Xác định sự sai khác di truyền của các giống gà nội

ViÖn Ch¨n nu«i














B¸o c¸o tæng kÕt ®Ò tµi:

X¸c ®Þnh sù sai kh¸c di truyÒn
cña c¸c gièng gµ néi


Cn®t: Lª ThÞ Thuý

8004

Hµ néi – 2010

1

MỤC LỤC
MỤC LỤC 1

PHẦN I. ĐẶT VẤN ĐỀ 2

PHẦN II. TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 4

A. SƠ LƯỢC VỀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI GÀ VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM
CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU 4
B. ĐẠI CƯƠNG VỀ PHÂN LOẠI HỌC PHÂN TỬ 6
PHẦN III. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

A. CÁC CHỈ TIÊU THEO DÕI: 17
B. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ADN TRONG HỆ GEN 21
C. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ADN TRONG TY THỂ 26
PHẦN IV. NỘ
I DUNG KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 30

PHẦN A . KHẢO SÁT TẠI THỰC ĐỊA, CẬP NHẬT VÀ XÂY DỰNG DỮ
LIỆU VỀ SỰ PHÂN BỐ, ĐẶC ĐIỂM NGOẠI HÌNH, SINH TRƯỞNG PHÁT
DỤC, KHẢ NĂNG SẢN XUẤT

CỦA 9 GIỐNG GÀ NỘI 31
1. Đặc điểm ngoại hình và các chiều đo cơ thể của các giống 32
2. Khối lượng 09 giống gà qua các tuần tuổi 39
3. Tiêu tốn thức ăn 43
4. Tỷ lệ nuôi sống 44
5. Khả năng sinh sản của các giống gà 46
6. Kết quả phân tích chất lượng thịt gà 49
PHẦN B. PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TONG HỆ GEN VÀ
XÂY D
ỰNG CÂY KHOẢNG CÁCH DI TRUYỀN GIỮA CÁC GIỐNG GÀ
NỘI. 52
1. Mục tiêu: 52
2. Nội dung công việc: 52
3. Kết quả và thảo luận 52
PHẦN C – PHÂN TÍCH ADN TRÊN TY THỂ GÀ 62
1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà 62
2. Xác định trình tự gen mã hoá cytocchrome B ở các mẫu gà 63
PHẦN D. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TRÌNH TỪ GEN LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT
LƯỢNG THỊT CỦA MỘT SỐ GIỐNG GÀ NỘI VÀ ĐĂNG KÝ TRÊN NGÂN
HÀNG GEN QUỐC TẾ
86
1. Cơ sở xác định gen mã hóa IGF liên quan đến chất lượng thịt 86
2. Nhân, xác định trình tự đoạn gen mã hóa IGF1 liên quan đến chất lượng
thịt gà 87
3. Xác định và phân tích trình tự gen mã hóa IGF-1 87
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 92

I. KẾT LUẬN 92
II. ĐỀ XUẤT 94
2

TÀI LIỆU THAM KHẢO 95


PHẦN I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo báo cáo của FAO [56], khoảng 37 % tất cả các giống gia cầm của Asian
(chiếm số lượng 18% toàn cầu) đang ở tình trạng nguy hiểm. FAO cũng lưu ý, con số
trên là tiếng chuông cảnh báo về sự mất mát đa dạng di truyền các giống gia cầm và cần
phải có những cố gắng nỗ lực kịp thời để ngăn chặn tình trạng đó. Một trong những
nguyên nhân bị mất nguồn gen bản địa quý giá là do thiếu các thông tin về đặc điểm và
các tính năng sản xuất, thiếu chương trình cải tạo giống hợp lý.
Do nhận thấy vai trò của gia cầm bản địa hết sức quan trọng với dân sinh, Viện
chăn nuôi Quốc tế -ILRI phối hợp với hệ thống nghiên cứu nông nghiệp Quốc gia-NARS
đã triển khai chương trình nghiên cứu và phát triển gọi là HOPE-A và APHCA's thông qua
việc bảo tồn và sử dụng b
ền vững các giống gia cầm cần ưu tiên ở 12 nước Asian.
Trong thập niên vừa qua, nghiên cứu gen động vật nói chung và gen gà nói riêng
phát triển rất nhanh nhờ những thành tựu di truyền phân tử và chương trình giải mã gen
người. Thập kỷ 90 bắt đầu bằng chương trình gen gà của EU, sau đó là các chương
trình nghiên cứu gen gà của Nhật bản, Mỹ, Úc, Trung Quốc ra đời. Mục đích của
chương trình nghiên cứu gen gà là để tìm ra chỉ thị di truyề
n phân tử giúp chương
trình khai thác và bảo tồn nguồn gen hiệu quả hơn, chính xác hơn. Theo David WB và
đồng tác giả (2004) )[50] có khoảng từ 20.000-30.000 gen trên bộ nhiễm sắc thể của
gà. Cho đến năm 2005 toàn bộ hệ gen của gà đã được giải trình tự, trong đó có 28/38
cặp nhiễm sắc thể thường (từ nhiễm sắc thế số 1 đến nhiếm sắc thể số 24, 26, 27, 28 ,
32) và 2 nhiễm sắc thể giới tính W và Z đã được lập bản đồ gen và công bố trên ngân
hàng gen Quốc tế NCBI ( Tổng số 12355 gen trong hệ gen gà
kể cả gen trên nhiễm sắc thể giới tính cũng đã được phân tích. Bên cạnh đó 13 gen trên
ty thể gồm: ND1, ND2, COX1, COX2, ATP8, ATP6, COX3, ND3, ND4L, ND4, ND 5

