Kháng thể trung hoà và cytokine trong sữa mẹ ảnh hưởng đối với vắc xin phòng rotavirus

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
QUỸ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ QUỐC GIA






BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Tên đề tài: KHÁNG THỂ TRUNG HÒA VÀ CYTOKINE TRONG
SỮA MẸ: ẢNH HƯỞNG ĐẾN VẮC XIN PHÒNG ROTAVIRUS



Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Đặng Đức Anh
Đơn vị chủ trì: Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương
Thời gian thực hiện: Từ 9/2010 đến 9/2011
Mã số đề tài: 106.99.182.09

Hà nội - 2012


2

MỤC LỤC

Những từ viết tắt….………………………………………………………………
3
Bảng tóm tắt nghiên cứu…………………………………………………………
4
Phần I. Thông tin chung……………………………………………………………
6
Phần II. Nội dung và kết quả nghiên cứu

1. Tổng quan……………………………………………………………………….
7
2. Mục tiêu …………………………………………………………………………
9
3. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu…………………………………………
9
4. Kết quả nghiên cứu……………………………………………………………
11

5. Bàn luận…………………………………………………………………………
31
6. Kết luận………………………………………………………………………….
33
7. Tài liệu tham khảo
35
Phần III. Kết quả công bố và đào tạo
39
Phần IV. Tình hình sử dụng kinh phí………………………………………………
42
Phần V. Kiến nghị………………………………………………………………
42

PHỤ LỤC

1. Các quy trình thao tác chuẩn…………………………………………………….
43
1.1. Quy trình lấy, vận chuyển và bảo quản mẫu phân
44
1.2. Quy trình ELISA xác định RV-IgA
48
1.3. Quy trình định lượng kháng thể trung hòa trong mẫu sữa
58
1.4. Quy trình trung hòa giảm đám hoại tử
62
1.5. Quy trình ELISA định lượng TGF-1
63
1.6. Quy trình ELISPOT xác định đáp ứng tế bào sinh kháng thể đặc hiệu RV
65
2. Danh sách mẫu và kết quả xét nghiệm………………………………………….

68
3. Giấy chứng nhận Y đức của Hội đồng cấp cơ sở………………………………
69
4. Thông tin người cho mẫu sữa……………………………………………………
70
5. Phiếu chấp thuận tham gia nghiên cứu (dành cho mẫu sữa)………………….…
72
6. Phiếu chấp thuận tham gia nghiên cứu (dành cho mẫu máu cuống rốn)………
76
7. Các bài báo công bố từ kết quả của đề tài……………………………………….
79




3
NHỮNG TỪ VIẾT TẮT


ACIP
Hội đồng cố vấn về tiêm chủng – Tổ chức Y tế thế giới
ELISA
Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme
ELISPOT
Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme tạo điểm
MEM
Môi trường minimul essential medium
MN
Microneutralization assay
Kỹ thuật trung hòa vi lượng

POLYVAC
Trung tâm sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế
RRV
Rhesus rotavirus – chủng virus từ khỉ
RV
Rotavirus
TGF-ß1
Transforming growth factor beta 1
Yếu tố chuyển đổi tăng trưởng beta 1
VN
Kháng thể trung hòa virus
WHO
Tổ chức y tế thế giới




4
BẢNG TÓM TẮT NGHIÊN CỨU

Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định hiệu giá kháng thể IgA, kháng thể trung hoà với các type rotavirus (RV) lưu
hành ở Việt nam và hàm lượng TGF-β1 trong sữa mẹ.
- Đánh giá ảnh hưởng bởi sữa mẹ đến vắc xin Rotavin-M1 phòng tiêu chảy do RV.
• Đánh giá khả năng sữa mẹ làm giảm hiệu giá virút trong vắc xin phòng
rotavirus.
• Đánh giá ảnh hưởng của TGF-β1 đến đáp ứng miễn dịch đối với vắc xin
phòng tiêu chảy do RV.

Phương pháp và đối tượng nghiên cứu

300 mẫu sữa (20-30 ml) được thu thập từ các bà mẹ tại thành phố Thái Bình và
huyện Thanh Sơn, tỉnh Phú Thọ. Phụ nữ lựa chọn tham gia nghiên cứu là phụ nữ khoẻ
mạnh, có con từ 6 tuần tuổi đến 6 tháng tuổi và đang cho con bú, không có bệnh tật, đồng
ý tham gia nghiên cứu và ký đơn tình nguyện tham gia nghiên cứu. Những phụ nữ đang
bị mắc các bệnh cấp tính, sốt (>38
o
C) trong vòng 3 ngày trước khi đ ến địa điểm cho mẫu
không được chọn tham gia nghiên cứu.
Kháng thể trung hoà kháng RV trong sữa mẹ được định lượng bằng phương pháp
trung hoà vi lượng (microneutralization assay) sử dụng chủng virus vắc xin G1P[8]
(Rotavin-M1) và G4P[6] (do POLYVAC, PGS/TS Lê Thị Luân cung cấp), cùng với một
số chủng chuẩn phòng thí nghiệm như DS1 (G2P[4]) và RRV (G3P[3]). Cytokine TGF-
β1 ở cả 2 dạng, tự do và ẩn trong sữa mẹ được định lượng bằng ELISA dựa trên đường
chuẩn nồng độ của bộ kít Emax Immunoassay Systems (Promega).
Ảnh hưởng của kháng thể với hiệu giá khác nhau trong sữa đến hiệu giá vắc xin
Rotavin-M1 được đánh giá bởi kỹ thuật trung hòa giảm đám họa tử. Để đánh giá ảnh
hưởng của sữa mẹ đến đáp ứng kháng thể đối với Rotavin-M1, đáp ứng tế bào sinh kháng
thể bằng kỹ thuật ELISPOT được đánh giá trên vitro sử dụng tế bào lympho, kích hoạt
bởi RV-chủng Wa với sụ có mặt của TGF-β1 với các nồng độ khác nhau.
Kết quả
Tỷ lệ mẫu sữa có kháng thể IgA đặc hiệu rotavirus cao, trên 93% ở cả 2 địa điểm
nghiên cứu, trong đó 68% mẫu có kháng thể trung hòa đối với 1 trong 2 chủng G1 và G4,
chủ yếu với hiệu giá thấp (2-16). Không có sự khác biệt về hiệu giá kháng thể trung hòa
giữa hai điểm nghiên cứu, tuy nhiên kháng thể IgA đặc hiệu rotavirus cao hơn ở Thái
Bình so với Thanh Sơn, Phú Thọ cho thấy mức độ tiếp xúc với virus khác nhau giữa nông
thôn miền núi và thành thị. Sữa mẹ giảm 80% lượng virus trong vắc xin ngay cả khi đã
pha loãng 8-128 lần. Phần lớn mẫu sữa (57-89%) có chứa TGF-ß1, nồng độ cao nhất là
1,4ng/ml. Ở nồng độ cao (5ng/ml), TGF-1 ức chế sự tăng trưởng của tế bào lympho. Ở
nồng độ thấp (0,1ng/ml), TGF-ß1 kích thích kháng thể IgA (toàn phần và đặc hiệu RV).
Như vậy, nghiên cứu này một lần nữa khẳng định sự điều chế đáp ứng miễn dịch của

TGF-ß1 phụ thuộc vào nồng độ của cytokine này.



