm kiếm sôi động trên thế giới
những năm gần đây. Một trong những hướng nghiên cứu để giảm giá thành vaccine là
sử dụng vaccine dùng qua đường miệng thay thế cho vaccine tiêm (gọi tắt là vaccine
uống). Vaccine uống có nhiều lợi thế hơn so với vaccine tiêm, như không phải sử
dụng nước cất, kim tiêm, không cần cán bộ y tế có trình độ, không có nguy cơ lây
nhiễm các bệnh qua đường máu Điều đó làm vaccine uống hấp dẫn hơn nhiều ở các
nước nghèo, đặc biệt ở các vùng sâu, vùng xa. Mặt khác, vaccine uống có một số ưu
điểm so với vaccine tiêm có liên quan đến hệ miễn dịch màng nhầy. Hệ màng nhầy
(bao phủ các đường tiêu hoá, đường hô hấp, đường bài tiết ) trong cơ thể người và
động vật chiếm một diện tích rất lớn (ở người lớn diện tích hệ màng nhầy lên đến trên
400 m

2
). Người ta đã nhận thấy rằng trong một số trường hợp sử dụng vaccine tiêm,
kháng thể tạo thành trong máu nhưng lại không tìm thấy ở hệ màng nhầy. Trong khi
đó màng nhầy lại là cửa ngõ xâm nhập vào cơ thể của nhiều tác nhân gây bệnh. Nếu
gây miễn dịch hệ thống màng nhầy, tác nhân gây bệnh sẽ bị chặn ngay lại khi xâm
nhập vào cơ thể (Mestecky & et al, 2005).
Hướng tiếp theo có tiềm năng giảm giá thành vaccine là sử dụng thực vật
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
4
chuyển gen để sản xuất vaccine. Có nhiều hệ thống sản xuất các protein tái tổ hợp cần
thiết cho các mục đích khác nhau của con người. Đó là hệ thống sử dụng tế bào động
vật bậc cao, vi khuẩn, nấm men Gần đây tế bào côn trùng, thực vật biến đổi gen
được sử dụng để khắc phục các nhược điểm của hệ thống sản xuất protein sử dụng tế
bào động vật bậc cao, vi khuẩn và nấm men. Ví dụ, hệ thống sản xuất vaccine sử
dụng vi khuẩn có khả năng cho lượng protein cao nhưng vi khuẩn không có khả năng
biến tính protein tạo thành bằng các phản ứng glycosit hoá, do đó hoạt tính của
protein tạo thành bị hạn chế (Knusadi et al, 1997). Do đó nhiệm vụ to lớn đặt ra cho
các nhà khoa học là tìm kiếm hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp khác, rẻ tiền, dễ sử
dụng và không mang nguy cơ lây nhiễm các bệnh có nguồn gốc virus. Hệ thống đó là
thực vật. So với các hệ thống truyền thống, thực vật có nhiều lợi thế trong việc sản
xuất protein tái tổ hợp. Trước hết phải kể đến khả năng glycosit hoá protein, đó là
một yếu tố rất quan trọng bởi vì các protein có khả năng gây miễn dịch đối với virus,
vi khuẩn thường là glycoprotein, nhóm glycosyl thường là yếu tố không thể thiếu
được cho phản ứng tạo miễn dịch (Alkhatib et al, 1984). Lợi thế thứ hai là protein tạo
thành từ thực vật tương đối an toàn so với protein tạo thành từ tế bào động vật bậc
cao bởi thực vật thường không là vật chủ của các nguồn gây bệnh cho người và động
vật (Ganz et al, 1996; Cramer et al, 1999). Cuối cùng là lợi thế về giá thành: Thực vật
có thể trồng trên diện tích lớn với chi phí tối thiểu về phân bón, công chăm sóc… So
với việc nuôi cấy tế bào, chí phí đó hầu như không đáng kể. Vaccine do thực vật sản
xuất ra thông qua kỹ thuật di truyền được gọi là "Vaccine sản xuất bằng thực vật"

(Rowlandson & Tackaberry, 2003). Vaccine này có thể được sử dụng ở dạng tinh
khiết hay dưới dạng dịch chiết thực vật hoặc nguyên liệu thực vật. Vaccine tái tổ hợp
có thể được đưa vào những thực vật ăn được đối với người và động vật, tạo khả năng
đưa vaccine vào qua đường miệng, gây miễn dịch cho hệ thống màng nhầy và miễn
dich toàn cơ thể (Hansson et al, 2000; Fishcher et al, 2003). ý tưởng sử dụng thực vật
làm hệ thống sản xuất vaccine uống (edible vaccine) đã lôi cuốn các nhà khoa học