CYTB và ND6 cũng đã được xác định.
Tuy diện tích lãnh thổ không lớn, nhưng Việt Nam là một trong số 15 quốc gia có đa
dạng sinh học động vật cao vào bậc nhất trên thế giới. Mật độ gi
ống vật nuôi địa phương
của Việt Nam là 1,520 giống/km2, so với thế giới là 0,098 giống/km2. Đây là tiềm năng
quan trọng trong việc giải quyết thực phẩm cho nhu cầu trong nước trước mắt cũng như
trong tương lai.
Tính đa dạng đặc biệt này đang phải đối mặt với nhiều đe doạ từ nền kinh tế thị
trường và từ phía con người. Ngoài việc phá huỷ môi trường sinh sống, các hệ thống
chăn nuôi thâm canh, nhập giống gà ngoại có năng suất cao, đầu tư lớn đã dẫn đến sự
cạnh tranh khốc liệt với các giống gà bản địa địa tuy năng suất thấp nhưng thích nghi với
điều kiện sinh thái khắc nghiệt, sức chống chịu bệnh tật và chất lượng thịt ngon, hợp
khẩu vị của người Việt nam. Hi
ện tại các giống gà bản địa địa mang các gen quý, đặc thù
đang bị xói mòn và mất dần.
3

Việt Nam có nguồn gen gà bản địa rất phong phú với nhiều tên gọi theo đặc điểm
ngoại hình, theo sự phân bố địa lý khác nhau: Gà Ri phân bố hầu hết trên cả nước, tập
trung nhiều ở khu vực miền Bắc, gà Hồ tại vùng Bắc Ninh, gà Đông Tảo vùng Hưng
Yên, gà Mía - Hà Tây, gà Ác ở Long An, gà H'mông ở vùng Hà Giang, Sơn La, gà Tre-
Vùng ở miền Đông Nam bộ, gà Chọi phân bố trong cả nước, gà Tàu vàng chủ yếu khu
vực phía Nam-Lê Viết Ly và cộng sự [16]. Trong quá trình chọn lọc tự nhiên và nhân
tạo, thực chất các giống đã bị lai tạp, thoái hoá nhiều và được vận chuyển đi khắp các địa
phương trong cả nước.
Từ năm 1990 đã có nhiều công trình nghiên cứu về bảo tồn gen các giống gà bản địa
thông qua phương pháp in-situ, nuôi giữ trong nông hộ với quần thể nhỏ, theo dõi các đặc
điểm ngoại hình, tính năng sản xuất của một số giống gà bản địa. Đến năm 1997 đã có
một số nghiên cứu của GS. Đặng Vũ Bình, Đại học NN I và GS.Amano, Đại học Nông
nghiệp Tokyo về đa hình nhóm máu của một số giống gà bản địa Việt Nam: gà Ri, gà

