Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh vì phân lập gen chaperonin liên quan đến tính chịu hạn của một số giống đậu tương địa phươngtrồng ở vùng tây nguyên
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (758.89 KB, 73 trang )
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
ĐINH THỊ NGỌC
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH
VÌ PHÂN LẬP GEN CHAPERONIN LIÊN QUAN ĐẾN
TÍNH CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG
ĐỊA PHƯƠNGTRỒNG Ở VÙNG TÂY NGUYÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Thái Nguyên - 2008
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
ĐINH THỊ NGỌC
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH
VÌ PHÂN LẬP GEN CHAPERONIN LIÊN QUAN ĐẾN
TÍNH CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG
ĐỊA PHƯƠNGTRỒNG Ở VÙNG TÂY NGUYÊN
CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN HỌC
MÃ SỐ: 60.42.70
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS CHU HOÀNG MẬU
Thái Nguyên- 2008
1
MU
1. Lý do chn tài
u tng (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghip ngn ngày, có giá
tr kinh t và hàm lng dinh dng cao. Ht u tng cha 30 % - 56% protein,
cha nhiu loi axit amin không thay th (lysin, tryptophan, metionin, cystein,
leucin…), 12 %-25% lipit, và các vitamin (B1, B2, C,D, E, K…) cn thit cho c
th ngi và ng vt. Mt c tính quan trng na ca cây u tng là có nt sn
r to kh nng cnh nit không khí, vì vy trng u tng góp phn ci to
t và bo v môi trng [20].
Sn xut u tng phát trin mnh ti M, Brazil, Argentina, Trung Quc và
nhiu nc khác. Sn lng u tng trên th gii t hàng trm triu tn/ nm. Trong
khi ó, Vit Nam sn lng mi cht trm nghìn tn/ nm, u ó chng t tình
hình sn xut u tng nc ta so vi khu vc vn còn mc thp. thúc y sn
xut u tng vn quan trng là chn to c nhng ging không ch cho nng
sut cao, phm cht tt mà còn phi thích hp vi u kin a hình khí hu.
c ta có h sinh thái rt a dng, khí hu gia các vùng, min li không
ging nhau. a hình có n 3/4 là i núi thng có mùa khô hanh min Bc, mùa
khô nóng Tây Nguyên…Nhng nm gn ây din bin khí hu ngày càng phc tp,
ng ma phân b không u gia các vùng và gia các thi k trong nm nên hn
hán và nng nóng kéo dài. u tng là cây tng i mn cm vi u kin ngoi
cnh và thuc vào nhóm cây chu hn kém, công tác chn to các ging u tng có
kiu gen chng chu ngày càngc quan tâm nghiên cu [10], [18], [23].
Vit Nam, ngun gen ca cây u tng rt a dng và phong phú; ngoài
nhng ging nhp ni, ging li to và ging t bin, còn có tp oàn các ging
a phng. Nhng ging u tng a phng thng có nng sut thp, nhng
li có cht lng ht tt và kh nng chng chu cao vi các u kin bt li ca
ngoi cnh. c tính chu nóng, chu hn ca các ging u tng này ã c
nhiu nhà khoa hc quan tâm nghiên cu [18], [24], [31], [36]. Tuy nhiên, các tác
gi mi ch tp trung nghiên cu các ging u tng trng các tnh trung du,
2
ng bng và các tnh vùng núi phía Bc, trong khi ngun gen ca cây u tng
các tnh khu vc Tây Nguyên nc ta cng rt a dng, có nhiu c tính quý còn ít
c quan tâm.
Tây Nguyên là vùng t vi hai mùa rõ rt, mùa ma và mùa khô, mùa khô
thng kéo dài gây thiu nc trm trng dn n nng sut, sn lng cây trng
hàng nm gim mnh trong ó có cây u tng. Vì vy, vic ánh giá, tuyn chn
các ging u tng có nng sut và cht lng, có kh nng chng chu hn cao
làm vt liu chn ging là yêu cu thc tin t ra cho ngành chn ging u tng
vùng t Cao Nguyên này. T nhng lý do trên chúng tôi ã tin hành tài:
“Nghiên cu c m hóa sinh và phân lp gen chaperonin liên quan n tính
chu hn ca mt s ging u tng a phng trng vùng Tây Nguyên”
nhm ánh giá cht lng ht và tìm hiu gen liên quan n kh nng chu hn ca
cây u tng trong iu kin sinh thái khu vc Tây Nguyên.
2. Mc tiêu nghiên cu
- So sánh cht lng ht ca mt s ging u tng trng ti khu vc Tây Nguyên.
- Nghiên cu kh nng chu hn, c s hóa sinh và phân lp gen liên quan
n kh nng chu hn ca mt s ging u tng trng ti khu vc Tây Nguyên.
3. Ni dung nghiên cu
- Phân tích c m hình thái, khi lng và kích thc ht ca mt s
ging u tng trng ti Tây Nguyên.
- Xác nh hàm lng protein, lipit trong ht ca các ging u tng nghiên cu.
- Phân tích thành phn axit amin trong protein ht ca các ging u tng
- Xác nh hàm lng protein tan, hot ca proteaza giai n ht ny mm.
-ánh giá kh nng chu hn ca các ging u tng giai n cây non
trong iu kin hn nhân to.
- Xác nh hàm lng prolin giai on cây non 3 lá thi m trc và sau
khi x lý bi hn.
- Nhân, tách dòng và c trình t gen chaperonin liên quan n tính chu hn
ca mt s ging u tng trng ti Tây Nguyên.
3
Chng 1
NG QUAN TÀI LIU
1.1. CÂY U TNG
1.1.1. c m sinh hc ca cây u tng
u tng có tên khoa hc là Glycine max (L) Merrill, có b nhim sc th
2n = 40, thuc thân tho, hu (Fabaceae), h ph cánh bm (Papilionoidea).
u tng có ngun gc t các tnh phía Bc và ông Bc Trung Quc, các vùng
k cn ca Cng hòa liên bang Nga, Triu Tiên và Nht Bn.Các ging u tng
ang trng ti nc ta c du nhp t Trung Quc t lâu i [13].
V hình thái, cây u tng các b phn chính là r, thân, lá, hoa và qu
Ru tng có r cc gm r cái và r bên, trên b r ca cây u tng có
nhiu nt sn cha vi khun Rhizobium japonicum có kh nng cnh nit t khí
tri cung cp m cho cây, có vai trò ci to t [9].
