Nghiên cứu đặc điểm một số gen điều hoà sinh tổng hợp anthocyanin liên quan đến tính chịu hạn của cây ngô nếp địa phương

1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
––––––––––––––––––




PHẠM THỊ THANH NHÀN



NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ GEN ĐIỀU HÒA
SINH TỔNG HỢP ANTHOCYANIN LIÊN QUAN ĐẾN
TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY NGÔ NẾP ĐỊA PHƢƠNG




LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC







THÁI NGUYÊN - 2014

2




























BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
––––––––––––––––––



PHẠM THỊ THANH NHÀN


NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ GEN ĐIỀU HÒA
SINH TỔNG HỢP ANTHOCYANIN LIÊN QUAN ĐẾN
TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY NGÔ NẾP ĐỊA PHƢƠNG
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 01 21



LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC


Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS. LÊ TRẦN BÌNH




THÁI NGUYÊN - 2014


3

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả
cộng tác với các tác giả khác. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận án là
trung thực, một phần đã đƣợc đăng trên các Tạp chí khoa học chuyên ngành,
trong Kỷ yếu hội nghị Công nghệ sinh học và trên GenBank, với sự đồng ý cho
phép của các đồng tác giả. Phần kết quả còn lại chƣa đƣợc ai công bố.

Tác giả


NCS. Phạm Thị Thanh Nhàn














4
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Lê Trần Bình đã tận tình
hƣớng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và
hoàn thiện luận án.

Tôi xin đƣợc trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ, đặc biệt là PGS.TS Chu Hoàng
Hà, TS. Lê Văn Sơn, ThS. Hoàng Hà và ThS. Lê Hoàng Đức thuộc Phòng Công nghệ
tế bào thực vật, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng Thí nghiệm trọng điểm
công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện tốt nhất, hƣớng dẫn kỹ thuật thí nghiệm và góp ý
chuyên môn để tôi hoàn thành đƣợc đề tài này. Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của các
đồng tác giả.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh- Kỹ thuật nông nghiệp,
Trƣờng Đại học Sƣ phạm- Đại học Thái Nguyên, cùng các cán bộ trong khoa đã tạo
điều kiện, động viên tôi trong học tập và hoàn thiện luận án, đặc biệt là sự giúp đỡ
của các Thầy, Cô trong Bộ môn Di truyền- SHHĐ nhƣ GS.TS Chu Hoàng Mậu,
PGS.TS Nguyễn Thị Tâm, CN Nguyễn Thị Hồng Chuyên (Phòng thí nghiệm Hóa
Sinh), CN Nguyễn Ích Chiến (Phòng thí nghiệm Di truyền & Công nghệ gen).
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trƣờng, Phòng Quản lý đào tạo Sau
Đại học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi
để tôi hoàn thành đề tài này.
Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo cùng các cán bộ của
Viện Nghiên cứu Ngô Đan Phƣợng- Hà Nội đã tạo điều kiện cung cấp các giống ngô
nếp địa phƣơng và những thông tin cơ bản về giống.
Cuối cùng, tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã đồng
hành, chia sẻ cùng tôi, khuyến khích tôi hoàn thành luận án Tiến sĩ này.
Thái Nguyên, tháng 10 năm 2014
Nghiên cứu sinh


Phạm Thị Thanh Nhàn


i
MỤC LỤC

Trang
Mục lục
i
Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt
iv
Danh mục các bảng
vii
Danh mục các hình
ix
MỞ ĐẦU
1
1. Đặt vấn đề
1
2. Mục tiêu của đề tài
2
3. Nội dung nghiên cứu
3
4. Những đóng góp mới của luận án
3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
5
1.1. Cây ngô
5
1.1.1. Sơ lƣợc về cây ngô
5
1.1.2. Giá trị dinh dƣỡng và kinh tế của ngô
7
1.1.3. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam ……

8
1.2. Phản ứng của cây ngô trƣớc tác động của hạn
10
1.2.1. Mối liên quan giữa tác động của hạn và tính chống chịu stress ôxy hóa
10
1.2.1.1. Mối liên quan giữa hạn và stress oxy hóa
10
1.2.1.2. Các dạng oxy hoạt hóa
12
1.2.1.3. Hệ thống bảo vệ cây trồng khỏi tác động của oxy hóa
13
1.2.2. Cơ sở sinh lý, sinh hoá và sinh học phân tử của tính chịu hạn ở cây ngô.
14
1.2.2.1. Cơ sở hình thái, sinh lý, hóa sinh của tính chịu hạn
14
1.2.2.2. Cơ sở sinh học phân tử của tính chịu hạn ở cây ngô
17
1.3. Anthocyanin và vai trò chuyển hóa các dạng oxy hoạt hóa
20
1.3.1. Vai trò của anthocyanin khi thực vật bị hạn
20
1.3.2. Gen điều hoà tổng hợp anthocyanin ở cây ngô …
27
1.3.2.1. Nhân tố phiên mã và điều hòa biểu hiện gen
27
1.3.2.2. Nhân tố phiên mã tham gia quá trình tổng hợp anthocyanin
30

ii
1.4. Ứng dụng real- time PCR nghiên cứu mức độ biểu hiện gen tham gia

sinh tổng hợp anthocyanin

34
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
40
2.1. Vật liệu nghiên cứu
40
2.2. Địa điểm nghiên cứu, hoá chất và thiết bị
40
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
41
2.3.1. Nhóm phƣơng pháp hoá sinh
41
2.3.2. Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của một số giống ngô địa phƣơng
45
2.3.3. Nhóm phƣơng pháp sinh học phân tử ………………………………
47
2.3.3.1. Phƣơng pháp tách RNA tổng số theo kit Trizol (Invitrogen)
47
2.3.3.2. Phƣơng pháp RT- PCR ………………………………………
47
2.3.3.3. Tạo vector tái tổ hơp …………………………………………
49
2.3.3.4. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5
49
2.3.3.5. Kiểm tra sản phẩm chọn dòng …………………………………
49
2.3.3.6. Tách plasmid ……………………………………
49
2.3.3.7. Xác định trình tự gen ……………………………………

