Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm dịch chiết lá tía tô giàu axit rosmarinic để ứng dụng trong sản xuất đồ uống chức năng

BỘ CÔNG THƯƠNG
VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM







BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP BỘ





ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM DỊCH CHIẾT LÁ TÍA TÔ
GIÀU AXÍT ROSMARINIC ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT ĐỒ UỐNG CHỨC
NĂNG



Cơ quan chủ trì: VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
Chủ Nhiệm đề tài : ThS. Trần Hoàng Quyên

8798


Hà Nội - 12/2010




1
KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ABS: Độ hấp thụ ánh sáng
BVTV: Bảo vệ thực vật
EtOAC: Ethyl acetate
PA: Perilla aldehyte
RA: Axít rosmarinic
SS/A: Đường/Axít (Sugar/acid)

2
TÓM TẮT NHIỆM VỤ
1. Mục tiêu của đề tài:
Xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất dịch chiết lá tía tô giàu axít
rosmarinic để ứng dụng sản xuất đồ uống chức năng
2. Nội dung nghiên cứu:
- Nghiên cứu lựa chọn nguồn nguyên liệu lá tía tô tại Việt Nam giàu axít

rosmarinic và phương pháp xử lý nguyên liệu
- Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm dịch chiế
t lá tía tô
giàu axít rosmarinic
- Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn cơ sở chế phẩm dịch chiết lá tía tô giàu
axít rosmarinic
- Ứng dụng chế phẩm dịch chiết lá tía tô giàu axít rosmarinic để sản
xuất thử đồ uống chức năng giàu axít rosmarinic
3. Phương pháp nghiên cứu và kết quả đạt được
3.1. Phương pháp nghiên cứu:
- Thu thập và sử dụng các phương pháp phân tích hóa lý đánh giá thành
phần, đặc biệt thành phần RA của các m
ẫu lá tía tô từ các địa phương
lân cận Hà Nội
- Các phương pháp vật lý, hóa học để xử lý nguyên liệu lá tía tô
- Sử dụng công nghệ trích ly để tách chiết RA trong lá tía tô
- Sử dụng các biện pháp hóa lý để nâng cao hàm lượng RA trong dịch
chiết lên 10%
- Sử dụng các biện pháp công nghệ để thu hồi dịch chiết từ lá tía tô tươi
để làm nguyên liệu sản xuất đồ uống từ lá tía tô.
- Nghiên cứu s
ản xuất sản phẩm đồ uống từ lá tía có hàm lượng RA
0,05%
- Sử dụng các phương pháp phân tích hóa lý để đánh giá các chỉ tiêu
chất lượng sản phẩm
- Sử dụng các phép thử cảm quan để đánh giá chất lượng sản phẩm và
- thăm dò thị hiếu người tiêu dùng
3.2. Kết quả đạt được;
- Lựa chọn được nguyên liệu lá tía tô sạch, có hàm lượng RA cao
-

Có được các thông số cho quá trình xử lý thu nguyên liệu bột lá độ ẩm
5%.
- Có quy trình công nghệ chiết tách, thu hồi và cô đặc dịch chiết lá tía tô
đạt đến hàm lượng RA 10%
- Sản xuất thử nghiệm 5 lít dịch chiết từ lá tía tô có hàm lượng RA 10%
- Có dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm dịch chiết lá tía tô có hàm
lượng RA đạt 10%
- Có quy trình công nghệ sản xuất đồ uống từ lá tía tô có hàm lượng RA
đạt 0,05%
- Có đánh giá thị hiếu và ước tính giá thành sản phẩm

3
MỞ ĐẦU
RA (Rosmarinic axít) là một hoạt chất sinh học quan trọng trong công
nghiệp dược phẩm và công nghiệp thực phẩm. Từ những nghiên cứu ban đầu
vào năm 1958 về cấu trúc, con đường sinh tổng hợp cũng như hoạt tính sinh học
của hợp chất, đến ngày nay con người đã thu được khá nhiều hiểu biết có ý
nghĩa trong công nghệ sinh tổng hợp, chiết tách, thu hồi, và ứng dụng RA trong
công nghiệp thực ph
ẩm, dược phẩm. Rosmarinic axít (RA), có công thức hóa
học là C
18
H
16
O
8
, là một hợp chất có bản chất là polyphenol có khả năng kháng
khuẩn, chống viêm, kháng virus, chống oxy hóa, chống dị ứng, viêm khớp, hen
suyễn…và một số nghiên cứu bước đầu cho thấy nó có tác dụng trong điều trị
bệnh Alzheimer. Trong công nghiệp thực phẩm, RA là thành phần có vai trò

ngăn ngừa và hỗ trợ chữa dị ứng, viêm loét dạ dày, là chất bảo quản tự nhiên,
chất chống ôxi hóa có thể kéo dài thời gian bảo quả
n hải sản tươi sống, một số
sản phẩm lên men, là gia vị cần thiết trong nhiều món ăn của các nước Châu Á
như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc…và Việt Nam.
RA được tìm thấy với một hàm lượng đáng kể trong họ thực vật
Boraginaceae, trong phân họ Nepetoideae của họ Lamiaceae. Ngoài ra, RA cũng
được tìm thấy ở các họ thực vật khác như trong các cây thuộc họ Blechnoceae
(Hausler và cộ
ng sự, 1992), các thực vật bậc thấp như rêu (Takeda và cộng sự
1990) và trong loại Monocotyledonous thí dụ như cỏ biển thuộc họ Zosteraceae
và gần đây RA được phát hiện có trong họ Potamogetonaceae (Petersen) và họ
Cannaceae. Các loại thực vật có hàm lượng RA đáng kể là Origanum vulgare
(họ bạc hà); Rosmariunus oficinalis (họ hương thảo), Salvia oficinalis (họ xô
thơm), Melissa officinalis (họ húng chanh) và Perilla frutescems (họ tía tô). [21]
Perilla fruiescems hay tía tô là một cây gia v
ị và cũng là một loại cây thuốc
được trồng phổ biến tại Việt Nam. Cây tía tô phù hợp với nhiều vùng khí hậu,
địa hình khác nhau. Với sự phổ biến của tía tô cùng với hàm lượng đáng kể RA
có mặt trong các bộ phận của cây, tía tô là một nguồn nguyên liệu tiềm năng để
tách chiết RA ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và công nghiệp thực
phẩm. Nhằm mục đích tạo ra sản ph
ẩm đồ uống thảo dược mới có giá trị kinh tế,
có tác dụng tốt cho sức khỏe người tiêu dùng, phù hợp với thị hiếu và xu hướng
chiến lược của thị trường đồ uống, Trung tâm Thực nghiệm sản xuất và chuyển
giao công nghệ – Viện CNTP tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu công
nghệ sản xuất chế phẩm dịch chiết lá tía tô giàu axít rosmarinic để ứng dụng
trong sản xuấ
t đồ uống chức năng” với mục tiêu: Xây dựng được quy trình
công nghệ sản xuất dịch chiết lá tía tô giàu axít rosmarinic để ứng dụng sản xuất

đồ uống chức năng.

4
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về axít rosmarinic: [27]
RA thường có mặt trong rất nhiều các loại thực vật như: các cây thuộc
loài Boraginaceae, họ Lamiaceae, phân họ Nepetoideae; dương xỉ thuộc họ
Blenchnaceae; một số thực vật bậc thấp như rêu sừng (Takeda và cộng sự, 1990)
và trong cây một lá mầm như cỏ biển họ Zosteraceae ; họ Potamogetonaceae (
họ Cannaceae
Simmonds và cộng sự, phát hiện). Sự phân bố này cho thấy sự có
mặt khá vphổ biến của RA trong thực vật.
1.1.1. Thành phần cấu tạo:
Rosmarinic axít (RA), có công thức hóa học là C
18
H
16
O
8
, là một hợp chất
polyphenol. Dẫn xuất của RA thường là hợp chất tự nhiên chứa một hoặc hai
phần tử RA cộng thêm thành phần chất thơm khác nhau được xác định từ các
loài thực vật bậc cao hơn. Dẫn xuất của RA được biết đến nhiều nhất có lẽ là
lithospermic axít, là liên kết của RA và cafeic axít; và lithospermic axít B, một
RA nhị phân (Kelley và cộng sự, 1975; Tanaka và cộng sự, 1989).