Thân u tng có hình tròn, thân non có màu xanh hoc tím, khi qu chín
thì thân ng sang màu vàng nâu.
Lá u tng gm 3 loi lá: lá mm, lá n và lá kép (có 3 lá chét ôi khi có
4-5 lá chét).
Hoa mc thành chùm nách lá, mi chùm hoa có t 10-15 hoa, có màu trng
hoc tím, hoa u tng t th phn hoàn toàn. Qu có th thng hoc cong có
nhiu lông, mi qu cha t 1-5 ht nhng thông thng là 2-3 ht.
Ht u tng không có ni nh mà ch có mt lp v bao quanh phôi và 2 lá
mm. Ht có hình tròn hoc hình bu dc, tròn dài, tròn dt, v ht u tng có màu
nâu, en, vàng, xanh. Khi lng ht rt a dng t 20-400 mg/ht
n c vào thi gian sinh trng ca cây u tng ngi ta chia làm 3 loi:
Ging chín sm (75-85 ngày), ging chín trung bình (80-100 ngày), và ging chín
mun (110-120 ngày). Thi gian sinh trng là mt yu t quan trng la chn
cây trng luân canh tng v [28].
4
1.1.2. Giá tr kinh t ca cây u tng
u tng là cây trng có giá tr kinh t cao, là cây công nghip, cây thc
phm, va là cây ci ci to t. Vi u th ngn ngày, trng c nhiu v trong
m, có th trng thun, trng xen, luân canh gi v, trng c nhiu vùng sinh
thái khác nhau, vì vy sau lúa và ngô, cây u tng có mt vai trò c bit quan
trng trong nn nông nghip nhit i.
V mt dinh dng, ht u tng có thành phn dinh dng cao cha 30-
56% protein, 12-25% lipit và 20% gluxit [20], là ngun axit amin, vitamin (B1, B2,
C, D, E) rt quan trng i vi i sng ca con ngi. Protein u tng còn có
tác dng hu hiu gim cholesterol trong máu, gim thiu nguy c các bnh liên
quan n tim mch, chúng cng ngn cn s phát trin các mm ung th, ngn nga
bnh thn, bnh tiu ng, bnh xp xng.....
Trong công nghip, sn phm t cây u tng c s dng rt a dng
nh dùng trc tip ht khô hoc ch bin thành u ph, ép thành du u tng,
làm bánh ko, sa u, nc gii khát, nc chm ... áp ng nhu cu m trong
khu phn n hàng ngày ca ngi cng nh gia súc.
nhng quc gia phát trin, ngi ta còn dùng u tng vào các k ngh
khác nh bin ch cao su nhân to, mc in, sn, xà phòng, cht t nhân to, cht
nhiên liu lng, du làm trn trong k ngh hàng không.
Trong trng trt, cây u tng còn có tác dng ci to t, tng nng sut
các cây trng khác. u này có c là do hot ng cnh N
2
ca loài vi khun
Rhizobium cng sinh trên r cây. Nh kh nng cnh m nên sau mi v thu
hoch thành phn hóa tính ca t trng c ci thin rõ rt, lng m trong t
tng và khu h vi sinh vt hiu khí trong t ng tng. Do ó, có li i vi cây
trng khác và sau khi thu hoch toàn b thân lá, r, lá ph li b mt t va có tác
dng che ph chng xói mòn, va là ngun hu c giàu m ci to t.
1.1.3. Tình hình sn xut u tng trên th gii và Vit Nam
Trên th gii (tính n tháng 4/ 2006), có 78 nc trng u tng vi din
tích là 91,3 triu ha; nng sut 22,9 t/ ha, sn lng t 236,1 triu tn. Các nc
sn xut u tng ng u th gii là: M, Brazil, Argentina và Trung Quc
chim khong 90-95% tng sn lng u tng trên toàn th gii [45].
5
Nh vy, có th thy u tng chim mt v trí quan trng trong nn kinh t
th gii không ch do c gieo trng trên din tích ln 78 nc, mà ht u tng
còn c s dng rng rãi làm thc phm và nguyên liu cho công nghip.
Bng 1.1. Sn lng u tng ca mt s nc trên th gii niên v 2006 – 2007
(Theo Oil World); n v tính: triu tn
Vit Nam, trong vòng hn 20 nm qua (t 1985- 2006) din tích, nng
sut và sn lng u tng ã không ngng tng, c bit trong nhng nm gn
ây: th m 2000 din tích trng u tng là 124100 ha n nm 2005 tng lên
203600 ha, nng sut t t 12000 t/ha nm 2000 lên 14,300 t/ha nm 2005 và
sn lng t 147300 tn nm 2000 lên 290600 tn nm 2005 [21].
Th gii 236,1
M 86,8
Brazil 59,0
Argentina 47,2
Paraguay 6,5
Trung Quc 16,2
n 7,7
Canada 3,5
Ukraine 0,9
Liên bang Nga 0,7
Indonesia 0,8
Vit Nam 0,3
Thái Lan 0,2
Nigeria 0,4
Các nc khác 0,8
6
Bng 1.2: Din tích, nng sut, sn lng u tng c nc qua các nm
(Ngun: Tng cc Thng kê, 2006)
m
Ch tiêu
2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006
Din tích (1000 ha) 124,1 140,3 158,6 165,6 182,5 203,6 185,8
ng sut (t/ha) 12,0 12,4 13,0 13,3 13,3 14,3 13,9
Sn lng (1000 tn) 149,3 173,7 205,6 219,6 242,1 290,6 186,9
Hin nay cây u tng c trng c 7 vùng nông nghip trên c nc,
do iu kin sinh thái ca mi vùng khác nhau nên có s khác bit khá rõ v din
tích trng, nng sut và sn lng [21].
Bng 1.3. Din tích, nng sut và sn lng u tng ca 7 vùng nm 2005
a m
Din tích
(1000 ha)
ng sut
(Kg/ha)
Sn lng
(1000 tn)
C nc 203,6 1430 291,5
ng bng Sông Hng 67,3 16000 107,5
Vùng ông Bc 48,4 1040 50,2
Vùng Tây Bc 25,0 1150 28,7
Vùng Bc Trung B 6,5 1220 7,9
Tây Nguyên 27,1 1570 42,5
ông Nam B 5,3 1060 5,6
ng bng Sông Cu long 21,2 2100 44,5
ng 3.1 cho thy Tây Nguyên là vùng có din tích trng u tng ln th
3 trong 7 vùng nông nghip trên c.Cùng vi s ng trng a các loi cây
trng chính nh cao su, cà phê, h tiêu, ca cao….thì cây u tng ng ang c
chú trng và phát trin trên vùng t này.