51
2.3.3.8. Phƣơng pháp real- time PCR
51
2.3.4. Phƣơng pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu
53
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………
54
3.1. Đánh giá khả năng chịu hạn của 10 giống ngô nếp địa phƣơng
54
3.1.1. Khả năng chịu hạn của 10 giống ngô nếp địa phƣơng giai đoạn hạt nảy
mầm

54
3.1.1.1. Ảnh hƣởng của hạn đến hàm lƣợng đƣờng và hoạt độ - amylase
54
3.1.1.2. Ảnh hƣởng của hạn đến sự biến đổi hoạt độ protease
57
3.1.2. Đánh giá khả năng chịu hạn của 10 giống ngô giai đoạn cây non 3 lá
58
3.1.2.1. Tỷ lệ thiệt hại của 10 giống ngô khi bị hạn ………………………
58
3.1.2.2. Chỉ số chịu hạn tƣơng đối của kiểu gen 10 giống ngô trong điều kiện
hạn nhân tạo

61
3.1.3. Phân nhóm 10 giống ngô nếp nghiên cứu theo mức độ chịu hạn
63
3.2. Ảnh hƣởng của hạn nhân tạo đến lƣợng anthocyanin ở cây ngô nếp

iii
địa phƣơng
65
3.2.1. Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin trong rễ của 10 giống ngô qua các
ngƣỡng xử lý bởi hạn nhân tạo

65
3.2.2. Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin trong lá của 10 giống ngô qua các
ngƣỡng xử lý bởi hạn nhân tạo

67
3.2.3. Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin trong thân mầm và bẹ lá của 10
giống ngô qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn nhân tạo

70
3.2.4. Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin trong thân và bẹ lá cây ngô qua các
ngƣỡng xử lý bởi hạn nhân tạo so với đối chứng

73
3.3. Phân tích trình tự đoạn gen B, Lc ở giống NH và BS1
78
3.3.1. Đặc điểm trình tự đoạn gen B của giống NH và BS1
78
3.3.2. Đặc điểm trình tự đoạn gen Lc của giống NH và BS1
85
3.3.3. Đặc điểm cấu trúc protein thuộc họ bHLH ở cây ngô
91
3.4. Định lƣợng mức độ biểu hiện của gen B và Lc bằng phản ứng real-
time PCR

93
3.4.1. Định lƣợng mức độ biểu hiện của gen B giai đoạn cây con
93
3.4.2. Định lƣợng mức độ biểu hiện của gen Lc giai đoạn cây con
97
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
103
Kết luận …………………………………………………………
103
Đề nghị…………………………………………………
103
CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN LUẬN ÁN
104
TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………………………………………
105
PHỤ LỤC 1
127
PHỤ LỤC 2
128
PHỤ LỤC 3
131
PHỤ LỤC 4
132





iv
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

Tên tiếng Anh
Nghĩa tiếng Việt
ABA

Abscisic acid
Axit abscisic
ANR

Anthocyanidin reductase
Enzyme chuyển hóa flavan-3-ol
ANS

Anthocyanidin synthase
Enzyme chuyển hóa tạo
anthocyanidin
APX

Ascorbate peroxidase
Enzyme chuyển hoá H
2
O
2
thành
H
2
O
bHLH

Binding helix- loop- helix
Protein họ bHLH
Bp

Base pair
Cặp bazơ nitơ
C1

Colored aleurone 1
Gen C1
cDNA

Complementary DNA
DNA sợi đôi đƣợc tổng hợp từ
mRNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc
CHI

Chalcon isomerase
Enzyme chuyển hóa chalcon
CHP


Cây hồi phục
CHS

Chalcone synthase
Enzyme xúc tác tổng hợp chalcon
CSCHTĐ

Chỉ số chịu hạn tƣơng đối
CKH


Cây không héo
DEPC

Diethyl pyrocarbonate
Chất ức chế enzyme phân hu
̉
y RNA
DFR

Dihydroflavonol 4 reductase
Enzyme chuyển hóa tạo
leucoanthocyanidin
DNA

Deoxyribonucleic acid
Axit deoxyribonucleic (ADN)
DNase

Deoxyribonuclease
Enzyme thủy phân liên kết
photphodieste của phân tử DNA
DRE

Dehydration responsive
element

Yếu tố đáp ứng với hydrat hóa
ĐC


Đối chứng

v
%ĐC


% so với đối chứng
F3‟H

Flavonoid 3‟ hydroxylase
Enzyme chuyển hóa naringenin
F3‟5‟H

Flavonoid 3‟,5‟ hydroxylase
Enzyme chuyển hóa naringenin
HBV

Hepatitis B virus
Virus viêm gan B
HCV

Hepatitis C virus
Virus viêm gan C
HP

Hồi phục
KLK


Khối lƣợng khô
KLT


Khối lƣợng tƣơi
KNGN


Khả năng giữ nƣớc
LAR

Leucoanthocyanidin
reductase
Enzyme xúc tác tổng hợp flavan-3-
ols
LEA

Late embryo abundant
protein trong giai đoạn muộn của
quá trình hình thành phôi
Lc (LC)

