Nghiên cứu ứng dụng qui trình thu gom, xử lý và bảo quản tế bào gốc sinh máu sử dụng cho ghép tủy đồng loài

Bộ y tế
viện huyết học truyền máu trung ơng




tổng kết
đề tài nghiên cứu khoa học
cấp bộ




Nghiên cứu ứng dụng quy trình thu gom,
làm sạch và bảo quản tế bào gốc sinh máu
sử dụng cho ghép tuỷ đồng loài

Chủ nhiệm đề tài :
GS. TSKH. Đỗ Trung Phấn
Cơ quan chủ trì :
Viện Huyết học - Truyền máu TW
Viện trởng: PGS. TS. Nguyễn Anh Trí



7596
20/01/2010


Hà Nội, 11/ 2008

Lời cảm ơn

Xin chân thành cảm ơn:
- Sự quan tâm và ủng hộ của lãnh đạo Bộ Y tế, Vụ Khoa học đào tạo - Bộ
Y tế.
- PGS.TS Nguyễn Anh Trí, Viện trởng Viện Huyết học Truyền máu,
Phó Chủ nhiệm môn Huyết học truyền máu Đại học Y Hà Nội đã tạo điều
kiện thuận lợi cho đề tài tiến hành có kết quả.
- PGS.TS Phạm Quang Vinh, Chủ nhiệm môn Huyết học Truyền máu
Đại học Y Hà Nội, Phó Viện trởng Viện Huyết học Truyền máu Trung ơng
đã hết sức ủng hộ và cung cấp cho đề tài các tài liệu quý giá, trực tiếp góp
phần nâng cao tính cập nhật của nghiên cứu này.
- Lãnh đạo Quân y Viện 108 đã tạo điều kiện cho nhóm nghiên cứu của
Quý Viện thực hiện nhánh của đề tài.
- Vụ Khoa học Đào tạo - Bộ Y tế đã hết sức ủng hộ và cho phép kéo dài
thời gian nghiên cứu để đề tài thực hiện mục tiêu góp phần vào công tác đào
tạo cán bộ sau đại học, thực hiện đề cơng nghiên cứu của nghiên cứu sinh
Nguyễn Quang Tùng.
- Viện Huyết học Truyền máu Trung ơng đã tạo mọi điều kiện về trang
bị, cơ sở làm việc cho đề tài thực hiện nhiệm vụ.
- Bộ môn Huyết học Truyền máu đã giúp đỡ và cùng tạo mọi điều kiện
hỗ trợ cho chủ nhiệm đề tài khi đã nghỉ chế độ.
- Cảm ơn tất cả mọi đồng nghiệp đã giúp đỡ cho đề tài hoàn thành. Tuy
có kéo dài thời gian nhng có hiệu quả.
Thay mặt nhóm nghiên cứu xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 11 năm 2008
Chủ nhiệm đề tài

GS.TSKH. Đỗ Trung Phấn

Danh sách
Các thành viên tham gia nghiên cứu


Chủ nhiệm đề tài :
GS. TSKH. Đỗ Trung Phấn
Th ký đề tài :
ths. nguyễn Quang Tùng

Cán bộ nghiên cứu Chức danh khoa học
1. Đỗ Trung Phấn GS. TSKH (Viện HHTMTW)
2. Nguyễn Quang Tùng ThS Y khoa (Đại học Y HN)
3. Trần Thị Mỹ Dung ThS Y học (Đại học Y HN)
4. Nguyễn Thị Thu Hà PGS. TS (QY 108)
5. Lê Xuân Hải TS (Viện HHTMTW)
6. Lý Tuấn Khải TS (QY 108)
7. Nguyễn Tiến Hải BSCKI (QY 108)
8. Trần Hồng Thủy BSCKII (Viện HHTMTW)

Với sự hỗ trợ của tập thể cán bộ công nhân viên Viện Huyết học Truyền
máu, và bộ môn HHTM, Đại học Y Hà Nội.


Đặt vấn đề

Tế bào gốc- một vấn đề lớn của nhân loại thế kỷ XXI. Tế bào gốc đang

đợc nhiều nớc tiên tiến trên thế giới nh Anh, Mỹ , Nhật quan tâm và đầu
t nghiên cứu. Nhiều kết quả về nguồn cung cấp tế bào gốc đã đợc ứng dụng
nh dịch tuỷ xơng, máu ngoại vi huy động, máu cuống rốn.Các nguồn này đã
đợc áp dụng khá rộng rãi cho ghép tự thân hoặc đồng loài điều trị các bệnh
máu ác tính hoặc bệnh di truyền. Riêng về máu cuống rốn một nguồn vô
tận, chất lợng tốt nhng vì số lợng ít không đủ liều tế bào gốc dùng cho
ngời lớn nên việc sử dụng còn gặp khó khăn.
Gần đây một số nhà nghiên cứu đã có sáng tạo khắc phục khó khăn trên
nh đã thành công sử dụng tế bào gốc MCR nuôi cấy ngoài cơ thể (ex vivo
expansion) tạo ra một lợng lớn tế bào gốc đủ liều điều trị cho ngời lớn [43,
75]. Tuy nhiên để thực hiện đợc điều này cần có ngân hàng với hàng ngàn
mẫu để chọn lựa.
Một hớng khác, hiện đại hơn là nuôi cấy dài ngày tế bào gốc Trùm
từ biểu mô của màng nhau thai [56], tế bào biểu mô và trung mô của màng lót
dây rốn tạo ra tế bào gốc chuyên biệt cho các cơ quan khác ngoài cơ quan tạo
máu nh tim, tuỵ, thần kinh, xơng [10, 71]. Đây là hớng mới đang có nhiều
triển vọng.
Trong nớc đã có một số cơ sở nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc tạo máu
cho điều trị bệnh nh bệnh viện TM - HH TPHCM, bệnh viện TW Huế, bệnh
viện QĐ 108, viện HH - TM TW, bệnh viện Nhi TW, các nghiên cứu này chủ
yếu ứng dụng điều trị các bệnh máu nh Lơ xê mi, đa u tuỷ, u lympho, một số
bệnh nhân bị bệnh di truyền (Thalassemia [3,5,9]. Gần đây bộ KHCN đã phê
duyệt chơng trình nghiên cứu tế bào gốc từ màng lót dây rốn, công trình
chuyển giao công nghệ của GS. Phan Toàn Thắng - Đại học Singapore, do xí
nghiệp Dựơc phẩm II thành phố HCM chủ trì, đề tài ứng dụng tế bào gốc máu
huy động và tuỷ xơng điều trị một số bệnh xơng khớp do bệnh viện TWQĐ
108 phụ trách, đề tài tế bào gốc ứng dụng điều trị tim mạch do đại học Y Hà
Nội phụ trách.

Để phục vụ cho nghiên cứu tế bào gốc, việc nghiên cứu xây dựng ngân

hàng tế bào gốc là cần thiết, đặc biệt là ngân hàng máu cuống rốn. Đây là
nguồn vô tận, bỏ đi nhng dễ thu hoạch. Trên thế giới đã có hàng trăm ngân
hàng máu cuống rốn, các ngân hàng đó đã l trữ đợc hàng vạn mẫu máu
cuống rốn đã đợc sàng lọc và loại bỏ các bệnh nhiễm trùng, di truyền, đã xác
định đợc Phenotype HLA, nhóm máu ABO, tạo ra nguồn lựa chọn tối u cho
điều trị. HLA đóng vai trò quyết định thành công của ghép, nếu có nguồn
ngời cho tơng đồng 6/6 hoặc 5/6 phenotype thì tiên lợng thành công rất
cao. Chính vì lẽ đó việc xây dựng ngân hàng tế bào gốc và thực hiện trao đổi
quốc tế trong khu vực và thế giới thì tần suất tìm đợc nguồn cho tơng đồng
là rất lớn, kết quả ghép tế bào gốc càng cao.
ở Việt Nam, bệnh viện Truyền máu Huyết học TP Hồ Chí Minh đã có
ngân hàng máu cuống rốn từ 2005, hiện đã chọn đợc >1400 mẫu, bớc đầu
đã sử dụng ghép đồng loài cho 5 bệnh nhân Thalasemia có kết quả[9]. ở miền
Bắc có một số nơi áp dụng ghép tế bào gốc, nhng cha có ngân hàng tế bào
gốc. Do đó viện Huyết học-Truyền máu TW đã có kế hoạch xây dựng ngân
hàng tế bào gốc cung cấp cho điều trị.
Xuất phát từ yêu cầu trên đây năm 2002, mặc dù có rất nhiều việc làm
cho chơng trình an toàn truyền máu (dự án WB), trang thiết bị thiếu thốn, cơ
sở chật hẹp, nhng chúng tôi đã đề nghị Bộ Y tế xét duyệt đề tài này nhằm
góp phần chuẩn bị các điều kiện về kỹ thuật và cán bộ cho xây dựng ngân
hàng tế bào gốc tại Viện Huyết học-Truyền máu TW phục vụ cho khu vực
phía Bắc, với 2 mục tiêu sau đây:
1. Nghiên cứu ứng dụng quy trình thu gom, làm sạch và bảo quản tế bào
gốc máu ngoại vi huy động, tuỷ xơng, máu cuống rốn sử dụng cho ghép tế
bào gốc đồng loài.
2. Nghiên cứu đánh giá kết quả bảo quản dài ngày tế bào gốc ở nhiệt độ -
196
0
C.