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của axít rosmarinic

5
1.1.2. Các tính chất vật lý, hóa học:
RA là ester của axit caffeic với R -(+)-3-(3,4-dihydroxylphenyl)lactic
axít. Ở dạng tinh thể, nó là một chất bột màu đỏ cam, tan tốt trong các dung môi
hữu cơ phân cực. RA có khối lượng phân tử là 360,31 g/mol; điểm nóng chảy là
171 – 175
0
C.
1.1.3. Các tính chất chức năng: [28], [29]
Hai tính chất chức năng nổi bật của RA là chống ôxi hóa và kháng khuẩn.
Tính chất chống ôxi hóa của RA đã được biết đến từ khá lâu cùng với hệ các
axít cinimic – một nhóm chất có tính chất polyphenol. Một số nghiên cứu trong
phòng thí nghiệm đã chứng minh axit rosmarinic có hoạt tính chống oxy hóa cực
mạnh, có khả năng chống lại quá trình peroxy hóa nguy hiểm của màng sinh
học. So với axit cafeic và các d
ẫn xuất khác có cùng bản chất, axit rosmarinic là
một trong những chất ức chế mạnh phản ứng 1,1 diphenyl 2 picrylhydrazyl
(DPPH).
Ở hàm lượng 15 mg/l - 25 mg/l dung dịch RA có khả năng diệt khuẩn
cao. Axit rosmarinic cung cấp hoạt chất có khả năng kháng khuẩn đáng chú ý
đối với Bacillus subtilis, Microccocus luteus và E.Coli. Hợp chất này cũng được
xem như có hiệu quả trong việc giảm viêm nướu và mảng bám như chất chống
oxy hóa và chống viêm tổng hợ
p chống ebselen (2 phenyl 1, 2 benzisoselenazol
3 (2H)- one) khi được điều trị tại chỗ. Hoạt tính kháng khuẩn và giảm viêm của
RA cũng là lý tưởng đối với các nhiễm trùng da tại chỗ của biểu bì và niêm mạc
miệng.

1.1.4. Công nghệ sản xuất axít rosmarinic: [5], [8], [11], [23],
RA có thể được tổng hợp bằng phương pháp hóa học từ các thành phần
cấu tạo: axít caffeic và 3,4 dihydroxylphenyllactic axít, hoặc
được chiết tách từ
thực vật giàu RA. Từ trước khi cấu trúc hóa học của RA được xác định, hợp
chất này cũng như các dẫn xuất đã được biết đến như là labiatengerbstoffe, một
loại tannin thuộc họ Lamiaceae. Hợp chất này được mô tả là catechin cô đặc
hoặc gallo hay ellagitannin, nhưng có chứa caffeic axít. Ngay sau đó, hai nhà
hóa học người Italia là Scarpati và Oriente (1958) đã lần đầu phân định được RA
tinh khiết và đặt tên theo tên loại th
ực vật đã được họ sử dụng là Rosmarinus
officinalis. Kết quả cho thấy RA là hợp chất của một ester của axit caffeic và
3,4 dihydroxylphenyllactic axít (Scarpati và Oriente, 1958). Những nghiên cứu
về gen bắt đầu vào năm 1970 khi Ellis và Towers phân tích amino axít của cây
bạc hà và thấy rằng hai amino axít thơm là phenylalanine và tyrosine được

6
chuyển hóa thành RA. Đồng thời các nghiên cứu cũng cho thấy, caffeic axít
được hình thành từ phenylalanine và 3,4-dihydroxyphenyl lactic axít hình thành
từ tyrosine ( Ellis và Tower, 1970). Kết quả này được lặp lại trong nhiều thí
nghiệm tương tự trên môi trường là cây thuộc họ Coleus Blumei ( Razzaque và
Ellis, 1977). Quá trình tổng hợp hóa học RA được bắt đầu nghiên cứu từ rất lâu
và chỉ mới có một số kết quả được ghi nhận vào năm 1991 bởi Albrecht
(Zinsmeister và cộng sự, 1991). Kể từ đó, một số
RA và dẫn xuất đã được tổng
hợp bằng phương pháp hóa học thí dụ như methyl ester, một loại stereoisomers
khác hoặc một số ít là hydroxylated isorinic axít (Matsuno và cộng sự, 2002).
a. Cơ chế sinh tổng hợp axit rosmarinic. [26], [27]
Một số enzyme được cho là ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp RA:
CoA-ligase, CoA-thioester, D-lactate dehydrogenase hay cụ thể hơn là D-

hydroxyisocaproate dehydrogenase. Phenylalanine được chuyển hóa thành dạng
hydroxylcinnamic axít hoạt động bởi enzyme theo con đường cơ bả
n là
phenylpropanoid được biết từ các quá trình sinh tổng hợp khác, thí dụ như
flavonoid hoặc lignin. Sự tích lũy xảy ra lên tới 21% RA trên tổng trọng lượng
khô của tế bào chỉ trong mười ngày nuôi cấy trên môi trường B5 có hàm lượng
sucrose cao (Ulbrich và cộng sự, 1985; Petersen và cộng sự, 1994).
Nuôi cấy tế bào thực vật.

Nghiên cứu của Llieva và Pavlov, 1997: nồng độ đường trong môi trường dinh
dưỡng có ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào và sự tích lũy rosmarinic axit của
Lavandula.vera. Kết quả thí nghiệm chỉ ra môi trường nuôi cấy với nồng độ
đường 7% tốt nhất cho sự phát triển và tích lũy rosmarinic axit trong tế bào loại
cây này.
Nghiên cứu của Karam và cộng sự, 2003 về sự tích lũy rosmarinic axit trong mô
sẹo, tế bào nuôi cấy trên môi trường đặc và rễ cây của Salvia. Fruticosa. Ti
ến
hành nuôi cấy tế bào tạo mô sẹo, mầm từ lá cây trong môi trường MS chứa
thidiazuron (TDZ) với các nồng độ khác nhau và indole 3-acetic acid (IAA) ( 0
hoặc 3µM). Kết quả sau 5 tuần là mô sẹo phát triển tốt nhất với hiệu suất tích
lũy rosmarinic axit cao ( 2,12mg/100 mg trọng lượng khô).
Nghiên cứu của Xu và cộng sự, 2008: nuôi cấy mô sẹo và nuôi cấy tế bào trên
môi trường đặc Agastache rugosa cho kết quả: trên môi trường dung dịch B5 bổ
sung 2mg/l 2,4-D và 0,1mg/l BAP sau 10 ngày tế bào phát triển tốt nhất với hàm
lượng rosmarinic axit tích lũy cao nhất là 11,5mg/g.