Mc dù, sn lng u tng nc ta có tng nhng so vi các nc trên
th gii và trong khu vc nng sut ca ta vn còn thp, và c bit trong nhng
m gn ây din tích, nng sut và sn lng u tng ca nc ta gim i áng
7
k. Nm 2005 din tích t 203600 ha gim xung ch còn 185800 ha nm 2006 và
sn lng gim t 290600 tn nm 2005 xung còn 186900 tn nm 2006.
Nguyên nhân chính là do u t thp, cha có b ging phù hp, cha áp
dng k tht tiên tin. Vì vy, nghiên cu ci tin các c m nông sinh hc ca
các ging a phng và to ging mi có nng sut cao, thích nghi vi u kin
sinh thái nhng vùng khác nhau bng phng pháp truyn thng kt hp vi hin
i s áp ng c yêu cu ca thc tin t ra và ó cng là chin lc quan
trng v s phát trin cây u nc ta.
1.1.4. Thành phn hóa sinh ht u tng
Trong ht u tng có các thành phn ã bit tính theo t l protein 30-
56%, lipit 12-25%, gluxit 20%; có các mui khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S, các
vitamin A, B1, B2, D, E, F, các men, sáp, nha, cellulose. Ngoài ra, ht u tng
còn có các axit amin c bn isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin,
tryptophan, valin...[20].
Protein là thành phn ch yu trong ht u tng. Chúng chim khong
30%-55% khi lng khô ca ht. Da vào h s lng, ngi ta chia protein ca ht
u tng thành 3 loi: 11S - legumin, 7S - vixilin, 2S - albumin. Nhng loi
protein chính trong ht u tng là: protein d tr (chim 70% tng s protein),
các enzim, các cht c ch proteaza và lectin. Thành phn ca protein gm có
albumin (9,5%), globulin tan trong nc (75,8%), globulin ch tan trong NaCl là
3%, glutelin - protein tan trong NaOH 0,2M là 11,7% [18], [25].
Thành phn axit amin ca ht u tng: Protein ca các loi u ,
nht là u tng, c xem là protein có cht lng tt nht trong các loi protein
thc vt. Chúng có cha tt c các axit amin không thay th. Hn na protein ca
cây hu còn có hàm lng lysin rt cao so vi protein t các loi ng cc.Tuy
vy, hàm lng các axit amin có cha gc SH (metionin, cystein) còn thp [8], [40].
Hàm lng lipit trong u tng khá cao chim khong 12-25% khi
ng khô, trong ó hàm lng các axit béo no thp, khong 13%, không có
cholesterol, 30% là các axit béo cha no mt ni ôi. Lng axit béo không no cn
8
thit: axit linoleic 50%, và c bit có 7% axit anpha linolenic là ngun cung cp
axit béo chui mch dài omega 3 quan trng cho c th nh DHA (Docosa
Hexaenoic Acid) và EPA (Eicosa Pentaenoic Acid ) [44].
Cht lng lipit ca ht u tng rt tt, cho nên nó c s dng rng rãi
trong công nghip ch bin thc phm. Ht u tng còn có các loi vitamin tan
trong lipit, c bit là vitamin E = 200 mg/100g lipit [8], ngoài ra trong ht u
ng còn cha mt s cht khác nh hydrat cacbon, mui khoáng, axit nucleic,
kích thích sinh trng .
Tóm li, ht u tng có giá tr dinh dng cao.Trong ó, hàm lng
protein d tr và cht lng ca chúng là yu t quyt nh làm cho u tng tr
thành ngun thc phm quan trng cho ngi và thc n cho gia súc [18].
1.2. NGHIÊN CU VC TÍNH CHU HN CA CÂY U TNG
1.2.1. Khái nim v hn và tác ng ca hn n thc vt
Hn i vi thc vt là khái nim dùng ch s thiu nc do môi trng
gây nên trong sut quá trình hay tng giai n, làm nh hng n sinh trng và
phát trin ca cây.
Thiu nc trc tiên nh hng n s cân bng nc ca cây, tó nh
ng n chc nng sinh lý nh quang hp, hô hp dinh dng khoáng và cui
cùng nh n s sinh trng phát trin ca thc vt. Cây s cht non hoc gim sc
sng, gim nng sut [19].
Hin tng mt nc có th do tác ng s cp, là kt qu ca s thiu nc
trong môi trng, hoc là tác ng th cp c gây ra bi nhit thp, st
nóng hay tác ng ca mui. Hn cng nh yu t ngoi cnh bt li khác khi tác
ng lên c th thc vt s gây ra phn ng ca c th. Tùy theo tng loài, ging
mà mc phn ng ca c th cng nh thit hi do khô hn gây ra khác nhau:
mt s b cht, mt s b tn thng nhng cng có mt s khác không b nh
ng. Kh nng thc vt có th gim thiu mc tn thng do thiu ht nc gây
ra gi là tính chu hn [19].
9
Vit Nam là mt nc có a hình a dng và din bin khí hu phc tp, lng
a phân b không u gia các vùng, min và gia các thi k trong nm nên hn
hán có th xy ra bt k mùa nào, vùng nào. Din tích có ti 3/4 lãnh th là i núi,
t canh tác ca các khu vc này thng xuyên b hn nên thành phn th nhng ca
các vùng khác nhau rt rõ rt. Tt c các yu t trên chi phi mnh m mc nc ngm
và kh nng gi nc ca t. chng li khô hn cây có th gi không b mt
c, gim din tích lá, rút ngn chu k sng…Kh nng duy trì áp sut thm thu ni
bào có tác dng bo v hoc duy trì sc sng ca t bào cht khi b mt nc [2]. Có
hai loi hn do môi tng tác ng là hn t và hn không khí [1], [5].
Tác ng a n lên cây ch yu theo hai hng chính là: làm tng nhit
cây và gây mt nc trong cây. Nc là yu t gii hn i vi cây trng, va là sn
phm khi u va là sn phm trung gian và cui cùng ca các quá trình chuyn hoá
sinh hc. Nc là môi trng các phn ng trao i cht xy ra [2].