Leaf colour
Gen Lc
mRNA

Messenger RNA
ARN thông tin
MGPT

chaperon
Môi giới phân tử
MW

Molecular weight
Khối lƣợng phân tử
NADP

Nicotinamide adenine
dinucleotide phosphate
Coenzym đƣợc sử dụng trong phản
ứng đồng hóa
NADPH

Nicotinamide adenine
dinucleotide phosphate-oxidase
Chất đƣợc tạo nên khi khƣ
̉
NADP
PAL

Phenylalanine ammonialyase
Enzyme chuyển hóa L-phenylalanine
Pl

Purple

Gen Pl
Pr1

Red aleurone 1
Protein chuyên trách tổng hợp
pelargonidin tạo Aleurone màu đỏ
PCR

Polymerase chain reaction
Phản ứng chuỗi polymerase
RNA

Ribonucleic acid
Axit ribonucleic (ARN)

vi
RT- PCR

Reverse transcription-
polymerase chain reaction
Phản ứng khuếch đại cDNA từ
mRNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc
ROS

Reactive oxygen species
Các dạng oxy hoạt hóa
SOD

Superoxide dismutase
Enzyme xúc tác phản ứng loại bỏ

superoxide
SNP

Single nucleotide
polymorphism
Đa hình nucleotit đơn
TFs

Transcription factors
Các nhân tố phiên mã, hay yếu tố
phiên mã
3GT

Flavonoid 3‟
glucosyltransferase
Enzyme xúc tác phản ứng tạo
flavonol 3-O-beta-D-glucoside
UFGT

flavonoid 3-O-
glucosyltransferase
Enzyme xúc tác phản ứng O-
glycosyl hóa

vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Diện tích, năng suất, sản lƣợng ngô, lúa mì, lúa nƣớc thế giới
1961-2010/11

8
Bảng 1.2. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 1961 đến 2012/13
9
Bảng 1.3. Các nhóm nhân tố phiên mã
29
Bảng 2.1. Các giống ngô nếp địa phƣơng sử dụng trong nghiên cứu
40
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR
48
Bảng 2.3. Thành phần dung dịch tách plasmid
51
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng real- time RT- PCR
52
Bảng 3.1. Tỷ lệ thiệt hại của 10 giống ngô nếp bị xử lý bởi hạn nhân tạo
59

Bảng 3.2. Tổng hợp đánh giá khả năng chịu hạn giai đoạn cây non 3 lá của
10 giống ngô nghiên cứu …………………………………………

62
Bảng 3.3. Hệ số tƣơng đồng về mức phản ứng của các giống trƣớc hạn …
63
Bảng 3.4. Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin trong rễ của 10 giống ngô
66
Bảng 3.5. Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin trong lá của 10 giống ngô
69
Bảng 3.6. Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin trong thân mầm và bẹ lá của
10 giống ngô

70
Bảng 3.7. Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin trong thân mầm và bẹ lá qua
các ngƣỡng xử lý bởi hạn so với đối chứng

74
Bảng 3.8. Mối tƣơng quan giữa sự biến động hàm lƣợng anthocyanin và tỷ lệ
thiệt hại

76
Bảng 3.9. Chu kỳ ngƣỡng của gen Act và B ở giống ngô NH và BS1 qua các
ngƣỡng xử lý bởi hạn nhân tạo

94
Bảng 3.10. Chu kỳ ngƣỡng của gen Act và Lc ở giống ngô NH và BS1 qua
các ngƣỡng xử lý bởi hạn nhân tạo

98

Bảng 1.1 (Phụ lục 1). Hình thái và kích thƣớc hạt của 10 giống ngô nếp địa
phƣơng

127
Bảng 1.2 (Phụ lục 1). Chất lƣợng hạt của 10 giống ngô
127
Bảng 2.1 (Phụ lục 2). Hoạt độ amylase qua các tuổi mầm khi xử lý bởi


viii
sorbitol 5% (ĐVHĐ/mg) ……………………
128
Bảng 2.2 (Phụ lục 2). Hàm lƣợng đƣờng qua các tuổi mầm khi xử lý bởi
sorbitol 5% (% KLT)

129
Bảng 2.3 (Phụ lục 2). Hoạt độ protease qua các tuổi mầm khi xử lý bởi
sorbitol 5% (ĐVHĐ/mg) …

130
Bảng 3.1(Phụ lục 3). Tỉ lệ tƣơng đồng trình tự nucleotit của đoạn gen B ở
giống NH và BS1 với một số trình tự trong họ bHLH

131
Bảng 3.2 (Phụ lục 3). Tỉ lệ tƣơng đồng trình tự nucleotit của đoạn gen Lc ở
giống NH và BS1 với một số trình tự trong họ bHLH

131

ix
DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 1.1. Cấu trúc aglucon của anthocyanin
21
Hình 1.2. Vai trò chất chống oxy hóa của anthocyanin
26
Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc chuỗi axit amin của một TFs.
28

Hình 1.4. Mô hình hoạt động của các nhân tố phiên mã
30
Hình 1.5. Ba nhóm gen điều hòa tham gia tổng hợp anthocyanin ở ngô theo
Hartmann và cộng sự (2005)

31
Hình 1.6. Cơ chế hoạt động của SYBR I
35
Hình 1.7. Biểu đồ chảy (a) và Biểu đồ đỉnh chảy (b)
36
Hình 3.1. Biểu đồ mô tả sự biến động hoạt độ - amylase của các giống ngô
qua các ngƣỡng xử lý bởi sorbitol 5%