5

Kết luận
Kháng thể trung hòa RV và TGF-ß1 trong sữa mẹ trung hòa virus trong vắc xin và ảnh
hưởng đến đáp ứng miễn dịch đối với RV invitro. Cần có các nghiên cứu tiếp theo để
đánh giá khả năng sữa mẹ ảnh hưởng đến tính sinh miễn dịch và hiệu lực của vắc xin ở
trẻ em Việt Nam.



6
Mẫu M4a


PHẦN I. THÔNG TIN CHUNG
1. Tên đề tài: Kháng thể trung hòa và cytokine trong sữa mẹ: Ảnh hưởng đến vắc xin
phòng rotavirus
2. Mã số:106.99.182.09
3. Danh sách chủ nhiệm, thành viên tham gia thực hiện đề tài:
TT
Họ và tên
Đơn vị công tác
Chức danh trong đề tài
1
PGS.TS. Đặng Đức Anh
Viện Vệ Sinh Dich Tễ TƯ

Chủ nhiệm đề tài
2
T.S. Nguyễn Vân Trang
Viện Vệ Sinh Dich Tễ TƯ
Thành viên tham gia chính
3
Th.S. Vũ Thị Bích Hậu
Viện Vệ Sinh Dich Tễ TƯ
Kỹ thuật viên
4
Th.S. Lê Thị Hồng Nhung
Viện Vệ Sinh Dich Tễ TƯ
Kỹ thuật viên
5
CN. Trần Thị Nhã
Viện Vệ Sinh Dich Tễ TƯ
Kỹ thuật viên
6
CN. Ngô Thị Thanh Hoa
Viện Vệ Sinh Dich Tễ TƯ
Kỹ thuật viên
7
CN. Lê Thị Kim Anh
Viện Vệ Sinh Dich Tễ TƯ
Kỹ thuật viên
4. Tổ chức chủ trì: Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương
5. Thời gian thực hiện:
5.1 Theo hợp đồng: 24 tháng, từ (11/2009) đến (11/2011)
5.2 Gia hạn (nếu có): tháng
5.3 Thực hiện thực tế: 24 tháng, từ (11/2009) đến 11/2011)

6. Tổng kinh phí được phê duyệt củ a đề tài: 730 triệu đ ồng.
Hà nội ngày tháng năm 2012
Tổ chức chủ trì đề tài
(Thủ trưởng đơn vị ký tên, đóng dấu)
Chủ nhiệm đề tài
(Họ tên, chữ ký)



PGS. TS. Đặng Đức Anh
Mã số hồ sơ

Ngày nhận báo cáo

(Do Cơ quan điều hành Quỹ ghi)


7

PHẦN II. NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Tổng quan
Rotavirus (RV) là loại virút không có vỏ ngoài, có vật liệu di truyền là ARN kép,
thuộc họ Reoviridae (10). RV được phân nhóm thành A, B và C dựa theo protein VP6 ở
lớp vỏ trong, với nhóm A gây nhiễm trên người với tỷ lệ cao nhất. Trong cùng một
nhóm, RV được phân chia thành các genotyp hoặc serotyp, dựa trên cả 2 protein lớp vỏ
ngoài của virút là VP4 và VP7, hay còn gọi là P genotyp và G genotyp. Hiện nay có đến
15 G genotyp và 22 P genotyp được phát hiện. Do tính đa dạng của RV, trẻ có thể bị
nhiễm một hoặc nhiều chủng trong cùng một năm.
Sau khi nhiễm RV, kháng thể IgA là thành phần chính được tạo ra tại niêm mạc

ruột. Kháng thể IgA đặc hiệu với RV trong phân của trẻ có liên quan đến việc bảo vệ trẻ
khỏi bị nhiễm virút và tiêu chảy (9). Đây cũng là kháng thể chính có mặt trong các dịch
thể như nước bọt, dịch ruột, dịch mật và sữa mẹ . Kháng thể IgA có khả năng trung hoà
hoặc ngăn chặn sự xâm nhập của RV qua rào chắn màng ruột. Sau khi nhiễm RV, kháng
thể IgG được tạo ra chủ yếu ở máu, một số lượng nhỏ IgG có khả năng thẩm thấu từ máu
ra niêm mạc ruột và trung hoà RV ở đây (29). Ở trẻ, kháng thể trung hoà đặc hiệu RV rất
cần thiết để tạo miễn dịch ngăn ngừa tình trạng nhiễm và tiêu chảy do virút này (11).
Hàng năm, ước tính trên thế giới RV là nguyên nhân gây ra 1,4 tỷ ca tiêu chảy ở
trẻ dưới 5 tuổi với 608,000 trường hợp tử vong, chiếm tỷ lệ 5% trong các ca tử vong ở trẻ
dưới 5 tuổi (5). Trong hơn 30 năm qua, nhiều loại vắc xin phòng RV đã và đang được
nghiên cứu như vắc xin từ chủng gây nhiễm trên bò, khỉ, người hoặc vắc xin tái tổ hợp từ
những chủng trên. Tuy nhiên các vắc xin này có hiệu quả không cao và không đồng đều
giữa các địa điểm nghiên cứu, giữa các nước phát triển và đang phát triển. Vắc xin tái tổ
hợp dựa trên chủng virút trên người và khỉ rhesus RRT-TV có hiệu lực cao ở Mỹ và Phần
Lan, nhưng lại kém hiệu quả khi thử nghiệm ở các nước phát triển như Peru và Brazil (3,
15, 18, 37). Một trong những nguyên nhân được xem xét là ảnh hưởng của kháng thể
nhận từ mẹ đến vắc xin (39). Kháng thể nhận từ mẹ qua rau thai hoặc qua sữa vừa có thể
bảo vệ con khỏi nhiễm virút và tiêu chảy, vừa ảnh hưởng đến khả năng gây miễn dịch và
bảo vệ của vắc xin trên trẻ. Nghiên cứu về kháng thể đặc hiệu RV ở bà mẹ và trẻ em ở
New York, Mỹ và Venezuela cho thấy kháng thể trẻ nhận từ mẹ trước khi sử dụng vắc
xin RRV (làm từ chủng RV gây nhiễm trên khỉ rhesus) làm giảm động lực kháng thể
(seroconversion) ở trẻ sau khi tiêm vắc xin. Một số thử nghiệm lâm sàng khác cũng cho
thấy động lực kháng thể sau khi dùng vắc xin phòng RV giảm đi nhiều ở trẻ có kháng thể
mẹ cao. Ở các nước đang phát triển như Banglades, Venezuela v.v , kháng thể mẹ đặc
hiệu RV cao và bao phủ một khoảng hiệu giá rộng (8, 34, 39), trong khi đó ở các nước
phát triển như Australia, Đức, Mỹ, kháng thể này thấp hơn và phủ một khoảng hiệu giá
hẹp hơn nhiều (6, 21, 38, 45). Vắc xin Rotarix khi cho uống 2 liều cách nhau 1 tháng chỉ
đạt được động lực kháng thể trong 50% trẻ ở Châu Phi, 50-60% ở các nước Châu Á,
trong khi tỷ lệ này là 70-90% ở Mỹ, các nước Mỹ latinh và Châu Âu.
Cũng như ở người, mặc dù kháng thể mẹ truyền cho con có khả năng bảo vệ trên

mô hình động vật như bò, lợn và khỉ (12, 31, 47), kháng thể mẹ truyền cũng ức chế khả
năng tạo miễn dịch bảo vệ của vắc xin trên lợn (25, 27). Chúng tôi cũng đã chỉ ra rằng


