Nghiên cứu phát hiện đa dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong các mẫu rau quả bằng GC/MS

BỘ CÔNG THƯƠNG
VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM








BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI CẤP BỘ

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐA DƯ LƯỢNG THUỐC
BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG CÁC MẪU RAU QUẢ
BẰNG GC/MS


Chủ nhiệm đề tài: PHẠM VĂN THÀNH











7842

07/4/2010



HÀ NỘI – 2010



Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009




1

LỜI NÓI ĐẦU
Đề tài : “ Nghiên cứu phát hiện đa dư lượng thuốc bảo vệ thực
vật trong các mẫu rau quả bằng GC/MS”, được thực hiện trong thời
gian 12 tháng theo “Hợp đồng đặt hàng sản xuất và cung cấp dịch
vụ sự nghiệp công nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ” số
034.09.RD/HĐ-KHCN ký ngày 25 tháng 02 năm 2009 giữa Bộ Công
Thương và Viện Công nghiệp thực phẩm. Đề tài đã hoàn thành đầy
đủ các nội dung nghiên cứu trong Hợp đồng đã ký kết bao gồm:
1. Nghiên cứu xây dựng qui trình chuẩn để phân tích dư lượng
thuốc bảo vệ thực vật với khả năng phát hiện 110 chất thuộc
nhiều nhóm khác nhau.
2. Áp dụng qui trình đã xây dựng để phân tích các mẫu rau
quả trên thị trường Hà Nội.
Thành công của đề tài đã góp phần nâng cao năng lực phòng thí
nghiệm phân tích của Trung tâm Phân tích và Giám định thực

phẩm quốc gia trong công tác kiểm soát chất lượng, an toàn vệ
sinh thực phẩm.
Nhóm thực hiện đề tài xin chân thành cám ơn Vụ Khoa học và
Công nghệ - Bộ Công Thương, Viện Công nghiệp thực phẩm và các
đơn vị bạn đã tạo điều kiện và hỗ trợ chúng tôi hoàn thành
nhiệm vụ này.
Nhóm thực hiện đề tài


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009




2
MỤC LỤC
Trang

Lời nói đầu
01

Mục lục
02

Ký hiệu và chữ viết tắt
04

Mở đầu
05
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

07

1.1

Khái quát chung về thuốc BVTV
07

1.2

Ảnh hưởng của thuốc BVTV đến môi trường
và sức khoẻ con người
09

1.3

Tình hình sử dụng và tiêu thụ thuốc BVTV ở
Việt Nam và trên thế giới
10

1.4

Kiểm soát dư lượng thuốc BVTV trong nông
sản thực phẩm ở Việt Nam
12

1.5

Phương pháp xác định dư lượng thuốc BVTV
13
1.5.1 Phương pháp phân loại để phân tích dư lượng

thuôc BVTV
14
1.5.2 Phương pháp lấy mẫu để xác định dư lượng
thuốc BVTV
15
1.5.3 Phương pháp phân tích dư lượng thuốc BVTV 17

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM
21

2.1 Đối tượng nghiên cứu
21
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009




3
2.1.1 Các loại rau quả nghiên cứu 21
2.1.2 Các loại thuốc BVTV nghiên cứu 21

2.2 Cách tiến hành thực nghiệm
22

2.3 Phương pháp nghiên cứu
26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÌNH LUẬN
32

3.1 Lựa chọn mẫu và chất phân tích
32

3.2 Nghiên cứu điều kiện tách, làm sạch, làm giàu
mẫu và lựa chọn chế độ phân tích trên GC/MS
32

3.3 Đánh giá phương pháp chiết tách và phân tích
đa dư lượng thuốc BVTV trong rau quả
40
3.3.1 Đường nội chuẩ
n của các loại thuốc BVTV 40
3.3.2 Độ thu hồi của các loại thuốc BVTV 44
3.3.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn xác định
(LOQ)
48

3.4 Đánh giá độ chính xác của phương pháp
51

3.5 Kết quả khảo sát một số mẫu rau, qủa trên thị
trường Hà Nội
57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
61

Tài liệu tham khảo
62

Phụ lục
65



Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009




4



DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BVTV Bảo vệ thực vật
ELIZA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
EIA Enzyme Immunosorbent Assay
GC/MS Gas Chromatography/Mass spectrophotomet
HPLC High Performant Liquid Chromatography
LC Liquid Chromatography
LOD Limit of Detection
LOQ Limit of Quantification
LC/MS Liquid Chromatography/ Mass spectrophotomet
RIA Radio Immuno Assay
PAN Polycyclic Aromatic Hydrocarbon
SPE Solid Phase Extract
TLC Think Layer Chromatography
NN&PTNT Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

VSAT Vệ sinh an toàn






Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009




5
Mở đầu
Những năm gần đây, lượng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) tiêu thụ ở Việt
Nam lên tới hàng chục ngàn tấn. Những loại thuốc thường dùng chủ yếu là các loại
thuốc thuộc nhóm clo hữu cơ và lân hữu cơ; đây là những loại thuốc có hiệu quả
phòng trừ cao nhưng cũng lại có độ độc rất cao và khó phân huỷ gây ảnh hưởng lớn
đến môi trường và sức khoẻ con người. Ngoài tác động trực tiếp bởi dư lượng còn lại
trên các sản phẩm, thuốc bảo vệ thực vật còn có thể làm thay đổi thành phần và tính
chất đất như làm chua cứng, thay đổi cân bằng các chất dinh dưỡng đối với cây trồng.
Vấn đề tồn dư thuốc BVTV trong môi trường đang thu hút sự quan tâm của nhiều
nhà khoa học. Các số liệu phân tích môi trường cho thấy, dù sau mộ
t thời gian dài
không sử dụng, thuốc BVTV vẫn còn lưu trong môi trường dù ở dạng vết [5] [6] [7].
Theo tác giả Lê Văn Khoa, kết quả phân tích tồn dư thuốc BVTV gồm các loại:
DDT, methyl parathion, lindan… trong 17 mẫu đất trồng rau trên địa bàn Hà Nội cho
thấy có tới 70% số mẫu có chứa ít nhất một loại thuốc, trong đó có 6 mẫu có chứa
hàm lượng DDT cao quá tiêu chuẩn cho phép. Đối với các loại thuốc BVTV ở các
nhóm khác như lân hữu cơ, cacbamat, pyrethroid tổng h