S tác ng ca hn, gây nên hin tng co nguyên sinh và làm cho cây b
héo. S co nguyên sinh các t bào din ra khi nng nc trong môi trng quá
cao hay do hn nc làm cho nc trong t bào tht thoát ra ngoài nên khi.
Hn hán làm gim mnh quang hp. Khi hàm lng nc trong lá còn
khong 40-50% quang hp ca lá s bình tr cn tr s sinh trng ca cây.
Nh vy, nh hng cc oan ca hn bt c giai n sinh trng nào ca
cây trng cng nh hng n các yu t cu thành nng sut và sn lng cây trng.
1.2.2. C s sinh lý, sinh hóa và sinh hc phân t ca tính chu hn
1.2.2.1. C s sinh lý, sinh hóa ca tính chu hn
Khi gp hn thc vt luôn có nhng bin i v mt sinh lý, sinh hóa nhm
không mt nc. Có hai c ch bo v thc vt tn ti trên môi trng thiu
c ó là vai trò ca b r và kh nng u chnh áp sut thm thu [2].
Vai trò ca b r: kh nng thu nhn nc ch yu ph thuc vào b r.
tránh mt nc nhng cây chu hn thng có b r khe, dài, mp, có sc xuyên
sâu s hút c nc nhng ni sâu trong t hoc r lan rng vi s lng ln
[19]. Thc vt nói chung, và cây u tng nói riêng, khi giai n cây non
thng chu tác ng mnh ca hn vì b r cha phát trin y còn yu.
10
Kh nng u chnh áp sut thm thu (ASTT): là mt c tính quan trng
ca t bào khi b mt nc do nóng hn. Nhng thc vt tn ti trên môi trng mt
cân bng v áp sut thm thu òi hi phi có kh nng chng li u kin khc
nghit ó. Trong u kin khô hn ASTT c u chnh tng lên giúp cho t bào
thu nhn c nhng phân t nc tt. Bng c ch nh vy, thc vt có th vt
qua c tình trng hn cc b.
Thông thng, thiu nc gây ri lon toàn b phng thc chuyn hóa
thc vt, làm tng hoc gim hàm lng các cht chuyn hóa nh: ng lên v hàm
ng prolin, nng ion K
+
, các loi ng, axit hu c...[2], [4], [30]. S tng
hp và tích ly các cht trên din ra rt nhanh khi t bào mt nc, các cht hòa tan
sc tích ly nhm chng li vic gim mt nc, tng kh nng gi nc ca
cht nguyên sinh và chúng có th tng tác vi lipit hoc protein màng ngn chn
s phá hy màng và các phc protein [24]. Quá trình này liên quan n s biu hin
ca các gen, hàng lot các gen nghc hot hóa tng hp to ra các cht cn thit
chng li s khô hn [1].
c ta nm trong khu vc nhit i gió mùa hn là yu t tng xuyên tác
ng gây nh hng n sinh trng, phát trin ca cây trng, nh hng xu n
ng sut và phm cht ca chúng. Vì vy, vic nghiên cu các c ch chu hn s
là c s cho vic ci thin ging cng nh to ra c các ging có tính chng chu.
Khi nghiên cu v kh nng chng chu ca các cây trng ly ht ngi ta
thc hin theo nhiu hng khác nhau: phân tích hóa sinh trong ht ny mm
nghiên cu a dng enzym - amylaza và proteaza hàm lng protein tan, thành
phn axit amim, prolin...
Các proteazaóng vai trò quan trng trong c th sng và nht là trong thi
k ny mm ca ht. Chúng rt a dng. Thành phn phc tp ca các proteaza ht
c to ra bi sa dng chc nng do chúng m nhim trong thi k ny mm.
Proteaza nói chung không ch tham gia vào phân gii protein d tr trong ht, nhm
cung cp các axit amin cho thi k phát trin u tiên ca cây mà chúng còn tham gia
vào quá trình vi x lý phân t protein. Proteaza tham gia vào phân gii các protein l
11
hoc b bin tính khi gp u kin cc oan (lnh, mn, hn, tác ng c hc...) [18].
Trn Th Phng Liên (1999) khi nghiên cu so sánh phn di hot tính proteaza
ca các ging u tng chu nóng chu hn khác nhauã nhn xét rng. Proteaza
trong quá trình ht ny mm ca ht tt c các ging u tng nghiên cu rt a
dng, có hot tính cao, có kh nng phân gii hoàn toàn protein d tr to nguyên
liu tng hp protein cho c th mi. X lý nhit cao chnh hng n hot
tính proteaza mt s ging chu hn, không nh hng n ging chu nóng [18].
Nguyn Th Kim Dung (2003) nghiên cu s bin ng hot proteaza giai
on ht ny mm ca các ging lc ã rút ra kt lun, hot ca proteaza trong
giai on ht ny mm có xu hng tng t 1 n 5 ngày tui, sau ó gim t 7 n
9 ngày tui [6]. Cng theo hng nghiên cu này Nguyn Th Thu Ngà (2007), cho
rng các giai n ht ny mm làm bin i hot ca proteaza và hàm lng
protein tan. S bin i này tuân theo quy lut chung : tng các giai n t 3 n
7 ngày tui, bt u gim giai n 9 ngày tui, hàm lng protein tan và hot
proteaza có mi tng quan thun cht ch [29].
Nhng thay i hóa sinh khác do hn gây ra cng c nhiu tác gi quan
tâm nghiên cu: nh s thay i hàm lng prolin khi cây gp hn.
Prolin là mt axit amin có vai trò quan trng trong su hòa ASTT trong
t bào, ng thi là mt axit amin a nc có kh nng gi và ly nc cho t bào,
ngn chn s xâm nhp ca ion Na
+
tng tác vi protein màng, ngn chn s phá
hy ca màng và các phc protein khác. Các kt qu nghiên cu u cho thy khi cây
trng gp hn thì cây gim tng hp protein và tng tng hp prolin [26], [28].