của nhiều nước tham gia vào nghiên cứu trong thập niên vừa qua và đã thu được
nhiều kết quả khả quan (Rowlandson & Tackaberry, 2003). Một trong những phát
triển hứa hẹn sáng sủa nhất của công nghệ sinh học thực vật là sử dụng cây chuyển
gen để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học như: vitamine, các hợp chất chữa bệnh,
các hoá chất sử dụng trong công nghiệp, trong y tế, như kháng nguyên, kháng thể,
interferon, vaccine (Mason etal, 1998)
Người ta đã tạo ra giống "lúa vàng" để sử dụng như nguồn bổ sung vitamine A
cho cơ thể. Một loạt các protein gây miễn dịch của virus, vi khuẩn và một loạt các
loài thực vật đã được nghiên cứu. Kết quả thử nghiệm đã chứng minh vaccine tái tổ
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
5
hợp chống viêm gan B sản xuất bằng thực vật đã gây miễn dịch hệ thống màng nhầy
trên động vật (Mason et al, 1992) gây miễn dịch ở người tình nguyện (Tacket et al,
1998). Nhiều loại vaccine thú y cũng được quan tâm nghiên cứu.
Hiện nay người ta đã thành công trong việc chuyển gen tổng hợp các vaccine ở
các thực vật sau: Glycoprotein B (cytomegalovirus người) ở lúa, thuốc lá (Tackabery
et al, 1999; Sardana et al, 2003); NVCP (virus Norwalk) ở khoai tây (Marson et al,
1996); Hemagglutinin (virus sởi) ở cà rốt (Bouche et al, 2003); HbsAg (viêm gan B)
ở khoai tây, rau diếp, chuối (Kapusta et al, 1999; Kong et al, 2001); độc tố gây bệnh
tả B (bệnh tả) ở cà chua (Jani et al, 2002); Protein F (virus hợp bào hô hấp) ở cà chua
(Sandhu et al, 2000); LT-B (E. coli) ở khoai tây, ngô (Haq et al, 1995; Chikwamba et
al, 2002); Protein S (virus đường ruột) ở thuốc lá (Tuboly et al, 2000); Protein L1
(papilloma virus người) ở khoai tây (Warzecha et al, 2003); kháng nguyên chống
bệnh than ở thuốc lá (Aziz et al, 2002); Protein vỏ hantavirus ở khoai tây (Kehm et al,

2001) và Epitope VP1 (bệnh lở mồm long móng) ở khoai tây (Carrillo et al, 2001).
Hiện nay, các nghiên cứu trên thế giới trong thập niên vừa qua đã cho thấy tiềm năng
ứng dụng của vaccine uống sản xuất thông qua hệ thống thực vật chuyển gen là rất
lớn, nó không những sẽ góp phần giảm rất đáng kể giá thành vaccine mà còn mở ra
những triển vọng mới trong việc ứng dụng CNSH thực vật cho mọi mặt của đời sống.
2.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1
2.2.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 trên thế giới
Đối với bệnh truyền nhiễm, vaccine được coi là biện pháp có tính chiến lược,
nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch (Subbarao, Luke, 2007). Đối với dịch
cúm trên người, nghiên cứu phát triển vaccine không những ngăn ngừa làm giảm
được bệnh ở gia cầm, mà còn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm
này sang người. Nhiều công trình nghiên cứu về gen H5N1 và phát triển công nghệ
cũng như vaccine gây miễn dịch cho gia cầm được xúc tiến mạnh mẽ. Kháng thể đặc
hiệu có thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên trong vaccine, và đó
là các kháng thể kháng HA, NA, MA và nhiều loại hình khác của virus đương nhiễm,
góp phần vô hiệu hóa virus cúm đúng đối tượng khi chúng xâm nhập vào. Có nhiều
loại kháng thể, nhưng trước hết chỉ kháng thể kháng HA (H5) có vai trò tiên quyết
quan trọng trong quá trình trung hòa virus phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai
loại chính: vaccine truyền thống và vaccine thế hệ mới (Capua & Alexander, 2008,
Subbarao & Luke, 2007). Virus cúm H5N1 rất độc có thể giết chết ngay phôi gà
(nguyên liệu dùng trong sản xuất vaccine) từ khi mới cấy virus vào phôi. Vì vậy loại
bỏ vùng gây độc là tiêu chí bắt buộc khi sản xuất vaccine.