ợp tuy ít bền vững hơn nhóm
thuốc clo hữu cơ nhưng chúng lại được sử dụng với số lượng lớn. Vì vậy mối đe doạ
của các loại thuốc này đối với môi trường cũng không phải nhỏ khi có sự ước tính
khoảng 50% lượng thuốc BVTV khi dùng là phun vào đất. Trong đất, thuốc BVTV
bị phân huỷ dần bởi các yếu tố vô sinh và hữu sinh. Một số vi sinh vật có thể sử
dụng
thuốc BVTV như một nguồn dinh dưỡng; ngược lại, nhiều loại vi sinh vật không phải
đối tượng phòng trừ cũng bị ảnh hưởng. Nhiều thí nghiệm cho thấy, khi sử dụng
thuốc BVTV, hoạt độ của đất giảm 50 đến 90% so với điều kiện tự nhiên. Trên thực
tế, việc kiểm tra, giám sát dư lượng thuốc BVTV vô cùng phức tạp, ngay cả với các
nước công nghi
ệp phát triển, có hệ thống kiểm soát dư lượng thuốc BVTV cao thì
những rủi ro về ngộ độc do thuốc BVTV vẫn có thể xảy ra. Ở Việt Nam, kết quả
kiểm tra hàng năm của Trung tâm kiểm định thuốc BVTV phía Bắc và phía Nam cho
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009




6
thấy dư lượng thuốc BVTV trong rau quả rất đáng báo động, số các sản phẩm bị
nhiễm thuốc BVTV có xu hướng tăng lên, ảnh hưởng rất lớn đến sức khoẻ người tiêu
dùng. Kiểm soát dư lượng thuốc BVTV trong các sản phẩm luôn là bài toán khó đối
với các nhà quản lý và các nhà nghiên cứu. Một lý do không nhỏ làm hạn chế sự
kiểm soát này là phương pháp phân tích hiện nay còn phức tạp, mỗi qui trình chỉ có
thể áp dụ
ng cho một số nhóm, một số chất nhất định.
Hiện nay, trong bộ tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) cũng chỉ ban hành tiêu
chuẩn kiểm tra thuốc BVTV cho nhóm ngũ cốc và chè, hơn nữa mỗi tiêu chuẩn chỉ
dùng xác định một số chất, số các loại thuốc BVTV có thể xác định được khi áp dụng

các tiêu chuẩn này rất ít chỉ gồm: parathiomethyl, metamidophos, gama-BHC,
dimethoit, diclovot, lidan và một vài chất khác [26] [27] [28] [29][30] [31]. Cũng vì
lý do đó nhiều phòng thí nghiệm trong nước có điều ki
ện trang thiết bị tốt như Trung
tâm TC-ĐL-CL 1, Trung tâm TC-ĐL-CL 2, Trung tâm TC-ĐL-CL 3, Viện Dinh
dưỡng Quốc gia, Trung tâm Phân tích và Thí nghiệm thành phố Hồ Chí Minh đã tự
xây dựng cho mình qui trình phân tích dư lượng thuốc BVTV để áp dụng trong
phòng thử nghiệm. Tuy nhiên các qui trình này cũng chỉ áp dụng trong nội bộ, hơn
nữa mỗi qui trình cũng chỉ áp dụng cho một nhóm chất hoặc cơ clo, hoặc cơ phot
pho, hoặc pyrethroid với các điều kiện kỹ thu
ật khác nhau trên sắc ký khí (GC) tương
ứng với việc sử dụng các loại detector FID, ECD, FPD. Chính vì lý do đó chúng tôi
xây dựng đề tài: “Nghiên cứu phát hiện đa dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong các
mẫu rau quả bằng GC/MS”, với mục tiêu phân tích được nhiều loại dư lượng thuốc
bảo vệ thực vật thuộc nhiều nhóm khác nhau trên một qui trình phân tích, có độ chính
xác tương đương các tiêu chuẩn AOAC, đáp ứng yêu cầu về gi
ới hạn kiểm soát dư
lượng thuốc BVTV trong các sản phẩm rau quả theo TCVN 5624-1991.


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009




7
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1.Kh¸i qu¸t chung vÒ thuèc b¶o vÖ thùc vËt
Định nghĩa:
Thuốc BVTV là những chất hoặc hợp chất được dùng để phòng chống, diệt trừ,

xua đuổi hoặc giảm nhẹ thiệt hại do dịch hại gây ra cho cây trồng (U.S.EPA).
Phân loại thuốc BVTV :
Có nhiều cách để phân loại thuốc bảo vệ thực vật [19], có thể phân loại thuốc theo
đối tượng phòng trừ, theo cơ chế tác động, theo mức độ độc h
ại,
+ Phân loại theo đối tượng phòng trừ
Theo cách này, thuốc BVTV được chia ra thành các nhóm
- Thuốc trừ nhện
- Thuốc trừ ốc
- Thuốc trừ nấm bệnh
- Thuốc trừ chuột
- Thuốc trừ cỏ
- Thuốc trừ sâu
- Thuốc trừ tuyến trùng
Trong các loại trên lại có thể chia ra theo nhiều cách khác nhau, ví dụ thuốc trừ
sâu có thể phân chia theo bản chất hoá h
ọc: clo hữu cơ, lân hữu cơ, carbamat,
pyrethroid, các nhóm thuốc trừ sâu thế hệ mới…
+ Phân loại theo cơ chế tác động
- Thuốc gây độc do tiếp xúc
- Thuốc gây độc vị độc
- Thuốc nội hấp, thấm sâu
- Nhóm thuốc xông hơi
+ Phân loại theo độ độc
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009