Soulages và cs (2003) ã chng minh ngoài vai trò tng cng kh nng chu
hn thì chui axit amin L – Prolin nhóm II còn có kh nng chng li các tác ng
bt li ca nhit i vi cây u tng [ 38]. Theo inh Th Phòng (2001), lúa
khi gây hn sinh lý bng dung dch sorbitol 5% hàm lng prolin ca các dòng chn
lc tng lên vt xa so vi i chng, s tng hàm lng prolin liên quan n kh
ng chu hn [30]. Kho sát cht lng ht và kh nng chu hn ca mt s ging
lúa cn a phng vùng núi phía Bc, Chu Hoàng Mu và cs ( 2005) ã nhn xét,
12
kh nng chu hn ca các ging lúa cn có liên quan n hàm lng protein và hàm
ng prolin. Khi gp hn, cây lúa cn gim hàm lng protein và tng hàm lng
prolin [24]. Nguyn Th Thúy Hng ( 2006), khi nghiên cu v kh nng chu hn ca
các ging u tng a phng ca Tnh Sn La cng ã nhn xét rng: khi gp hn
các ging u tng có s gim tng hp protein và tng cng tng hp prolin [26 ].
1.2.2. C s phân t ca tính chu hn
Kh nng chng chu ca sinh vt nói chung và ca thc vt nói riêng liên
quan n cu trúc, chc nng ca các thành phn trong t bào và các quá trình
xy ra trong mi vùng liên quan n kh nng chu nóng, chu hn, mn, phèn
ca thc vt.
Phn ng ca thc vt trc nhng tác ng: nóng, hn rt a dng nó ph
thuc vào nhiu yu t khác nhau, trong ó có kiu gen, dài và tính khc lit ca
iu kin ngoi cnh. Biu hin ca quá trình này là vic sinh tng hp mt lot các
cht trong t bào, mt s hormon hoc cht kích thích giúp cho cây có kh nng
thích ng. Khi i sâu vào nghiên cu mc phân t ca hin tng nóng hn
thc vt ngi ta ã có nhng bc tip cn khác nhau trên nhiu loài cây trng
các giai on phát trin khác nhau. c nghiên cu nhiu nht là các protein sn
phm biu hin gen [19]. Nhóm các protein c c bit quan tâm bao gm:
protein sc nhit, môi gii phân t, LEA...
Protein sc nhit (heat shock protein- HSP): HSP có hu ht các loài
thc vt nh: lúa mì, mch, lúa go, ngô, u nành, hành, ti…. chúng chim
khong 1% protein tng s trong lá ca các loài thc vt này. HSP c tng hp
khi t bào gp iu kin cc oan nh: hn, nhit cao, mui cao. S xut hin
ca HSP có chc nng ngn cn hoc sa cha s phá y do stress nóng và m
rng giá tr ngng vi s chng chu nhit cao. Trong các t bào thc vt HSP
t bào cht tp trung thành các ht sc nhit (HSG-Heat Shock Granules). Ngi ta
cho rng các HSP gn kt trên các ARN polymeraza ngn cn s phiên mã tng
hp mARN trong quá trình b stress nóng. Sau sc nóng các ht này phân tán và
liên kt dày c vi các ribôxôm hot ng sinh tng hp protein [19].
13
HSP có th chia làm 6 nhóm da trên c s khi lng phân t khác nhau:
110, 90, 70, 60, 20, 8,5 kDa. Trong ó có nhóm HSP70 và HSP 60 có nhiu i
din ca cht môi gii phân t (gi là chaperonin) HSP 8,5 kDa (Ubiquitin) có chc
ng bo v cho t bào nhng không phi là môi gii phân t. Ubiquitin có hot
tính proteaza vi chc nng phân gii các protein không có hot tính enzym.
Ubiquitin có MW rt thp, ít chu nh hng ca nhit nên có vai trò t sa cha
ca t bào khi gp yu t cc oan, c bit là nhit cao [19].
Môi gii phân t (MGPT): MGPT là mt nhóm gm nhóm gm nhiu loi
protein khác nhau, nhng chúng u có chc nng tham gia to cu trúc không gian
úng cho protein trong t bào. Phn ln các cht MGPT có hot tính ATP-aza, có
chc nng: (1) Gin nh chui polypeptit khi ang tng hp và to cu trúc
không gian úng cho chúng, (2) To li cu trúc không gian ca protein sau khi vn
chuyn qua màng t bào, (3) Lp ráp các chui polipeptit vào phc to cu trúc
bc 4, (4) MGPT c tng cng nh quá trình tng hp trong u kin cc oan
do nhu cu cp thit ca t bào, nht là sc nhit.
MGPT có th chia thành mt s nhóm nh sau:
HSP 70 là nhóm MGPT có hot tính ATP-aza và có tính bo th cao. Trong
iu kin cc oan HSP có th ngn chn s co cm và kt t protein.
HSP 60 (chaperonin) là loi protein cu to t các tiu n v có khi lng
60 kDa và cng có hot tính ATP-aza [24].
H CCT: Chaperonin ca t bào cht, còn gi là chaperonin cha polypeptit-
l ca phc t (CCT), hay còn gi là phc vòng cha polypeptit-l ca phc t (TriC) là
mt nhóm môi gii phân t mi. Chúng giúp cho vic to cu trúc không gian úng
ca protein trong khung t bào actin và tubulin trong t bào cht. Chúng óng vai
trò quan trng trong qua trình hình thành thoi vô sc ca giai n phân bào, c
bit là thi k phát trin mm t ht. Chaperonin t bào cht là mt phc có khi
ng phân t khong 90 kDa bao gm 8 tiu n v có tên là α, , , , , , ,
(tng ng vi CCT1- CCT8) và hình thành nên cu trúc vòng bi kép [16]. Trong
dch chit t bào các tiu n v trong cu trúc không gian ca vòng bi có vai trò rt
14
quan trng gn c cht. Chc nng này gn lin vi s có mt ca 4 tiu n v:
CCTα. Vì quá trình to cu trúc không gian trong CCT không có s tham gia
ca protein dng GroES, nên c cht protein c gi li trong khi hình tr nh c
chóng mc bit theo kiu bc thang ca các vùng CCT. Ngoài CCT còn có hai
nhóm nhân t cùng tác ng A và B tham gia vào cu trúc không gian úng ca
protein. Trong ó nhóm nhân t A không óng vai trò trong công vic u chnh
hot tính ca CCT. Nó không tham gia tng tác vi CCT nhng li tham gia vào
to cu trúc không gian úng ca protein khi gii phóng ra khi CCT [18].