Hồ, gà Chọi. Tiếp theo sau là nghiên cứu của Lê Thị Thúy và cộng sự 1994 [30], Bùi
Đức Lũng và cộng sự 2004 [15], Trần Thị Mai Phương, và đồng tác giả 2004 [23] về
nuôi dưỡng, bảo tồn và phát triển giống gà Hmông, gà Hồ, nghiên cứu khả năng sinh
sản, sinh trưởng và chất lượng thịt của giống gà Ác Việt Nam.
Tuy nhiên, cho đến nay chưa có công trình nào nghiên cứu một cách hệ thống để
đánh giá chính xác sự sai khác, quan hệ di truyền giữa các giống, nguồn gốc các giống
bằng công nghệ gen tại Việt Nam… Việc này sẽ làm giảm hiệu quả cho việc đầu tư vào
công tác bảo tồn và sử dụng hợp lý nguồn gen gà bản địa.
Từ năm 1999, Viện Chăn nuôi đã tiến hành nghiên cứu xác định đa hình ADN của
một số động vật chăn nuôi thông qua đề tài cấp Bộ Nông nghiệp (1999-2000), đề tài cấp
Nhà nước KC 04-03 (2001-2004). Đó là các công trình nghiên cứu về gen Halothan,
nghiên cứu xác định giới tính, nghiên cứu các vùng gen điều khiển sự biểu hiện gen
protein sữa bò, tỷ lệ nạc và số con sinh ra trên/lứa đẻ. Bước đầu đã xác định được các
biến thể ADN liên quan khả năng tiết sữa cao, các gen liên quan đến tốc độ sinh trưởng,
tỷ lệ nạc, số con đẻ ra/lứa của lợn.
Đa số các nghiên cứu trong thời gian qua tại Việt Nam chủ yếu tập trung mô tả về
đặc điểm ngoại hình, sinh trưởng phát dục và khả năng sinh sản của một số giống gà địa
phương. Cho đến nay, chưa có nghiên cứu thông qua kỹ thuật gen để xác định quan hệ
di truyền giữa các giống cũng như nguồn gốc, phân loại các giống… Việc này làm giảm
hiệu quả cho việc đầu tư vào công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng nguồn gen của các
giống gà nội.
Nghiên cứu: Xác định sự sai khác di truyền của các giống gà nội không những
xác định được mối quan hệ di truyền giữa các giống, giúp cho khai thác và sử dụng hợp
lý nguồn gen gà nội mà còn góp phần xác định nguồn gốc, sự thuần hóa và phân bố
trong lịch sử phát triển so với các giống gà của các nước trong khu vực đông Nam á.
MôC TI£U CñA §Ò TµI
Xác định sự sai khác di truyền, góp phần khai thác và sử dụng hợp lý các giống gà bản địa
4

PHẦN II. TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

A. SƠ LƯỢC VỀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI GÀ VÀ MỘT SỐ ĐẶC
ĐIỂM CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU
1. Sơ lược về nguồn gốc và vị trí phân loại của gà nhà:
Hiện nay, gà là một trong những vật nuôi phổ biến và được nuôi ở nhiều vùng trên
toàn thế giới. Tuy nhiên nguồn gốc của gà nuôi hiện chưa được thống nhất và vẫn đang
được tranh cãi giữa thuyết đơn nguyên và đa nguyên.
Thuyết đơn nguyên được khởi xướng dựa trên các nghiên cứu của Darwin (1868),
cho rằng gà nhà có chung một nguồn gốc và xuất phát từ giống Gallus. Trong giống này
có 4 loài gà rừng khác nhau, phổ biến rộng rãi nhất là loài
Gallus bankiva hay còn có tên
là Gallus gallus, thường gặp ở rừng Đông Nam Á, Ấn Độ, Myanmar, Malaysia và vài
nước khác. Loài Gallus lapayette lesson gặp ở vùng rừng Seilon và còn có tên gọi là gà
rừng Seilon. Loài thứ ba là Gallus sonerati, còn gọi là gà rừng màu xám, thường gặp ở
vùng rừng núi Ấn Độ. Một loài khác nữa là Gallus varius shaw, phổ biến ở Java nên còn
gọi là gà rừng Java. Khi nghiên cứu nguồn gốc chung của gà nhà từ các loài này, Darwin
đã khẳng định Gallus bankiva là tổ tiên chung nhất. Kết luận này càng được củng cố bởi
nhiều đặc điểm tương đồng giữa giống Gallus và gà nhà về hình thái, cấu tạo giải phẫu
các nội quan, về tiếng gáy cũng như tập tính hoạt động. Thuyết đa nguyên dựa trên những
nghiên cứu gần đây về một số tính trạng của gà, cho rằng gà nhà ngày nay bắt nguồn từ
các loại gà hoang khác nhau, một trong số đó là gà Gallus gallus. Tuy nhiên, thuyết này
xuất phát từ những nguồn thông tin mới, do đó cần phải thẩm định rõ ràng.
Theo nhiều tài liệu, gà rừng được thuần hoá và nuôi dưỡng tại Ấn Độ khoảng 3200
năm trước Công nguyên và tại Trung Quốc, Ai Cập khoảng 1400 năm trước Công
nguyên. Ban đầu, gà được nuôi chủ yếu để chọi hơn là vì mục đích thực phẩm. Sau khi
được đưa sang Châu Âu vào khoảng thế kỷ XVIII-XIX, nhờ tiến bộ của công tác chọn
giố
ng, các giống gà bản địa của Châu Á đã được lai tạo thành những giống cho năng suất
cao hơn.
Ở Việt Nam, gà rừng được thuần hoá và nuôi sớm nhất ở vùng Vĩnh Phú , Hà Bắc,
Hà Tây … Từ giống gà nuôi ban đầu là tiền thân của giống gà Ri hiện nay, nhân dân ta đã