7
Nuôi cấy mô mầm.
Nghiên cứu của Eguchi và cộng sự, 1996: Nhân dòng vô tính tế bào của

Lamiaceae từ nhiều mô mầm bằng 1mg/l benzylaminopurine trên môi trường
MS chuẩn có 3% đường. Dưới điều kiện này, 7-10 mô mầm được cấy truyền để
tiến hành tái nhân bản. Sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường MS chứa hormone
tự do cho thấy Pseudomonas sp gián tiếp kích thích sản xuất phenolic và
rosmarinic axit trong mô mầm.
Xử lý bằng chất mồi sinh học
. một số nghiên cứu đã tiến hành tổng hợp
rosmarinic axit sử dụng chất mồi như: dimethyl sulfoxide (DMSO) với các nồng
độ, pythium aphanidermatum hoặc với methyl jassmonate kết hợp với bổ sung
cao dịch chiết cao nấm men đậm đặc với tỉ lệ 4-6 g/l cho kết quả lượng axít
rosmarinic lượng thu được tăng từ 5-7 lần so với mẫu đối chứng.
b. Thu hồi axít rosmarinic từ nguồn thực vật: [7
], [5], [27],
Bên cạnh xu hướng công nghệ đang được nghiên cứu là tạo giống thực
vật có khả năng sinh hàm lượng RA cao bằng công nghệ sinh học, hoặc sử dụng
các tế bào thực vật để sinh tổng hợp RA, phương pháp thu nhận RA phổ biến
nhất hiện nay đang được sử dụng là sử dụng dung môi trích ly RA từ nguồn thực
vật.
Các nguồn thự
c vật có hàm lượng RA cao thường được sử dụng làm
nguyên liệu sản xuất RA là: cây húng chanh (balm), cây hương nhu, … Các
dung môi thường được sử dụng là etanol, metanol, propanol và nước tùy theo
mục đích sử dụng và yêu cầu của sản phẩm.
Chiết tách và tinh sạch RA: Wang, Provan và Helliwell, 2004; Yilmaz và
Toledo, 2004: sử dụng dung môi hữu cơ để chiết tách các hợp chất phenolic bao
gồm cả rosmarinic axit trong thực vật.
Ammann, Hinz, Addleman, Wai và Wenclawiak, 1998; Seidel, 2006: sử
dụng chưng cất lôi cuốn hơi nước và carbone dioxide siêu tớ
i hạn ( SC- CO2) để
chiết tách rosmarinic axit từ thực vật. Phương pháp này có hạn chế do chưng cất

lôi cuốn hơi nước làm oxy hóa polyphenolic do nhiệt độ sử dụng chiết tách cao;
SC-CO2 có tính kỵ nước cao nên việc chiết tách polyphenolic gặp khó khăn.
Boyadzhiev và Dimitrova, 2006: sử dụng lọc màng để cô đặc chọn lọc
rosmarinic axit từ dịch chiết của húng chanh.
Christ và Kesselring, 1981: húng chanh được chiết với nước, dịch chiết
sau đó kết tủa bằng HCl và trích ly s
ử dụng di-isopropylether sau đó kết tinh.

8
Bruno Zelic và cộng sự, 2004: thu hồi và tinh chế rosmarinic axit từ
hương thảo sử dụng phương pháp thẩm tích điện từ. Tuy nhiên, phương pháp
này được đánh giá là chưa thích hợp khi sử dụng để thu hồi và tinh chế
rosmarinic axit từ cả dung dịch nước và chất khô của hương thảo. Nguyên nhân
chính là do sự cân bằng hằng số phân ly cho rosmarinic axit thấp nên độ dẫn
điện thấp.
Kumaran và Karunakaran, 2007: tinh sạch rosmarinic axit từ Coleus
aromaticus sử dụng nh
ựa Sepadex LH -20, rửa giải bằng nước, sau đó cô đặc
trong methanol và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của rosmarinic axit thu
được.
Kim, Lee, Shin và Hug, 1999: chiết xuất rosmarinic axit từ Agastache
rugosa được tinh chế bằng nhựa Sephadex LH 20, rửa giải bằng nước.
Elena Kovacheva, Milen Georgiev và cộng sự, 2004: tinh sạch dịch chiết
rosmarinic axit từ sinh khối tế bào Lavandula vera. Thí nghiệm được tiến hành
hấp phụ trên các loại nhựa Amberlite XAD khác nhau và trích ly bằng
ethylacetate. Mẫu tiến hành hấp phụ trên Amberllite XAD -7 và rửa giải bằng
ethanol 80% có 29,8% là rosmarinic axit, độ tinh sạch cao hơn 7,7 lần so với
mẫu đối chứng. Độ tinh sạch của mẫu cao hơn đối chứng 18,7 lần khi chiết bằng
ethylacetate. Kết tủa rosmarinic axit dưới dạng Canxi rosmarinate cho kết quả
tốt.

Kyoung Heon Kim và cộng sự, 2009: trích ly lá húng chanh ( Melissa
oficinalis) bằng methanol sử dụng phương pháp hấp phụ bề mặt. Dịch chiết
rosmarinic axit sau đó chạy qua cột nhồi Sephadex LH -20 và rửa giải bằng
methanol 100%. Rosmarinic axit thu được có độ tinh khi
ết là 38,8%, tăng 3,1
lần so với mẫu đối chứng, hiệu suất là 43,8%.
Một số xu hướng mới trong nghiên cứu sản xuất RA là:
- Ứng dụng công nghệ sinh học tạo ra các giống thực vật có hàm lượng RA
cao, hoặc sinh tổng hợp RA bằng phương pháp nuôi cấy tế bào.
- Chiết tách RA từ thực vật sau đó dùng công nghệ cao: lọc màng, hoặc điện
phân có màng ngăn thu RA
- Chuyển RA thành các dạ
ng dẫn xuất có hoạt tính cao hơn như rosmarinyl
glucoside với khả năng chống ôxi hóa cao hơn nhiều lần.




9
1.1.5. Một số ứng dụng của axít rosmarinic trong y tế và thực phẩm chức
năng: [14], [23], [27], [29]
Vai trò của axit rosmarinic trong các chế phẩm chống oxy hóa đã được
khá nhiều nghiên cứu đề cập đến. Axít rosmarinic thuộc nhóm polyphenols có
tác dụng chống o xy hóa và kháng khuẩn. Theo nghiên cứu của Đại học bang
Michigan Hoa Kỳ, hợp chất axit rosmarinic có hoạt tính chống oxy hóa tốt ở
nồng độ 10 microM. Các tác dụng ch
ống oxy hóa của axit rosmarinic mạnh hơn
so với vitamin E. Axít rosmarinic giúp ngăn ngừa các thiệt hại gây ra bởi các
gốc tự do của tế bào, do đó làm giảm nguy cơ ung thư và xơ vữa động mạch.
RA có một số hoạt tính sinh học chính là chống oxy hóa, kháng khuẩn,

kháng virus ( Parnham và Kesslring, 1985). RA từ dịch chiết của cây thuộc họ
bạc hà được sử dụng trong điều trị các bệnh liên quan đến nhiễm vi rút Herpes.
Khả năng chống viêm củ
a rosmarinic do tác dụng ứng chế enzyme lipoxygenase
và cyclooxygenase của dung dịch có mặt RA (Parnham và Kesselring, 1985).
Khi được truyền tĩnh mạch, RA nhanh chóng bị loại bỏ khỏi dòng máu lưu
thông, gây độc rất thấp khi thử nghiệm trên chuột. RA thường được dùng để hỗ
trợ điều trị viêm loét dạ dày tá tràng, viêm khớp, ung thư, đục thủy tinh tế, viêm
khớp dạng thấp, dị ứng và bệnh hen phế quản
Khả năng chống oxy hóa củ
a RA đã được chứng minh mạnh hơn so với
vitamin E. RA giúp ngăn ngừa sự tổn thương tế bào gây ra bởi các gốc tự do, do
đó làm giảm nguy cơ ung thư và xơ vữa động mạch. Hợp chất này còn có thể
ngăn ngừa sự phát triển của các tế bào u bướu cũng như có khả năng chống oxy
hóa tốt, có tiềm năng lớn trong việc ứng dụng vào công nghiệp hóa mỹ phẩm.
D
ịch chiết từ tía tô, giàu axit rosmarinic qua những thử nghiệm lâm sàng
(Sangongi và cộng sự, 2004) đã cho thấy uống RA can thiệp hiệu quả đối với
bệnh nhân bị hen suyễn dị ứng. Youn J và cộng sự (2003) cũng đã chứng minh
RA ức chế sự viêm màng hoạt dịch ở chuột, do đó có lợi cho việc điều trị bệnh
viêm khớp dạng thấp. Không giống như các thuốc kháng histamine khác, RA
ngăn cả
n sự kích hoạt tế bào miễn dịch đáp ứng thường gây sưng và hình thành
các chất lỏng.
RA cũng thường được sử dụng để bảo quản thực phẩm do nó có đặc tính
chống ôxi hóa và kháng khuẩn. Với đặc tính chống ôxi hóa, RA có tác dụng hỗ
trợ chống mất màu, hương vị của sản phẩm trong quá trình chế biến và tàng trữ.