8

Theo cách phân loại này (WHO), thuốc BVTV được chia thành các nhóm như
sau
Bảng 1. Phân loại thuốc BVTV theo độ độc của tổ chức Y tế Thế giới
Độc cấp tính LD
50
( Chuột nhà) mg/kg
Qua miệng Qua da
Phân nhóm
và ký hiệu
Biểu tượng
nhóm độc
Thể rắn Thể lỏng Thể rắn Thể lỏng
Ia độc mạnh
“rất độc”
(chữ đen, nền
đỏ)
Đầu lâu
xương chéo
( đen trên nền
trắng)
≤ 5 ≤ 20 ≤ 10 ≤ 40
Ib độc “độc”
(chữ đen, nền
đỏ)
Đầu lâu
xương chéo
( đen trên
nền trắng)
5-50 20-200 10-100 40-400
II độc trung

bình “ có
hại”(chữ đen
trên nền
vàng)
Chữ thập đen
trên nền
trắng
50-500 200-2000 100-1000 400-4000
III độc ít “chú
ý” (chữ đen,
nền xanh)
Chữ thập đen
trên nền
trắng
500-2000 2000-3000 1000 4000
IV nền xanh
lá cây
> 2000 > 3000



Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009




9
1.2 Ảnh hưởng của thuốc BVTV đến môi trường và sức khoẻ con người
Sản xuất nông nghiệp ở bất cứ nơi nào trên thế giới đều không thể thiếu thuốc
BVTV nếu muốn đạt năng suất cao. Tuy nhiên, thuốc BVTV cũng chính là chất độc

gây hại cho sức khoẻ con người và môi trường nếu không được quản lý và sử dụng
đúng cách. Thuốc BVTV có tác động mạnh mẽ đến môi trường. Chúng có thể
làm
thay đổi thành phần và tính chất của đất, làm chua cứng và thay đổi cân bằng dinh
dưỡng trong đất.
Vấn đề tồn dư của các chất BVTV trong môi trường đã thu hút sự quan tâm
của nhiều nhà khoa học, đặc biệt các chất clo hữu cơ có khả năng gây độc cao và bền
vững trong môi trường. Các số liệu phân tích môi trường cho thấy, dù sau một thời
gian dài không sử dụng, một lượng tồn lưu các hợp chất này v
ẫn được tìm thấy (Lê
Văn Khoa 1997). Cũng theo tác giả Lê Văn Khoa, trong số 17 mẫu đất trồng rau lấy
ở Hà Nội để phân tích các chất thuộc nhóm DDT, methyl parathion, lidan, monitor thì
có tới 70% số mẫu phát hiện ra có một trong các chất phân tích, trong đó có tới 36%
số mẫu phát hiện có DDT vượt mức cho phép. Đối với các thuốc BVTV ở các nhóm
khác như lân hữu cơ, cacbamat, pyrethroid ít bềnn vững hơn nhóm thuốc clo hữu cơ
nhưng chúng lại đang được sử d
ụng rộng khắp với số lượng lớn, vì vậy những hiểm
hoạ cho môi trường từ những nhóm này cũng không hề nhỏ.
Trên thực tế, không phải tất cả lượng thuốc BVTV đem sử dụng đều nhằm
đúng mục đích. Người ta ước tính khi phun thuốc có tới 50% lượng thuốc phun thẳng
vào đất. Trong đất thuốc BVTV bị phân huỷ dần bởi các yếu tố vô sinh và hữu sinh.
Nhiều loại vi sinh vật có khả năng sử dụng thuốc như một nguồn dinh dưỡng, ngược
lại nhiều loại không thuộc đối tượng phòng trừ cũng bị tiêu diệt. Nhiều nghiên cứu
cho thấy thuốc BVTV làm giảm 50-90% hoạt độ của đất so với điều kiện tự nhiên.
Ngoài việc tích tụ trong đất, thuốc BVTV còn phân tán vào nước, các trầm tích nước
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009

10
ngọt, vào cá, qua cây cỏ vào sữa bò là những hiểm hoạ trực tiếp đến sức khoẻ con
người.
Thuốc BVTV không chỉ tích tụ trong đất mà khi bị rửa trôi do quá trình tưới
tiêu, mưa bão, chúng sẽ gây ô nhiễm nguồn nước mặt, nước ngầm và nước vùng cửa
sông. Người ta ước tính khoảng 340 tấn altrazin hay 1,2% lượng thuốc được dùng tại
12 bang của Mỹ đã chảy vào sông Misisipi và ra vịnh Mehicô. Tại California- Mỹ, từ
1980 đến 1984 đã phát hi
ện chất dibromo propan ở 2.000 giếng nước ăn trong khu
vực rộng 18.000 km
2
. Các loại thuốc diệt cỏ như altrazin, alaclo, sumazin trở thành
các chất gây ô nhiễm phổ biến dưới tầng canh tác của nhiều nước trên thế giới. Thậm
chí có nơi đã phát hiện thấy dư lượng thuốc BVTV ngay cả trong nước mưa và sương
mù.
1.3. Tình hình sử dụng và tiêu thụ thuốc BVTV ở Việt Nam và trên thế giới
Những năm trước đây, nhiều người cho rằng thuốc hoá học có thể dậ
p tắt mọi
dịch sâu bệnh, bảo vệ mùa màng, tăng năng suất cây trồng, hơn nữa chi phí cho việc
sử dụng thuốc hoá học lại rất thấp. Chính vì vậy, việc sử dụng thuốc BVTV bị lạm
dụng tràn lan ngay cả khi không thật cần thiết. Theo ước tính, lượng thuốc trừ sâu
bệnh được sử dụng thời gian này ở Mỹ gấp hàng trăm lần lượng thuốc c
ần thiết [6]
[7]. Hậu quả của việc sử dụng này đã gây tác hại rất xấu cho môi trường và con
người. Ngày nay có tới trên 1300 loại hoá chất được công nhận là thuốc BVTV [8]
[20]. Vào cuối những năm 40 của thế kỷ trước, lượng thuốc hoá học sản xuất trên thế
giới chỉ vào khoảng vài trăm tấn (tương đương vài trăm triệu USD), nhưng đến nay
giá trị sản lượng thuốc BVTV trên th
ế giới đã lên đến 31,25 tỷ USD.
Theo nhận định của Hội nghị liên tịch FAO và UNEP, thị trường thuốc BVTV

trên thế giới vẫn tiếp tục tăng mạnh, nhất là ở các nước đang phát triển thuộc Mỹ La
tinh và Châu Á. Hiện nay, tác dụng không mong muốn của thuốc hoá học đã được
chứng minh rõ ràng nên xu hướng nghiên cứu và sử dụng thuốc BVTV sinh học đang
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009