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
6
 Vaccine truyền thống: bao gồm vaccine vô hoạt đồng chủng và dị chủng.
Vaccine vô hoạt đồng chủng (homologus vaccine), đó là các loại vaccine được sản
xuất chứa cùng những chủng virus cúm gà giống như chủng gây bệnh trên thực địa
(Swayne, Suarez, 2000). Vaccine vô hoạt dị chủng (heterologus vaccine) là vaccine
sử dụng các chủng virus có kháng nguyên HA giống chủng virus trên thực địa, nhưng
có kháng nguyên NA dị chủng.

 Vaccine thế hệ mới hay vaccine công nghệ gen: là loại vaccine được sản
xuất dựa trên kỹ thuật gen loại bỏ các vùng “gen độc” đang được nghiên cứu và đưa
vào sử dụng phổ biến, bao gồm:
+ Vaccine tái tổ hợp có vector đậu gia cầm dẫn truyền: sử dụng virus đậu gia
cầm làm vector tái tổ hợp mang gen H5 và N1 phòng chống virus týp H5N1 và H7N1
(Quiao et al., 2006). Ví dụ, Hãng Merial của Pháp sản xuất vaccine TrovacAIV-H5
lấy nguồn gen H5 từ chủng A/Turkey/Ierland/83 (H5N2), sử dụng được cho gia cầm
lúc 1 ngày tuổi.
+ Vaccine dưới nhóm chứa protein kháng nguyên NA, HA tái tổ hợp và tách
chiết làm vaccine (Peyre et al., 2009).
 Vaccine nhược độc virus cúm nhân tạo: được sản xuất bằng kỹ thuật di
truyền ngược, đó là việc lắp ghép virus cúm nhân tạo chứa đầy đủ hệ gen, trong đó
các gen kháng nguyên H5 có vùng “độc” đã được biến đổi bằng kỹ thuật gen (Liu et
al., 2003, Tian et al., 2005). Có 3 loại vaccine đã được Tổ chức Y tế thế giới (WHO)
công nhận về độ an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sản xuất vaccine trên
thế giới hiện nay, đó là NIBRG-14 (NIBSC), VN/04xPR8-rg (SJCRH) và VNH5N1-
PR8/CDC-rg (CDC).
 Vaccine ăn được ở thực vật (plant edible vaccine): Do hiện tượng kháng
kháng sinh của các chủng vi khuẩn và sự gia tăng các vi sinh vật mới, ngoài vaccine
tiêm chủng ra, từ năm 1990, đã xuất hiện một thuật ngữ mới vaccine đường miệng
(oral vaccine) để chỉ loại vaccine không cần giữ lạnh, trong đó vaccine ăn được ở
thực vật (plant edible vaccine) cũng thuộc nhóm này. Đây là lĩnh vực nghiên cứu mới
trong công nghệ sinh học bao gồm cả lĩnh vực nghiên cứu sản xuất vaccine và nghiên
cứu cây trồng chuyển gen (Lal et al., 2007).
Vaccine ăn được ở thực vật là vaccine tiểu phần protein được sản xuất dựa trên
hệ thống thực vật để thu được protein làm kháng nguyên mong muốn. Chúng tác
động vào dịch thể, kích thích cả hệ thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào (Lê
Trần Bình & Cao Huyền Trang, 2005). Vaccine này bền vững trong dịch tiêu hóa, đi
qua đường tiêu hóa mà không bị phân hủy. Sản xuất vaccine ăn được có thể thực hiện
theo quy trình sau đây:

2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
7
- Lựa chọn gen cần được biểu hiện và đưa vào vector thích hợp;
- Lựa chọn đối tượng thực vật thích hợp để chuyển gen;
- Chuyển vector tái tổ hợp mang gen quan tâm vào thực vật đã lựa chọn bằng
các phương pháp chuyển gen khác nhau;
- Kiểm tra biểu hiện của gen quan tâm trong những bộ phận ăn được của thực
vật;
- Thử nghiệm khả năng đáp ứng miễn dịch của vaccine sản xuất từ thực vật;
- Sử dụng vaccine đã được thử nghiệm thành công bằng cách ăn tươi hoặc dưới
dạng thức ăn đã chế biến.