10
1.2. Tổng quan về cây tía tô: [1],[2] [11], [16], [20], [21], [22], [23], [25]
Tía tô hay còn được gọi là é tía, tử tô, xích tô, perilla, purple, common
perilla, pérille…tía tô có danh pháp khoa học là Perilla frutescens thuộc giới
Plantae, bộ Lamiales, họ Lamiaceae, phân họ Nepetoideae, bộ Elsholtzieae, chi
Perilla. [1],[2]
Tía tô là một trong những cây gia vị được trồng rộng rãi và sử
dụng đại
trà ở Châu Á, đặc biệt là Đông Á, rau tía tô được xem như một loại gia vị không
thể thiếu trong nhiều món ăn truyền thống ở Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản,
Hàn Quốc, Việt Nam, Tía tô còn là một cây nguyên liệu quan trọng để lấy dầu
cũng như là một loại dược liệu cổ truyền có nhiều tác dụng hữu ích, đặc biệt là
nên y học cổ truyền Trung Quố
c, Ấn Độ và Nhật Bản. [20], [21], [22]
Có 4 loại chính gồm:
- Perilla frutescens var. crispa
- Perilla frutescens var. frutescens
- Perilla frutescens var. hirtella
- Perilla frutescens var. purpurascens.
Dựa trên mục đích sử dụng, tía tô được chia thành hai loại chính là Perilla
frutescens var. frutescens thường được trồng để lấy dầu thường có hạt lớn và
mềm và Perilla frutescens var. crispa được dùng để làm thuốc trong y học cổ

truyền, thân có nhiều nhánh nhỏ, hạt nhỏ và cứng.[1]


Hình 1.2 Perilla frutescens var. Frutescens Hình 1.3: Perilla frutescens var. crispa

1.2.1. Đặc điểm thực vật, sinh thái:
Cây tía tô có một số đặc điểm chính như sau [1], [2] :

- Cây nhỏ, cao 0,5 – 1 mét. Thân vuông, mọc đứng, phân cành nhiều, có
rãnh dọc và có lông.Lá mọc đối, hình bầu dục, dài 2 – 3 cm gốc tròn, dầu

11
nhọn, mép khía răng và uốn lượn, mặt trên xanh lục, ở dưới màu tía, có
khi cả hai mặt đều tía có lông; cuống lá dài. Khi vò ra, lá có mùi thơm đặc
biệt.
- Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành, dài 6 – 20 cm; lá bắc hình mác, dài
hơn hoa; hoa nhỏ, màu trắng hay tím; đài hình chuông
- Quả ( hạt) hạch nhỏ, hình cầu, đường kính dao động từ 1,11mm tới 2,47
mm, trung bình là 1,68mm.

Hình 1.4: Tía tô
1. Đoạn cành mang lá và hoa; 2. Hoa; 3. Quả; 4. Hạt
Tía tô là cây mọc hằng năm, gieo hạt sau lập xuân (tháng 1 - 2) với 20 - 30
kg/ha hạt giống, tháng 3 - 4 đã hái được lá lần đầu, bón phân tưới nước để hái
thêm 2 - 3 lần, mùa hoa, quả chính là tháng 5- tháng 8.
Dựa trên những đặc điểm về màu lá, mùi hương, độ cứng và kích thước của hạt,
người ta thường chia tía tô thành các nhóm [2]:
- Loại tía tô lá màu xanh, hạt cứng,không có terpenoid của perillaldehyde
(PA) là chất tạo nên mùi thơm dễ chịu của tía tô, có mặt trong dầu thơm
của tía tô. Loạ
i tía tô này có kích thước hạt lớn, thường được trồng để lấy
dầu.
- Loại tía tô lá màu xanh, không có PA, hạt mềm, kích thước lớn, được
dùng để lấy dầu
- Loại tía tô lá đỏ, có PA, hạt cứng, kích thước nhỏ, được trồng để làm
thuốc và làm gia vị
- Loại tía tô lá đỏ, không có PA, hạt cứng, được trồng để làm thuốc và làm
gia vị.

- Loại tía tô lá xanh, có PA, hạt cứng, được tr
ồng để làm thuốc và làm gia
vị.

12
1.2.2. Vùng trồng và sản lượng: [20], [21], [22],
Tía tô được phân bố dọc theo dãy Hymalaya của Ấn độ, Bhutan, Pakistan
và Nepal, phía bắc Đông Nam Á như Campuchia, Lào, Myanmar, Thái Lan,
Việt Nam; Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và Đài Loan. Gần đây, tía tô được
đưa vào Châu Âu, Nga và Mỹ như một loại cây lấy dầu hoặc cây gia vị trồng
trong vườn. Tía tô được sử dụng như một loại hương liệu trong chế bi
ến thực
phẩm, là nguồn nguyên liệu ép dầu, là nguồn dược liệu quý trong điều trị một số
bệnh như hen suyễn, cảm, viêm khớp, dị ứng…
Tía tô được ghi nhận lần đầu trong thư tịch cổ của Trung Quốc vào thế kỷ
thứ 5- thứ 6 [4], là cây ưa sáng và ưa ẩm, thích nghi với những vùng khí hậu ôn
hòa, nhiệt độ trung bình từ 18 -25
0
C. Loại cây này mọc chủ yếu ở vùng khí hậu
ôn hòa, có nguồn gốc từ vùng núi Ấn Độ và Trung Quốc, sau được nhân trồng ở
nhiều nơi trên Thế giới ở cả Châu Á, Châu Âu và Châu Mỹ. Tại Châu Á, tía tô
được trồng hoặc mọc hoang ở vĩ độ chủ yếu từ 36 đến 42 độ vĩ bắc đối với cây
lấy dầu và được trồng hoặc mọc hoang trên núi cao đối với cây dùng làm thuốc.
Các qu
ốc gia trồng nhiều loại cây này là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài
Loan, Ấn Độ, Nepal, Pakistan, Campuchia, Lào, Myanmar, Thái Lan và Việt
Nam. [20], [21], [22], [25]
Tại Nhật Bản, tía tô được trồng chủ yếu ở tỉnh Hokkai, Miyagi, Fukushima,
Nagano, Tokyo, Shiga, Osaka, Nara, Hiroshima, Kyoto, Nagasaki, Wakayama,
Kochi, Fukuoka, và Okinawa. Sản lượng tía tô hàng năm tại Nhật là 10.000 tấn.