Chơng 1
Tổng quan

1. Tế bào gốc (Stem cells).
Danh từ tế bào gốc có từ trên 60 năm nay, kể từ khi nghiên cứu thành
công tạo colony tế bào lách (CFU-S) trong nghiên cứu tạo máu ở chuột
(1950).Từ đó dựa trên các tiến bộ về khoa học kỹ thuật: hình thái học, hoá tế
bào, miễn dịch, lai phân tử huỳnh quang, PCR, Rt-PCR, nuôi cấy tế bào
ngời ta đã phân lập và biết đợc quá trình phát triển của cơ thể ngời và động
vật bắt đầu từ tế bào gốc trùm (gangleader- stem cells) hay còn gọi là tế bào
gốc nguyên thuỷ (primitive stem cells) hay tế bào gốc toàn năng (Totipotent
stem cells).[11,21,72,80].
1.1. Tế bào gốc trùm( Totipotent stem cells)
1.1.1. Đặc điểm tế bào gốc trùm:
- Có khả năng tự tái sinh để duy trì nguồn gốc của chúng.
- Có số lợng rất ít nhng có khả năng sinh sản lớn.
- Cha có dấu ấn riêng biệt để có thể nhận biết.
- ở điều kiện bình thờng chúng ở trạng thái nghỉ ngơi, không quay vòng
(noncycling), nhng khi có kích thích từ môi trờng chúng sinh sản và biệt
hóa rất nhanh để tạo ra các tế bào kế cận, các tế bào kế cận này là tế bào gốc
của các cơ quan riêng biệt [21,80], lúc này chúng mới có các dấu ấn riêng có
thể nhận biết đựơc, ví dụ tế bào gốc cơ quan tạo máu có dấu ấn CD34 đây là
dấu ấn riêng đầu tiên của tế bào gốc tạo máu, kể từ khi tách khỏi tế bào gốc
nguyên thuỷ, đồng thời đó cũng là tế bào gốc nguyên thuỷ hay tế bào gốc
trùm (primitive hematopoietic stem cells) của cơ quan tạo máu.
- Cũng nh các tế bào khác, tế bào gốc trùm cũng có quá trình già tự
tiêu huỷ (Apotosis).
- Trong cơ thể ngời và động vật tế bào gốc trùm có mặt ở tất cả các vị

trí: tuỷ xơng, máu ngoại vi, máu cuống rốn, giác mạc, não cơ tim, xơng,

gan, da ở đây chúng vừa là tế bào dạng nghỉ ngơi, vừa là dạng tế bào
thờng trực để khi cần thiết có nhu cầu chúng sẽ biệt hoá thành các tế bào
gốc kế cận tạo ra các tế bào chức năng [72].
1.1.2. Xếp loại và danh pháp tế bào gốc trùm (H.1)
Có 2 phơng pháp[21]:
a) Theo khả năng sinh sản và biệt hoá
* TBG toàn năng: tế bào gốc trùm (gangleader- stem cells) hay còn gọi
là tế bào gốc nguyên thuỷ (primitive stem cells) hay tế bào gốc toàn năng
(Totipotent stem cells) điều hoà chung sự phát triển của cơ thể, tạo ra tế bào
gốc của tất cả các cơ quan trong cơ thể.
* TBG đa năng (pluripotent stem cells hay multipotent stem cells) là
TBG trùm của các dòng tế bào riêng biệt thuộc cùng 1 cơ quan, nh cơ quan
tạo máu, cơ tim, xơng, tuyến tuỵ.
* TBG đơn năng (Unipotent stem cells) hay còn gọi là TBG đầu dòng,
chỉ sinh ra 1 dòng tế bào nhất định (ví dụ dòng hồng cầu: CFU-E).
b) Theo hớng phát triển phôi
* TBG phôi: Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng tế bào gốc phôi,
tơng tự nhu tế bào gốc trùm đã mô tả ở trên, khi nuôi tổ chức bào thai
trong môi trờng có các chất kích thích tăng trởng nh IL-3, Transferrin,
Albumin, Retinoic acid, erythropoietin tế bào gốc phôi đã phát triển thành
các tế bào máu nh HC, bạch cầu , tiểu cầu [77,79]. Tơng tự nh vậy, các
nhà nghiên cứu đã thành công khi xây dựng mô hình biến tế bào phôi bất động
thành tế bào cơ tim có thể co bóp đợc (59).Tế bào gốc phôi cũng có thể biến
thành tế bào biểu mô sắc tố võng mạc, và nếu đợc nuôi cấy trong môi trờng
thích hợp chúng sẽ biệt hoá thành tế bào có khả năng cảm thụ ánh sáng [73].
* TBG thai: Gần đây Phan Toàn Thắng đã phân lập thành công và nuôi tế
bào gốc từ màng đáy dây rốn trẻ sơ sinh trong môi trờng thích hợp đã tạo ra
đợc tế bào tuyến tuỵ và tế bào thần kinh trởng thành [71].

* TBG trởng thành: Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, tế bào gốc
trởng thành không chỉ có khả năng taọ tế bào gốc cho chính vị trí chúng c
trú mà cho cả các nơi khác. Ví dụ tế bào gốc tách từ tuỷ x
ơng có thể biệt hoá
thành cơ tim, thành tế bào thần kinh[52].

1.2. Tế bào gốc tạo máu(memopoietic stem cells: HSC)
1.2.1. Đặc điểm tế bào gốc tạo máu
HSC là các tế bào đợc tách ra từ tế bào gốc trùm, chúng có đặc điểm sau:
- Có khả năng tự tái tạo (self renewal) để tự duy trì nòi giống của chúng
nhng chỉ có tế bào gốc toàn năng có dấu ấn CD34 mới có khả năng này.
- Chúng có dấu ấn đặc hiệu CD34 có thể nhận biết đợc.
- Có khả năng sinh sản và biệt hoá thành tất cả các tế bào máu trởng thành.
Tế bào gốc = TBG
(Stem cells)
Theo khả năng sinh sản
TBG "Trùm" (gang-leader SC)
(TBG toàn năng - Totipotent stem cells)
TBG đa năng
(Multipotent SC)
TBG sinh sản nhiều dòng TB
TBG đơn năng
(Unipotent SC = TBG đơn dòng)
TBG chỉ sinh 1 dòng TB
cho 1 cơ quan
Apoptosis
Theo quá trình phát triển
TBG phôi
TBG thai
TBG trởng thành
TBG "Trùm"
các cơ quan
TBG
thần
kinh
TBG

tạo
máu
TBG
tuỷ
TBG
xơng
TBG
cơ
tim
Mỗi cơ quan có TBG "Trùm" riêng, dới tế bào gốc
"Trùm" là các tế bào gốc kế cận: TBG đa năng, tế gào
gốc đơn dòng, tế bào chức năng.
H.1. Sơ đồ tóm tắt phân loại và tên gọi tế bào gốc