8
mức độ ảnh hưởng đối với vắc xin phụ thuộc vào hiệu giá kháng thể mẹ (Xem phần tiến
độ nghiên cứu).
Sữa mẹ, ngoài các chất dinh dưõng cần thiết cho cơ thể, sữa mẹ chứa kháng thể và
các yếu tố miễn dịch, có tác dụng bảo vệ trẻ khỏi các bệnh truyền nhiễm đặc biệt là tiêu
chảy. Tuy nhiên sự có mặt của kháng thể và các yếu tố miễn dịch như cytokine có thể
ảnh hưởng đến hiệu lực của vắc xin, đặc biệt là vắc xin sống. Sữa mẹ có chứa TGF-β 1,
hàm lượng từ 100pg/ml -3000pg/ml. Cytokine này đóng vai trò điều hoà miễn dịch trong
quá trình mang thai và khi sinh, đồng thời cytokine này là nguyên nhân của hệ miễn dịch
trẻ sơ sinh nghiêng về loại Th2 (16, 35). Để làm việc này, TGF-β1 ức chế tế bào ghi nhớ
Th1 trong bào thai, làm cho hệ miễn dịch của trẻ có chiều hướng nghiêng về Th2 ngay từ
trước khi sinh (20, 46). Khi TGF-β1 truyền cho chuột con thông qua chuột mẹ trong thời
gian mang thai hoặc qua sữa khi cho bú đã cứu chuột con mới sinh thiếu gen sản sinh
TGF-β1 khỏi những ảnh hưởng tim mạch nghiêm trọng (17). Ở những chuột đang bú
mẹ, cho chuột ăn sữa bột không có TGF-β1 dẫn đến phản ứng dị ứng thức ăn bao gồm
tập trung sản xuất IL-18, số lượng lớn tế bào dendritic, bạch cầu ưa axit, và tế bào mast
(33). Những phản ứng viêm trên chuột đang bú này có thể giảm đi bằng cách cho chuột
ăn khẩu phần có thêm TGF-β2. Ở người, TGF-β1 và TGF-β2 trong sữa non liên quan
đến nồng độ IgA trong máu trẻ trong tháng đầu sau khi sinh (30). Ở lợn, nồng độ TGF-
β1 thấp kích thích quá trình chuyển isotype sang IgA, trong khi đó nồng độ TGF-β1 cao
ức chế tế bào sản xuất IgA. Khi cho chuột ăn TGF-β1, lượng cytokine này giữ nguyên
hoạt tính trong ruột, và làm giảm kháng thể IgE và IgG1 đặc hiệu với kháng nguyên, và
tăng tolerance với thức ăn (1). Như vậy TGF-β1 trong sữ a mẹ có khả năng ảnh hưởng
đến đáp ứng miễn dịch của trẻ đối với vắc xin phòng RV.

Tình hình nghiên cứu trong nuớc

Ở nước ta, tỷ lệ nhiễm RV trên trẻ em bị tiêu chảy phải nhập viện là 44-62% (28,
44) với ước tính 5300-6800 ca tử vong hàng năm ở trẻ dưới 5 tuổi, chiếm 8-11% tỷ lệ tử
vong ở trẻ có cùng độ tuổi. Ước tính rằng ở nước ta, hàng năm đã có 820.000 ca cần hỗ
trợ của bác sỹ và 122.000-140.000 trường hợp nhập viện và do tiêu chảy với tác nhân là
RV (2). Tình trạng nhiễm RV ở miền Bắc khác với miền Trung và miền Nam (28) Ở
miền Bắc, tiêu chảy do RV thường xảy ra vào mùa lạnh, trong khi đó các tháng hè tỷ lệ
nhiễm giảm xuống. Ở miền Trung và Nam, nhiễm RV xảy ra quanh năm với tỷ lệ tương
đương. Chủng RV lưu hành ở Việt Nam đa dạng với chủng G1, G2, G4 và G9 chiếm tỷ
lệ đáng kể (44). Hiện tại, G3 đang là chủng lưu hành rộng rãi ở nước ta.
Do nhu cầu cấp thiết chế tạo vắc xin phòng RV ở Việt Nam, Trung tâm khoa học
sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế (POLYVAC), hợp tác với Trung tâm kiểm soát và
phòng ngừa bệnh tật CDC, Mỹ đang tiến hành nghiên cứu vắc xin phòng RV sử dụng
chủng phân lập Việt Nam (Rotavin) và sẽ tiến hành thử nghiệm vắc xin này (19). Tuy
nhiên bên cạnh thử nghiệm vắc xin, cần có những nghiên cứu về yếu tố ảnh hưởng đến
hiệu lực của vắc xin ở những địa điểm khác nhau.
Rotavirus (RV) nhóm A là tác nhân phổ biến gây ra tiêu chảy cấp ở trẻ em chiếm
30-50% trong các tác nhân gây tiêu chảy cấp. Với tỷ lệ nhiễm RV cao ở trẻ, trong suốt
hơn 30 năm qua, vắc xin phòng RV đã và đang được phát triển để bảo vệ trẻ. Hiện nay,
có 2 vắc xin phòng RV là vắc xin Rotarix (Glaxo-Smith-Kline, GSK) và RotaTeq
(Merck) đã được Tổ chức kiểm dịch Thực phẩm và Thuốc (FDA), Mỹ cấp phép sử dụng
ở trẻ em. Cả hai vắc xin này đều đã được Hội đồng cố vấn về tiêm chủng của Tổ chức Y


9
tế Thế giới (Advisory Committee on Immunization practices) khuyên dùng cho trẻ từ 1.5-
4 tháng tuổi. Rotarix đã được bán rộng rãi ở Việt Nam, tuy nhiên với giá thành cao (gần
50 đô la Mỹ/liều) và không thuộc chương trình tiêm chủng mở rộng, khả năng đưa vắc
xin này đến đa số dân nước ta là rất ít. Ở Việt Nam, chúng ta cũng đang sản xuất thử vắc
xin phòng RV và đang đưa vào thử nghiệm.
Tuy nhiên, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực của vắc xin cần được xem xét.