Các thành tựu về công nghệ chuyển gen ở thực vật trong hướng nghiên cứu
vaccine đường miệng: nghiên cứu vaccine virus viêm gan B biểu hiện trong chuối
(Kumar et al., 2005), rau diếp (Marcondes & Hansen, 2008), vaccine chống bệnh
đường ruột (Carol et al., 2007), vaccine chống bệnh SARS-CoA ở nhiều loài thực vật
(Li et al, 2006), vaccine từ gạo chống bệnh dị ứng phấn hoa (Takagi et al., 2005).
Tuy nhiên, nghiên cứu về sử dụng H5N1 làm vaccine ăn được còn rất hạn chế
(Khandelwaal et al., 2003)
2.2.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 ở Việt Nam
Từ năm 2006 nhờ áp dụng chương trình tiêm chủng mở rộng trên toàn quốc đã
hạn chế đáng kể sự lây lan dịch bệnh cúm gà. Nhu cầu sản xuất vaccine trở nên cấp
bách hơn bao giờ hết.
Vấn đề chẩn đoán và xây dựng phương pháp phát hiện nhanh và phân biệt cúm A
với các tác nhân gây triệu chứng hô hấp khác, cũng như phân biệt các phân týp HA
và NA đã được các nhà khoa học Việt Nam quan tâm, kết hợp nghiên cứu với các tổ
chức thế giới. Về nghiên cứu sản xuất vaccine, Viện Công nghệ Sinh học kết hợp với
Viện Thú y, Xí nghiệp Thuốc thú y Trung ương, Công ty Thuốc thú y Trung ương II,
Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương, thực hiện nghiên cứu có được
vaccine sản xuất từ chủng NIBRG-14 (Lê Trần Bình, 2007). Đây là chủng vaccine
được tạo ra bằng công nghệ di truyền ngược tại Viện Tiêu chuẩn và kiểm định sinh

học quốc gia (Vương quốc Anh), thích ứng trên phôi gà 10 ngày tuổi và vaccine tạo
ra dưới dạng vô hoạt nhũ đầu. Kết quả là đã xây dựng được các quy trình sản xuất
giống, sản xuất vaccine, kiểm nghiệm và bảo quản vaccine cúm A/H5N1, kiểm
nghiệm miễn dịch đạt chất lượng bằng phương pháp huyết thanh học và thử thách
cường độc. Ngoài ra, một số đề tài khác như nghiên cứu dịch tễ học phân tử, chẩn
đoán, vector tái tổ hợp dẫn truyền kháng nguyên sử dụng adenovirus hoặc LaSoTa
virus. Và đặc biệt nghiên cứu các gen HA và các biến chủng H5N1 làm cơ sở để chế
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
8
tạo vaccine được tiến hành trên một số Viện nghiên cứu ở nước ta và trên thế giới (Lê
Trần Bình, 2007, Trần Quang Vui et al., 2008, Kodihalli et al., 1999).
2.3. Gen Hemagglutinin
Gen HA có độ dài thay đổi tùy theo từng chủng virus cúm: A/H1N1 có độ dài
1778 bp, ở A/H9N1 – 1714 bp, còn ở A/H5N1 từ 1704 đến 1707 bp. Gen HA mã hóa
cho protein kháng nguyên ngưng kết hồng cầu có độ dài 568−569 amino acid. Gen
HA được phân lập từ chủng H1N1 (1934) Tây Ban Nha, chủng H5N1 (1996) ở
Quảng Đông, Trung Quốc như các chủng nguyên thủy. Nhiều gen HA phân lập từ các
chủng trong giai đoạn 1997-2003. Đó là các biến chủng có khả năng gây bệnh rất cao.