- Có khả năng phát triển và phục hồi tạo máu ở cơ thể khác đã chiếu xạ
liều chí tử.
- Tế bào HSC có số lợng rất thấp, trong tuỷ xơng chúng có khoảng
1/100 đến 1/10000 tế bào tuỷ ở trạng thái bình thờng.
- HSC là tế bào nghỉ ngơi không hoạt động, nhng ở bất kỳ thời điểm nào
có tác nhân kích thích nh nhiễm trùng, chảy máu cấp, hoá chất, chúng sẽ đáp
ứng, nhanh chóng phân chia biệt hoá.
- Với các tác nhân gây đột biến, HSC có thể trở thành tế bào ác tính
(leukemia ) chúng sinh sản rất nhanh, nhng không biệt hoá hoặc biệt hoá
không bình thờng (leukemia kinh hoặc rối loạn sinh tuỷ).
- Tế bào HSC có thể giảm sinh hoặc vô sinh gặp trong bệnh giảm sinh
hoặc suy tuỷ xơng.
- Cũng nh các tế bào khác, HSC có quá trình già tự tiêu huỷ
(Apotosis) [11,33].
1.2.2. Xếp loại và tên gọi tế bào gốc tạo máu (HSC) (H.2)
Trên cơ sở đặc điểm về khả năng phân chia (Proliferation) và biệt hoá

(differentiation) của HSC, có thể xếp HSC thành 3 nhóm nh sau:
- Tế bào gốc tạo máu toàn năng hay tế bào gốc trùm tạo máu
(Pluripotential HSC) thí dụ CFU S. Tế bào này có khả năng tạo ra tất các tế
bào gốc kế cận của tế bào máu trởng thành.
- Tế bào gốc đa năng (multipotent) thí dụ CFU- GEMM , CFU- L, tế bào
này có khả năng tạo ra nhiều (nhng không phải tất cả) tế bào gốc kế cận
thuộc 2 nhóm tuỷ và lymepho, còn gọi là tế bào gốc định hớng.
- Tế bào gốc đơn năng (unipotent) thí dụ: CFU E, CFU G, CFU M,
CFU T, tế bào này chỉ có khả năng tạo ra một dòng tế bào chuyên biệt (dòng
hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu ) nên còn gọi là tế bào gốc đầu dòng. (H.2). Tất
cả tế bào gốc tạo máu đều có thể nhận biết bằng dấu ấn (CD). Thí dụ, tế bào
gốc trùm tạo máu CFU-S có CD
34
+
; tế bào gốc đa năng (CFU- GEMM) có
CD
33
+
, CD
34
+ ,
tế bào gốc dòng lympho có CD
7
+
, CD
34
+
. Tế bào gốc đơn năng
(đầu dòng) dòng hồng cầu có CD
38

+
, CD
71
+
, dòng mẫu tiểu cầu có CD
16
+
,
CD
61
+
, dòng bạch cầu hạt có CD
33
+
, CD
13
+
, dòng mono CD
33
+
, CD
14
+
[58,79].

Hình 2: Sơ đồ tóm tắt quá trình sinh sản và biệt hoá của tế bào gốc

1.2.3. Các nguồn cung cấp tế bào gốc tạo máu
* Tuỷ xơng:
Nguồn tế bào gốc tạo máu sử dụng cho ghép đợc thu thập từ tuỷ xơng, từ
máu ngoại vi, máu cuống rốn và gan phôi (nguồn này hiện mới chỉ đợc ứng
dụng trong các thử nghiệm in vitro, cha đợc trong các nghiên cứu lâm sàng).
Nguồn cung cấp tế bào định hớng tạo máu đợc sử dụng cho ghép đầu
tiên là từ tuỷ xơng của ngời cho. Trong 20 năm qua nguồn cung cấp chính
tế bào gốc cho ghép là tuỷ xơng. Tế bào CD34 trong tuỷ xuơng chiếm
khoảng 1/100 đến 1/10000 tế bào có nhân trong tuỷ. Tuy nhiên một hạn chế
lớn của tế bào gốc tuỷ xơng là chọc hút tủy phải gây mê và bệnh nhân phải
nằm viện khoảng 1 tuần, ngoài ra nếu phải truyền máu thì có thể lây nhiễm
các bệnh qua đờng truyền máu (tự thân).
Hiện nay, nguồn tế bào gốc từ tuỷ xơng chủ yếu đợc sử dụng cho ghép
đồng loại, hoặc trong một số trờng trờng ghép tự thân nhng không thể huy
động đợc TBG ra máu. Không có nguy cơ lẫn tế bào ung th (tumor free
graft), đồng thời cung cấp khả năng miễn dịch chống ung th. Những bệnh lý
chính đợc chỉ định kiểu ghép này bao gồm bệnh lý có tổn thơng tủy xơng,
suy giảm miễn dịch, rối loạn chuyển hoá bẩm sinh hoặc bệnh lý huyết sắc tố.
Nguồn tế bào sử dụng ghép có thể thu thập từ tuỷ của ngời cho hoà hợp
toàn bộ hoặc một phần, có hoặc không có liên hệ huyết thống. Một số ngân
hàng dữ liệu về tuỷ xơng đã đợc thiết lập trên khắp thế giới, trong đó lớn
nhất là chơng trình ngời hiến tuỷ quốc gia Mỹ, hàng năm có trên 2000

trờng hợp đ
ợc tiến hành ghép (10).
CD
7
+

CD
10
+

CD
34
+


CD
34
+

CD
33
+

CD
38
+


CD
34

CD
3
+

CD
19
CD
16/56
+

CD
41
+
+ CD
16
+

CD
36
+
+ CD
71
+

CD
33
+
+ CD
38
+

CD
33
+
+ CD
38
+

CD
33

CD
13
+

CD
14
+



* Nguồn tế bào gốc huy động ra máu ngoại vi.
Đây là nguồn tế bào định hớng tạo máu từ tuỷ xơng, đợc huy động ra
máu ngoại vi bằng cách sử dụng những yếu tố kích thích tăng trởng, thờng
sử dụng G CSF (Filgrastime) có kèm theo hoặc không kèm theo hoá trị liệu.
Các tế bào gốc ra máu sẽ đợc thu thập bằng cách gạn bạch cầu. Thu hoạch tế
bào gốc ở máu ngoại vi không cần gây mê, ít thô bạo và trong chế phẩm để
ghép chứa ít tế bào ung th hơn so với thu tế bào gốc từ tuỷ xơng trong ghép
tự thân.
Hiện nay, đây là nguồn chủ yếu sử dụng cho ghép đồng loài khi có ngời

cho cùng huyết thống (related donor). Theo báo cáo của Trung tâm quốc tế về
đăng ký ghép tuỷ (International Bone Marrow Transplant Registry) trong
những năm 1998 đến 2000 có đến trên 90% các trờng hợp tự ghép ở ngời
trởng thành sử dụng tế bào gốc huy động ra máu ngoại vi, tỷ lệ sử dụng tế
bào gốc từ tuỷ chỉ chiếm khoảng 5%. Huy động tế bào gốc đợc tiến hành đối
với ngời tình nguyện bằng G CSF có thể thu số lợng tế bào CD34đủ lớn
cần thiết, đồng thời tránh đợc các biến chứng khi phải gây mê để thu hoạch
từ tuỷ xơng. Các nghiên cứu lâm sàng so sánh khi sử dụng tế bào gốc máu
ngoại vi với sử dụng tế bào gốc từ tuỷ cho thấy: kết quả mọc ghép sớm hơn,
khả năng hồi phục miễn dịch nhanh hơn, tỷ lệ tử vong liên quan đến biến
chứng ghép ở nhóm sử dụng tế bào gốc máu ngoại vi thấp hơn, nguy cơ xuất
hiện bệnh ghép chống chủ tơng đơng ở cả hai nhóm [69,80] nhng bệnh
ghép chống chủ mạn lại gặp nhiều hơn ở bệnh nhân nhận tế bào gốc máu
ngoại vi huy động[69].
* Nguồn tế bào gốc từ máu cuống rốn
Năm 1989, lần đầu tiên tiến hành ghép thành công tế bào gốc máu cuống
rốn cho bệnh nhi Fanconi, và đến nay hàng nghìn trờng hợp ghép đã đợc
tiến hành để điều trị bệnh máu ác tính và không ác tính[ 41].
Trong khoảng 15 năm trở lại đây máu cuống rốn đã và đang trở thành
nguồn quan trọng cung cấp TBG cho ghép đồng loài. Đây là một nguồn cung
cấp tế bào gốc rất lớn đáng lẽ bỏ đi, dễ thu hoạch. Trong máu cuống rốn rất

giàu tế bào định hớng tạo máu ở giai đoạn sớm và giai đoạn đa dòng (early
and committed progenitor cells ); số lợng tế bào CD34 từ 1/100 đến
1/10000 tế bào có nhân, có khả năng sinh sản gấp 2 lần tế bào gốc tuỷ và máu
ngoại vi ngời trởng thành [ 37,42] nhng có nhợc điểm là lợng thu đợc
nhỏ, liều tế bào gốc chỉ đủ ghép cho trẻ em< 10 tuổi. Tuy nhiên gần đây một
số tác giả đã dùng tế bào gốc pool của 2 mẫu máu cuống rốn có gen HLA
tơng đồng [49,81] do đó có thể dùng cho cả ngời trởng thành. Nhng
muốn làm đợc điều này cần có một lợng lớn máu cuống rốn để lựa chọn.