Người Nhật thường gọi tía tô là aojiso, aobam hoặc aoshiso. Nó thường
được dùng để ăn với món sashimi, một món ăn truyền th
ống từ hải sản của Nhật,
cũng như thường được dùng như một loại rau gia vị trong salad, mì ống, thịt và
các món ăn từ cá khác. Năm 2009, hãng Pepsi tại Nhật Bản đã cho ra một loại
nước giải khát mang hương vị tía tô là pepsi tía tô. Trong y học cổ truyền Nhật
Bản, tía tô được sử dụng như một hoạt chất chữa bệnh dị ứng, hen suyễn do dị
ứng, viêm khớ
p và bước đầu ứng dụng để điều trị bệnh alzheimer. [22]
Tại Hàn Quốc, tía tô được trồng chủ yếu ở các tỉnh Kangwon, Kyonggi,
Kyongsangbuk, Chungchongnam, Chungchongbuk, Chollanam và Jeju. Diện
tích trồng năm 1001 tại Hàn Quốc là 40.800 ha, số lượng hạt giống thu được là
770kg/ha, sản lượng đạt gấp đôi năm 1993. Ngoài những ứng dụng trong y học,
trong thực phẩm, tía tô được sử dụng như một loại cây l
ấy dầu và cây gia vị.
Dầu từ tía tô được sử dụng phổ biến tương tự dầu mè trong chế biến thực phẩm.
Hạt tía tô được dùng sau khi nấu chín trong bữa ăn, trong đồ nướng cũng như

13
dùng làm thành phần tăng hương vị của đồ ăn cùng với vừng và muối. Tía tô
được dùng như một trong những thành phần không thể thiếu trong ẩm thực Hàn
Quốc. [22]
Tại Trung Quốc, tía tô được trồng nhiều ở các tỉnh Yunnan, Zheng Ning,
Guangdong và Guangxi. Diện tích trồng hàng năm chỉ riêng tại tỉnh Zheng
Ning là 110.000 ha với sản lượng hàng năm trên 10.000 tấn.Tại nước này, tía tô
là một loại dược thảo cổ truyề
n trị cảm, nhức mỏi, ho suyễn và tạo hưng phấn.
Nó cũng là loại gia vị dân dã được sử dụng hết sức phổ biến trong điều chế
thuốc đông y cũng như chế biến và bảo quản thực phẩm.
Tại Việt Nam, tía tô là một loại cây gia vị quen thuộc được sử dụng trong

chế biến thực phẩm, trong trang trí món ăn hoặc ăn sống. T
ại Việt Nam, theo Vũ
Xuân Phương [2000], tía tô gồm nhiều giống khác nhau, mọc tự nhiên và được
trồng ở nhiều nơi khắp cả nước nhưng tập trung nhiều ở các tỉnh miền núi phía
Bắc như Lào Cai, Lạng Sơn, Hòa Bình… , ở miền Nam, tía tô được trồng nhiều
ở Bình Chánh, Củ Chi, Hóc Môn. Ở miền Bắc, do nhu cầu sử dụng tía tô làm gia
vị, cây được trồng quanh năm ở các vùng ngoại thành như Đông Dư
( Gia
Lâm); Hoàng Liệt ( Thanh trì); Duyên Hà (Thanh Trì), Hà An ( Giang Biên,
Long Biên); Vân Nội ( Hà Nội )…

1.2.3. Thành phần hóa học và hàm lượng axít rosmarinic trong lá tía tô: [1],
[2], [11]
Tía tô chứa 0,3 – 0,5% tinh dầu (theo trọng lượng khô) có các chỉ số sau:
d
20
– 0,990; n
20
d
- 1,4865; [α]
20
d
- 74; chỉ số axít2,64; chỉ số xà phòng 78,01; chỉ
số este 75,32. Hàm lượng citral 20% (The Wealth of India vol VII 1966, 311,
312). Hạt tía tô chứa nước 6,3%, protein 23,12%, dầu béo 45,07%, N 10,28%,
sợi 10,28%, tro 4,64, axítnicotinic 3,98 mg/100g. Ngoài ra còn có các chất có
hoạt tính chống oxy hóa. Thành phần protein trong hạt tía tô gồm : 16g arinin
14,8; histidin 2,5; leucin 0,3; isoleusin 4,3; lysin 4,4; methionin 1,4;
phenylalanin 5,1; threonin 3,0 và valin 6,0.
Thành phần hóa học của tía tô bao gồm các chất bay hơi, chất màu và một

số thành phần khác có hoạt tính sinh học. Các chất này bao gồm terpenoid,
phenol, flavonoid, cyanogenic glycosides và anthocyanin. Trong vài năm gần
đây, các nhà khoa học đã xác định được trong tía tô có khoảng 20 loại glycoside
khác nhau với 9 loạ
i mới khám phá ra. Thêm vào đó, tác dụng ức chế của

14
perillosides A và C và gần đây là monoterpene glucoside trên đường 5 cacbon
tồn dư và mối quan hệ với cấu trúc động của chúng cũng đã được chứng minh.
Bằng các phương pháp phân tích hiên đại được ứng dụng gần đây trong
phân tích hóa học như GC, TLC, HPLC, IR, UV, MS , NMR, các hợp chất có
trong tía tô được chia thành hai nhóm thành phần chính là chất bay hơi và chất
không bay hơi. Nhóm hợp chất không bay hơi được chia thành năm nhóm gồm
terpenid, phenolic, flavonoid glycosides và các thành phần khác. Thành phần
bay hơi trong lá tía tô được tách bằng phương pháp chư
ng cất lôi cuốn hơi nước.
Có 4 loại chính là mono và sesquiterpenes, phenylpropanoid và furylketones.
Nói chung các chất này được chia thành 6 loại riêng biệt dựa trên thành phần
hợp chất bay hơi chính ( Honda, 1994) gồm perillaldehyde (PA);
Elsholtziaketone (EK); perillaketone hay isogomaketone (PK); Citral ©; và PP (
một hoặc nhiều gốc phenylpropanoid đặc biệt là myristicin, dillapiole và
elemicin); PL ( chứa perillene ). Nhóm PA gồm perillaldehyde chiếm 71%,
limonene chiếm 9,3% và caryophyllene chiếm 5,8% , sesquiterpene với nhóm
PP gồm myristicin chiếm 52,7% và caryophyllene chiếm 38,2% phần
monoterpenoid ( Nishizawa và cộng sự , 1992).
Hàm lượng axít rosmarinic trong các cây tía tô và một số thực vật khác
cũng được nhiều nhà khoa học trên thế giớ
i nghiên cứu xác định. Theo kết quả
thu được của các nhà khoa học Nhật Bản tại hàm lượng rosmarrinic trong lá tía
tô là 3,95 ± 0,42 mg/g. Hàm lượng axít rosmarinic trong hạt tía tô là 0,2475mg

và trong dầu tía tô tương ứng là 0.0794mg/g. Các nhà khoa học tại Viện Khoa
học thu hoạch quốc gia Hàn Quốc đã công bố kết quả phân tích trên 203 giống
tía tô trồng tại Hàn Quốc, kết quả thu được, hàm lượng rosmarinic dao động
trong khoảng 15,7 đến 2717 µg/g.
1.2.4. Một số nghiên cứu về RA từ
lá tía tô: [6], [8], [11], [17], [29]
- Nghiên cứu xác định và đánh giá hàm lượng RA trong các loại nguyên
liệu từ tía tô: phương pháp phổ biến để phân tích hàm lượng axít
rosmarinic trong thực vật được sử dụng là sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC) với pha động phổ biến là methanol, TFA (Trifluoroacetic acid),
- Nghiên cứu chiết tách RA từ nguồn nguyên liệu tía tô
- Nghiên cứu về tính chất chứ
c năng của RA từ nguồn nguyên liệu tía tô