55
Hình 3.2. Biểu đồ mô tả sự biến động hàm lƣợng đƣờng của các giống ngô quaa
các ngƣỡng xử lý bởi sorbitol 5%

56
Hình 3.3. Biểu đồ mô tả sự biến động hoạt độ protease của các giống ngô qua các
ngƣỡng xử lý bởi sorbitol 5%

58
Hình 3.4. Đồ thị mô tả tỷ lệ thiệt hại của 10 giống ngô trong quá trình xử lý
hạn

60
Hình 3.5. Sơ đồ hình cây thể hiện sự giống nhau về khả năng phản ứng với hạn
của 10 giống ngô nếp địa phƣơng

64

Hình 3.6. Đƣờng biểu diễn quang phổ hấp thụ của anthocyanin trong các bộ
phận cây ngô khi bị hạn

73
Hình 3.7. Màu sắc thân và lá của cây ngô sau 7 ngày hạn …………………
77
Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm RT- PCR của đoạn gen B (A) và kiểm tra
plasmid tái tổ hợp bằng BamHI (B) của giống BS1 và NH

79
Hình 3.9. So sánh trình tự nucleotit của đoạn gen B ở giống NH và BS1
82
Hình 3.10. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền giữa đoạn gen B của
hai giống ngô NH và BS1 với các gen thuộc họ bHLH

83
Hình 3.11. So sánh trình tự axit amin suy diễn của đoạn protein B ở giống NH


x
và BS1
84
Hình 3.12. Hình ảnh điện di sản phẩm RT- PCR của đoạn gen Lc (A) và kiểm
tra plasmid tái tổ hợp bằng BamHI (B) của giống BS1 và NH

85
Hình 3.13. So sánh trình tự nucleotit của đoạn gen Lc ở giống NH và BS1
88
Hình 3.14. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền giữa đoạn gen Lc của
hai giống ngô NH và BS1 với các gen thuộc họ bHLH

89
Hình 3.15. So sánh trình tự axit amin suy diễn của đoạn protein Lc ở giống NH
và BS1

90
Hình 3.16. Các vùng chức năng của nhân tố bHLH
92
Hình 3.17. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi mức độ phiên mã của gen B ở giống
ngô NH và BS1

95
Hình 3.18. Biểu đồ chảy (A) và Biểu đồ đỉnh chảy (B) của gen B và Act ở hai
giống ngô NH và BS1 qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn.

96
Hình 3.19. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi mức độ phiên mã của gen Lc ở giống
ngô NH và BS1

99
Hình 3.20. Biểu đồ chảy (A) và Biểu đồ đỉnh chảy (B) của gen Act và Lc ở hai
giống ngô NH và BS1 qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn.

100
Hình 4.1 (Phụ lục 4). So sánh trình tự nucleotit của đoạn gen Act của giống NH
với trình tự trên GenBank

132

i

1
MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Ngô (Zea mays L.) là một trong ba cây ngũ cốc quan trọng nhất, cung cấp
lƣơng thực cho loài ngƣời và là thức ăn cho gia súc (với 70% chất tinh trong
khẩu phần ăn), là nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất và chế biến lƣơng thực-
thực phẩm- dƣợc phẩm, là mặt hàng nông sản xuất khẩu có giá trị. Giá trị sử
dụng rộng rãi của ngô đƣợc chứng minh bằng 670 mặt hàng khác nhau. Ở Việt
Nam, ngô là cây lƣơng thực quan trọng thứ hai sau lúa của nông dân vùng trung
du và miền núi phía Bắc, và là cây lƣơng thực chính của đồng bào các dân tộc
thiểu số ở các vùng núi cao. Năm 2012, tỉnh Sơn La có diện tích trồng lúa là
48200 ha, ngô là 133700 ha; tỉnh Hà Giang có diện diện tích trồng lúa là 37400
ha, ngô là 52500 ha; tỉnh Cao Bằng có diện tích trồng lúa là 30700 ha, ngô là
39300 ha; tỉnh Lào Cai có diện tích trồng lúa là 30600 ha, ngô là 33700 ha [22].
Nƣớc ta có 75% diện tích là đồi núi, lƣợng mƣa hàng năm không đồng đều
giữa các vùng, tình trạng hạn hán thƣờng xuyên xảy ra dẫn đến năng suất của
các giống cây trồng nói chung, cây ngô nếp địa phƣơng nói riêng bị giảm. Trong
những năm gần đây, hƣớng sản xuất ngô ở nƣớc ta là tăng cƣờng diện tích ngô
lai có năng suất cao trên cơ sở ứng dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật tiên
tiến. Các giống ngô nếp địa phƣơng có chất lƣợng hạt cao, khả năng chịu hạn tốt
và phù hợp với điều kiện canh tác đất dốc của từng vùng ở miền núi, nhƣng do
năng suất thấp nên nhiều giống quý bị mất dần. Vì vậy, việc nghiên cứu và chọn
tạo các giống ngô có khả năng chịu hạn là rất cần thiết, góp phần bảo tồn nguồn
gen và tạo vật liệu cho lai giống.
Trƣớc đây, công tác chọn giống truyền thống thƣờng tốn rất nhiều thời gian
và công sức, nhất là đối với những tính trạng đa gen chịu nhiều ảnh hƣởng của
điều kiện môi trƣờng. Hiện nay, công nghệ sinh học đƣợc coi là phƣơng tiện hữu