Hệ gen của virus biến đổi nhanh, trong đó, những biến đổi gen HA thường xảy ra
nhiều và sử dụng để phân định nhóm kháng nguyên, phân tuýp và phân tích mối quan
hệ tiến hóa. Các chủng từ 1997-2002 vẫn mang tính đồng kháng nguyên, nhưng các
chủng từ 2003 -2005 đã có bằng chứng của sự lệch kháng nguyên của A/H5N1. Cúm
A/H5N1 có 12 genotype, những dạng cũ (A, B, C, D) trước 2002 không còn tồn tại,
mà tồn tại 8 dạng mới (V, W, X1, X2, X3, Y, Z và Z+). Các chủng H5N1 phân lập tại
Việt Nam từ 2004 đến 2006 đều thuộc dòng Quảng Đông, tập trung chủ yếu ở
genotype Z, nhưng phân thành 2 nhóm: nhóm N – miền Bắc và nhóm S- miền Nam
thuộc nhóm tiến hóa (clade) 1. Năm 2007 đã phát hiện thêm dưới dòng Phúc Kiến
thuộc clade 2.3.4 ( Lê Thanh Hòa et al., 2008). Gen HA được phân lập từ chủng
A/Ck/Vietnam/HG4/2005 (Hậu Giang) có 9 vị trí nucleotide sai khác hoàn toàn so
với các chủng phân lập ở Việt Nam và Đông Nam Á, được xác định thuộc nhóm dưới

dòng Quảng Đông và clade 1 (Trần Quang Vui et al., 2008).
Hemagglutinin (HA) có thể được coi là một loại protein vừa quyết định tính
kháng nguyên, vừa quyết định tính độc lực của virus cúm A. Protein HA là một
glycoprotein thuộc protein màng týp I (lectin), có khả năng gây ngưng kết hồng cầu
gà trong ống nghiệm (in vitro). Kháng thể đặc hiệu với HA có thể phong tỏa sự
ngưng kết đó, được gọi là kháng thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI-Hemagglutinin
Inhibitory antibody). Có 16 phân týp HA đã được phát hiện (H1-H16), ba phân týp
(H1, H2 và H3) thích ứng lây nhiễm gây bệnh ở người liên quan đến các đại dịch cúm
trong lịch sử (Murphy & Webser, 1996). Có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt
capsid của một virus và khởi động quá trình xâm nhiễm của virus vào tế bào chủ
(Bender et al., 1999, Wagner et al., 2002).
Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130Å, thường ở dạng kết 3 (trimer),
mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ chuỗi HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa).
Các đơn phân liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-). Các đơn phân sau
khi tổng hợp đã được glycosyl hóa (glycosylation) và gắn vào mặt ngoài capsid là
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
9
chuỗi HA2, phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi hạt HA1 chứa đựng vị trí gắn
với thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào đích (Bosch et al., 1981,
Wagner et al., 2002). Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa
sialic acid) trên bề mặt màng tế bào, khởi đầu quá trình xâm nhiễm của virus trên vật
chủ giúp cho virus xâm nhập, hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá
trình nhân lên ở tế bào cảm nhiễm. Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu
hình không gian của thụ thể chứa sialic acid của tế bào đích với vị trí gắn thụ thể này
trên phân tử HA của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các loài
vật chủ khác nhau (Wagner et al., 2002, Webser, 1998). Vị trí amino acid 226
(aa226) của chuỗi HA1 được xác định là vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ thể
đặc hiệu của nó, ở hầu hết các chủng virus cúm A lưu hành trong tự nhiên vị trí này là
Glycine, thích ứng với thụ thể Gal α-2.3 sialic acid (chứa sialic acid liên kết với
nhóm hydroxyt (4-OH) của galactose ở góc quay α-2.3) của tế bào biểu mô đường hô

hấp của chim và cúm gia cầm (vật chủ tự nhiên của virus cúm A). Ngoài ra, một số vị
trí amino acid khác: Glutamine 222, Glycine 224, hay cấu trúc SGVSS và NGQSGR
cũng có sự liên quan chặt chẽ đến khả năng thích ứng với thụ thể chứa sialic acid bề
mặt màng tế bào chủ (Keawcharoen et al., 2005). Đặc biệt, một số chủng cường độc
A/H5Nx; A/H7Nx lưu hành hiện nay có thể xâm nhiễm trên người, khi chúng có tải
lượng cao trong đường hô hấp (do tiếp xúc trực tiếp với chất thải hay gia cầm nhiễm
bệnh) (Hui, 2008, Webser, 1998).