Đây là mục tiêu của việc xây dựng ngân hàng máu cuống rốn. Xu hớng hiện
tại của các nghiên cứu về tế bào gốc trong máu cuống rốn tập trung vào các
vấn đề:
1.Tính an toàn và hiệu quả của ghép tế bào từ máu cuống rốn,
2. Khả năng sử dụng cho ghép TBG ngời lớn,
3. Mở rộng phạm vi ghép không hoà hợp HLA nhng vẫn duy trì tính an
toàn và hiệu quả mọc ghép.
Các nghiên cứu lâm sàng ở những trẻ nhận tế bào gốc từ ngời cho
không có liên quan huyết thống cho thấy nguy cơ xuất hiện GVHD thấp hơn ở
nhóm nhận tế bào gốc từ máu cuống rốn so với ghép tế bào gốc từ tuỷ xơng.
Điều này phù hợp với số lợng thấp của T lympho trởng thành ở máu cuống
rốn. Thời gian phục hồi các dòng tế bào tạo máu cũng có khác nhau, đối với
ghép tế bào từ máu cuống rốn, dòng bạch cầu hạt hồi phục sau 26 đến 27
ngày, dòng tiểu cầu sau 60 ngày, trong khi đó, nếu ghép tế bào gốc từ tuỷ
xơng thì thời gian hồi phục bạch cầu hạt và tiểu cầu lần lợt là 18 đến 19
ngày và 29 ngày [32,69].
* Tế bào gốc từ gan bào thai ngời:
Gan bào thai ngời ở tuần thứ 10-22 là nguồn cung cấp tế bào gốc có giá
trị [12]. Tác giả đã chứng minh ở giai đoạn này gan của phôi chứa chủ yếu là
tế bào máu và tạo máu, ở thời kỳ này tế bào gan còn ít việc phân lập tế bào
gốc tạo máu thuận lợi. Tế bào gốc gan phôi có một số đặc điểm đáng chú ý:
chúng có khả năng sinh trởng rất nhanh, T lympho ít, hệ HLA phát triển cha

hoàn chỉnh [ 12,46]. Tuy nhiên tế bào gốc gan phôi bị hạn chế vì nó liên quan đến
vấn đề y đức, mặc dù ta chỉ thu thập các thai, phần bỏ đi của cuộc đẻ cha đủ
tháng. Uphoff (1958) , Scott (1961) là những ngời đầu tiên đã ghép tế bào gốc tạo
máu từ gan phôi cho bệnh nhân suy tuỷ xơng Fanconi [66,74]
Nh vậy, có 4 nguồn cung cấp tế bào nguồn: tuỷ xơng, máu huy động,
máu dây rốn, tế bào máu gan phôi. Trong đó máu cuống rốn và máu huy động
đợc nhiều tác giả quan tâm phát triển. Hai nguồn này dễ thu hoạch và đạt

hiệu quả cao, máu cuống rốn có thể tạo thành ngân hàng lớn. Có nh vậy mới
có thể chọn lọc đợc nguồn tế bào gốc pool tơng đồng về miễn dịch (HLA)
sử dụng cho ngời lớn [25,34,49]. Gần đây một số ít các tác giả chú ý nghiên
cứu tế bào máu gan phôi bởi vì ở đó có nhiều tế bào gốc trùm với khả năng
phân chia và biệt hóa lớn, có thể dùng nuôi cấy ex - vivo để tạo ra một lợng
lớn đủ dùng cho điều trị[12,46].
*. Ngoài ra còn một nguồn nữa ngày nay đang đợc nhiều nhà nghiên
cứu khai thác và có thể có triển vọng lớn, đó là tế bào gốc nuôi cấy, phơng
pháp này cũng có thể tạo một lợng lớn tế bào gốc, bao gồm 2 loại sau đây:
- Nuôi cấy khuếch đại ngoài cơ thể (ex Vivo expansion) tế bào gốc
máu cuống rốn[22,43,75].
- Nuôi cấy khuyếch đại ngoài cơ thể tế bào gốc máu ngoại vi [55] bằng
IL 3, G CSF GM CSF GF
- Nuôi cấy dài ngày tế bào biểu mô của màng ối [56], hoặc nuôi cấy tế
bào biểu mô và trung mô của dây rốn có thể tạo tế bào gốc đa dòng nh tế bào
gốc tạo máu, tế bào thần kinh, cơ tim [71,72,77], tế bào giác mạc [73] Các
loại tế bào gốc này có u điểm lớn là khả năng miễn dịch còn thấp nên nguy
cơ bệnh ghép chống chủ ít, khả năng đậu ghép nhiều hơn các nguồn khác
1.3. Các nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc
Từ các nghiên cứu cơ bản trên đây, nhiều nhà lâm sàng đã tiến vào trận
địa sôi bỏng này. Nhiều chính phủ đã đa vào chơng trình nghiên cứu quốc
gia nh Mỹ, Anh, Nhật Bản, Trung Quốc, Triều Tiên, Singapore, Thái lan ở
Trung Quốc từ 2001 đã thiết lập trung tâm điều trị bằng liệu pháp tế bào gốc,

đã thành công trong điều trị bệnh tim mạch. Năm 2003 ở Brazin, Mỹ đã ghép
tế bào gốc giác mạc cho bệnh nhân hỏng mắt. ở Bangkok đã có trung tâm điều
trị liệu pháp tế bào gốc trởng thành lấy từ chính cơ thể bệnh nhân. Nhận thấy
tâm quan trọng của tế bào gốc trong tơng lai, nhiều nớc đã có đầu t lớn
cho chơng trình này. ở Nhật, Chính phủ đã dành khoản kinh phí lớn xây
phòng thí nghiệm hiện đại nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc vào điều trị, ở

Singapore chính phủ đã đầu từ 600.000 USD xây phòng thí nghiệm hiện đại
nghiên cứu tế bào gốc, đầu t 22 triệu USD cho công ty ES CELLS đang sở
hữu 6 dòng tế bào gốc[10]. Triển vọng của các nghiên cứu cơ bản và nghiên
cứu ứng dụng về tế bào gốc là rất lớn, để đáp ứng nhu cầu này, vấn đề phân
lập tế bào gốc, nhận biết chúng cần có ngân hàng để bảo quản chúng. Các
nớc phát triển ở Châu Âu, Mỹ, úc, Trung Quốc đều đã có ngân hàng tế bào
gốc tạo máu lấy từ tuỷ xơng và gần đây lấy máu từ cuống rốn. Dòng tế bào
gốc phôi đầu tiên đợc tạo ra bởi Thomson (Mỹ) 1998, tới nay theo thông báo
đã có tới 200 dòng đợc phân lập từ một số nớc nh Mỹ, Trung Quốc, Pháp,
Nhật, Singapore, Hàn Quốc, Tiệp, Iran [10]. Đó là các ngân hàng tế bào gốc
trong tơng lai. Tuy nhiên, mong mỏi lớn nhất của các nhà khoa học về tế bào
gốc tới nay vẫn cha giải quyết đợc, đó là làm sao nuôi cấy nhân lên để sản
xuất đợc lợng lớn tế bào gốc đồng gen cho ngời bệnh để họ không phải
dùng thuốc ức chế miễn dịch kéo dài sau ghép nhằm chống phản ứng thải
ghép và ghép chống chủ (GVHD).
2. Thu hoạch tế bào gốc cho ghép tế bào gốc đồng loài
2.1. Tuyển chọn ngời cho
Công việc hàng đầu là làm tốt tuyển chọn ngời cho máu theo đúng tiêu
chuẩn, khoẻ mạnh, tình nguyện, chú ý loại ngời cho có tiền sử gia đình liên
quan đến bệnh di truyền, bệnh nhiễm trùng, [4,16,37]
2.2. Các phơng pháp thu gom tế bào gốc
2.2.1.Thu gom tế bào gốc từ tuỷ xơng
Quá trình thu gom tế bào gốc từ tuỷ xơng đối với trờng hợp tự ghép
hay ghép đồng loại tơng tự nh nhau và thực hiện trong phòng mổ vô khuẩn.