2
hiệu để khắc phục những vấn đề khó khăn đó. Sự hiểu biết về phân tử DNA,
RNA, protein, hay các hợp chất thứ cấp có liên quan đến các đặc tính, tính
trạng giúp cho ngƣời nghiên cứu chủ động lựa chọn kỹ thuật sinh học tác động
vào chúng nhằm nhận dạng giống cây trồng theo mong muốn. Chọn giống nhờ
sự trợ giúp của chỉ thị phân tử liên kết với các tính trạng (Molecular Assisted
Selection- MAS) đang ngày càng đƣợc quan tâm vì phƣơng pháp này có thể rút
ngắn đƣợc thời gian chọn lọc, thậm chí có thể chọn lọc sớm ở giai đoạn cây non.
Anthocyanin là một loại sắc tố dịch bào, là sản phẩm thứ cấp của quá trình
trao đổi chất. Anthocyanin thuộc nhóm flavonoid, xuất hiện trong các bộ phận
của thực vật với màu đỏ, đỏ tía, tím và xanh đậm. Ngoài việc tạo màu sắc đẹp để
bảo vệ và thụ phấn, anthocyanin còn có hoạt tính sinh học rất quý là khả năng
chống oxy hóa mạnh, giúp tế bào giữ nƣớc khi mất cân bằng áp suất thẩm thấu.
Anthocyanin đƣợc coi là một dấu hiệu của điều kiện cực đoan và là một phần
trong cơ chế hạn chế tác động tiêu cực đó. Hiện nay, định hƣớng nghiên cứu xác
định chỉ thị cho đặc tính chịu hạn của cây trồng đang đƣợc quan tâm, trong đó
có chỉ thị sắc tố anthocyanin.
Xuất phát từ các lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu đặc
điểm một số gen điều hoà sinh tổng hợp anthocyanin liên quan đến tính
chịu hạn của cây ngô nếp địa phƣơng”.
2. Mục tiêu của đề tài
Xác định đƣợc mối tƣơng quan giữa anthocyanin và khả năng chịu hạn của
cây ngô nếp địa phƣơng.
Xác định và phân lập đƣợc một số gen điều hòa (gen TF) quan trọng liên
quan đến sinh tổng hợp anthocyanin ở cây ngô nếp địa phƣơng.
Đánh giá đƣợc mức độ phiên mã của gen điều hòa sinh tổng hợp
anthocyanin của ngô nếp địa phƣơng trong điều kiện hạn.

3
Những mục tiêu trên nhằm định hƣớng ứng dụng trong tuyển chọn và bảo

tồn giống ngô nếp có chất lƣợng và khả năng chịu hạn cao.
3. Nội dung nghiên cứu
- Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống ngô nghiên cứu giai đoạn hạt
nảy mầm và cây con thông qua một số chỉ tiêu sinh lý, hoá sinh (hàm lƣợng
đƣờng, hoạt độ amylase, chỉ số chịu hạn tƣơng đối ). Phân nhóm các
giống ngô theo mức độ chịu hạn.
- Xác định mối tƣơng quan giữa sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin và khả
năng chịu hạn của ngô nếp địa phƣơng ở giai đoạn cây con.
- Phân lập đoạn gen B và Lc điều hòa hoạt động của nhóm gen cấu trúc mã
hoá enzyme chuyển hóa tổng hợp sắc tố anthocyanin ở đại diện thuộc nhóm
chịu hạn tốt và kém trong điều kiện hạn.
- Sử dụng kỹ thuật real- time RT- PCR để phân tích, so sánh mức độ biểu
hiện của gen B và Lc ở giai đoạn phiên mã của đại diện thuộc nhóm chịu
hạn tốt và kém trong điều kiện hạn.
4. Những đóng góp mới của luận án
- Xác định đƣợc mức độ tƣơng quan giữa hàm lƣợng anthocyanin với khả
năng chịu hạn của cây ngô nếp địa phƣơng, và hàm lƣợng anthocyanin
đƣợc coi là một trong những chỉ thị sinh hóa hóa phục vụ chọn lọc giống
ngô chịu hạn.
- Phân lập đƣợc 02 đoạn gen B và Lc mã hóa cho protein là nhân tố phiên mã
điều hòa quá trình sinh tổng hợp anthocyanin.
- Bƣớc đầu xác định đƣợc mức độ phiên mã của 02 gen B và Lc là một trong
các chỉ thị ở mức độ phân tử cho khả năng chịu hạn giai đoạn cây ngô non.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Ý nghĩa khoa học
- Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp những dẫn liệu khoa học về vai

4
trò của anthocyanin khi cây ngô nếp địa phƣơng bị hạn.
- Cung cấp thông tin về hai gen điều hòa (nhân tố phiên mã) B và Lc thuộc

họ bHLH tham gia sinh tổng hợp anthocyanin ở cây ngô nếp địa phƣơng bị
hạn.
- Tìm hiểu đƣợc cơ sở sinh học phân tử của khả năng chịu hạn ở cây ngô nếp
địa phƣơng thông qua so sánh mức độ biểu hiện của gen điều hòa sinh tổng
hợp anthocyanin.
Ý nghĩa thực tiễn
- Kết đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô nếp địa phƣơng giai đoạn hạt
nảy mầm và cây non đƣợc sử dụng làm cơ sở để đánh giá khả năng chịu
hạn ở cây trồng. Trong đó, anthocyanin đƣợc xem là chất chỉ thị phục vụ
chọn lọc giống ngô chịu hạn
- Sử dụng gen Lc của ngô nhƣ một gen chỉ thị mạnh mẽ để tăng tổng hợp
anthocyanin nhằm tạo ra các loại thực phẩm vừa có lợi cho sức khỏe ngƣời
tiêu dùng, vừa có tiềm năng kinh tế cho ngƣời sản xuất, và vừa có lợi cho
sự chống chịu hạn cho bản thân cây trồng.