Một trong các yếu tố đó là kháng thể đặc hiệu RV trong sữa mẹ có khả năng trung hoà
làm giảm hiệu giá của vắc xin, dẫn tới làm giảm hiệu lực củ a vắc xin. Ảnh hưởng bởi
kháng thể mẹ truyền đối với vắc xin phòng sởi đã được biết đến từ lâu, và do đó trẻ chỉ
được tiêm vắc xin này ở độ tuổi 9-15 tháng. Ảnh hưởng của kháng thể mẹ đối với vắc xin
phòng RV đã được chứng minh ở các mô hình động vật. Trong khi vắc xin phòng RV có
tên RIT4327 cho hiệu lực cao trong các thử nghiệm lâm sàng ở Phần Lan, vắc xin này lại
không bảo vệ trẻ em ở Rwanda, Gambia cũng như một khu vực dân cư thuộc vùng Tây
Nam nước Mỹ. Tương tự như vậy, vắc xin RRV-TV có hiệu quả cao ở Mỹ và Phần lan
nhưng lại có hiệu quả kém hơn ở Brazil và Peru. Trong khi đó các thử nghiệm lâm sàng
của Rotarix này ở các nước đang phát triển ở Châu Á cũng cho hiệu lực thấp hơn so với
các nư ớc như Mỹ, Châu Mỹ la tinh và Châu Âu. Đ iều này cho thấy có sự khác biệt đáng
kể giữa hiệu lực của vắc xin ở các địa điểm khác nhau. Giả thuyết đưa ra là hiệu giá
kháng thể trong sữa mẹ ở các nước đang phát triển cao hơn ở các nước phát triển, do đó
khả năng trung hoà virus trong vắc xin ở các nước đang phát triển cao hơn. Một yếu tố
khác trong sữa có thể ảnh hưởng đến hiệu lực của vắc xin là cytokine, cụ thể là TGF-β1.
Đây là cytokine có vai trò điều phối đáp ứng miễn dịch TGF-β1có tác dụng kích thích
hoặc ứng chế miễn dịch tuỳ theo nồng độ khác nhau. Có khả năng nồng độ TGF-β1 trong
sữa mẹ ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch đối với RV vắc xin.

2. Mục tiêu
Mục tiêu của đề tài.
- Xác định hiệu giá kháng thể IgA, kháng thể trung hoà với các type RV lưu hành ở Việt
nam và hàm lượng TGF-ß1 trong sữa mẹ.
- Đánh giá ảnh hưởng bởi sữa mẹ đến vắc xin Rotavin-M1 phòng RV
• Đánh giá khả năng sữa mẹ làm giảm hiệu giá virút trong vắc xin phòng
tiêu chảy do RV.
• Đánh giá ảnh hưởng của sữa mẹ và TGF-β1 đến đáp ứng miễn dịch đối với
vắc xin phòng tiêu chảy do RV.

3. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

3.1 Định lượng kháng thể trung hoà và cytokine trong sữa mẹ
300 mẫu sữa (20-30 ml) được thu thập từ các bà mẹ tại 2 địa điểm bao gồm 4 quận
huyện tại thành phố Thái Bình và 4 Trung tâm Y tế xã tại huyện Thanh Sơn, tỉnh Phú
Thọ. Tại các trung tâm y tế này, các bà mẹ đưa trẻ đến tiêm phòng vắc xin trong một
ngày cố định trong tháng. Tại thời điểm này, bà mẹ cho con đến tiêm/uống vắc xin trong
khoảng 6 tuần-6 tháng tuổi được lựa chọn cho nghiên cứu. Trẻ ở lứa tuổi này được
khuyến cáo sử dụng vắc xin phòng RV. Các bà mẹ được giải thích về mục đích nghiên


10
cứu, và ký vào phiếu cam kết tham gia nghiên cứu nếu đồng ý cho mẫu sữa. Các thông
tin nhưtuổi của bà mẹ, tuổi hoặc ngày sinh của trẻ và tình trạng sức khoẻ của mẹ. Đề
cương nghiên cứu và phiếu đồng ý tham gia nghiên cứuđã được thông qua hội đồng y
đức, Viện Vệ Sinh Dịch Tễ TW.

Tiêu chí tham gia nghiên cứu
Phụ nữ khoẻ mạnh có con từ 6 tuần tuổi đến 6 tháng tuổi và đang cho con bú,
không có bệnh tật, đồng ý tham gia nghiên cứu và ký đơn tình nguyện tham gia nghiên
cứu (Phụ lục 5).

Tiêu chuẩn loại trừ:
Phụ nữ đang bị mắc các bệnh cấp tính, Sốt (>38
o
C) trong vòng 3 ngày trước khi
đến địa điểm cho mẫu.
Mẫu sữa được giữ tại 4
o
C sau khi lấy. Ở phòng thí nghiệm (PTN), mẫu sữa sẽ được chia
thành 4 mẫu nhỏ, và giữ tại -80
o

C.
Kháng thể trung hoà kháng RV trong sữa mẹ được định lượng bằng phương pháp
trung hoà vi lượng (microneutralization assay). Chúng tôi xác định hiệu giá trung hoà đặc
hiệu với chủng virút sẽ sử dụng trong vắc xin phòng RV sản xuất tại Việt Nam (G1P[8]
và G4P[6] do POLYVAC, PGS/TS Lê Thị Luân cung cấp), cùng với một số chủng chuẩn
phòng thí nghiệm như DS1 (G2P[4]) và RRV (G3P[3]). Đây cũng là những serotype có
mặt trong các vắc xin đang được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Vắc xin Rotarix (công ty
GSK) là chủng giảm động lực từ người thuộc type G1P[8], Rotateq (Merck) là vắc xin
bao gồm 5 chủng (G1-G4 và P1[8]) tái tổ hợp có nguồn gốc một phần từ virút phân lập
tại bò (WC3). Như vậy trong nghiên cứu của chúng tôi, hiệu giá kháng thể trung hoà với
những chủng RV lưu hành rộng rãi trên thế giới và Việt Nam với tỷ lệ cao như G1, G2,
G3, G4, P[4], P[6]và P[8] được xác định. Kháng thể IgA đặc hiệu RV trong sữa được xác
định bằng ELISA (Phụ lục 1). Cả hai kỹ thuật này đã được phát triển tại PTN đường ruột,
CDC (13, 47). Tuy nhiên kỹ thuật trung hòa (Phụ lục 1) ứng dụng cho một chủng virus
có một điều kiện phản ứng riêng, vì vậy chúng tôi đã nghiên cứu thay đổi điều kiện phản
ứng cho phù hợp với từng type virus (Bảng 3.1).
Bảng 3.1. Các điều kiện tối ưu cho kỹ thuật trung hòa vi lượng


G1P[8] Rotavin
G2P[4]DS1
RRV
G4P[6] POLYVAC
Nồng độ trypsin
5µg/ml
5µg/ml
5µg
5µg/ml
Nồng độ Ca
2+

80µg/ml
80µg/ml
0
80µg/ml
Thời gian nuôi
cấy sau khi gây
nhiễm
60-72h
60-72h
24h
40-48h

Đồng thời, một số mẫu sữa này được gửi đến phòng thí nghiệm (PTN) virút
đường ruột, CDC (Dr Baoming Jiang) để kiểm nghiệm, sử dụng một số virút trên và các


11
virút có trong vắc xin Rotarix va Rotateq (bản quyền của những chủng virus này đ ược
chuyển cho CDC sử dụng).