Các nhóm HSP 100, HSP 90 u có tính bo th cao và có hot tính ATP-
aza. Mt s tìm thy trong t bào bình thng, nhng phn ln chúng sinh ra khi
gp các u kin ngoi cnh bt li nh hn, nóng, lnh. Chc nng chính ca
chúng là ngn chn s co cm ca protein và tái hot hoá các protein bin tính [19].
1.2.3. Nghiên cu v tính chu hn cây u tng
Trong các cây trng ly ht thì cây u tng có nhu cu v nc cao hn
các loi cây khác. ó chính là do trong ht và cây u tng có hàm lng protein
và lipit rt cao, tng hp 1kg cht khô cn 500 - 530 kg nc. Trong quá trình
ny mm thì nhu cu v nc ca u tng cng khá cao 50%, trong khi ó ngô
ch là 30%, lúa là 26% [20 ].
Nghiên cu v các c tính chu hn ca cây u tng v phng din sinh
lý và di truyn ã cho thy rng, các c tính này liên quan cht chn c m
hoá keo ca nguyên sinh cht, c m ca quá trình trao i cht. Tính chu hn
ca cây u tng là tính trng a gen. Chúng th hin nhiu khía cnh khác nhau
nh: v s phát trin ca b r, tính chín sm tng i, cng nh bn cht di
truyn ca tng ging có kh nng s dng nc tit kim trong quá trình sinh
trng và phát trin ca cây. n c vào c m này, u tng c chia thành
hai nhóm [18].
- Nhóm chu c s mt nc trong tng giai n phát trin ca cây.
- Nhóm chu c s thiu nc trong tt c giai n phát trin ca cây.
15
giai n cây con khi gp hn, u tng có th d vt qua hn, còn
nhng giai n sau nh giai on ra hoa, kt qu, ht chín sa mà gp hn thì s
dn n nng sut gim áng k.
Trong nhng nm gn ây các nhà khoa hc ã có nhiu thành công khi
nghiên cu sâu hn v tính chu hn ca cây u tng.
Maitra và Cushman (1994) ã phân lp c cDNA ca dehydrin t lá u
ng khi b mt nc, ngoài ra các tác gi còn phân lp c cDNA ca LEA nhóm D
- 95 t lá và r cây u tng khi b hn [36].
Jinn và các tác gi khác (1997) nghiên cu v sHSP nhóm 1 (15-18 kDa) ã
nhn thy, chúng tng lên lng ln trong mm u tng di tác ng ca nhit
c tìm thy cu trúc dng ht trong nguyên sinh cht và trong nhân cùng vi
protein b bin tính.[35].
m 2004, nhóm nghiên cu gm Huang và cs ca Trng i hc T
nhiên và K thut Pingtung, ài Loan, ã phân lp c gen P5CS u tng t
mARN vi kích thc 2148bp [45]. Gen P5CS là nhân t gii hn cho nhp tng
hp proline thc vt trong u kin bt li do hn và do mn gây nên [39].
Nghiên cu ca Porcel và Cs (2005), ã ch ra rng, gen mã hoá protein dehydrin
(LEA-DII) có vai trò vi kh nng chng chu ca u tng.
Vit Nam ã có mt s công trình nghiên cu phân lp các gen liên quan
n kh nng chu nóng, chu hn ca cây u tng. Nghiên cu phân lp và c
trình t gen chaperonin t ging u tng chu nh Bonminori- Nht n vi kích
thc phân t 1,6 kb ca Nông Vn i và cs (1997) [12]. Nghiên cu ca Trn Th
Phng Liên (1999) ã phân lp, xác nh trình t gen chaperonin t bào cht CCT
t ging u tng t bin M103 vi kích thc 1602 bp mã hóa cho 533 axit
amin. Trình t gen này có s thay i axit amin 3 v trí 99 (Ser Thr), 280 (Ser Gly)
và 308 ( Ser Ala), s thay i này tuân theo quy lut tng kh nng chu nhit.
Tác gi khng nh s thay i này là cn c lý gii kh nng chu nóng ca ging
t bin M103 [18]. Trn Th Phng Liên và cs (2003), ã phân lp c gen
chaperonin CCTδ t ging u tng a phng chu n Cúc Vàng, gen này gm
16
1602 nucleotit mã hóa cho 533 axit amin [17]. Nguyn Th Thu Hin (2005), phân
lp c gen dehydrin vi kích thc 751bp liên quan n kh nng chu hn t hai
ging u tng vàng Mng Khng và Cao Bng 4 [11].
1.3. NHN XÉT CHUNG
1.3.1. u tng là cây trng có giá tr kinh t cao, là cây công nghip, cây
thc phm, va là cây ci ci to t. c trng ph bin nhiu quc gia trên th
gii. Vit Nam, cây u tng chim mt v trí quan trng trong nn nông
nghip. Trong nhng nm gn ây nng sut và sn lng u tng tuy có s tng
áng k, nhng so vi các nc trên th gii nng sut ca các ging u tng
c ta còn mc thp.
1.3.2.Trong ht u tng có các thành phn ã bit tính theo t l protein
30-56%, lipit 12-25%, gluxit 20%; có các mui khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các
vitamin A, B1, B2, D, E, F….Trong ó, hàm lng protein d tr và cht lng ca
chúng là yu t quyt nh làm cho u tng tr thành ngun thc phm quan
trng cho ngi và thc n cho gia súc.
1.3.3. u tng là loi cây có nhu cu v nc cao hn các loi cây trng
khác, thuc vào nhóm chu hn kém. Hn ã nh hng ln n quá trình sinh trng,
phát trin ca cây u tng và làm gim nng sut, cht lng. Nghiên cu v tính
chu hn ca cây u tng ngi ta thc hin theo nhiu hng khác nhau: phân tích
hóa sinh trong ht ny mm nghiên cu a dng enzym - amylaza và proteaza hàm
ng protein tan, thành phn axit amin... i sâu vào nghiên cu mc phân t,
c nghiên cu nhiu nht là các protein sn phm biu hin gen. Nhóm các protein
c c bit quan tâm bao gm: protein sc nhit, môi gii phân t, LEA...
1.3.4. Trên th gii ã thành công trong vic nghiên cu gen mã hóa protein
u tng và các trình t gen này ã c công b trên ngân hàng gen th gii.