5
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Cây ngô

1.1.1. Sơ lược về cây ngô
Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L., thuộc chi Zea, họ Hoà thảo
(Poaceae), bộ Hoà thảo (Poales). Từ loài Zea mays Line, dựa vào cấu trúc nội
nhũ của hạt và hình thái bên ngoài, ngô đƣợc phân thành các loài phụ: ngô đá
rắn, ngô răng ngựa, ngô nếp, ngô đƣờng, ngô nổ, ngô bột, ngô nửa răng ngựa.
Từ các loài phụ dựa vào màu hạt và màu lõi ngô đƣợc phân chia thành các thứ.
Ngoài ra, ngô còn đƣợc phân loại theo sinh thái học, nông học, thời gian sinh
trƣởng và thƣơng phẩm [11].
Cây ngô là một loại cây lƣơng thực đƣợc thuần canh tại khu vực Trung Mỹ
và sau đó mở rộng ra khắp châu Mỹ, và trên toàn thế giới vào cuối thế kỷ 15, đầu
thế kỷ 16 [186]. Tuy nhiên dạng ngô dại hiện không còn tồn tại nên có nhiều giả
thuyết về nguồn gốc di truyền của cây ngô. Song điều quan trọng nhất là hình
thành vô số loài phụ, các thứ và nguồn dị hợp thể của cây ngô, các dạng cây và
biến dạng của chúng đã tạo cho nhân loại một loài ngũ cốc có giá trị đứng cạnh
lúa mì và lúa nƣớc [11].
Thân cây ngô trông tƣơng tự nhƣ thân cây của các loài hòa thảo. Ngô có
hình thái phát triển rất khác biệt; các lá hình mũi mác rộng bản, dài 50–100 cm
và rộng 5-10 cm; thân cây thẳng, thông thƣờng cao 2–3 m, nhiều mấu, các lá tỏa
ra từ mỗi mấu với bẹ nhẵn. Dƣới các lá này và ôm sát thân cây là các bắp. Khi
còn non chúng dài ra khoảng 3 cm mỗi ngày. Từ các đốt ở phía dƣới sinh ra một
số rễ [11]. Thân cây ngô non tích lũy một chất kháng sinh mạnh là DIMBOA
(2,4-dihydroxy-7-methoxy-1,4-benzoxazin-3-on). DIMBOA là thành viên của
nhóm các axít hydroxamic (còn gọi là benzoxazinoit) có khả năng phòng chống
tự nhiên đối với một loạt các loài gây hại nhƣ côn trùng, nấm và vi khuẩn gây

6
bệnh. Giống ngô đột biến (bx) thiếu DIMBOA rất dễ bị các loài rệp và nấm gây
bệnh. Khi ngô trở nên già hơn thì hàm lƣợng DIMBOA cũng nhƣ khả năng đề
kháng sâu bệnh cũng giảm đi [179], [187].
Các bắp ngô là các cụm hoa cái hình bông đƣợc bao bọc trong một số lớp

lá, và đƣợc các lá này bao chặt vào thân đến mức chúng không lộ ra cho đến khi
xuất hiện các râu ngô màu hung vàng từ vòng lá vào cuối của bắp ngô. Râu ngô
là các núm nhụy thuôn dài trông giống nhƣ một búi tóc, ban đầu màu xanh lục
và sau đó chuyển dần sang màu hung đỏ hay hung vàng. Các hạt ngô là các dạng
quả thóc với vỏ quả hợp nhất với lớp áo hạt, là kiểu quả thông thƣờng ở họ Hòa
thảo. Các hạt ngô bám chặt thành các hàng tƣơng đối đều xung quanh một lõi
trắng để tạo ra bắp ngô. Mỗi bắp ngô dài khoảng 10- 25cm, chứa khoảng 200-
400 hạt. Các hạt có màu nhƣ ánh đen, xám xanh, đỏ, trắng và vàng. Khi đƣợc
nghiền thành bột, ngô tạo ra nhiều bột và ít cám hơn so với lúa mì [11].
Ngô có 10 cặp nhiễm sắc thể (n=10). Chiều dài tổng cộng của các nhiễm
sắc thể là 1500 cM. Một số nhiễm sắc thể của ngô có "bƣớu nhiễm sắc thể"- các
vùng lặp lại cao với vết màu sẫm. Mỗi bƣớu riêng biệt là đa hình trong số các
giống của cả ngô lẫn cỏ ngô. Barbara McClintock đã sử dụng các bƣớu này để
chứng minh thuyết “Yếu tố di truyền vận động” [185]. Năm 2005, Quỹ Khoa
học Quốc gia Hoa Kỳ (NSF), Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ và Bộ Năng lƣợng Hoa
Kỳ (DOE) đã xác định trình tự chuỗi bộ gen của ngô. Bộ gen ngô có 50000–
60000 gen nằm rải rác trong 2,5 tỷ base [186].
Ngô nếp (Zea mays L. subsp. Ceratina Kulesh), là một trong những loài
phụ chính của Zea mays L. Bề ngoài hạt ngô nếp tƣơng tự với ngô đá, nhƣng
bóng hơn. Lớp ngoài cùng của mặt cắt nội nhũ không có lớp sừng nhƣ ở ngô tẻ,
có tính chất quang học giống nhƣ lớp sáp. Do vậy, ngô nếp còn có tên gọi khác
là ngô sáp. Ngô nếp là dạng ngô tẻ do biến đổi tinh bột mà thành. Tinh bột của
ngô nếp chứa gần nhƣ 100% amylopectin, trong khi ngô thƣờng chỉ chứa 75%