Định lượng TGF-β1 trong mẫu sữa mẹ
Cytokine TGF-β1 trong sữa mẹ được định lượng bằng ELISA dựa trên đường
chuẩn nồng độ của bộ kít Emax Immunoassay Systems (Promega). TGF-ß1 ở cả 2 dạng,
tự do và ẩn, đều được định lượng trong nghiên cứu này. TGF-ß1 dạng tự do được đo trực
tiếp từ mẫu sữa, TGF-ß1 dạng ẩn được đo từ mẫu sữa sau khi xử lý bằng acid (10 phút)
theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

3.2. Ảnh hưởng của kháng thể mẹ trong sữa đến hiệu giá vắc xin.
Thay vì phân loại kháng thể theo hiệu giá kháng thể IgA (RV-IgA), chúng tôi sử

dụng kháng thể trung hòa chủng G1P[8] để phân loại thành (1) không có kháng thể trung
hòa,, (2) kháng thể với mức hiệu giá 2-16, (3) kháng thể với mức hiệu giá >=32. Các mẫu
sữa với hiệu giá trên được lựa chọn để đánh giá khả năng trung hoà virút trong vắc xin
Rotavin sản xuất tại Việt nam. Rotarix không được sử dụng để đánh giá do khả năng tạo
đám hoại tử kém. Rotavin (100ul, 10
6.5
pfu/ml sẽ được ủ với 1ml sữa trong 2h tại 37
o
C.
Đây cũng là thời gian thông thường vắc xin tiếp xúc với sữa trong hệ tiêu hoá của trẻ.
Sau thời gian ủ, hỗn hợp sữa và virus sẽ được hấp phụ trên lớp tế bào Ma104. Virút
không bị trung hoà bởi kháng thể trong sữa sẽ gây nhiễm tế bào và tạo đám hoại tử (Phụ
lục).

3.3. Ảnh hưởng của sữa mẹ đến đáp ứng kháng thể đối với vắc xin
Máu cuống rốn toàn phần (10 mẫu, 10-20ml/mẫu) được thu thập trong dung dịch
chống đông, tế bào lympho từ các mẫu này sẽ được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của
sữa mẹ đến đáp ứng kháng thể đối với Rotavin. Mẫu được thu thập với sự đồng ý của sản
phụ (Phụ lục 6, Phiếu chấp thuận tham gia nghiên cứu và cung cấp máu cuống rốn). Tế
bào lympho, kích hoạt bởi RV-chủng Wa, phát triển thành tế bào tạo kháng thể với sụ có
mặt của TGF-β 1 với các nồng độ khác nhau, chúng tôi muốn tìm hiểu xem số lượng tế
bào sản sinh kháng thể IgM, IgA và IgG có thay đổi so với khi sử dụng cytokine IL-2.
Chúng tôi sử dụng phương pháp ELISPOT để xác định số lượng tế bào sản sinh kháng
thể đặc hiệu RV này.

4. Kết quả nghiên cứu

4.1. Thông tin về các mẫu sữa thu thập tại 2 địa điểm nghiên cứu
Chúng tôi thu thập được 307 mẫu sữa từ các bà mẹ ở Phú thọ và Thái Bình có con
từ 1,5 tháng tuổi đến 6 tháng tuổi. Các bà mẹ đều được giải thích rõ về mục đích của đề

tài và quyền lợi khi tham gia nghiên cứu. Các bà mẹ đã ký vào phiếu đồng ý tham gia
nghiên cứu, những phiếu này được lưu lại tại Viện Vệ Sinh Dịch tễ TƯ (Phụ lục 5).

Các địa điểm lấy mẫu được tổng kết ở Bảng 4.1 dưới đây.


12

Bảng 4.1: Số lượng bà mẹ tham gia ở từng địa điểm nghiên cứu

STT
Thanh Sơn -Phú Thọ
Xã (số mẫu)
Thành phố Thái Bình -Thái Bình phường
(số mẫu)
1
Giáp lai (n=32)
Đề Thám (n=25)
2
Yên Sơn (n=53)
Kỳ Bá (n=48)
3
Yên Lãng (n=32)
Bồ Xuyên (n=50)
4
Khả cửu (n=35)
Lê Hồng Phong (n=32)
Tổng
n=152
n=155

Sau khi sàng lọc các mẫu có đủ thông tin, đủ điều kiện về tuổi cuả trẻ, chúng tôi chọn
300 mẫu để phân tích.
Thông tin về tuổi của trẻ, tuổi của mẹ cũng được thu thập và tổng kết ở Bảng 4.2.
Tuổi của các bà mẹ ở Thanh Sơn –Phú Thọ nhỏ hơn các bà mẹ ở thành phố Thái Bình
(p<0.001), điều này có thể ảnh hưởng đến hiệu giá kháng thể trong mẫu sữa. Các giai
đoạn khác nhau của sữa mẹ được tính bằng số tháng sau khi sinh.

Bảng 4.2: Tóm tắt thông tin về tuổi của bà mẹ và trẻ tham gia nghiên cứu tại 2 tỉnh


Phú thọ
Thái Bình
Số mẫu
148
152
Tuổi mẹ (trung binh +SD)
25 ±4,8*
30±5,1
Các giai đoạn của sữa
(tháng sau sinh)


1.5-1,9
18
12
2-2,9
31
40
3-3,9

40
36
4-4,9
35
34
5-6
24
30
* khác nhau về tuổi của các bà mẹ tham gia nghiên cứu ở 2 tỉnh, p<0,001

4.2. Hàm lượng kháng thể IgA tổng số, IgA đặc hiệu RV trong các mẫu sữa ở 2 địa
điểm nghiên cứu.
Hàm lượng IgA tổng số được xác định trong 300 mẫu sữa từ các bà mẹ ở khu vực
nông thôn miền núi (huyện Thanh Sơn, tỉnh Phú Thọ) và khu vực đô thị đồng bằng. Giải


13
nồng độ IgA trong mẫu sữa dao động từ 29-1395mg/dL (nồng độ trung bình ± độ lệch
chuẩn là 189 ±12mg/dL ở Phú Thọ đến khoảng từ 27-432mg/dL (nồng độ trung bình ±độ
lệch chuẩn: 87 ±5mg/dL) ở thành phố Thái Bình (Bảng 4.3). Hàm lượng IgA tổng số
trong mẫu sữa ở tỉnh miền núi cao hơn đáng kể đối với mẫu thu thập ở thành thị (p<0.05).
Ngươc lại, mẫu sữa của các bà mẹ ở Thái Bình có hiệu giá kháng thể RV-IgA cao
hơn mẫu sữa của các bà mẹ ở Thanh sơn. Có tới trên 90% số mẫu có hiệu giá kháng thể
trên mức 20, trong đó phần lớn số mẫu ở trong khoảng hiệu giá 20-160. (Bảng 4.1). Số
mẫu của các bà mẹ ở thành thị có hiệu giá trên 320 cao hơn đáng kể so với số mẫu của
các bà mẹ ở miền núi, cho thấy sự tiếp xúc rộng rãi đối với virus này ở thành thị.

Bảng 4.3. Hàm lượng kháng thể IgA tổng sốvà kháng thể RV-IgA trong 300 mẫu sữa
ở Thái Bình và Thanh Sơn, Phú Thọ.