11
được khuyến khích. Theo dự tính đến 2010 thuốc BVTV sinh học sẽ chiếm 10% thị
phần thuốc BVTV tiêu thụ trên thế giới. Tuỳ theo trình độ canh tác, mức độ đầu tư về
thuốc BVTV ở các nước cũng khác nhau. Mức độ sử dụng thuốc BVTV cũng như
chi phí cho thuốc BVTV trên một hec-ta gieo trồng ở một số nước trong khu vực
Đông Nam Á được thể hiện trong bảng sau :
Bảng 2. Tình hình sử dụng thuố
c BVTV ở một số nước khu vực Đông Nam Á
Bình quân trên
một ha
Quốc gia
Diện tích
canh tác
( triệu ha)
Số lượng
(tấn a.i*)
Giá trị
(triệu USD)
kg a.i* USD
Đài Loan 0,800 7.521,1 60,7 9,40 75,80
Trung Quốc 120,000 160.800,0 1.300,0 1,34 10,80
Inđônêsia 33,048 48.646,7 240,7 0,73 7,47

Malysia 5,245 24.183,5 121,0 4,60 23,06
Phillipin 6,206 24.582,0 174,0 3,90 28,03
Thái Lan 15,623 71.365,8 320,0 4,57 20,48

Tỷ lệ các nhóm thuốc BVTV tiêu thụ trên thế giới cũng không đều nhau. Theo
thống kê năm 1993, tính chung trên thế giới thuốc trừ cỏ chiếm tỷ lệ cao nhất là 46%,
sau đó là thuốc trừ sâu 29% và thuốc trừ bệnh là 21%. Trong khi đó các nước Nam Á
tỷ lệ này có phẩn thay đổi. Pakistan thuốc trừ sâu chiếm 92%, thuốc trừ cỏ chỉ chiếm
6% [1] [3].
Ở Việt nam, trong những năm 90, lượng thuốc tiêu thụ khoảng 4000 tấ
n hoạt
chất, tương đương với khoảng 13 đến 15 ngàn tấn thành phẩm, trị giá khoảng 8,5
triệu USD. Giai đoạn này, mức độ sử dụng hoá chất BVTV còn rất thấp, chỉ vào
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009




12
khoảng 0,40 kg a.i./ha ; chủng loại sử dụng chủ yếu là nhóm clo hữu cơ và lân hữu
cơ. Các loại thuốc này tuy có hiệu quả phòng trừ tốt nhưng lại có độ độc cao, thời
gian phân huỷ chậm gây tác động xấu đến môi trường và con người. Năm 1999, số
lượng thuốc BVTV đạt 33,715 tấn tương đương 158,8 triệu USD, số tiền đầu tư cho
thuốc BVTV là 15,11 USD/ha. Những năm gần đây con số này t
ăng lên rất nhiều,
năm sau tăng hơn năm trước. Nếu năm 2006 giá trị thuốc BVTV nhập khẩu là 305
triệu USD thì năm 2007 là 383 triệu USD (tăng 25% so với 2006). Đến năm 2008
con số này là 472 triệu USD (tăng 23,3% so với 2007) ; dự đoán con số này sẽ không
giảm vào 2009 (Nguồn từ Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn).
Cơ cấu các loại thuốc BVTV ở Việt Nam cũng như một số nước Nam Á, số

l
ượng thuốc trừ sâu được tiêu thụ cao hơn thuốc trừ bệnh và trừ cỏ. Tuy nhiên, những
năm gần đây số lượng thuốc trừ cỏ tăng 5,6 lần trong khi thuốc trừ sâu và trừ bệnh chỉ
tăng 2,6 lần. Điều này chứng tỏ đang có sự thay đổi đáng kể trong cơ cấu thuốc
BVTV ở Việt Nam và phù hợp với xu thế tăng cường thuốc tr
ừ cở trên thế giới.
1.4. Kiểm soát dư lượng thuốc BVTV trong nông sản thực phẩm ở Việt Nam
Những năm gần đây, việc kiểm soát dư lượng thuốc BVTV ở Việt Nam được
quan tâm rất nhiều. Tại các Trung tâm kiểm định thuốc BVTV, hàng năm đều tiến
hành khảo sát đánh giá dư lượng thuốc BVTV trên một số loại nông sản tại một số
khu vực trọng
điểm. Kết quả cho thấy, rau cải, đậu đỗ, nho, dưa chuột đều có mẫu có
chứa hàm lượng thuốc BVTV vượt quá MRL
s
. Tỷ lệ các mẫu nhiễm này là 15% đối
với rau cải, 20% đối với nho và đậu đỗ, dưa lê là 19,6%, dưa chuột là 12%[1] [7].
Theo một số tác giả Viện Rau quả thì dư lượng một số loại thuốc trên các loại
rau cao hơn nhiều so với giới hạn tối đa cho phép. Ví dụ : Wotabox trên rau cải là
1ppm (MRL
s
là 0,2 ppm) ; Monitor trên rau cải là 2,0ppm (MRL
s
là 0,1 ppm).
Việc kiểm soát thuốc BVTV tại Việt Nam rất khó khăn, ngoài lượng thuốc
nhập khẩu có giá trị hàng trăm triệu USD mỗi năm, một lượng không nhỏ các loại
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009