Chọc hút dịch tuỷ ở xơng chậu(gai chậu sau trên), chọc nhiều lần mỗi lần hút
3-5 ml với tỷ lệ 10-15ml /kg cân nặng ngòi cho. Trộn dung dịch chống đông
cho dịch tuỷ với mỗi lần hút và đợc lọc trớc khi bơm vào túi bảo quản, sau
đó chuyển vào túi vô khuẩn và tiến hành các xử lý và đánh giá: đánh giá chất
lợng, khả năng sử dụng, nhãn mác và bảo quản.

Liều thông thờng là 2.10
8
tế bào có nhân/kg cân nặng của ngời nhận.
Thể tích tuỷ tối đa có thể thu là 1500ml. Một số trung tâm ghép tiến hành đếm
tế bào có nhân trong quá trình thu thập để quyết định thể tích cần thu gom.
Việc truyền máu tự thân có kế hoạch cũng cần phải tiên lợng và tiến hành
trớc thời điểm thu gom từ 2 3 tuần, và chỉ truyền lại sau khi đã hút dịch
tuỷ, để tránh hiện tợng pha loãng.
2.2.2. Thu gom tế bào gốc từ máu ngoại vi sau huy động
Những tế bào có CD34 (+) thu thập từ máu ngoại vi sau kích thích có khả
năng phục hồi cả ba dòng tế bào máu. Bình thờng TBG chiếm tỷ lệ rất thấp,
sau khi huy động có thể đạt từ 1- 3%.
Tế bào gốc máu ngoại vi sử dụng cho phép đồng loài đợc huy động
bằng các yếu tố kích thích tăng trởng (growth factors) đơn độc hoặc kết hợp
với hoá trị liệu. Thờng sử dụng các yếu tố kích thích tạo cụm dòng bạch cầu
hạt (G CSF: Granulocyte Colony stimulating factor), GM CSF hoặc kết
hợp cả hai. Nếu chỉ sử dụng các yếu tố kích thích hoá trị liệu đơn độc có thể
làm tăng số tợng tế bào có CD34 ra máu lên 10 đến 30 lần. Kết hợp cả hai
phơng pháp có thể làm tăng số lợng CD34 lên 50 đến 200 lần [6,54]. Các
nghiên cứu ghép tự thân cho thấy thời gian mọc ghép khi sử dụng tế bào gốc
huy động từ máu ngoại vi ngắn hơn so với tế bào gốc thu gom từ tuỷ
xơng[55], đặc biệt là thời gian phục hồi số lợng tiểu cầu. Thời gian nằm
viện của ngời bệnh rút ngắn đợc khoảng 7 đến 10 ngày[40].
Số lợng bạch cầu, số lợng tế bào đơn nhân và số lợng tế bào có CD34
(+) đợc sử dụng để chọn thời điểm thu gom thích hợp nhất. Với những bệnh
nhân điều trị hoá chất lần đầu, có thể tiến hành thu hoạch tế bào gốc khi số
lợng bạch cầu bắt đầu tăng lên hơn 5 G/l, nhng cần nói rõ rằng không có

mối liên quan chặt chẽ giữa số lợng bạch cầu và tỷ lệ tế bào CD34 ở máu
ngoại vi. Và dựa vào số lợng tế bào CD34 trớc khi thu gom để dự toán số

lợng tế bào CD34 có thể thu đợc. Khi số lợng CD34 lớn hơn hoặc bằng 10
tế bào/microlit máu thì có thể thu đợc không ít hơn. 1ì10
6
CD34/kg cân nặng
của ngời cho. Một số nghiên cứu cho thấy có sự liên quan giữa số lợng tế
bào gốc thu đợc với thể tích máu xử dụng. Khi thu gom bằng tách với thể
tích máu lớn có thể thu gom đợc tỷ lệ tế bào CD34 có thể cao hơn từ 2,5 đến
3 lần so với tỷ lệ này trong máu tại thời điểm bắt đầu xử lý [5,18]
Thời gian mọc ghép có liên quan chặt chẽ với số lợng tế bào CD34 thu
hoạch đợc. Mục đích thu gom đủ số lợng tế bào CD34 trong sản phẩm,
thờng là từ 1.10
6
đến hơn 5ì10
6
/kg trọng lợng ngời nhận là đợc:
Khi sử dụng tế bào gốc từ máu ngoại vi để ghép đồng loại, liều G CSF
thờng dùng từ khoảng 10 đến 16 mcg/kg thể trọng ngời cho/ ngày, tiêm
dới da từ 1 đến 2 lần/ ngày. Số lợng tế bào CD34 tăng lên từ ngày thứ ba và
đạt cao nhất vào ngày thứ năm và thứ sáu[19,20].
Một số biến chứng có thể gặp trong quá trình huy động và gạn tách tế
bào gốc: nguy cơ chảy máu và nhiễm trùng tại chỗ đặt cathether. Hiện tợng
giảm tiểu cầu do G CSF và do quá trình gạn tế bào cũng là một trong những
biến chứng thờng gặp. Khoảng 90% các trờng hợp có biểu hiện đau xơng,
đau đầu, đau ngời, cảm giác mệt, buồn và nôn (9). Các biến chứng nặng có
thể gặp nh lách to ra, thâm nhiễm bạch cầu hạt dới da (hội chứng Sweet),
huyết khối động mạch, phản vệ [40,54]. Tuy nhiên cha có trờng hợp nào mô
tả tử vong do huy động tế bào gốc máu ngoại vi [18].
2.2.3.Thu gom tế bào gốc từ máu cuống rốn
Tế bào gốc từ máu rốn thu thập từ bánh rau trớc hoặc sau khi sổ rau hoặc kết
hợp cả 2 phơng pháp. Qúa trình thu gom không đợc gây cản trở việc chăm sóc

ngời mẹ cũng nh em bé và nên có kế hoạch thu gom từ trớc khi sinh.
Để giảm khả năng nhiễm khuẩn, dây rốn cần đợc sát khuẩn bằng cồn và
các dung dịch sát khuẩn khác. Sử dụng kim có kích thớc lớn, dẫn máu rốn
chảy theo trọng lực. Dung dịch chống đông nên sử dụng là CPD và CPDA vì
đẳng trơng và có pH trung tính.