15
1.2.5. Ứng dụng của lá tía tô trong y học và thực phẩm truyền thống:
Theo y học cổ truyền của Trung Quốc, lá tía tô có tác dụng làm toát mồ
hôi và trừ hàn, điều hòa chức năng dạ dày, chữa cảm hàn với ho và nôn, nôn do
thai nghén, tiêu chảy, ngộ độc cua cá. Ở Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản… tía tô
được coi như có tác dụng an thần, chống co thắt, làm tot mồ hôi, chống dị ứng ,
chữa nhức đầu và rối lọan ho
ạt động tử cung. Tía tô cũng được dùng làm thuốc
ra mồ hôi, giải biểu, hành khí, giải độc tôm cá.
Theo y học cổ truyền Việt Nam, cả thân, lá và hạt tía tô đều là những vị
thuốc hay. Theo đông y, tía tô có vị cay, mùi thơm, tính ấm, vào hai kinh phế và
tỳ, có tác dụng phát tán, phong hàn, hành khí, hóa trung. Lá tía tô được gọi là tô
diệp, thân là tô ngạnh, quả là tô tử. Các bộ phận này khi thu hoạch được phơi

trong râm mát hay sấy nhẹ cho khô để giữ nguyên mùi vị.
Lá tía tô được dùng chữa c
ảm mạo, không có mồ hôi, phong hàn, ho
nhiều đờm, ngạt mũi, nhức đầu, tiêu hóa kém, nôn mửa, đau bụng, động thai,
ngộ độc. Cành tía tô có tác dụng như lá nhưng kém hơn. Hạt tía tô chữa ho có
đờm, hen suyễn, tê thấp. Liều dùng ngày 3 - 10g lá và hạt, 6 - 20g cành, dạng
thuốc sắc và xông. Có thể uống nước hãm 15 – 20g lá tươi hoặc thái nhỏ 10 lá
tươi trộn với cháo nóng ăn.
Thân tía tô điều hòa lưu thông khí, làm giảm rối loạn chức năng dạ dày,
giảm đau, phòng ngừa sẩy thai. Chủ trị : tức thở ở ngực và đau vùng thượng vị
với cảm giác nóng, nôn, đe dọa sẩy thai. Hạt tía tô làm giảm khó thở và giảm ho,
trừ đờm, làm thư giãn rụôt. Chủ trị : ho và khó thở do ứ trệ đờm, táo bón. Lá tía
tô và thân non được dùng như rau gia vị hoặc rau xanh trong nhiều món ăn
ngon, hấp dẫn.Hạt tía tô được dùng để ăn sống hoặc rang khô dùng trong nhiều
mụ
c đích khác nhau như làm gia vị, ép dầu…Tinh dầu tía tô có tác dụng kháng
khuẩn đối với nhiều loại vi sinh vật như tụ cầu vàng, trực khuẩn lỵ Flexner, trực
khuẩn lao, Bacillus mycoides, Bacillus subtilis, liên cầu tan máu, trực khuẩn lỵ
Shigela, Salmonella typhi, Proteus vulgaris, Candida albicans, trực khuẩn Coli,
phế cầu. Đồng thời, nó có tác dụng diệt lỵ amip với nồng độ ức chế thấp là
1/1280.
Dịch chiết methanol của tía tô có tác dụ
ng kháng nấm Candida albicans
do có chứa một hoạt chất kháng khuẩn và kháng nấm là perilladehyd citral.




16
1.2.6 Các sản phẩm ứng dụng trong y học hiện đại và thực phẩm chức năng:

a. Trong y học hiện đại:
Một nghiên cứu của Sanbongi C và đồng nghiệp (Tạp chí Thử nghiệm
lâm sàng và Dị ứng, 6/2004) đã cho thấy uống axit rosmarinic có hiệu quả đối
với bệnh suyễn dị ứng. Không giống như antihistamines, axit rosmarinic ngăn
không kích hoạt các tế bào miễn dịch gây ra sưng và hình thành chất lỏng.
Các nhà nghiên cứu đã ch
ứng minh rằng điều trị hàng ngày với 1,5 mg
axít rosmarinic trong lá tía tô cho chuột có thể ngăn ngừa bệnh hen suyễn do dị
ứng bụi. Axít rosmarinic ngăn chặn sự gia tăng đáng kể IL-4, IL-5, và eotaxin
trong dịch rửa phế quản và khí quản. Trong những nghiên cứu gần đây, các nhà
khoa học đi đến kết luận, uống axít rosmarinic từ tía tô có thể là một phương
pháp điều trị hiệu quả cho bệnh hen suyễn dị ứ
ng bằng cách hạn chế phân bào và
kháng thể đặc hiệu dị ứng.
Axit rosmarinic đặc biệt ức chế các triệu chứng dị ứng theo mùa liên quan
đến các chứng ngứa mắt và mũi. Kết quả xét nghiệm chức năng thận và gan cho
thấy axít rosmarinic không có tác dụng phụ. Sử dụng axít rosmarinic trong điều
trị các bệnh dị ứng theo mùa ở người hiệu quả, an toàn và ít tốn kém hơn so với
thuốc chống dị
ứng thông thường và hoàn toàn có thể thay thế đơn thuốc.
Hiện nay tại Nhật Bản có khoảng hơn 210 chế phẩm thuốc dựa trên công
thức thảo dược cổ truyền Kampo (thảo dược Kampo dựa trên y học cổ truyền
Trung Quốc nhưng thích nghi với văn hóa Nhật Bản) có sẵn tại các hiệu thuốc.
Theo một khảo sát của Chiến dịch quốc gia phòng chống hen suyễn, 70% người
bị bệ
nh hen suyễn nặng sử dụng thuốc dựa trên công thức thảo dược. Nhiều chế
phẩm chống dị ứng được bào chế từ các bài thuốc Kampo truyền thống chứa
acid rosmarinic
và luteolin chiết xuất từ lá tía tô.

b. Trong sản phẩm thực phẩm chức năng:
Cây tía tô với thành phần hóa học chứa nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho
sức khỏe, không độc nên là một nguồn nguyên liệu tự nhiên dùng làm thực
phẩm chức năng được nhiều nhà sản xuất quan tâm. Đặc biệt trong số đó, hoạt
chất axít rosmarinic được coi là một thành phần chủ yếu của các sản phẩm thực
phẩm được sản xu
ất từ lá tía tô.
Các chế phẩm chống oxy hóa, chống lão hóa được bào chế từ hoạt chất
sinh học axít rosmarinic có tác dụng khử các gốc tự do, kích hoạt các enzyme
kháng ô xy hóa trong cơ thể Hiện nay, đã có rất nhiều sản phẩm thực phẩm

17
chức năng làm từ lá tía tô tại Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc. Các sản phẩm
này tập trung chủ yếu là các loại đồ uống, các loại trà, bột tía tô bổ sung vào
bánh, kẹo, bột súp
Công ty Thực phẩm KODAMA Nhật Bản đã sản xuất đồ uống chiết xuất
từ lá tía tô và dịch cô đặc bổ sung vào các loại rượu. Bên cạnh đồ uống, người
Nhật Bản còn có món ăn có chứa lá tía tô như bộ
t rắc cơm, các món súp, dưa
muối
Tại Hàn Quốc, Trung Quốc cũng có rất nhiều công ty có các sản phẩm
chức năng sản xuất từ lá tía tô chủ yếu đưa ra dưới trà, dạng bột, viên nén, đồ
hộp như các công ty Sangsoo Herb, Milal Food, Dowoodang Pharmacy (Hàn
Quốc); Naturalin Bio-resources, JoryHerb, Changsha Huancheng Biotech. Inc.,
(Trung Quốc)
Ngoài các sản phẩm truyền thống như: bột, dầu, trà nhúng, trên thị trường
thế giới đã xuất hiện sản phẩm đồ
uống đóng chai từ lá tía tô.

Hình 1.5: Một số sản phẩm đồ uống từ lá tía tô



18
CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM
2.1. Phương pháp hóa học:
2.1.1. Xác định hàm lượng axít rosmarinic bằng phương pháp so màu với
máy UV- Spectrophotometter:
a. Nguyên tắc: axit rosmarinic tạo phức chất màu vàng sáng với Zr4+ ,có độ hấp
phụ màu trên máy spectrophotometer cao nhất ở bước sóng 362nm.
b. Hóa chất và thiết bị
Axit rosmarinic (97%) – Sigma –Aldrich ( Chemie, GmbH Steinheim, Đức)
Zirconium (IV) oxide chloride octahydrate (ZrOCl
2
.8H
2
O)- Merck (KgaA,
Darmstadt, Đức)
Dung môi, hóa chất khác thuộc loại hóa chất tinh khiết phân tích.
Máy Spectrophotometer: UV –Visible spectrophotometric Shimadzu
1601(Kyoto, Japan).