Hình 2.1. Cấu trúc protein Hemagglutinin
A: Dải biểu đồ protein bề mặt Hemagglutin của virus cúm H5 giới hạn bởi
kháng thể F10 (màu đỏ). Hai chuỗi của HA là HA1 (màu vàng) và HA2 (màu xanh)
B: Protein Hemagglutinin đại diện từ 1918 virus cúm. Vị trí bám receptor là
nơi protein cúm tấn công vào phổi con người
Trình tự mã hóa chuỗi nối và thành phần chuỗi nối trên protein HA cũng như
các vị trí amino acid liên quan đến khả năng gắn với thụ thể thích ứng được coi là chỉ
thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên HA (Keawcharoen et al.,
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
10
2005). Protein HA còn là kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm A, kích
thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng týp HA và tham gia
vào phản ứng trung hòa virus, được coi là protein vừa quyết định độc lực của virus, là
đích bảo vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm,
cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay (Horimoto & Kawaoka, 2006,
Keawcharoen et al., 2005, Matrosovich et al., 1999). Hemagglutinin là polypeptide
gồm 2 chuỗi HA1 và HA2 (hình 2.1) nối với nhau bằng một đoạn oligonucleotide
ngắn, thuộc loại hình motif riêng biệt, đặc trưng cho các týp H (H1-H16) trong quá
trình tái tổ hợp tạo nên biến chủng (Vey et al., 1992). Chuỗi nối này cũng chính là
điểm cắt của protease tạo nên 2 phân đoạn HA rời nhau. Motif của chuỗi nối
oligonucleotide này chứa một số amino acid mang tính kiềm làm khung, thay đổi đặc
hiệu theo từng loại hình subtýp H và sự biến đổi thành phần của chuỗi nối quyết định
tính độc lực của virus thuộc biến chủng mới (Horimoto, Kawaoka, 1995). Đối với týp

H5 cường độc, loại H5N1, motif chuỗi nối này có cấu trúc là TPQRERRKKR, loại
H5N2: motif chuỗi nối này có cấu trúc là VPQRKRKTR, trong khi đó, đối với subtýp
H5 vô độc (hoặc nhược độc thấp), tất cả các loại H5N1, H5N2, H5N3, H4N6, và
H1N1, motif chuỗi nối này có cấu trúc là VPQRETR (Horimoto, Kawaoka, 1995,
Zhou et al., 1999). Đối với chủng cường độc H7, motif này là P−K−G−R (Horimoto,
Kawaoka, 2006). Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh, mặc dù trên bề mặt virus có
hai kháng nguyên glycoprotein là HA và NA nhưng chỉ có HA có khả năng gây đáp
ứng miễn dịch bảo hộ (Chen et al., 2004, Justerwicz et al., 1995). Để chứng minh có
điều đó, gần đây nhất, các nhà khoa học đã thành công trong việc tạo vaccine tái tổ
hợp bằng cách đưa các đoạn gen mã hóa kháng nguyên HA hoặc tiểu đơn vị của
kháng nguyên HA (HA1, HA2) của chủng H5N1 vào biểu hiện trong adenovirus.
Điều đáng chú ý là kháng nguyên HA1 và HA tái tổ hợp có mức bảo hộ 100% đối với
gà thực nghiệm, trong đó kháng nguyên HA2 có mức độ bảo hộ 60%.
Hemagglutinin với nghiên cứu sản xuất vaccine thực vật
Vấn đề biểu hiện và sản xuất kháng nguyên HA ở lượng đáng kể được quan
tâm nghiên cứu từ năm 2002 trở lại đây. Nhiều loại protein, enzyme và kháng nguyên
đã biểu hiện thành công trong tế bào vi sinh vật và đã được áp dụng rộng rãi trong
thực tế cuộc sống như dùng làm thuốc, thực phẩm chức năng… Kháng nguyên HA
cũng như các tiểu phần HA1, HA2 của một số virus cúm A như H1N1, H3N2, H7N9
và H5N1 đã được nghiên cứu biểu hiện trong tế bào vi sinh vật như E. coli,
Baculorvirus, nấm men P. pastoris và S. cerevisiiae (Yi Minh Xu et al., 2006). Việc
biểu hiện gen này trong thực vật đang được tiến hành nghiên cứu, tuy nhiên, có
những kết quả trái ngược nhau được công bố. Nghiên cứu của Bruchmüller và cộng
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
11
sự, 2007, cho thấy HA1 đã cải biến mã codon thích hợp với thực vật được biểu hiện
cao trong cây đại mạch dưới sự điều khiển của promoter gliadin lúa mỳ. Phân tích
bằng Western blot khẳng định sự biểu hiện của HA1 trong hạt của 84 dòng chuyển
gen HA1. Những nghiên cứu của D
’

Aoust và cộng sự, 2008, đã biểu hiện được gen
HA từ virus H5N1 (A/Indonesia/5/05) và H1N1 (A/New Caledonia/20/99) tạm thời
trong cây thuốc lá Nicotiana bethamiana. Biểu hiện lượng lớn HA tích tụ trong dạng
hạt (virus like particles) vùng giữa các tế bào (apoplastic) ở cây thuốc lá cho hiệu suất
đến 50mg/kg (Rybicki, 2010). Spitsin và các cộng sự, 2009, thử biểu hiện HA, HA1
từ chủng A/Vienam/1203/2004 vào thuốc lá nhưng kết quả lai miễn dịch cho thấy thí
nghiệm chưa thành công. Trong khi đó, Shoji và các cộng sự, 2009, đã biểu hiện
thành công gen HA từ chủng A/Indonesia/05/05 sử dụng vector pGRD4. Ở Việt Nam,
việc nghiên cứu biểu hiện gen HA đã thành công trên cây thuốc lá và đang được tiến
hành trên đối tượng thực vật như cây đậu tương (Nguyễn Thị Hiền et al., 2009, Bùi
Phương Thảo et al., 2009).