13
thuốc BVTV khác được nhập lậu qua biên giới, đặc biệt là biên giới phía Bắc hầu
như không được kiểm soát. Trong số này có không ít loại thuốc đã bị cấm sử dụng.
Về số lượng các chủng loại thuốc BVTV thương mại đang lưu hành trên thị
trường cũng gia tăng rất nhanh. Chỉ trong vòng 6 năm (từ năm 1998 đến 2004), số
lượng tên thuốc BVTV thương mại đã tăng g
ấp đôi, trong đó thuốc trừ sâu chiếm tỷ
lệ rất cao (499/261) khoảng 45%, thuốc trừ bệnh (364/208) chiếm khoảng 32%, thuốc
trừ cỏ (266/156) chiếm khoag 20%.
Năm 2000, Cục Bảo Vệ thực vật đã có đợt thanh tra lớn, kết quả 70% trong số
19.063 cơ sở bán lẻ thuốc BVTV tại các tỉnh và thành phố trong cả nước hoạt động
không có giấy phép, hoặc bán thuốc ngoài danh mục, hàng không đúng qui cách
Ngoài ra kiế
n thức về sử dụng thuốc BVTV sao cho an toàn, bảo đảm sức khoẻ và
bảo vệ môi trường của đại đa số nông dân còn rất thấp. Nhiều nơi nông dân thích mua
thuốc rẻ, có độc tính cao để sử dụng. Điều này càng làm tăng nguy cơ ngộ độc cho
người sử dụng và huỷ hoại môi trường sống.
1.5. Phương pháp xác định dư lượng thuốc BVTV
1.5.1. Phương pháp phân loại để phân tích thuố
c BVTV
Do tính chất phức tạp của thuốc BVTV: về số lượng (tới trên 1000 chất), về
đặc tính hoá học (rất nhiều nhóm chất khác nhau), và về cả phương thức sử dụng, đối
tượng sử dụng. Chính vì vậy việc phân tích dư lượng thuốc BVTV cần phải được
phân loại cụ thể cho từng đối tượng. Theo tổ chức tiêu chuẩn CODEX, nông sản thực
phẩm và thức ăn ch
ăn nuôi được phân loại thành 86 nhóm khác nhau để phân tích dư
lương thuốc BVTV [26]. Việc phân loại này được chia thành 5 lớp : A,B,C,D và E.
- Lớp A : Các mặt hàng thực phẩm ban đầu có nguồn gốc thực vật, từ nhóm 1
đến nhóm 29.
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009

14
- Lớp B : Các mặt hàng thực phẩm ban đầu có nguồn gốc động vật, từ nhóm
30 đến nhóm 49.
- Lớp C : Các mặt hàng thức ăn chăn nuôi ban đầu, từ nhóm 50 đến nhóm 52.
- Lớp D : Thực phẩm chế biến có nguồn gốc thực vật, từ nhóm 53 đến nhóm
78.
- Lớp E : Các thực phẩm chế biến nguồn gốc động vật, từ nhóm 78 đến nhóm
86.
Đối với lớp A, việc phân loại lại
được chi tiết như sau :
- Loại 1 : Quả, được thu hái từ nhiều loại thực vật lâu năm khác nhau tuỳ thuộc
loại cây gỗ và cây bụi, thường là cây gieo trồng. Chúng bao gồm hầu hết là
quả chín mọng nước hoặc đầy thịt quả, được phát triển từ bầu hoa thực vật và
các phần phụ của nó. Sự tiếp xúc với thuốc bảo vệ thực vật của chúng thườ
ng
phụ thuộc vào phần riêng biệt của quả được dùng làm thực phẩm. Quả có thể
được tiêu thụ toàn bộ sau khi loại bỏ vỏ hoặc một phần quả (loại này được chia
thành 8 nhóm).
- Loại 2 : Rau, được lấy từ nhiều loại khác nhau của các cây, phần lớn được
canh tác một năm. Sự phơi nhiễm thuốc BVTV của rau phụ thuộc vào phần
của cây dùng làm thực phẩm và thự
c tế gieo trồng. Các loại rau được phân
thành các nhóm đặc trưng : rau thân hành, rau cải (cải dầu hoặc cải), rau loại
quả bầu bí, rau loại quả không phải bầu bí, rau lá, rau đậu, đậu hạt, rau thân rễ
củ, rau thân và cuống, cây có tinh dầu và gia vị .v.v (bao gồm 21 nhóm).
1.5.2. Phương pháp lấy mẫu để xác định dư lượng thuốc BVTV

Để bảo đảm tính khách quan, mẫu lấy phải đủ đại diện cho lô hàng phân tích.
Đối với phân tích dư lượ
ng thuốc BVTV thì yêu cầu này càng được qui định một
cách nghiêm ngặt. Trong quá trình lấy mẫu ban đầu, cần tránh không gây nhiễm
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009




15
bẩn mẫu hoặc biến đổi mẫu. Việc lấy mẫu phải phù hợp về số lượng và vị trí khi
lấy mẫu. Đối với đối tượng dạng rời, về số lượng mẫu ban đầu cần lấy theo bảng
sau :
Bảng 3. Số lượng mẫu ban đầu cần lấy
STT Khối lượng lô hàng
(kg)
Số lượng nhỏ nhất các mẫu ban đầu cần l
ấy
1 < 50 3
2 51-500 5
3 501-2000 10
4 >2000 15

Về khối lượng mẫu cần lấy cũng có những qui định cụ thể tuỳ thuộc đối
tượng, dạng sản phẩm. Tiêu chuẩn Việt Nam qui định cho từng đối tượng, dạng sản
phẩm như sau:
Bảng 4. Khối lượng mẫu cần lấy
STT Hàng hoá Tên Lượng yêu cầu
nhỏ nhất
1

Các sản phẩm nhỏ hoặc nhẹ,
mỗi đơn vị sản phẩm dưới 25 g
- Dâu
- Đậu
- Rau mùi tây
-