Tiền sử cá nhân và gia đình của ngời mẹ (và nếu có thể của cả đứa trẻ
và bố đứa trẻ) cần đợc ghi rõ ràng trớc khi thu gom hoặc trong vòng 48giờ
kể từ khi thu gom. Đơn vị máu rốn sẽ không đợc sử dụng cho ghép đồng loại
nếu tiền sử gia đình (ngời mẹ, ngời bố hoặc anh chị em) có bệnh di truyền
và các bệnh lây truyền qua đờng truyền máu.
Bắt buộc tiến hành định nhóm ABO/Rh của đơn vị máu cuống rốn sau
khi thu thập, sàng lọc kháng thể bất thờng. Tiến hành định nhóm HLA, sau
đó tiến hành bảo quản. Nêu lu trữ đồng thời mẫu huyết thanh của ngời mẹ
để kiểm tra các bệnh lý truyền nhiễm mới sau này, tại thời điểm sử dụng đơn
vị máu cuống rốn. Nên tiến hành đếm số lợng CD34 và tỷ lệ tế bào sống tại
thời điểm giải đông đơn vị máu rốn trớc khi sử dụng.
2.2.4. Thu gom tế bào gốc từ nguồn nuôi cấy exvivo (Exvivo expansion)
Nuôi cấy khuyếch đại (expansion) exvivo tế bào gốc có số lợng ít, nh
tế bào gốc máu cuống rốn, số lợng tế bào gốc máu cuống rốn có khoảng
0.04-0.05% nhng nếu nuôi trong môi trờng có đủ chất dinh dỡng và phát
triển thì có thể tạo ra 1 lợng lớn đủ đáp ứng cho nhu cầu điều trị. Ví dụ nuôi
cấy khuyếch đại tế bào gốc máu cuống rốn sử dụng cho ghép tế bào gốc ở
ngời lớn. Kết quả nghiên cứu của Astori cho thấy với môi trờng nuôi cấy
đặc biệt, tế bào gốc máu cuống rốn khuyếch đại rất nhanh: tế bào có nhân
tăng gấp 180 lần, tế bào tạo GM-CSF tăng gấp 20 lần[ 22].
2.2.5. Thu gom tế bào gốc từ nguồn nuôi cấy dài ngày tế bào góc trùm
Nuôi cấy tế bào gốc biểu mô, tế bào gốc trung mô của dây rốn, tế bào
gốc phôi có thể thu đợc tế bào gốc cho cơ tim, thần kinh[71], tế bào gốc tạo
máu[77].Hớng này rất có ý nghĩa cho phát triển ghép tế bào gốc trong tơng

lai.Nó còn có thể có giá trị làm giảm phản ứng miễn dịch đối với ghép tế bào
gốc đồng loài [72].
3. Kỹ thuật chọn lọc và làm sạch tế bào gốc
3.1. Chọn lọc tế bào CD34
Trong quá trình biệt hoá và trởng thành, số lợng phân tử CD34 giảm
dần bề mặt tế bào định hớng tạo máu. Dựa vào đặc điểm này, ngời ta sử

dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu với những nhóm quyết định kháng nguyên
của phân tử CD34, để xác định giai đoạn biệt hoá và tách tế bào.
Hiện tại có một số kỹ thuật đợc ứng dụng rộng rãi nh: Tách tế bào sử
dụng huỳnh quang (FACS: fluoresence activated cells sorting) và kỹ thuật sử
dụng hạt từ (immunomagneti beads). Qúa trình tách CD34 có thể đồng thời
tiến hành với loại bỏ tế bào lympho T và tế bào ung th: Tuy nhiên, cho đến
nay, hiệu quả lâm sàng của tách CD34 đồng thời với làm sạch tế bào u, tế bào
lympho T vẫn cha đợc xác định
a) Tách tế bào có sử dụng hạt từ miễn dịch: trực tiếp hoặc gián tiếp
+ Sử dụng hạt từ có gắn kháng thể CD34 đem ủ với hỗn hợp tế bào đơn
nhân, những tế bào có CD34 sẽ gắn với kháng thể đặc hiệu và tạo mạng ngng
kết. Sau đó sử dụng nam châm để tách các hạt ngng kết.
+ Một kỹ thuật mới để tách CD34 hiện đang đợc nghiên cứu thử nghiệm
in vitro tại Mỹ, sử dụng nguyên lý tách tế bào từ tính (MACS: magnetic cell
sorting). Nguyên lý là sử dụng các hạt nhỏ, gắn kháng thể với phân tử sắt và
phân tử sắt đợc gắn với phân tử đờng. Những tế bào gắn từ sẽ đợc tách qua
cột có độ chênh lệch từ tính cao và bộ vi sử lý sẽ tách đợc tế bào có CD34.
b) Tách tế bào bằng ly tâm phân lớp
+ Nguyên lý tách dựa vào kích thớc và tỷ trọng tế bào sử dụng dòng ly
tâm liên tục để tạo ra cặp đối lực (lực ly tâm và lực dòng chảy) tác dụng lên tế
bào Những tế bào có tỷ trọng thấp sẽ đợc phân lập trớc.
+ Hiện nay, kỹ thuật này chủ yếu đợc sử dụng để tách lympho T, nhng
cũng sử dụng để tách tế bào có CD34. Những tế bào có CD34 là một quần thể

tế bào đồng nhất, đợc phân tách và sử dụng để thực nghiệm tái tạo quần thể
tế bào, hoặc thử nghiệm mở rộng ex vivo.
3.2. Xử lý loại bỏ tế bào ung th sử dụng cho ghép tự thân
Là quá trình làm sạch hay loại bỏ, loại trừ những tế bào ung th bị lẫn
khi tiến hành ghép tự thân. Với những bệnh nhân bệnh máu hoặc bệnh ác tính
thờng có xâm lấn tuỷ xơng (nh u lympho ), tồn l
u bệnh tối thiểu (MRD:
minimal residual disease) là nguyên nhân gây tái phát. Mặc dù tỷ lệ nhiễm tế

bào ung th trong chế phẩm tế bào gốc tách từ máu ngoại vi là rất thấp, thấp
hơn nhiều so với tế bào gốc thu gom từ tuỷ xơng, tuy vậy vẫn có thể lẫn
nhiều tế bào ung th. Một số nghiên cứu cho thấy có thể tế bào ung th cũng
đợc huy động từ tuỷ ra máu trong quá trình huy động tế bào gốc (45).
Tuy vậy, biện pháp này cũng vẫn còn đang đợc bàn luận, vì có thể
những phơng pháp loại trừ sẽ gây tổn thơng tế bào gốc. Khi tiến hành loại tế
bào u, khả năng giảm mức độ tồn lu hoặc tái phát bệnh cũng kèm theo việc
gia tăng nguy cơ không mọc ghép, tăng tỷ lệ chết do suy tuỷ kéo dài (45).
Có nhiều kỹ thuật hiện nay đợc áp dụng để loại bỏ, phá huỷ dòng tế bào
ung th, đồng thời bảo tồn tế bào định hớng tạo máu sử dụng cho phép.
* Kỹ thuật dợc lý học (Pharmacologic technique): Trong cơ thể, tác
dụng của hoá trị liệu chủ yếu tác động trên tế bào ung th, vì những tế bào này
nhạy cảm với hoá chất hơn tế bào bình thờng. In vitro, kỹ thuật này cũng sử
dụng nguyên lý đó, với liều hoá chất cao hơn mà không lo ngại sẽ ảnh hởng
đến các tế bào bình thờng, đồng thời liều hóa chất sử dụng cũng không đợc
gây độc khi truyền lại chế phẩm sau khi xử lý vào cơ thể ngời bệnh.
Mafosfamid (oxazaphosphorine hoạt hoá) và một số thuốc khác hiện đang
đợc thử nghiệm theo hớng này. Hiệu quả của việc ứng dụng những thuốc
này nhằm làm sạch tế bào ung th đối với những bệnh nhân ghép tuỷ tự thân
làm kéo thời gian suy tuỷ và tỷ lệ tế bào định hớng GM CSF chỉ còn lại
dới 1%.

* Kỹ thuật vật lý (Physical techniques): Là kỹ thuật tách dựa vào kích
thớc và tỷ trọng của tế bào. Kỹ thuật này cũng không đủ hiệu quả để tách tế
bào ung th, tuy nhiên sử dụng kết hợp cùng với kỹ thuật miễn dịch học sẽ
đem lại hiệu quả cao hơn.
* Kỹ thuật miễn dịch học (Immunologic techniques): kỹ thuật này sử
dụng để tách các tế bào ung th bằng phức hợp kháng thể đơn dòng đặc hiệu
kháng nguyên khối u kết hợp bổ thể có gắn tác nhân gây độc hoặc gắn hạt từ.
Việc lựa chọn kháng thế và tính bộc lộ kháng nguyên đồng nhất trên màng tế
bào sẽ quyết định hiệu quả quá trình loại bỏ tế bào ung th. Nhiều tác giả sử