Đia
điểm thu
thập
mẫu
Hiệu giá RV-IgA*
Nồng độ IgA tổng số

Số mẫu(%)
TB ±SE
(mg/dL)
Khoảng nồng
độ (mg/dL)

Hiệu giá
<20
Hiệu giá
20-160
Hiệu
giá≥320


Thanh
Sơn, Phú
Thọ
(n=148)
13 (8.8)
121 (81.8)
14 (9.5)**
189 ±12**
29-1395

Thành
phố Thái
Bình
(n=152)
7 (4.6)
109 (71.7)
36 (23.7)
87 ± 5
27-432
*: mẫu với hiệu giá RV-IgA ≥20 được coi là dương tính với RV-IgA
* *: p<0.05 (chi-square test) so với mẫu từ Thái Bình

Hiệu giá kháng thể RV-IgA và hàm lượng IgA tổng số trong các mẫu sữa mẹ phân
lớp theo các giai đoạn của sữa mẹ được tổng kết ở Bảng 4.4. Ở mọi giai đoạn của sữa mẹ,
hiệu giá kháng thể của các bà mẹ ở Thanh sơn Phú thọ thấp hơn ở Thái Bình trong khi đó
hàm lượng IgA tổng số trong mẫu sữa ở Thanh Sơn, Phú Thọ cao hơn các mẫu sữa ở
Thành phố Thái Bình (p<0.001) .




14
Bảng 4.4. Hiệu giá kháng thể RV-IgA trong mẫu sữa ở các giai đoạn ở 2 địa điểm
nghiên cứu.

Tháng sau khi sinh
Phú Thọ

Thái Bình

Số mẫu
Hiệu giá TB nhân
RV- IgA
Số
mẫu
Hiệu giá TB nhân
RV-IgA
1 (1.5-1,9 tháng)
18
68,6
13
89,0
2 (2-2,9 tháng
31
52.3
39
84,4
3 (3-3,9 tháng)
41
43,5
36
75,7
4 (4-4,9 tháng)
36
50,4
35
119,2
5 (5-6 tháng)
24

82,3
29
111,8
Tổng
150
54,8*
152
94,4*
* khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0.001)

Ở cả 2 địa phương, hiệu giá kháng thể RV-IgA trong sữa mẹ cao trong giai đoạn
dưới 2 tháng sau khi sinh và giảm dần đến 4 tháng sau khi sinh (Bảng 4.4). Đây cũng là
thời điểm trẻ được bảo vệ khỏi tình trạng nhiễm RV (trong các giám sát dịch tễ học RV,
tỷ lệ trẻ tiêu chảy do RV khi dưới 3 tháng tuổi thấp). Tuy nhiên sau giai đoạn này, hiệu
giá kháng thể tăng lên (khi trẻ trên 4 tháng tuổi). Đó là do kháng thể mẹ truyền mất dần
khả năng bảo vệ, trẻ bị nhiễm virus và có thể lây nhiễm cho mẹ.
Sự khác nhau giữa hiệu giá kháng thể RV-IgA ở mẫu sữa các bà mẹ 2 địa phương
nằm ở sự phân bố các mức hiệu giá. Ở hình 4.1, kháng thể trong mẫu sữa ở Phú Thọ ở
mức thấp (45% mẫu có hiệu giá ≤80), trong khi đó có đến 43.1 % mẫu sữa ở Thái Bình ở
mức trên 160. Điều này có thể do tuổi của bà mẹ ở Phú Thọ thấp hơn ở Thái Bình. Đồng
thời, mức tiếp xúc với rotavirus ở 2 địa phương này có thể khác nhau.

15
Hình 4.1: Phân bố các mức hiệu giá kháng thể trong mẫu sữa ở 2 điểm nghiên
cứu



Sự khác nhau về hiệu giá kháng thể IgA đặc hiệu RV trong sữa các bà mẹ ở 2 địa
điểm có thể do sự khác nhau giữa nồng độ IgA trong sữa mẹ, chúng tôi đánh giá hàm
lượng IgA tổng số trong sữa của một số bà mẹ ở 2 địa điểm trên (Hình 4.2). Hàm lượng
IgA tổng số ở các bà mẹ Phú Thọ cao hơn ở Thái Bình (185,7pg/ml so vơi 78,1pg/ml)
(p<0.001), và cao hơn ở mọi giai đoạn của sữa. Do đó đây không thể là nguyên nhân dẫn
đến hiệu giá RV-IgA trong mẫu sữa ở Phú thọ thấp hơn ở Thái Bình.

Hình 4.2: Hàm lượng IgA tổng số trong mẫu sữa ở 2 địa điểm nghiên cứu



!"!#
$!"!#
%!"!#
&!"!#
'!"!#
(!"!#
)!"!#
*!"!#
+!"!#

,!"!#
$!!"!#
'#$)#)'#%()#$!%'#'!,)#
tỷ#lệ#lũy#tích#(%)
RV0IgA
#
./#
!"!#
$!"!#
%!"!#
&!"!#
'!"!#
(!"!#
)!"!#
*!"!#
+!"!#
,!"!#
$!!"!#
$!#'!#$)!#)'!#
tỷ#lệ#lũy#tích##(%)
IgA#tổng#số#(pg/ml)
01234#
52637#


16
4.2 Sự lưu hành kháng thể trung hòa các chủng RV khác nhau trong mẫu sữa các
bà mẹ.

Bảng 4.5. Kháng thể trung hòa chủng RV G1P[8] (Rotavin-M1) trong mẫu sữa, phân

chia theo các giai đoạn mẫu sữa.

Tháng sau
sinh


G1P[8]

Hiệu giá
VN

Phú Thọ
Thái
Bình

Phú thọ

Thái
Bình

Khoảng hiệu giá

N
n
%
%

1,5- 1,9

<2
10
6
56
46
2-128
2-16
6
6
33
46
>16
2
1
11
7,7





2-3,9



<2
37
39
53

52
2-64
2-16
26
35
37
47
>16
7
1
10
1,3





≥4



<2
19
30
32
47
2-128

2-16
36
29
60
45
>16
5
5
8
8





Tổng
<2
67
76
45
50


2-16
69
70
46
46

>16

14
7
9
4,6



17





Tháng sau
sinh




Bảng 4.6. Kháng thể trung hòa chủng RV G3P[3] (RRV) trong mẫu sữa,
phân chia theo các giai đoạn mẫu sữa.