7
amylopectin và 25% amylose [11]. Theo Peter Thompson (2005), đặc tính của
ngô nếp đƣợc quy định bởi đơn gen lặn đó là gen wx [135].
1.1.2. Giá trị dinh dưỡng và kinh tế của ngô nếp
Ngô nếp đƣợc sử dụng làm lƣơng thực và thức ăn chăn nuôi gia súc, gia
cầm. Khi nấu chín có độ dẻo, mùi vị thơm ngon, giá trị dinh dƣỡng

cao, dễ hấp thụ
hơn so với tinh bột

của ngô tẻ [189]. Một trong những nguyên nhân là do trong
ngô nếp có hàm lƣợng các axit amin không thay thế nhƣ lyzin và triptophan cao.
Hàm lƣợng lipit cao (3,5- 7%) và phụ thuộc vào từng giống, điều kiện tự
nhiên. Lipit đƣợc tập trung ở phôi và tầng alơron. Dầu ngô chứa đến 50% axit
linoleic liên kết với các glyxerit, axit oleic, panmitic, rixinic. Hàm lƣợng lipit là
một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lƣợng hạt.
Protein của ngô đƣợc chia thành ba loại chính: protein hoạt tính (chủ yếu là
enzyme), protein cấu trúc và protein dự trữ, trong đó protein dự trữ chiếm tỷ lệ
cao nhất. Hàm lƣợng protein dao động từ 4,8- 16,6% ở mỗi giống. Lợi dụng tính
chất hoà tan của protein trong các dung môi, ngƣời ta có thể tách chiết protein
tan từ ngô phục vụ cho nhiều mục đích nghiên cứu nhƣ đánh giá chất lƣợng, khả
năng chịu hạn [187].
Ngô đƣợc sử dụng chủ yếu để nuôi gia cầm và gia súc: cỏ khô, cỏ ủ chua
hay lấy hạt làm lƣơng thực. Hạt ngô có nhiều ứng dụng trong công nghiệp nhƣ:
chuyển hóa thành chất dẻo hay vải sợi; thủy phân hay xử lý bằng enzyme để sản
xuất xi rô chứa nhiều fructose, đôi khi đƣợc lên men để chƣng cất một số dạng
rƣợu. Ethanol từ ngô cũng đƣợc dùng ở hàm lƣợng thấp (10% hoặc ít hơn) nhƣ
là phụ gia của xăng làm nhiên liệu cho một số động cơ để gia tăng chỉ số octan,
giảm ô nhiễm và giảm mức tiêu thụ xăng (ngày nay gọi chung là "các nhiên liệu
sinh học"). Trong nhiều nền văn hóa ngƣời ta sử dụng các món cháo ngô, bánh
ngô. Một vài dạng ngô cũng đƣợc trồng làm cây cảnh. Đối với mục đích này,
các dạng với lá hay bắp nhiều màu, kích thƣớc lớn, bắp dài đƣợc sử dụng [187].

8
1.1.3. Tình hình sản xuất ngô nếp trên thế giới và ở Việt Nam
Ngô nếp đƣợc trồng nhiều nhất ở Mỹ, diện tích hàng năm khoảng 290000 ha.

Hầu hết diện tích này đƣợc trồng là nếp vàng [189]. Theo Peter Thompson (2005),
năng suất của ngô có hàm lƣợng amylose cao biến động tuỳ thuộc vào đất trồng,
trung bình đạt từ 65- 75% so với ngô tẻ thƣờng. Ngô nếp có thể cho năng suất thấp
hơn ở điều kiện thời tiết bất thuận [135]. Theo thông báo của trƣờng Đại học
Illinois, gần đây đã có một số giống nếp lai điển hình cho năng suất cao hơn những
giống ngô lai thông thƣờng [190].
Bảng 1.1. Diện tích, năng suất, sản lƣợng ngô, lúa mì, lúa nƣớc trên thế giới 1961-2011
Năm
NGÔ
LÚA MÌ
LÚA NƢỚC
Diện tích
(triệu ha)
N.suất
(tạ/ha)
Sản lƣợng
(triệu tấn)
Diện tích
(triệu ha)
N.suất
(tạ/ha)
Sản lƣợng
(triệu tấn)
Diện tích
(triệu ha)
N.suất
(tạ/ha)
Sản lƣợng
(triệu tấn)
1961

105,5
19,0
205,0
204,2
11,0
222,4
115,3
19,0
215,6
2004
145,7
50,0
727,4
217,2
29,0
633,3
150,2
40,0
607,3
2005
145,5
49,0
712,9
221,4
28,0
628,7
154,5
41,0
631,5
2006

144,4
48,0
695,2
216,1
28,0
605,9
153,0
41,0
634,6
2008
157,0
49,0
766,2
217,2
28,0
603,6
153,7
41,0
626,7
2010/11
314,6
36,0
1121,9
217,3
30,0
653,4
161,8
43,0
701,1
Nguồn Niên giám thống kê Thế giới, 6/2013 [183]

Theo thông tin từ Hội nghị ngô châu Á lần thứ 9 tại Bắc Kinh (2005), Trung
Quốc đã tạo ra khá nhiều giống ngô nếp lai cho năng suất cao và chất lƣợng tốt. Ví
dụ: giống lai đơn màu trắng JYF 101 cho năng suất trung bình 150 tạ bắp tƣơi/ha;
giống lai đơn màu tím Jingkenou 218 cho năng suất khoảng 120 tạ bắp tƣơi/ha;
giống nếp trắng Jingkenou 2000 năng suất trung bình trên 130 tạ bắp tƣơi/ha; giống
lai đơn tím trắng Jingtianzihuanuo và giống lai đơn Yahejin 2006 cho năng suất tới
200 tạ bắp tƣơi/ha [188]. Ở Hàn Quốc, một số tỉnh trồng ngô nếp bán bắp tƣơi thu
đƣợc 7925 USD/ha, sau đó trồng bắp cải, tổng thu nhập trên 16228 USD/ha.