1 kg

Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009




16
2
Các sản phẩm cỡ trung bình,
mỗi đơn vị sản phẩm thường
nặng giữa 25g và 250 g
- Táo tây
- Cam
- Cà rốt
- Khoai tây
- …
1 kg (Ít nhất 10
đơn vị)
3
Các sản phẩm cỡ lớn, mỗi đơn
vị nặng trên 250g
- Cải bắp

- Dưa gang
- Dưa chuột
- …
2 kg (Ít nhất 5
đơn vị)
4 Các sản phẩm sữa
- Sữa nguyên
chất
- Bơ
- Pho mat
- …
0,5 kg
5
Thịt, thịt gia cầm, mỡ cá, các
sản phẩm thuỷ sản và gia súc
khác
1 kg
6 Dầu thực vật và mỡ 0,5 kg
7
Ngũ cốc và các sản phẩm của
ngũ cốc
1kg

Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009




17
1.5.3. Phương pháp phân tích dư lượng thuốc BVTV

Hiện nay các phương pháp cơ bản được sử dụng để xác định dư lượng thuốc
BVTV gồm có: phương pháp ELIA, phương pháp TLC, phương pháp CE, phương
pháp HPLC, phương pháp GC (mở rộng có LC/MS và GC/MS)[15] [16] [17] [24].
- Phương pháp EIA hay ELIZA là phương pháp thử nghiệm miễn dịch, gắn enzyme
theo phương pháp cạnh tranh trực tiếp. Dung dịch chiết xuất từ mẫu được trộn với
conjugate (kết gắn). Hỗn hợp
được chuyển vào các giếng phủ kháng thể, tại đó chất
cần phân tích và conjute cạnh tranh nhau để gắn kết với kháng thể. Phương pháp này
sử dụng dạng kit thử được chế tạo sẵn, ưu điểm là đơn giản, dễ thao tác, cho kết quả
nhanh (chỉ trong vòng một giờ); tuy nhiên độ chính xác không thật cao, để khẳng
định kết quả vẫn phải sử dụng kết hợp các phươ
ng pháp khác.
- Phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC), phương pháp này được phát triển từ những
năm 1950 và được ứng dụng khá rộng rãi với ưu điểm là đơn giản, rẻ tiền. Phương
pháp có thể sử dụng để phân tích định tính, định lượng nhiều loại thuốc BVTV. Rất
nhiều bộ TCVN về xác định dư lượng thuốc BVTV vẫn còn sử dụng phương pháp
này.
- Phương pháp đi
ện di mao quản (CE). Những năm gần đây, điện di mao quản phát
triển và trở thành một kỹ thuật có tiềm năng trong nghiên cứu. Giai đoạn đầu, CE
được ứng dụng chủ yếu vào phân tích sinh học, thời gian gần đây đã được đã được
ứng dụng nhiều trong phân tích hoá học. CE có khả năng phân tích nhanh và có hiệu
quả các hợp chất dạng ion, ion hoá và các hợp chất trung tính dựa trên một kỹ thuậ
t
khác với sắc ký khí và sắc ký lỏng, vì vậy CE là một kỹ thuật có giá trị khi kết hợp
với sắc ký để phân tích một số chất BVTV, khi các hợp chất này cần phải dẫn xuất
hoá khi phân tích bằng sắc ký khí hoặc không thể phân tích bằng sắc ký lỏng.
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009

18
- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), về nguyên tắc, kỹ thuật tách bằng
HPLC giống với sắc ký cột truyền thống, tuy nhiên HPLC dùng bơm cao áp, cột nhồi
nhỏ, các cấu tử được phát hiện bằng các detector có độ nhậy cao.
- Phương pháp sắc ký khí (GC), phương pháp này liên quan đến sự tương tác giữa
pha hơi và pha tĩnh nên khó phát hiện các chất không bay hơi. Có hai loại sắc ký khí
là sắc ký khí - lỏng (pha tĩnh là chất lỏng) và sắc ký khí - rắ
n (pha tĩnh là chất rắn).
Mẫu được bơm vào buồng mẫu có nhiệt độ cao đủ để mẫu có thể hoá hơi, khí mang
sẽ kéo theo các cấu tử phân tích qua cột. Tại đây sẽ có sự tương tác với pha tĩnh dẫn
đến thời gian lưu của các cấu tử sẽ khác nhau. Các cấu tử sẽ lần lượt đi ra khỏi cột và
đi vào detector. Detector sẽ cho tín hiệu khi có mặt một chất hoặc m
ột nhóm chức
nào đó. Tín hiệu này có cường độ tỷ lệ với nồng độ cấu tử được phát hiện.
- Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS). Sự kết hợp giữa sắc sắc ký khí (GC) và
khốiphổ (MS), tạo nên một phương pháp phân tích đặc biệt có hiệu quả trong lĩnh
vực hoá phân tích. Hai thiết bị này có khả năng bổ sung và hỗ trợ cho nhau trong quá
trình phân tích (GC: tách, MS: phát hiện), vì vậy phương pháp này được sử
dụng rất
hữu hiệu cho quá trình khảo sát, định lượng các chất[13]. Hai kỹ thuật trên ghép nối
với nhau có thể tách và định lượng các chất có nồng độ 10
-10
gram hoặc nhỏ hơn nữa,
đây là nồng độ rất khó phát hiện ở các phương pháp phân tích công cụ khác. Ngoài
ra, với sự kết nối này, những mẫu không bền trong thời gian bảo quản cũng có có thể
được phân tích một cách thuận lợi, đặc biệt là việc phân tích các hỗn hợp phức tạp.
Nhờ đó, có thể tiết kiệm khá nhiều thời gian thực nghiệm vì phân lập mẫu theo
nguyên tắc điề

u chế trước khi đưa vào khối phổ do vậy giảm nhẹ yêu cầu kỹ thuật đối
với các kỹ thuật viên.
Về cơ bản, thiết bị sắc ký sử dụng cột nhồi hoặc cột mao quản có thể ghép nối
thiết bị khối phổ loại hội tụ chùm tia đơn hoặc kép [4], [9]. Có nhiều giải pháp kỹ
thuật khác nhau để thực hiện việc ghép nối trong h
ệ thống. Với thiết bị hiện đại ngày
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009