* Chuẩn bị dung dịch chuẩn:
Dung dịch chuẩn của axit rosmarinic có nồng độ 10
-3
M (0,0901g hòa tan trong
cồn và định mức tới 250ml)
Dung dịch Zirconium (IV) oxide chloride: nồng độ 0,5M (hòa tan 1,6117g trong
nước và định mức đến 10 ml bằng nước).
Dung dịch chiết tách mẫu: dung dịch methanol 0,125M pha trong ethanol 96%,
pha trước khi dùng.
Phương pháp chiết mẫu: 25 g mẫu khô ngâm trong 100 ml dung môi /lần, chiết 3
lần/24h. Cô chân không loại hết dung môi. Phần kết tủa hòa tan trong 100 ml
ethanol 96%.
* Dựng đường chuẩn axit rosmarinic:
Pha các mẫu dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượng là 50, 70, 125, 150, 175 và
200µl từ dung dịch tiêu chuẩn trong các ống mẫ
u khác nhau có dung tích 5ml,
thêm 4,6ml ethanol, lượng dung dịch axit rosmarinic gốc với hàm lượng xác
định và lượng ethanol = (200-x)µl. Thêm dung dịch Zr ( nồng độ 200µl) vào
mỗi ống chuẩn, trộn đều . Sau 5 phút, đem xác định độ hấp phụ trên máy UV ở
bước sóng 362nm, mẫu blank là nước cất tinh khiết. Dựng đường chuẩn bằng
phương pháp tính graph trên excel 2007. Tính chỉ số R
c. Phương pháp tính: Nồng độ của rosmarinic acid trong dịch chiết được tính
bằng công thức sau, dựa trên đồ thị hàm lượng rosmarinic tiêu chuẩ
n:
Độ hấp thụ = [0,0266µM acid – 0,0269.]*R

19
2.1.2. Xác định hàm lượng axít rosmarinic bằng HPLC:
Mẫu chiết được để trong 12h ở 4°C, ly tâm 5000 vòng/phút. Lọc qua màng lọc
0,2 µm.

Hệ máy: Shimadzu
Detector: PDA – 320 nm
Cột: C18 (150 x 4.6 mm I.D., Phenomenex)
Mobile phase: formate 0.02 M pH 6,25 (A) và methanol (B), tỉ lệ 1:1
Tốc độ dòng: 1 mL/min
Thời gian: 43 phút/mẫu
Lượng mẫu: 20 µL
2.1.3. Xác định dư lượng thuốc BVTV bằng GC:
Hệ máy: Agillent 6890N MS: 5973i
T
0
inject: 250
0
C ; Thể tích bơm mẫu : 10µl
Tốc độ: 1ml/phút
MS source : 280
0
C
Colum : BD 5MS.32m x 0.25 mmm (ID)
2.1.4. Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy khô đến trọng lượng không
đổi
2.1.5. Phân tích hàm lượng anthocyanin:
Lá tía tô tươi sạch: 20 g/mẫu, nghiền nhỏ, ngâm trong 200 ml dung dịch
ethanol/nước (1:1) trong 60 phút. Lọc sơ bộ, ly tâm 5000 vòng/phút trong 10
phút, lấy phần dịch trong.
Bột lá, lá khô: 5 g/mẫu nghiền nhỏ, ngâm trong 200 ml dung dịch
ethanol/nước (1:1) trong 60 phút. Lọc sơ bộ, ly tâm 5000 vòng/phút trong 10
phút, lấy phần dịch trong.
Anthocyanin tổng số được xác định theo phương pháp chênh lệch pH
(Metivier et al., 1980).

a. Nguyên t
ắc
Dựa trên sự phụ thuộc của màu sắc của anthocyanin vào pH. Khi pH
≤
1
toàn bộ lượng anthocyanin ở dạng màu đỏ, khi pH
≥
4,5 toàn bộ anthocyanin ở
dạng không màu.



20
b. Tiến hành
Lọc mẫu qua màng lọc 0,45µm rồi tiến hành pha loãng 10 lần với cả 2
dung dịch đệm ở trên, trường hợp màu đậm quá có thể pha loãng trước bằng
nước cất hoặc pha loãng nhiều lần hơn bằng dung dịch đệm. Sau đó đặt ở chỗ tối
trong vòng 1 giờ cho màu sắc ổn định. Sau đó đem đo độ hấp thụ ở bước sóng
524nm với mẫu trắ
ng là các dung dịch đệm tương ứng.
c. Phương pháp tính
Hàm lượng anthocyanin tổng số được tính theo malvidinclorua-3,5-
glucozit theo công thức:
TA (Total anthocyanins) = (A520pH 1,0 – A520pH 4,5) x 25,575 x f (mg/l).
Trong đó
TA - Hàm lượng anthocyanin tổng số
A520 pH 1,0 - Độ hấp thụ ở 520 của mẫu pha loãng 10 lần bằng đệm pH 1,0
A520 pH 4,5 - Độ hấp thụ ở 520 của mẫu pha loãng 10 lần bằng đệm pH 4,5
255,75 - Hệ số quy đổi từ giá trị độ hấp thụ thành hàm lượng mg/l
f - Hệ số pha loãng

2.2.
Phương pháp vật lý:
- Xác định độ hấp thụ ánh sáng ánh sáng của dung dịch chiết: Lấy 5 ml
dịch chiết pha loãng với dung dịch đệm pH = 1,0 trong bình định mức
25 ml, lọc qua màng 0,45 µm, quét phổ hấp thụ trong vùng khả kiến (λ =
450 – 720 nm) trên máy quang phổ UV - Vis, kết quả thu được Bước
sóng hấp thụ cực đại và độ hấp thụ ánh sáng tại bước sóng cực đại
λmax = 524 (nm). Đo độ hấp thụ ánh sáng t
ại 524 nm.
2.3. Phương pháp vi sinh:
Theo TCVN 5042:1994: Nước giải khát. Yêu cầu vệ sinh. Phương pháp thử
- Phương pháp phân tích tổng số nấm men nấm mốc
- Phương pháp phân tích tổng số vi khuẩn hiếu khí
- Phương pháp phân tích phân tích E.Coli
- Phương pháp phân tích tổng số Coliform
2.4. Phương pháp cảm quan:
- Phương pháp so sánh cặp đôi thị hiếu
- Phương pháp so hàng
- Phương pháp cho điểm

21
2.5. Phương pháp công nghệ:
2.5.1. Xác định thành phần hóa học, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật và hàm
lượng axít rosmarinic (RA) của lá tía tô tại các vùng nguyên liệu khác
nhau
2.5.2. Nghiên cứu lựa chọn dạng nguyên liệu sơ chế:
- Các dạng nguyên liệu được thử nghiệm là: lá tía tô tươi làm sạch (bỏ
cành, cuộng,), lá tía tô khô, lá tía tô cắt sợi khô, và bột lá tía tô
2.5.3. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết tách RA từ lá tía tô:
-