G3P[3]

Hiệu giá
VN

Phú Thọ
Thái
Bình

Phú thọ

Thái
Bình

Khoảng hiệu giá

N
n
%
%

1,5- 1,9



<2
0
1
0
7,7
2-128
2-16
15
10
83,3
76,9
>16
3

2
16,7
15,4





2-3,9



<2
2
4
2,9
5,3
2-64
2-16
59
66
84,3
88
>16
9
5
12,9
6,1

≥4



<2
2
3
3,3
4,7
2-128



2-16
49
49
81,7
76,6
>16
9
12
15
18,8

Tổng
<2
4
8
2,7
5,3


2-16
123
125
83,1
82,2

>16
21
19
14,2
12,5

18
Bảng 4.7. Kháng thể trung hòa chủng RV G4P[6] trong mẫu sữa, phân chia theo các
giai đoạn mẫu sữa.

Các giai đoạn của sữa
Tháng sau khi sinh




G4P[6]

Hiệu
giá VN
Phú
Thọ

Thái
Bình

Phú
Thọ

Thái
Bình

Dải nồng độ

n
n
%
%

1,5- 1,9




<2
10
5
56
39
2-512

2-16
7
7
39
54

>16
1
1
6
7,7

2-3,9




<2
27
36
39
48
2-128

2-16
37
34
53
45

>16
6
5
9
7

≥4




<2
17
26
28
41
2-91

2-16
36
29
60
45

>16
7
9
12
14

Tổng

<2
55
68
37
44



2-16
81
70
54
46


>16
14
15
9
10

19

Các hoạt tính trung hòa trong sữa mẹ
Kháng thể trung hòa đối với các chủng G1P[8], G2P[4], RRV (G3P[3] và G4P[6]
được xác định nhằm đánh giá hoạt tính trung hòa với các chủng virus heterologous với
các kiểu G và P khác nhau. Không có mẫu nào có kháng thể kháng chủng G2P[4]. Bảng
4.5-4.7 và hình 4.3-4.6 miêu tả sự phân bố kháng thể trung hòa với các chủng G1, G3 và
G4. phân tầng phân tích theo vùng, giai đoạn của mẫu sữa. Giai đoạn của mẫu này tương
ứng với giai đoạn trẻ từ 1.5 đến 6 tháng tuổi, giai đoạn trẻ uống vắc xin phòng tiêu chảy
do virus rota. Có đến 68% số mẫu có kháng thể trung hòa với chủng G1 và G4, và tỷ lệ
này tăng cao đối với chủng G3, trong số đó có 44.2% số mẫu dương tính với cả 3 loại
virus. Có thể thấy xu hướng giảm tỷ lệ bà mẹ không có kháng thể kháng chủng virus G1
khi mẫu thu thập từ 2-6 tháng sau khi sinh. Ngược lại, tỷ lệ mẫu với kháng thể trung hòa
virus chủng G1 tăng từ 37-60% trong mẫu của các bà mẹ ở khu vực nông thôn miền núi.
Kháng thể trung hòa chủng G4P[6] trong mẫu sữa có cùng xu hướng phát triển
giống kháng thể trung hòa chủng G1P[8], với thay đổi giữa các giai đoạn của mẫu sữa rõ
rệt hơn ở khu vực nông thôn miền núi. Hiệu giá thấp (2-16) thường thấy ở phần đông số
mẫu, trong khi số mẫu có hiệu giá cao hơn 16 có trong 14% số mẫu. Một điều đáng lưu ý
là hiệu giá kháng thể trung hòa kháng chủng G4 cao hơn đáng kể kháng thể trung hòa
chủng G1 (p<0,05). Tỷ lệ mẫu không có kháng thể trun ghòa với chủng G4 dưới 33% và
không thay đổi ở các giai đoạn của mẫu sữa và không có sự khác biệt giưã hiệu giá kháng
thể trung hòa chủng G4P[6] ở các mẫu của bà mẹ ở nông thôn và thành thị.
Kháng thể trung hòa chủng G3 không thay đổi nhiều giữa các giai đoạn của sữa,

~80% số mẫu có hiệu giá 2-16. Tuy nhiên tỷ lệ mẫu có hiệu giá kháng thể trung hòa
chủng G3 >16 cao hơn đáng kể so với tỷ lệ này đối với chủng G1 và G4, cho thấy sự lưu
hành rộng rãi của chủng này tại thời điểm nghiên cứu và trước đó.

Hình 4.3. Phân bố hiệu giá kháng thể trung hòa chủng G1P[8] trong các mẫu sữa tại
2 địa điểm nghiên cứu



!"!#
$!"!#
%!"!#
&!"!#
'!"!#
(!"!#
)!"!#
*!"!#
+!"!#
,!"!#
$!!"!#
$#%#'#+#$)#&%#)'#$%+#
Tỷ#lệ#lũy#tích##(%)
Hiệu#giá#kháng#thể#trung#hòa#G1P[8]
#
./#


20

Hình 4.4. Phân bố hiệu giá kháng thể trung hòa chủng G3P[3] trong các mẫu sữa tại
2 địa điểm nghiên cứu




Hình 4.5. Phân bố hiệu giá kháng thể trung hòa chủng G4P[6] trong các mẫu sữa tại
2 địa điểm nghiên cứu



!"!#
$!"!#
%!"!#
&!"!#
'!"!#
(!"!#
)!"!#
*!"!#
+!"!#
,!"!#
$!!"!#
$#%"+#(")#$$"&#%%")#'("%(#,!"(#%()#
Tỷ#lệ#lũy#tích#(%)#
Hiệu#giá#kháng#thể#trung#hòa#RRV#G3P[3]#
#
./#
!"!#
$!"!#

%!"!#
&!"!#
'!"!#
(!"!#
)!"!#
*!"!#
+!"!#
,!"!#
$!!"!#
$#%#'#+#$)#&%#)'#$%+#%()#($%#
Tỷ#lệ#lũy#tích#(%)
Hiệu#giá#kháng#thể#trung#hòa#G4P[6]#VN#titers
#
./#


21
Hình 4.6. So sánh phân bố hiệu giá kháng thể trung hòa các chủng virus khác nhau
trong các mẫu sữa tại 2 địa điể m nghiên cứu

!#
$!#
%!#
&!#
'!#
(!#
)!#
*!#
+!#
,!#
$!!#
$#%"+#(")#$$"&#%%")#'("%(#,!"(#%()#
Tỷ#lệ#lũy#tích#(%)#
HIệu#giá#kháng#thể#trung#hòa##
8$9 #
8$9./#
8&9 #
8&9./#
8'9 #
8'9./#


22
4.5 So sánh kháng thể trong sữa các bà mẹ Việt nam với các bà mẹ ở Ấn độ, Hàn
Quốc, Hoa Kỳ (22).

Một số mẫu sữa (77 mẫu) được gửi sang CDC để so sánh cùng với các mẫu của
các bà mẹ từ các nước khác. Mẫu sữa của các bà mẹ Việt Nam có hiệu giá IgA và hiệu
giá trung hòa virus G1 (Rotarix) thấp nhất và tương đươc với mẫu của các bà mẹ Hoa Kỳ,
hoặc tương đương với các mẫu ở Hàn Quốc (kháng thể trung hòa chủng G1- RotaTeq),
trong khi đó mẫu sữa củ a các bà mẹ ở Ấn độ có hiệu giá kháng thể (IgA, kháng thể trung
hòa) cao nhất. Điều đặc biệt là có sự khác nhau giưã hiệu giá kháng thể trung hòa trên
cùng một mẫu sữa với chủng G1 (RotaRix) và G1 (RotaTeq). Sư so sánh này được tiếp
tục ở phần 4.10.