dụng hỗn hợp kháng thể để nâng cao hiệu quả tách, và sử dụng kháng thể có
gắn bổ thể trong trờng hợp kháng thể đợc sử dụng là IgM hoặc mật độ
kháng nguyên dày đặc trên bề mặt tế bào. Kỹ thuật tách miễn dịch gắn từ tính
để tách tế bào, trực tiếp hoặc gián tiếp, sử dụng kháng thể gắn hạt từ. Một
nghiên cứu đã công bố kết quả loại bỏ đợc 5 log tế bào ung th sau hai chu
kỳ tách gián tiếp ở bệnh nhân u lympho không Hodgkin tế bào B, nhng lại
làm giảm 20% các tế bào cụm GM CFU - GEMM CFU.( ).
3.3. Vấn đề loại tế bào T lympho trong dịch tế bào gốc
Nhằm loại hoặc làm giảm biến chứng GVHD. Đây là biến chứng chủ yếu
khi tiến hành ghép đồng loại do các T lympho từ ngời cho phản ứng chống
lại cơ thể ngời bệnh[13]. Khi tiến hành loại bỏ T lympho trong quá trình
ghép sẽ có hai khả năng xảy ra liên quan đến hiện tợng mọc ghép hay tái
phát bệnh. Hầu hết các tình trạng thải ghép xảy ra trừ miễn dịch. Còn ở những
bệnh nhân có hiện tợng ghép chống vật chủ thì tỷ lệ tái phát thấp hơn. Qua
hiện tợng đó, các tác giả đã nghiên cứu chứng minh tác dụng ghép chống
leukemia (GVL). Với mục đích hạn chế bệnh ghép chống chủ, đồng thời phát
huy tác dụng của ghép chống leukemia, các nghiên cứu đã tập trung vào việc
xác định mức tế bào T lympho phù hợp. Tuy nhiên đây vẫn là vấn đề đang
đợc tiếp tục nghiên cứu. Đồng thời một số nghiên cứu khác đã đi sâu vào
từng quần thể tế bào lympho, vai trò của các cytoknines trong GVL. Gần đây

nhiều tài liệu đã công bố, loại T lympho sẽ gây suy giảm miễn dịch, tăng khẳ
năng thải ghép, giảm khả năng ghép chống Leukemia[]. Vì vậy vấn đề loại T
lympho của dịch tế bào gốc hiện nay không đợc quan tâm nhiều nh vấn đề
chọn lựa HLA trong ghép. Ngoài ra số lợng T lympho ở máu cuống rốn rất
thấp, chức năng cha hoàn thiện[1,17].
3.4.Vấn đề loại hồng cầu trong dịch tế bào gốc:
Đây cũng là một vấn đề đợc nhiều nhà nghiên cứu đề cập. Loại hồng cầu
giúp giảm thể tích túi tế bào gốc do đó rút ngắn thời gian đông lạnh cũng nh tan
đông, giảm sử dụng các hoá chất bảo quản, giảm thiểu các yếu tố bất lợi cho
ngời nhận ghép cũng nh giảm tỷ lệ tế bào gốc bị chết do bảo quản [64,82].

4. Bảo quản lâu dài tế bào gốc tạo máu
4.1. Giảm thể tích bảo quản tế bào gốc
Đây là khâu quan trọng của xây dựng ngân hàng tế bào gốc. Và mặc dù
đợc tiến hành dễ dàng ở nhiều trung tâm ghép, nhng quá trình làm lạnh và
bảo quản tế bào gốc cũng có những nguy cơ mất tế bào gốc. Việc truyền tế
bào bảo quản lạnh cũng gây một số nguy cơ cho ngời nhận, một số trong các
nguy cơ đó có thể đe doạ tính mạng họ, và một số khác cha đợc hiểu cặn
kẽ. Hiện tợng mất tế bào gốc trong quá trình bảo quản lạnh và ảnh hởng của
hiện tợng này đến tốc độ mọc ghép vẫn cha đợc lợng giá chính xác. Có
nhiều yếu tố ảnh hởng đến kết quả của quá trình bảo quản lạnh, mỗi yếu tố
có ảnh hởng riêng đối với quá trình hồi phục của tế bào gốc qua từng bớc
của quá trình bảo quản và vì vậy, quá trình này cần đợc kiểm soát một cách
chặt chẽ. Hớng nghiên cứu hiện nay tìm ra những dung dịch, những quy trình
kỹ thuật đơn giản hơn mà lại đạt kết quả bảo quản tốt hơn, rẻ hơn, dễ thực
hiện hơn, ít độc hơn cho ngời nhận và cho tế bào bảo quản. Xuất phát từ mục
tiêu này gần đây nhiều nhà nghiên cứu bảo quản TBG nêu ra 1 số chú ý sau:
- Thể tích bảo quản mỗi túi đông lạnh (túi đặt trong cassette), dịch tế bào
dàn đều, đảm bảo độ mỏng, khi đông lạnh sẽ lạnh nhanh và đều, khi tan đông
cũng nhanh và đều. Trớc đây bảo quản trong lọ 3ml nên khi gây đông ngoài

vỏ đông trớc, còn khi tan đông ngoài vỏ tan truớc nên tỷ lệ tế bào chết cao
(>10%). Thể tích này còn thuận lợi cho truyền cho bệnh nhân.
- Loại bớt hồng cầu, tiểu cầu tạo điều kiện thuận lợi cho phát triển tế bào
gốc. Vì khi tan đông hồng cầu vỡ giải phóng HST tự do khá cao bất lợi cho
phát triển ghép và bệnh nhân.
- Dung dịch bảo quản DMSO 10%và HES 6% là thích hợp và không độc
cho cơ thể và không cần loại DMSO trớc khi truyền cho bệnh nhân (68),
huyết tơng tự thân, albumin- làm tăng độ nhớt của dịch bảo quản giúp màng
tế bào không bị tổn thơng ở nhiệt độ lạnh sâu hoặc khi tan đông.
- Nồng độ tế bào có nhân từ 1-2.5 10
8
/ml dịch bảo quản thuận lợi cho bảo
quản và truyền cho bệnh nhân.

- Tốc độ làm lạnh: để đạt đợc -196
0
C cần tiến hành qua nhiều bớc,
nhanh quá hoặc chậm quá đều ảnh hởng đến chất lợng của bảo quản.
- Tan đông: lấy ra nhanh, bỏ cassette, ngâm túi đựng tế bào gốc trong
nớc ấm 37
0
C, khi tan gần hoàn toàn có thể truyền ngay cho bệnh nhân, hay
lấy tế bào từ túi sử dụng cho nghiên cứu đánh giá kết quả bảo quản.
Tế bào gốc đợc bảo quản diễn ra trong 3 giai đoạn:
- Giai đoạn đầu bảo quản ở 4
0
C có thể giữ ở 24-72h sau đó truyền cho bệnh
nhân. Phơng pháp này thờng áp dụng cho ghép tế bào gốc tự thân, kết quả rất
khả quan [19]. Tuy nhiên 1 số tác giả nghiên cứu nuôi cấy cụm tế bào cho thấy
nếu để ở 4

0
C hoặc 25
0
C quá 9h sau xử lý thì số lợng colony giảm tác giả cho
rằng thời gian thích hợp cho chuẩn bị trớc đông lạnh là 9-24 h[57].
- Giai đoạn đông lạnh: từ 4
0
C xuống - 45
0
C với tốc độ -1
0
C/ phút. Từ -
45
0
C đến 135
0
C với tốc độ - 5

C
0
/ phút sau đó chuyển vào bình Nitơ lỏng -
196
0
C, duy trì dài ngày ở nhiệt độ này. Hàng tuần Nitơ lỏng đợc bổ sung để
cho túi tế bào gốc đợc ngập sâu trong Nitơ [64].
- Giai đoạn tan đông và sử dụng: nhiều tác giả thống nhất phải tiến hành
nhanh, túi tế bào gốc đợc ngâm trong chậu nớc ấm 37
0
C khi tan hết thì
truyền cho bệnh nhân. Túi tế bào gốc đợc bảo quản trong DMSO (10%) và