Nghiên cứu xác định loại dung môi phù hợp: Dung môi sử dụng: Nước;
ethanol, propan-2-ol
- Nghiên cứu xác định nồng độ (%v/v) của loại dung môi phù hợp
- Nghiên cứu xác định tỉ lệ khối lượng nguyên liệu/V dung môi
- Nghiên cứu xác định thời gian trích ly
- Nghiên cứu xác định nhiệt độ trích ly
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ khuấy trộn
- Nghiên cứu số lần trích ly
2.5.4.
Nghiên cứu nâng cao hàm lượng RA của dung dịch thu được:
- Nghiên cứu các thông số cho quá trình cô đặc chân không dung dịch:
nhiệt độ, áp suất, thời gian quy trình chiết lại bằng các dung môi hữu cơ
khác
2.5.5. Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho chế phẩm dung dịch RA
từ lá tía tô
2.5.6. Nghiên cứu tạo sản phẩm đồ uống giàu RA từ lá tía tô:
- Nghiên cứu các điều kiện chiết tách thu dịch chiết lá tía tô: nồng độ

muối, tỉ lệ lá/V dung dịch, nhiệt độ
- Nghiên cứu tạo sản phẩm đồ uống pha chế: chọn tỉ lệ phối chế dịch chiết
RA – xác định màu sắc, hương vị sản phẩm, xác định tỉ lệ SS/A được ưa
thích, lựa chọn chất điều vị: chua, ngọt
- Nghiên cứu chế độ thanh trùng và bảo quản sản phẩm nướ
c uống tía tô
2.5.7. Điều tra sơ bộ thị hiếu người tiêu dùng: Sử dụng phiếu điều tra
2.6. Nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị dụng cụ thí nghiệm:
2.6.1. Nguyên vật liệu:
- Tía tô: lá bánh tẻ, bỏ cuộng, cành

22

- Đường tinh luyện
- Muối tinh
- Cồn thực phẩm
- Nước tinh lọc RO
2.6.2. Hóa chất thí nghiệm:
- Axit rosmarinic (97%) – Sigma –Aldrich (Chemie, GmbH Steinheim,
Đức)
- Zirconium (IV) oxide chloride octahydrate (ZrOCl2.8H2O)- Merck
(KgaA, Darmstadt, Đức)
- Đường: glucoza - Merck
- Axít citric, malic, latic, tartatric, ascorbic - Meck
- Ethanol, propan-2-ol; tOAc, n-butanol– Meck
2.6.3. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm:
- Bộ cô đặc chân không – Buchii – Thụy Sỹ
- UV Vis – Spectrophotometter
- Hệ thống HPLC – Shimadzu – Detector PDA – Nhật Bản
- Hệ
thống GC – Agillent – Mỹ
- Tủ sấy Memert
- Cân phân tích, cân kỹ thuật
- Bể ổn nhiệt
- Sàng phân loại đường kính lỗ
- Khúc xạ kế - Nhật Bản

23
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÌNH LUẬN:
Với mục tiêu đặt ra của đề tài là nghiên cứu công nghệ sản xuất dịch chiết có
hàm lượng axít rosmarinic đạt nồng độ ≥ 10% và ứng dụng vào sản xuất đồ
uống chức năng, đề tài sẽ tiến hành hai phần nghiên cứu chính :
- Phần 1: Nghiên cứu tạo sản phẩm dịch chiết từ lá tía tô có hàm lượng

RA ≥ 10%.
- Phần 2: Dịch chi
ết có hàm lượng RA 10% có thể được bổ sung vào một
trong rất nhiều dạng sản phẩm đồ uống: nước giải khát pha chế, nước
quả, trà đóng chai thanh trùng, rượu vang, … Tuy nhiên với thời gian 1
năm, đề tài quyết định lựa chọn tạo sản phẩm đồ uống từ chính lá tía tô
và bổ sung dịch chiết hàm lượng axít rosmarinic đạt nồng độ ≥ 10% thu
được để sản phẩm đồ uống có hàm lượ
ng hàm lượng axít rosmarinic ≥
0,05% với những lý do sau:
+ Sản phẩm dịch chiết không phải là dung dịch tinh sạch của RA 10% mà
là dịch chiết từ lá tía tô nên sản phẩm còn chứa một số các thành phần
khác của lá tía tô. Khi bổ sung dịch chiết này vào các sản phẩm đồ uống
có nguồn gốc nguyên liệu khác, các thành phần này có tác dụng với các
thành phần của đồ uống đó tạo ra các sản phẩm không mong muốn và có
ảnh hưởng
đến sức khỏe người tiêu dùng hay không, cần thời gian và
nhiều thí nghiệm đánh giá. Nếu sử dụng chính dịch chiết này cho sản
phẩm đồ uống từ nước lá tía tô sẽ giảm thiểu tối đa sự khác biệt thành
phần.
+ Dịch chiết từ lá tía tô tươi là một loại đồ uống thảo dược truyền thống
khá phổ biến ở Nhật Bản và Trung Quốc, được s
ử dụng phòng chống
cảm cúm, nhức đầu, dị ứng, … và chưa ghi nhận hiện tượng ngộ độc.
Dịch chiết lá tía tô tươi có chứa cả 3 thành phần là: rosmarinic axít, màu
(anthocyanin) và hương. Sản phẩm đồ uống từ lá tía tô tươi có màu sắc
đẹp, hương thơm hấp dẫn, không cần bổ sung hương và màu nhân tạo sẽ
là một sản phẩm mới nhiều ưu điểm.
Do vậy, đề tài
đã lựa chọn nghiên cứu tạo sản phẩm đồ uống từ lá tía tô

tươi sau đó bổ sung dịch chiết chưa 10% RA tăng thêm tính chất chức năng cho
sản phẩm đồ uống từ lá tía tô.





24
3.1. Nghiên cứu lựa chọn nguyên liệu:
Lá tía tô được thu thập từ các địa phương tại Hà Nội và được phân tích
hai chỉ số chính: hàm lượng RA và dư lượng thuốc BVTV. Nguyên liệu được
lựa chọn trên hai tiêu chí:
- Có hàm lượng RA cao: phục vụ cho quá trình nghiên cứu tạo sản phẩm
dịch chiết giàu RA
- Cho dịch chiết có màu sắc (hàm lượng anthocyanin cao) và hương thơm
đặc trưng.
Đề tài đã tiến hành phân tích các chỉ tiêu: hàm lượ
ng RA (mg/g lá tươi),
anthocyanin và cảm quan hương của các nguyên liệu.
Các mẫu lá tươi được cân 5g/mẫu. Nghiền nhỏ, trích ly trong dung môi
methanol/water/TFA (50:50:0.1) với tỉ lệ 1g/10 ml dung môi . Trích ly trong 30
phút ở nhiệt độ phòng sau đó ly tâm với tốc độ 3.000 vòng/phút – trong 5 phút,
lục qua màng lọc 0,45. Dịch chiết thu được đưa đi phân tích bằng hệ HPLC.
Kết quả thu được như sau:

Bảng 3.1: Hàm lượng RA và dư lượng thuốc BVTV một số mẫu lá tía tô

Mẫu Hàm
lượng
RA (%

chất
khô)
Anthoc
yanin
(%)
Tên thuốc
BVTV
Hàm
lượng
thuốc
BVTV
Cảm quan
Vùng trồng
1 0,269 0,309 Cypermethrin
Cyhalothrin
3,25
0,06
Lá xanh, tím sẫm,
mùi hơi hắc
Vân Nội – Đông
Anh – Hà Nội
2 0,448 0,259 Cypermethrin 2,81
Lá xanh, tím
nhạt, mùi hắc
nhẹ
Thường Tín – Hà
Nội
3 0,316 0,356 Cypermethrin 3,56
Lá xanh, tím sẫm,
mùi rất nhẹ

Thường Tín – Hà
Nội
4 0,279 0,311 Cypermethrin 2,20
Lá xanh, tím, mùi
thơm hắc đặc
trưng
Hoài Đức - Hà
Nội
5 0,261
0,382 KPH -
Lá xanh, tím,
mùi thơm hắc
đặc trưng
Đông Dư – Hà
Nội