9
Ở Việt Nam, ngô nếp đƣợc phân bố ở khắp các vùng, miền trong cả nƣớc với
nhiều dạng mày hạt khác nhau: Trắng, vàng, tím, nâu, đỏ Hiện nay, Viện nghiên
cứu ngô đã thu thập và lƣu giữ 148 mẫu ngô nếp địa phƣơng, trong đó có: 111
nguồn nếp trắng, 15 nguồn nếp vàng và 22 nguồn nếp tím, nâu đỏ. Theo điều tra của
Trung tâm Khảo kiểm nghiệm giống cây trồng Trung ƣơng, trong 2 năm 2003 và
2004, diện tích ngô nếp ở nƣớc ta chiếm gần 10% diện tích trồng ngô [17]. Diện tích
trồng ngô nếp không ngừng tăng nhanh trong thời gian qua, đặc biệt là ở vùng đồng
bằng ven đô thị. Nguyên nhân chính trƣớc hết do các giống ngô nếp đáp ứng đƣợc
nhu cầu luân canh tăng vụ trong cơ cấu nông nghiệp hiện nay, nhƣng quan trọng
hơn là do nhu cầu của xã hội ngày một tăng đối với sản phẩm này. Ở các vùng núi
cao và vùng sâu, ngô nếp đƣợc ngƣời dân sử dụng làm lƣơng thực chính, dƣới dạng
xôi ngô hoặc dùng tƣơi dƣới dạng nƣớng, luộc.
Bảng 1.2. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 1990 đến 2012/13
Năm
1990
2000
2005
2007
2009
2011

2012/13
Diện tích (1000ha)
432,0
730,2
1052,6
1096,1
1089,2
1121,3
1118,3
Sản lƣợng (1000 tấn)
671,0
2005,9
3787,1
4303,2
4573,1
4835,6
4803,6
Năng suất (tạ/ha)
15,5
27,5
36,0
39,3
40,1
43,1
43,0
Nguồn Niên giám thống kê, 8/2013 [22]
Cũng nhƣ tình trạng chung trên thế giới, các nghiên cứu về ngô ở Việt Nam tập
trung chủ yếu vào ngô tẻ. Đối với các giống ngô nếp địa phƣơng, đến nay chỉ có
một số ít công trình đƣợc công bố. Tác giả Ngô Hữu Tình và Nguyễn Thị Lƣu
(1990) đã chọn tạo thành công giống ngô nếp trắng từ vốn gen gồm các dòng thuần

nếp trắng (làm nền) đƣợc bổ sung 12 nguồn gen tƣ
̀
các giống nếp địa phƣơng [20].
Nguyễn Thế Hùng và cộng sự (2010) đã tuyển chọn đƣợc 22 nguồn ƣu tú trong tổng
số 64 nguồn vật liệu ngô nếp có nguồn gốc từ các vùng địa lý khác nhau (miền Bắc
Việt Nam, Lào). Thông qua đánh giá đa dạng di truyền phân nhóm ƣu thế lai và các

10
tổ hợp lai, các tác giả đã chọn đƣợc ba tổ hợp lai cho năng suất cao và chất lƣợng tốt
(W1 x W16, W1 x W9, W1 x W2) [7].
Thời gian gần đây, các nhà tạo giống Việt Nam đã bắt đầu chuyển sang
hƣớng tạo giống nếp lai và đã tạo đƣợc một vài giống nếp lai không quy ƣớc có
triển vọng nhƣ các giống lai VN2, MX2, MX4, Bạch ngọc Trong khi đó, các
giống ngô nếp địa phƣơng có ƣu điểm chất lƣợng hạt cao, khả năng chịu hạn và
kháng sâu bệnh tốt, có thể gieo trồng trên nhiều loại đất khác nhau đang đứng
trên nguy cơ bị suy giảm quỹ gen vì năng suất thƣờng thấp. Vì vậy, việc sƣu tập,
nghiên cứu và đánh giá một cách toàn diện nguồn gen các giống ngô địa phƣơng
là hết sức cần thiết cho công tác giống, và bảo tồn nguồn gen quý.
1.2. Phản ứng của cây ngô trƣớc tác động của hạn
1.2.1. Mối liên quan giữa hạn và tính chống chịu stress oxy hóa
1.2.1.1. Mối liên quan giữa hạn và stress oxy hóa
Hạn đối với thực vật là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nƣớc do môi
trƣờng gây nên làm ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và phát triển. Những cây có khả
năng duy trì sự phát triển và cho năng suất ổn định trong điều kiện khô hạn gọi
là cây chịu hạn và khả năng của thực vật có thể làm giảm thiếu hụt mức độ tổn
thƣơng do thiếu nƣớc gây ra gọi là tính chịu hạn.
Có hai loại hạn cơ bản: hạn thật (gồm hạn đất, hạn không khí, hạn toàn
diện), và hạn sinh lí. Hạn đất là do lƣợng nƣớc trong đất giảm làm hệ rễ của cây
không thể lấy nƣớc từ đất vào tế bào dẫn đến cây có hiện tƣợng bị héo lâu dài.
Hạn không khí thƣờng có đặc trƣng là nhiệt độ cao (39- 42

o
C) và độ ẩm thấp
<62%. Hạn không khí thƣờng gây nên hiện tƣợng héo tạm thời vì rễ cây không
hút đủ nƣớc mà quá trình thoát hơi nƣớc quá nhanh do nhiệt độ môi trƣờng cao.
Hạn sinh lí khác với hai loại hạn trên ở chỗ môi trƣờng vẫn đầy đủ nƣớc nhƣng
do mất cân bằng áp suất thẩm thấu giữa môi trƣờng tế bào và môi trƣờng bên
ngoài nên rễ cây không có khả năng hút nƣớc.