19
nay, toàn bộ dòng khí thoát ra (khí mang và mẫu) từ cột nhồi hoặc cột mao quản được
chuyển thẳng vào bộ phận chiết khí mang trung gian, sau đó được đưa trực tiếp vào
nguồn ion hoá mẫu. Thiết bị chiết khí mang trung gian có thể có những cấu trúc khác
nhau, nhưng khi làm việc chúng phải tuân theo một nguyên lý chung là khuếch tán
qua hệ thống lỗ xốp hoặc khuyếch tán trong một thiết bị tách khuếch tán phân tử.
Sắc ký đồ được ghi lại t
ừ tín hiệu của dòng ion tổng cộng. Những sắc đồ thu
được từ tín hiệu dòng ion hoá và detector ion hoá ngọn lửa nói chung tương tự nhau.
Sắc ký khối phổ đã được sử dụng rộng rãi, đặc biệt nó có thể giúp phát hiện
các cấu tử trong hỗn hợp phức tạp. Nhiều cải tiến quan trọng đã được áp dụng, đặc
biệt trong phân tích các hợp chất sinh hoá. Ngoài ra các chương trình xử lý số liệu khi
ghép nố
i với máy tính khiến quá trình phân tích trở nên đơn giản hơn và cho phép thu
được những kết quả đáng tin cậy.
Phổ khối được sử dụng như một detector đặc biệt có độ nhạy cao. Trong
trường hợp này, các thiết bị sẽ cho các giá trị số khối khác nhau và dòng ion đáp ứng
được tập hợp và ghi lại dưới dạng một sắc đồ (phân mảnh khối). quá trình này cho
phép xác định được tất cả các mẫ

u có nồng độ rất nhỏ (tới 10
-10
g).
Về nguyên tắc hoạt động của detector khối phổ, khi cho một chất ở trạng thái
khí va chạm với một dòng electron thì phân tử chất có thể bị tách ra một hoặc hai
electron để trở thành các ion mang dương mang điện tích 1 hoặc 2; cũng có thể quá
trình va chạm này làm phân tử chất tiếp nhận thêm electron để trở thành ion âm gọi là
ion hoá phân tử. Khi va chạm mạnh hơn thì phân tử còn có thể bị phá vỡ ra thành
nhiều phần khác nhau mang đ
iện tích dương hoặc âm. Sự phá vỡ này hoàn toàn phụ
thuộc vào năng lượng va chạm dẫn đến các cách phá vỡ phân tử khác nhau. Các ion
này sẽ được tách và đo khối lượng sau đó ghi trên sắc phổ đồ.
Một ưu điểm của sự kết hợp GC/MS là có thể được áp dụng một cách hữu
hiệu cho việc nghiên cứu và phân tích các chất đồng vị bền. Nhờ những ưu điểm
đó
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009




20
mà kỹ thuật phân tích GC/MS ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong phân tích dư
lượng các chất kích thích, độc chất dễ bay hơi trong kiểm soát vệ sinh an toàn thực
phẩm và bảo vệ môi trường.
Ngoài những kỹ thuật phân tích đã nêu trên, hiện nay với sự phát triển không
ngừng của khoa học, kỹ thuật phân tích sắc ký khố phổ đã nâng lên thành
LC/MS/MS; GC/MS/MS, với sự ghép nối hai lần khối phổ này làm tăng lên rất nhiều
độ chính xác củ
a phương pháp, và khẳng định sự chắc chắn cho các kết quả thu được.

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Các loại rau quả nghiên cứu
Trong phạm vi đề tài này, các loại rau quả tươi được lấy từ các chợ trên
địa bàn Hà Nội để khảo sát và nghiên cứu
2.1.2. Các thuốc BVTV nghiên cứu
Nhóm Clo- hữu cơ: 10 loại
Aldrine
1)
, BHC(BHC alpha, beta, gamma, and delta)
2)
, Chlorobenzilate,
Dieldrin
1)
, DDT

(o,p'-DDD, p,p'-DDD, p,p'-DDE, p,p'-DDT)
1) 2)
,
Endosulfan(Endosulfan alpha, beta, and Endosulfan sulfate)
2)
, Endrin,
Heptachlor (Heptachlor, Heptachlor Epoxide isomer A, isomer B)
1) 2)
,
Dicofol, Phenisobromorate.
Nhóm Photpho-hữu cơ: 30 loại
Butamifos, Cadusafos, Chlorpyrifos, Chlorpyrifosmethyl, Chlorfenvinfos(
(E)- and (Z)-Chlorfenvinfos)
2)

, Cyanofenphos, Diazinon, Dimethoate,
Edifenphos, EPN, Ethion, Ethoprophos, Etrimfos, Fenitrothion, Fensulfothion,
Fenthion, Iprobenfos, Isoxathion, Malathion, Methidathion, Methylparathion,
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009




21
Parathion, Phenthoate, Phorate, Phosalone, Pirimiphos-methyl, Prothiofos,
Quinalphos, Salithion, , Terbufos, Tolclofos-methyl.
Nhóm Pyrethroid: 10 loại
Bifenthrin, Cyfluthrin, Cyhalothrin, Cypermethrin, Ethofenprox,
Fenpropathrin, Fenvalerate, Flucythrinate, Fluvalinate, Permethrin, Tefluthrin
.
Nhóm cacbamate: 12 loại
Bendiocarb, Benthiocarb, Carbaryl, Chloro IPC, Diethofencarb, Fenobucarb,
Isoprocarb, Metolcarb, Pirimicarb, Propoxur, Swep, XMC, Xylylcarb.
Nhóm Anilide: 6 loại
Alachlor, Flutolanil, Mepronil, Metalaxyl, Oxadixyl, Propanil .
Nhóm Acaricide: 3 loại
Halfenprox, Pyridaben, Tebufenpyrad.
Nhóm ức chế tổng hợp sinh học Ergosterol (EBI): 5 loại
Bitertanol, Fenarimol , Propiconazole , Triadimefon, Triadimenol,
Triflumizole (Triflumizole and Triflumizole metabolite)


Nhóm ức chế sự tăng trưởng của côn trùng (IGR): 1 loại
Buprofezin.
Các loại khác: 9 loại

Atrazine, Chlorfenapyr, Difenamid, Fenoxaprop - ethyl,
Kresoxim-methyl, Paclobutrazol, Pendimetharin, Procymidone,
Trifluralin.




Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009




22
2.2.Cách tiến hành thực nghiệm
Các thiết bị, dụng cụ, hóa chất
Thiết bị phân tích:
- Máy sắc ký khí Agilent
TM
model 6890N.
- Detector khối phổ Agilent
TM
model 5973i.
Dụng cụ:
- Máy cô quay chân không có hệ điều chỉnh áp suất,nhiệt độ.
- Máy đồng hóa mẫu
- Máy cất nước khử ion
- Cân điện tử
- Bơm chân không có van chỉnh áp
- Máy lắc đứng
- Phễu chiết loại 500ml, Yamato Nhật Bản.

- Bình cầu cổ nhám loại 300ml và 100ml.
- Ống đong 100ml, 200ml.
- Phễu lọc chân không Kiriyama loại 60mm.
-
Phễu thủy tinh.
- Giấy lọc 5C.
- Các loại pipet thể tích 0,5ml, 1ml, và 2ml, pipet Pasteur:loại thủy tinh
dài.
- Các bình định mức 10ml, 20ml, 50ml, 100ml.
- Ống nghiệm, bông thủy tinh.
- Bể lọc chân không, Supelco
TM
.
- Lọ thủy tinh (Vial) đựng mẫu loại 1,5 đến 2ml, dung cho hệ bơm mẫu tự
động của hệ thống GC/MS.
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009




23
- Các loại cột làm sạch pha rắn: Supelclean
TM
ENVI-Carb/LC-NH
2
6ml
(500mg/500mg): Supelco
TM
part# 54035-U, Cột Florisil, Ôxit nhôm,
Silicagen.

Hóa chất:
- Acetonitril: độ tinh khiết dùng cho hệ thống HPLC.
- n-Hexan: Độ tinh khiết dùng cho phân tích thuốc BVTV.
- Aceton: Độ tinh khiết dùng cho phân tích thuốc BVTV.
- Toluen: Độ tinh khiết dùng cho phân tích thuốc BVTV.
- Ethyl acetat: Độ tinh khiết dùng cho phân tích thuốc BVTV.
- Natri Chloride (NaCl): Độ tinh khiết dùng cho phân tích hóa học.
- Natri sulfate khan (Na
2
SO
4
): Độ tinh khiết dùng cho phân tích hóa học.
- Celite
TM
: Độ tinh khiết dùng cho phân tích hóa học.
- Triphenyl phosphate: Độ tinh khiết > 99,9%.
- Khí Nitrogen: Độ tinh khiết > 99,99%
- Khí Helium: Độ tinh khiết > 99,999%
- Chất chuẩn của các loại thuốc BVTV, đều phải có độ tinh khiết dùng
phân tích sắc kí khí và chứng chỉ chất lượng phù hợp.
- n- Hexan bão hòa với Acetonitril.
Lắc n-hexan và acetonitril với tỷ lệ thể tích phù hợp, giữ lại lớp n-Hexan.
- Toluen/Ethyl acetate 2:8 (V/V) : Dùng ống đong lấy chính xác 2 phần thể
tích toluen và 8 phầ
n thể tích ethyl acetate, trộn đều vào nhau.
- Dung dịch nội chuẩn gốc (1mg/ml).
Cân chính xác 100mg triphelyl phosphate cho vào bình định mức 100ml,
hòa tan và định mức bằng dung môi acetone.
- Dung dịch nội chuẩn nồng độ 10µg/ml
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 2009

24
Dùng pipet lấy chính xác 1ml dung dịch nội chuẩn gốc nồng độ 1mg/ml
cho vào bình định mức 100ml, định mức đến vạch bằng dung môi aceton.
* Pha dung dịch chuẩn:
- Dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1mg/ml pha trong bình định mức màu
nâu, cổ nhám bảo quản ở nhiệt độ < 4
0
C để tránh bay hơi, dung môi pha
là aceton.
- Dung dịch chuẩn trung gian: Dung dịch này có nồng độ 100 µg/ml được
chuẩn bị bằng cách lấy chính xác 1ml dung dịch chuẩn gốc 1mg/ml cho
vào bình định mức nâu 10ml, định mức đến vạch bằng acetone, lắc đều,
bảo quản ở nhiệt độ < 4
0
C.
- Dung dịch chuẩn làm việc hàng ngày: Dung dịch này được pha ở nồng
độ 10 µg/ml bằng cách lấy chính xác 1ml dung dịch chuẩn bằng acetone,
lắc đều, bảo quản ở nhiệt độ < 4
0
C.
* Xây dựng đường nội chuẩn:
Đường nội chuẩn được xây dựng dựa trên mối quan hệ giữa tỷ lệ nồng độ chất
cần phân tích với nồng độ chất nội chuẩn ( biểu diễn trên trục hoành) và tỷ lệ của số
đếm diện tích píc của chất cần phân tích với nội chuẩn ( biểu diễn trên trục tung).
X ( trục hoành): Nồng độ của chất phân tích/ nồ
ng độ chất nội chuẩn.

Y(trục tung): Số đếm diện tích pic chất phân tích / Số đếm diện tích pic chất nội
chuẩn.
Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành xây dựng đường nội chuẩn của các chất
nghiên cứu ở năm điểm nồng độ: 0,050
µg/ml; 0,100 µg/ml; 0,500 µg/ml; 1,000 µg/ml
và 5,000 µg/ml
. Chất nội chuẩn triphenyl phosphate nồng độ 1,000 µg/ml. Cách pha
thể hiện ở bảng 5