Hình 4.7. Kháng thể IgA, kháng thể trung hòa các chủng virus G1 (Rotarix và
RotaTeq) và chủng G9 (116E) trong mẫu sữa của các bà mẹ Ấn độ, Hàn Quốc, Hoa
Kỳ, Việt Nam







23
4.5. Đáp ứng kháng thể trung hòa các chủng virus G1P[8] và G4P[6] ở trẻ uống vắc
xin/giả dược tại 2 địa điểm nghiên cứu- Ảnh hưởng của kháng thể mẹ truyền tới đáp
ứng miễn dịch đối với vắc xin G1P[8]
Nghiên cứu về kháng thể trung hòa trong mẫu sữa tại 2 địa điểm Thanh Sơn, Phú
Thọ và Thành phố Thái bình có thể bổ xung cho kết quả của thử nghiệm lâm sàng vắc
xin Rotavin-M1 (chủng virus G1P[8]) tại chính 2 địa điểm naỳ. Hình 4.8 tóm tắt hiệu giá
kháng thể trước và sau khi uống vắc xin/giả dược tại 2 địa điểm nghiên cứu. Trước khi
uống vắc xin, hiệu giá kháng thể kháng virus G1 trong mẫu huyết thanh trẻ ở Phú Thọ

cao hơn trẻ ở Thái bình (máu Mo), cho thấy có sự khác nhau về mức kháng thể mẹ truyền
qua nhau thai giữa 2 địa điểm nghiên cứu này. Tuy nhiên sau khi uống vắc xin, hiệu giá
kháng thể kháng virus G1 ở trong huyết thanh trẻ ở Phú Thọ thấp hơn trẻ ở Thái Bình
(p<0.05), cho thấy kháng thể mẹ truyền đã một phần ảnh hưởng đến đáp ứng kháng thể
đối với vắc xin này. Chúng tôi cũng thấy rằng đáp ứng kháng thể dị tip chủng G4P[6] (so
với văc xin G1P[8] là không cao.

Hình 4.8 Giá trị trung bình nhân kháng thể trung hòa các chủng G1P[8] và G4P[6] ở
trẻ trước và sau khi uống vắc xin giả dược tại 2 địa điểm nghiên cứu.




$$(#
$!*#
,)#
+(#
$!%#
)(#
$)%#
+'#
'*#
%!#
'!#
''#
%&#
$*#
%!#
$)#
$!#

$!!#
$!!!#
:;# -4# :;# -4#
# ./#
GMT#
Địa#điểm#nghiên#cứu#
8$9<=# 8$9<%#
8'9<=# 8'9<%#
>#
>#


24
4.6. Hàm lượng TGF-
β
1 trong sữa mẹ.
Bên cạnh kháng thể IgA và kháng thể trung hòa, chúng tôi đánh giá hàm lượng TGF-ß1 trong mẫu sữa (Bảng 4.8). Cytokine ở dạng
tự do chỉ chiếm dứoi 5.6% ở tất cả các giai đoạn của mẫu sữa. Tuy nhiên phần lớn (53.5-89.3%) số mẫu có chứa TGF-ß1 ở dạng ẩn (cần
hoạt hóa bởi axit). Giải nồng độ TGF-ß1 rộng, từ 13pg/ml cho đến 5.8ng/ml, cho thấy mức độ ảnh hưởng của cytokine này trong sữa mẹ
đến hệ miễn dịch của trẻ khá đa dạng.

Giai đoạn
của sữa mẹ
(tháng sau
sinh)
n
TGF-ß1 tự do

TGF-ß1 dạng ẩn

Số mẫu dương tính
(%)*
Nồng độ
(pg/ml)

Số mẫu dương tính
(%)
Nồng độ TB ±SE
$
(pg/ml)
Giải nồng độ (pg/ml)
<2
31
0 (0)


22 (71)
141 ± 23
18-521
[2-3)
70
3 (4,3)
16, 220, 3013

55 (78,6)
122 ±18
13-852
[3-4)
75
2 (2,7)

274, 392

67 (89,3)
190# ±25
16-1433
[4-5)
71
4 (5,6)
35-1218

38 (53,5)
210@# ±21
29-831
[5-6]
53
2 (3,8)
3642, 5818

38 (71,7)
176 ±25
19-718

Bảng 4.8: Hàm lượng TGF ß1 (dạng ẩn và dạng tự do) trong mẫu sữa


25
4.7. Ảnh hưởng của kháng thể mẹ ở các nồ ng độ khác nhau tới vắc xin phòng
rotavirus .

Trong phần này, chúng tôi sử dụng vắc xin thử nghiệm Rotavin-M1 (phát triển

từ chủ ng phân lập ở Việt Nam do POLYVAC sản xuất) và ủ vắc xin này với các độ
pha loãng khác nhau của các mẫu sữa có hiệu giá kháng thể trung hòa chủ ng G1 ở mức
thấp, trung bình và cao (xác định trong phần 4.2).
Mẫu sữa (100µl) với các nồng độ khác nhau được ủ với 100µl vắc xin Rotavin
(pha loãng 1:1000, 280FFU/100µl) trong 1h ở 37
o
C, sau đó hỗn hợp sữa-vắc xin được
hấp phụ trên bề mặt tế bào Ma104 trong 1h ở 37
o
C. Sau thời gian ủ, lượng virus dư
thừa được rửa khỏi bề mặt tế bào. Lượng virus trong vắc xin không bị trung hoà bởi
sữa sẽ gây nhiễm tế bào và tạo đám hoại tử (kỹ thuật trung hoà giảm đám hoại tử). Số
lượng đám hoại tử tạo ra khi sự có mặt của sữa được so sánh với số lượng đám hoạt tử
tạo ra khi chỉ có virus (Hình 4.9)
Có thể thấy rõ trong Hình 4.9 khả năng làm giảm hiệu giá virus trong vắc xin
tăng lên khi hiệu giá IgA trong mẫ u sữa tă ng lên. Ở nhóm hiệu giá cao (G1VN: >=32)
sữa mẹ làm giảm từ 80%-95% hiệu giá virus vắc xin khi mẫu sữa pha loãng 1:128 –
1:32 lần. Trong khi đó ở nhóm không có hiệu giá trung hòa chủng G1, mẫu sữa với độ
pha loãng 1:2 vẫn có thể làm giảm từ 20-96% lượng virus vắc xin, cho thấy các yếu tố
khác ngoài kháng thể trung hòa làm giảm virus trong vắc xin. Với nhóm mẫu có hiệu
giá trung bình (từ 2-16), độ pha loãng mẫu sữa 1:2-1:8 mới có khả năng giảm virus vắc
xin từ 80%-90%. Khả năng trung hòa chủng Rotavin-M1 liên quan tới hiệu giá kháng
thể trung hòa chủng G1 trong sữa mẹ, và không liên hệ tới hiệu giá chủng G3P[3] hay
chủng G4P[6] trong sữa mẹ.
Như vậy với liệu vắc xin sử dụng là 10
6
FFU/liều và nếu trẻ uống 100ml trong thời
gian uống vắc xin, mẫu sữa với hiệu giá RV-IgA cao và trung bình có khả năng trung
hoà virus vắc xin.