Tạo vaccine thực vật là một hướng đi cần thiết nhưng cho đến nay vẫn đang
còn nghiên cứu, chưa có vaccine thực vật mang gen HA được đưa vào sử dụng.
2.4. Chuyển gen vào bèo tấm thực tại và triển vọng
2.4.1. Bèo tấm và tiềm năng chuyển gen
2.4.1.1. Giới thiệu chung về cây bèo tấm
Phân bố của bèo tấm: Bèo tấm với tên khoa học Lemnaceae là loài sinh vật
thủy sinh có khả năng tồn tại và phát triển ở nhiều nơi trên thế giới, trừ những vùng
cực bắc và cực nam quanh năm giá lạnh. Ở vùng sa mạc và vùng ẩm ướt thì sự có mặt
của bèo tấm cũng ít hơn. Trong các chi thuộc loài bèo tấm thì 2 chi (Spirodela,
Lemna) được phân bố khắp thế giới. Spirodela có tâm phân bố ở Nam Mỹ. Chi
Lemna có tính đa dạng cao nhất ở Bắc Mỹ và Đông Nam Á. Cùng với nghề trồng lúa
nước, chúng có mặt rộng rãi ở nhiều vùng khác nhau như: Nam Âu, vùng trung tâm
Bắc Mỹ, Bắc Trung Quốc, Bắc Nhật Bản Ở Việt Nam, đã phát hiện thấy có 3 loài
bèo tấm thuộc 2 chi khác nhau (Spirodela, Lemna) đó là loài L. aequinoctialis, S.
polyrrhiza và W. globosa (Landolt, 1986). Hiện nay, các loài bèo này phân bố khá
phổ biến trên các vùng mặt nước, ao hồ đồng ruộng và tập trung nhiều ở khu vực
đồng bằng Bắc Bộ và Nam bộ.
Đặc điểm hình thái bèo tấm: Lemnaceae thuộc nhóm cây một lá mầm nhỏ
nhất phần lớn có cả lá, rễ, hoa, quả, những cây trưởng thành không có thân cây. Lá

(cánh bèo) có kích thước khác nhau phụ thuộc vào từng chi, từng loài.
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
12
Đặc điểm cánh bèo: Dạng thân giống lá của các loài Lemnaceae được gọi là
“frond” (cánh bèo), là một tập hợp của các mô có sự biệt hóa hạn chế. Mức độ tổ
chức của mô cánh bèo trong họ Lemnaceae giảm từ Spirodela tới Lemna, Wolffiella
và Wolffia. Cánh bèo không ở dạng phẳng mà tồn tại các u lồi đặc trưng trên đó có
định vị các gân lá, cây trưởng thành thường có từ 4-7 gân lá trong khi các cây non chỉ
có 3 gân lá. Đa số bèo tấm có cánh mỏng giống lá. Một số loài có cánh không dẹt do
có xoang khí lớn. Cánh bèo có hình ô van (hoặc tròn) dài tới 1,5 cm và rộng tới 1 cm
(S. polyrrhiza, L. trisulca). Loài nhỏ nhất có cánh đạt kích thước 3 mm ở điều kiện tối
ưu. Ở điều kiện thường có thể nhỏ hơn 1 mm (Wolffia). Kích thước và hình dạng của
cánh bèo phụ thuộc nhiều vào các điều kiện bên ngoài và kiểu gen của chúng. Các
yếu tố ngoại cảnh này bao gồm: ánh sáng, hàm lượng đường, hàm lượng nitơ,
phospho, kali, canxi và magie, nhiệt độ…(Landolt, 1986).