Ti Vit Nam, ã có mt s tác gi nghiên cu v tính chu hn và ã phân lp, gii
trình t gen liên quan n tính chu hn ca cây u tng, trong ó có chaperonin
trên các ging u tng khác nhau. Tuy nhiên, vic nghiên cu các ging u
ng a phng ca các tnh khu vc Tây Nguyên còn ít c quan tâm chú ý.
17
Chng 2
NGUYÊN LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIÊN CU
2.1. NGUYÊN LIU
2.1.1. Nguyên liu thc vt
Các ging u tng a phng: Azmpa- Gia Lai (AZP), Sa Thy -
Kon Tum (ST), Chmnga-k Lk (CNg) do Trung tâm Tài nguyên Di truyn
thc vt - Vin Khoa hc Nông nghip Vit Nam cung cp.
Ging a phng Duy Linh- Lâm ng (DL) và ging i chng HN9 do
Trung tâm Khuyn Nông tnh k Lk cung cp.
Bng 2.1. Ngun gc ca các ging u tng nghiên cu
TT
Tên ging Ký hiu Ngun gc
1 Duy Linh DL Ging a phng, Duy linh- Lâm ng
2 Sa Thy ST Ging a phng, Sa Thy- Kon Tum
3 mnga CNg Ging a phng, Chmnga-k Lk
4 HN9 HN9 Ging i trà c trng ph bin huyn Buôn
ôn- k lk
5 Azmpa AZP Ging a phng, Azmpa- Gia Lai
2.1.2. Hóa cht, thit b và a m nghiên cu
Hóa cht: dùng cho các thí nghim phân tích hoá sinh và sinh hc hc phân
t: gm các loi hoá cht mua ca các hãng Anh, c, M, Trung Quc: EDTA,
CTAB, TAE, Agarose…
Các hóa cht thông dng khác: axit citric, NaOH, NaCl, CH3COONa, ethanol
(70%, 100%), tris HCl 1M, chloroform, isoamyl alcohol, isopropanol, nc kh ion,
NaH
2
PO
4
, Fe
2
( SO
4
), K
3
Fe( CN)
6
, CuSO
4
, ninhydrin…
Thit b: Các thit b chính c s dng phân tích hoá sinh và sinh hc
phân t gm:
- Máy quang ph UV-Vis Cintra 40 (Australia)
- Máy in di + b ngun PowerPac 300 (Bio-Rad, M)
18
- Máy phân tích axit amin t ng - HP amino Quan SeriesII (Hewlett
Parkard, M)
- Máy phân tích trình t gen ABI 3100 Genetic Analyzer (M)
- Bn nhit (Techne, OSI, Anh)
- Pipetman các loi (Gilson, Pháp)
- T sy (Anh)
- Cân in t (Thu S)
- T lnh sâu – 85
0
C (Sanyo, Nht Bn)
- Ni kh trùng (Tomy- Nht)
- Máy PCR (ABI System, M)
- Máy soi ADN (Bio-Rad, M)
- Máy li tâm lnh (c)
- Máy khuy trn Voltex (c)
- Máy o pH (Metter Toledo, Thy S)
a m nghiên cu: Các thí nghim c thc hin ti Phòng thí nghim
Di truyn hc và Công ngh gen, Khoa Sinh- KTNN, Trng i hc S phm -
i hc Thái Nguyên. Các phân tích axit amin tng và xác nh trình t gen
c thc hin ti Phòng thí nghim trng m Công ngh gen, Vin Công ngh
sinh hc, Vin Khoa hc và Công ngh Viêt Nam.
2.2. PHNG PHÁP NGHIÊN CU
2.2.1..Phng pháp hoá sinh
2.2.1.1. Phân tích hóa sinh giai n ht tim sinh
(1) Xác nh hàm lng lipit
Da vào tính cht hoà tan ca lipit trong dung môi hu c chit rút, dung
môi hu cc s dng là petroleum ether [24].
Mu em sy khô, bóc v, nghin mn. Cân 0,05g mu cho vào mi ng
Eppendorf (3 ng Eppendorf / mu). Tip theo, cho 1,5ml petroleum ether vào mi
ng, lc o u, ngn lnh 4
o
C trong 24 gi, em ly tâm 12000 vòng/phút trong 20
phút, b dch, lp li thí nghim 3 ln. Sau ó, sy khô mu còn li trong epp 70
0
C
n khi khi lng không i ri cân mu. Hàm lng lipit c tính theo công thc:
19
Hàm lng lipit =
(%)
AB
A
−
Trong ó: A: Khi lng mu ban u
B: Khi lng mu sau khi loi lipit
(2) Xác nh hàm lng protein
Protein tan tng s xác nh theo phng pháp Lowry c mô t trong tài
liu ca Phm Th Trân Châu và cs (1998) [3].
Cân 0,05g mu ã nghin nh, sy khô cho vào ng Eppendorf, mi mu lp
li 3 ln. Cho vào mi ng 1,5ml dung dch m photphat citrat ( pH=10 ), o u
bng máy voltex, trong t lnh 4
o
C qua êm, em ly tâm thu dch 12000
vòng/phút trong 20 phút ri thu ly dch. Thí nghim c lp li 3 ln .
Dch chit c nh mc lên 5ml và o hp th quang ph trên máy quang
ph UV bc sóng 750 nm vi thuc th Folin.
Hàm lng protein c tính theo công thc :
X % =
m
AxHSPL
x 100%
Trong ó :
X : hàm lng protein (% khi lng khô)
A : nng thu c khi o trên máy (mg /ml )
HSPL: h s pha loãng
m: khi lng mu (mg)
(3) Xác nh hàm lng và thành phn axit amin trong ht
Hàm lng axit amin c xác nh trên máy HP - Amino Quant s dng
ortho-phtalADNehyt to dn xut i vi các axit amin bc 1 và 9 - fluoreryl -
metyl - cloroformat i vi các axit amin bc 2. Mu c x lý theo phng pháp
thu phân pha lng theo hng dn s dng máy phân tích axit amin tng.
2.2.1.2 ánh giá kh nng chu hn thông qua phân tích mt s ch tiêu hóa
sinh giai n ht ny mm
(1) Chun b mu
Ht các ging u tng c ngâm trong nc 1h, sau ó c m
bng dung dch MS pha loãng 10 ln cha sorbitol 7%. Ht ny mm sau các
20
thi gian 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày c ly xác nh hot
c proteaza và hàm lng protein tan. i chng là ht u tng c bng
c không cha sorbitol.