HES (6%) do đó không cần phải loại bỏ DMSO và HES trớc khi truyền [5].
4.3. Đánh giá và kiểm tra chất lợng chế phẩm tế bào gốc sau bảo quản
4.3.1. Đếm số lợng tế bào có nhân
Mọi chế phẩm tế bào gốc cần đợc phân tích và xác định tổng số tế bào,
số lợng tế bào đơn nhân để tính toán lợng tế bào đợc truyền /kg thể trọng
ngời nhận hoặc liều tế bào của từng chế phẩm. Số lợng này, kết hợp với
những xét nghiệm khác, xác định số lần thu hoạch cần thiết để có đủ lợng tế
bào đảm bảo mọc ghép. Ngoài ra, các thông số này cũng giúp tính toán tỷ lệ tế
bào còn lại và cung cấp các dữ kiện cho quá trình kiểm soát chất lợng của
các bớc xử lý và bảo quản chế phẩm.
Nói chung các máy đếm tế bào tự động có thể giúp đếm các tế bào nhanh
và chính xác. Tuy nhiên, các đám tiểu cầu/ tế bào ngng kết trong HPC A

hoặc các hạt mỡ trong HPC M có thể gây những sai số nhất định. Trong
những trờng hợp này, nên tiến hành đếm thủ công, và không bao giờ nên ớc
đoán số lợng tế bào, vì đây là thông số quan trọng đánh giá thời gian mọc
ghép hoặc ghép thất bại.
4.3.2. Đếm tỷ lệ tế bào sống/chết
Bằng phơng pháp nhuộm màu với dung dịch xanh trypan cho kết quả
tơng đối chính xác, nhanh, đáp ứng nhu cầu lâm sàng.
4.3.3. Nuôi cấy cụm
Cho biết khả năng hoạt đông của tế bào gốc sau xử lý và bảo quản cả về
chất lợng (khả năng sinh sản và biệt hoá) và số lợng. Tuy nhiên có một số
nhợc điểm là thời gian nuôi cấy dài ngày (10-14 ngày), không đáp ứng kịp
thời cho lâm sàng, xác định số lợng cụm khó chính xác, dung dịch nuôi
cấy đắt tiền.
4.3.4. Xác định tế bào u
Kỹ thuật sử dụng chủ yếu hiện tại là các kháng thể đơn dòng gắn đặc
hiệu các kháng nguyên ung th. Có thể đếm bằng kỹ thuật đếm tế bào theo
dòng chảy, miễn dịch huỳnh quang, hoặc nhuộm hoá mô miễn dịch. Độ nhạy

từ 0,1% đến 0.0004% tuỳ theo kỹ thuật. Kết quả các nghiên cứu đã công bố
đều cho thấy rằng tồn lu các tế bào u trong chế phẩm ghép có ảnh hởng đến
thời gian sống thêm của bệnh nhân ( ).
4.3.5. Sự phục hồi và hoạt động của tế bào gốc sau ghép:
Dựa vào diễn biến của bệnh nhân trên lâm sàng và diễn biến xét nghiệm.
5. Vấn đề ngân hàng tế bào gốc và sử dụng:
Đây là vấn đề có tính toàn cầu, nếu có nhiều ngân hàng với nguồn cung
cấp tế bào gốc máu cuống rốn dồi dào, các mẫu phẩm đạt tiêu chuẩn thống
nhất quốc tế lại có thể trao đổi giữa các ngân hàng thì tơng lai của ghép tế
bào gốc rất lớn, đặc biệt các sản phẩm xung quanh máu cuống rốn nh cuống
rốn, màng rau. Tất cả các sản phẩm này đều là sản phẩm bỏ đi, nay thu lại và
sử dụng thì thật là hữu ích. Giá trị khoa học của các sản phẩm này rất lớn.
Nhiều tác giả đã chứng minh rằng, chất lợng của tế bào có nhân và tế bào

gốc CD 34 gấp 10 lần tế bào gốc tuỷ và > 10 lần máu ngoại vi với các đặc
điểm sau (31,32,42,47):
- Khả năng tạo Colony rất lớn, khả năng sinh sản và biệt hoá rất lớn, khả
năng tự tái sinh lớn hơn tế bào gốc tuỷ và máu ngoại vi. 100ml máu rốn có giá
trị tơng đơng 1000ml dịch hút tuỷ xơng (32, 47).
- Khả năng đậu ghép đồng loài của tế bào gốc máu cuống rốn nhiều hơn
ghép tế bào gốc tuỷ và máu huy động
- Bệnh ghép chống chủ trong ghép tế bào gốc máu cuống rốn ít hơn và
mức độ cũng nhẹ hơn các tế bào gốc khác, ở giai đoạn II và IV (chỉ gặp 3% -
18%), giai đoạn III và IV ( 0 5% ). (Nếu có HLA tơng đồng 6/6 hoặc 5/6
thì kết quả rất mỹ mãn).
- Vấn đề liều tế bào gốc ghép cho ngời lớn đã đợc nghiên cứu và
đang mở ra triển vọng lớn, đó là:
+ Hỗn hợp (pool) nhiều đơn vị tế bào gốc máu cuống rốn có HLA tơng
đồng (Multiunit cord blood cells ), điều này có thể thực hiện đợc khi có hợp
quốc tế lớn (49, 53).

+ Nuôi cấy nhân lên ngoài có thể (Ex Vivo expansion) đạt đợc lợng tế
bào gốc đủ liều cho bệnh nhân ngời lớn từ 1 đơn vị máu cuống rốn tơng
đồng (33, 43).
+ Kết quả nghiên cứu so sánh số lợng tế bào CD
34
của 3 nguồn
(sourcers) khác nhau tác giả Takahashi (69) nhận thấy số lợng tế bào
CD
34
MCR cao hơn ở tuỷ và máu, khả năng sinh sản cao hơn. Đây là một u
thế của máu cuống rốn, lợi thế này có thể giúp cho phát triển ghép tế bào gốc
MCR cho ngời lớn.
Với các hiểu biết và tiến bộ mới hiện nay, cho thấy việc xây dựng Ngân
hàng máu cuống rốn, lu trữ đợc nhiều mẫu phẩm để lựa chọn là điều kiện
tiên quyết cho phát triển ghép tế bào gốc trong tơng lai.
ở Việt Nam đã có ngân hàng máu cuống rốn ở thành phố Hồ Chí Minh,
hiện nay ở Hà Nội cần xây dựng Ngân hàng máu cuống rốn đạt tiêu chuẩn
quốc tế để hoà chung vào mạng lới tế bào gốc khu vực và thế giới.

Chơng 2
Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu

2.1. Đối tợng nghiên cứu
2.1.1. Các mẫu tế bào gốc thu gom từ máu ngoại vi huy động và không
huy động
- 9 đơn vị tế bào thu gom từ máu ngoại vi không huy động của 3 ngời
cho khoẻ mạnh, nam giới, từ 24 đến 27 tuổi, tình nguyện tham gia nghiên cứu.
- 10 đơn vị tế bào gốc thu gom từ máu ngoại vi có huy động bằng
Filgrastime của 5 ngời cho khoẻ mạnh, nam giới, từ 24 đến 32 tuổi, tình
nguyện tham gia nghiên cứu.

- Tất cả những ngời cho tình nguyện đợc t vấn, khám tuyển và xét
nghiệm sàng lọc trớc khi tham gia nghiên cứu theo tiêu chuẩn ngời cho máu
theo quy định của Pháp lệnh an toàn truyền máu 1992
2.1.2. Các mẫu tế bào gốc thu gom từ tuỷ xơng
- 15 mẫu dịch hút tế bào tuỷ xơng đợc tiến hành thu gom từ 15 ngời
cho tình nguyện, khoẻ mạnh, tuổi từ 22 đến 41.
- Tất cả những ngời cho tình nguyện đợc t vấn, khám tuyển và xét
nghiệm sàng lọc trớc khi tham gia cho tuỷ theo quy định của Pháp lệnh an
toàn truyền máu 1992.
2.1.3. Các mẫu tế bào gốc thu gom từ máu cuống rốn
- 112 mẫu máu cuống rốn của các sản phụ đẻ thờng tại bệnh viện Phụ
sản Hà Nội, sử dụng cho nghiên cứu xây dựng quy trình thu gom máu cuống
rốn đạt hiệu quả cao
- 34 mẫu máu cuống rốn có thể tích 90ml, sử dụng cho nghiên cứu xây
dựng quy trình loại hồng cầu bằng phơng pháp ly tâm.
- 20 mẫu máu cuống rốn có thể tích 90 ml, dùng cho nghiên cứu các
chỉ số tế bào huyết học, tế bào miễn dịch, tế bào gốc CD
34
trớc và sau khi
loại xử lý.