Đặc điểm rễ bèo: Kích thước và số lượng rễ trên 1 cánh bèo ở các loài bèo
tấm không giống nhau và phụ thuộc vào từng loài. Đa số các loài thuộc họ Lemna chỉ
có một rễ, S. polyrrhiza có từ 7-12 rễ hoặc nhiều hơn và có thể dài đến 10 mm,
Landoltia có 2-3 rễ và có thể lên đến 5 rễ với chiều dài tối đa có thể đạt được là 6 mm.
Ngoại trừ điều kiện khắc nghiệt, trong điều kiện thiếu nitơ, phosphate hay các chất
khoáng, rễ sẽ dài hơn. Trong khi đó, trong môi trường dinh dưỡng thuận lợi, rễ ngắn
hơn và thậm chí có loại không hình thành rễ. Cấu trúc rễ của bèo tấm cũng hết sức
đơn giản, không có các rễ con và không phản ánh sự tăng trưởng cũng như sự tạo
nhánh. Vì lẽ đó, rễ của bèo tấm rất mảnh và nhỏ. Cũng giống như các loại rễ phổ biến
khác, rễ bèo tấm có cấu tạo gồm 4 phần chính: Đỉnh rễ (root cap), vùng mô phân sinh
(meristematic region), vùng kéo dài (elongation zone), và vùng các tế bào thuần thục
(zone of mature cells).
Hoa và quả bèo: Hoa của các loài bèo tấm đã được nghiên cứu tương đối kĩ.
Chúng thường hình thành và tồn tại trong thời gian ngắn và hiếm khi được quan sát
thấy. Hoa của các loài bèo có thể hình thành trong thời gian ngắn hay dài khác nhau

tuỳ thuộc vào loài. Mỗi hoa thường có 2 nhị hoa và 1 vòi nhụy hoa duy nhất. Các
nhụy hoa thường ngắn và khó quan sát hơn. Quả của bèo tấm đa phần là nhỏ, có lớp
vỏ ngoài khô, một số trong đó có thể được quan sát thấy bằng mắt thường. Quả bèo
thường có dạng như một túi có răng cưa, đôi khi có dạng dọc hơi phẳng, và thường
chứa từ 1-6 hạt. Hình 2.2 thể hiện một số đặc điểm của hoa bèo tấm.
2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài
13
Hình 2.2. Hoa của loài bèo Lemna gibba
Cây phân loại bèo tấm
Theo Landolt, 1986, bèo tấm thuộc giới thực vật, ngành Magnoliophyta, lớp
Liliopsida, bộ Arales, họ Lemnaceae gồm các chi Lemna, Spirodela, Wolffia,
Woffiela với trên 40 loài khác nhau.
Hình 2.3. Cây phân loại bèo tấm theo Landolt, 1986
Ông đã phân loại bèo tấm dựa trên số rễ và kích thước của cánh bèo: Lemna (1
rễ); Spirodela (7-12 rễ; cánh bèo từ 10 mm trở lên); Landoltia (2-3 rễ, cánh bèo 3-6
mm); Wolffia (không có rễ, cánh bèo 0,6-1,2 mm)…
Năm 2002, Les và cộng sự đã dựa trên đặc điểm về hình thái nhiễm sắc thể và
vi phân tử (DNA của nhân và lục lạp) đề ra giả thiết về cây phân loại của bèo tấm
gồm 5 chi tức là có thêm một chi mới là Landoltia.
Một số nghiên cứu gần đây của Rothwell và cộng sự, 2004, dựa trên sự so
sánh trình tự đoạn intron tRNA
Leu
UAA (trnL) và tRNA
Phe
UAA (trnF) của bộ gen lục
lạp đã xác định rằng họ Lemnaceae và Pisita cùng thuộc họ ráy Araceae. Hình 2.3
biểu thị cây phân loại bèo tấm.
Hình thức sinh sản của bèo tấm: Bèo tấm có hai phương thức sinh sản để
duy trì nòi giống: Sinh sản hữu tính và sinh sản vô tính. Sinh sản vô tính chiếm ưu thế