(2) Xác nh hot ca proteaza
Hot enzym proteaza xác nh theo phng pháp Anson ci tin theo mô
t ca Nguyn Vn Mùi ( 2001) [27].
Ht ny mm bóc v la, cân khi lng, nghin nh, chit bng m
phosphat pH= 6,5 li tâm 12000 vòng/phút 4
o
c, dch thu c s dng làm thí
nghim. Thí nghim c tin hành trên ng thí nghim, ng kim tra, o trên máy
quang ph bc sóng 750 nm. Hot enzym proteaza c tính da trên th
ng chun xây dng bng tyrosin, và c tính theo công thc:
VH/mg =
()n k D HSPL
Tm
− ××
×
Trong ó:
n: so trên máy ng thí nghim (mg/ml)
HSPL: h s pha loãng
k: so trên máy ng kim tra (mg/ml)
m: khi lng mu (mg)
D: s ml dch chit
T: thi gian enzym vi c cht
(3) nh lng hàm lng protein tan
Hàm lng protein tan c xác nh theo phng pháp Lowry c mô t
trong tài liu ca Phm Th Trân Châu và cs (1998) [3].
2.2.2. ánh gía kh nng chu hn giai n cây non bng phng pháp gây
hn nhân to
Phng pháp ánh giá nhanh kh nng chu hn giai n cây non c
tin hành theo Lê Trn Bình và cs (1998) [2].
21
Ht u tng ny mm gieo vào chu (kích thc 30cm x 30cm) cha cát
vàng ã ra sch, mi chu trng 30 cây, mi ging trng 4 chu. Thí nghim c
lp li 3 ln trong iu kin và ch chm sóc nh nhau. Thi gian u ti nc
cho m, khi cây u tng c 3 lá tin hành gây hn nhân to và ánh giá kh
ng chu hn ca các ging u tng bng cách xác nh t l thit hi và ch s
chu hn tng i.
(1) Xác nh t l cây sng sót (%)
S cây sng
T l cây sng sót =
Tng s cây x lý
(%)
(2) Xác nh kh nng gi nc qua các giai n x lý bi hn theo công thc
(%)
ft
fc
W
W
W
=
Trong ó:
W(%): Kh nng gi nc ca cây sau khi x lý bi hn
W
ft
(g): Khi lng ti ca cây sau khi x lý bi hn (g)
W
fc
(g): Khi lng ti ca cây không x lý (g)
(3) Xác nh t l thit hi do hn gây ra c tính theo công thc
()
(%)
o
Nb
a
NC
=
∑
Trong ó:
a: T l thit hi do hn gây ra (%);
b: Tr s thit hi ca mi cp;
c: Tr s thit hi ca cp cao nht;
N
o
: S cây ca mi cp thit hi;
N: Tng s cây x lý
Các tr s:
S cây cht: Tr s 3
22
S cây héo: Tr s 1
S cây không bnh hng: Tr s 0.
(4) Xác nh ch s chu hn tng i c da trên 15 ch tiêu phân tích
và c tính theo công thc
1
sin ( ... )
2
= + + ++S ab bc cd paα
Trong ó:
S: Ch s chu hn tng i
a, b, c, … : Các ch tiêu theo dõi
: Góc to bi 2 trc mang tr s lin nhau = 360
0
/15
15: S ch tiêu theo dõi
(5) Xác nh mt s ch tiêu khác chu tác ng ca hn
- Khi lng ti ca r và thân lá: Ct riêng r và thân lá, dùng giy thm
khô, ri cân trng lng ti trên cân phân tích.
- Xác nh khi lng khô ca r và thân lá: Các mu c sy trong t sy
nhit 100
0
C ri xác nh khi lng khô tuyt i.
- Xác nh t s chu hn
T = W
r
/W
tl
Trong ó :
T: T s khi lng ca r/ thân lá khô
W
r
: Khi lng khô ca r (mg)
W
tl
: Khi lng khô ca thân lá (mg)
(6) Xác nh hàm lng prolin theo Bastes (1973) [33].
Tách chit prolin: Nghin 0,5 gram thân lá cây u tng ã x lý hn
ngng trc hn, hn 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày trong ci chày x, thêm 10ml dung
dch axit sunfosalisilic 3 %, li tâm 8000 vòng /phút trong 30 phút.Thu dch làm thí
nghim. o hp th quang ph bc sóng 520 nm.
Hàm lng prolin c tính theo công thc:
X % =
m
AxHSPL
x 100%
23
Trong ó:
X : Hàm lng prolin (%)
A : Nng thu c khi o trên máy (mg /ml)
HSPL: H s pha loãng
m: Khi lng mu (mg)
2.2.3. X lý kt qu và tính toán s liu
Mi thí nghim c nhc li 3 ln. S dng toán thng kê xác nh tr s
thng kê nh trung bình mu
)(x , phng sai (σ
2
), và sai s trung bình mu )(
x
S ,
h s tng quan R… theo tài liu ca Chu Vn Mn và cs (2001) [22]. Các s liu
c x lý trên máy vi tính bng chng trình Excel vi mc ý ngha α = 0,05 [32].
Xác nh khong cách và thit lp mi quan h gia các ging u tng bng
chng trình NTSYS pc 2.02i.
2.2.4. Phng pháp sinh hc phân t
2.2.4.1. Phng pháp tách chit ADN tng s t mm u tng
Quy trình tách chit và làm sch ADN tng s t mmu tng c thc
hin theo phng pháp ca Gawel và CS (1991) [34].
Mm u tng c 3 ngày tui tách ly phn thân mm ri em bao qun
t lnh sâu (-85
0
C).
Quy trình tách chit ADN tng sc thc hin theo các bc sau:
- Ly khong 200g mm u tng ã lnh -85
0
C nghin nhanh trong
ci và chày x (ci chày ã c vô trùng và trong t -85
0
C).
- B sung 0,8ml m ra, li tâm 15 phút, 12000 vòng/ phút, loi b dch ni.
c này làm 2 ln.
- Thêm 700µl m tách, mix nh, 65
0
C trong 2h, sau ó ly ra nhit
phòng 5 phút.
- Thêm 600µl cloroform:isoamyl alcohol ( 24:1 ), trn u 20 phút
- Li tâm 15 phút, 12000 vòng/phút. Hút cn thn 500µl dch trong sang ng
eppendorf 1,5 ml mi ( b ta).