tạo được nhiều giống gà: gà Mía, gà Ác, gà Ri, gà Tre, gà Đông Tảo …
Theo Nguyễn Ân (1983)[3] và nhiều tác giả, trong hệ thống phân loại sinh giới, gà
nhà có vị trí phân loại như sau:
Giới
Động vật (Animal)
Ngành Động vật có xương sống (Chordata)
Lớp Chim (Aves)
Bộ Gà (Galliformes)
5

Họ Trĩ (Phasianidae)
Giống Gallus
Loài Gallus gallus
Phân loài Gallus gallus domesticus
2. Sự phân bổ của 9 giống gà nghiên cứu:
* Gà Ri:
Gà Ri được nhân dân ta thuần dưỡng, nuôi phổ biến khắp các vùng miền và với phương
thức chăn thả vì vậy màu sắc lông của chúng rất đa dạng, uy nhiên màu phổ biến ở gà
mái là màu vàng sẫm hoặc vàng nhạt còn gà trống có màu đỏ tía
* Gà Hồ:
Gà Hồ có phân bố hẹp, chỉ còn ở thôn Lạc Thổ, huyện Thuận Thành, tỉnh Bắc
Ninh. Gà Hồ được biết tới với tầm vóc cơ thể to lớn, gà tr
ống dáng cao to.
* Gà Đông Tảo:
Gà Đông Tảo có phân bố hạn chế, chủ yếu được nuôi ở tại xã Đông Tảo, huyện
Khoái Châu, tỉnh Hưng Yên. Gà Đông Tảo có tầm vóc cơ thể to lớn nhưng không cao
như gà Hồ và gà Đông Tảo lại có vòng ống chân rất to và to hơn so với gà Hồ.
* Gà Mía:
Gà Mía có nguồn gốc từ xã Đường Lâm, thành phố Sơn Tây, Hà Nội. Giống gà
này có sự đồng nhất về m

ột số đặc điểm ngoại hình như con trống có thân hình to dài,
lông chủ yếu có màu mận chín.
* Gà Ác:
Gà Ác có phân bố chủ yếu ở đồng bằng Nam Bộ, với vai trò như một loại dược
liệu dùng làm thuốc bổ bồi dưỡng cho người ốm, phụ nữ mới sinh. Chân thường có lông
và có 5 ngón chân.
* Gà H’Mông:
Gà H'Mông phân bố chủ yếu ở các tỉnh vùng núi phía Bắc (các tỉnh Tây Bắc).
Chúng được người H’Mông thuần hóa và nuôi dưỡng từ lâu đời vì vậy có tên là gà
H’Mông. Đặc điểm nổi bật ở gà H’Mông là da, thịt, xương có màu đen.
* Gà Chọi:
Gà Chọi có phân bố rộng ở khắp các vùng miền. Nhưng tập trung chủ yếu ở các khu
đồng bằng và ven đô. Gà Chọi được nuôi phổ biến với mục đích giải trí là dùng để thi đấu nên
gà có ngoại hình phù hợp với mục đích này là dáng thanh gọn nhưng kết cấu cơ thể chắc ch
ắn.
Chân gà Chọi có 4 ngón và cũng có màu rất đa dạng: vàng, chì, vàng tối, trắng.
* Gà Tàu Vàng
Gà Tàu Vàng cũng là một giống gà lâu đời của nước ta, giống gà này chủ yếu
nuôi ở Miền Nam Gà Tàu Vàng phần lớn có lông màu vàng rơm, vàng sẫm, có đốm đen
ở cổ, cánh và đuôi. Mào cờ, chân 4 ngón, mỏ vàng, chân vàng, da vàng và thịt trắng.
* Gà Tre
6

Giống gà Tre cũng có nguồn gốc từ Nam Bộ, nhưng theo thời gian do đặc điểm
ngoại hình đặc trưng nên hiện nay đã phân bổ rộng rãi trong cả nước. Gà Tre là một
giống gà nhỏ con, con mái chân thấp, con trống chân cao hơn, ngoại hình luôn thể hiện
được sự mạnh mẽ.
B. ĐẠI CƯƠNG VỀ PHÂN LOẠI HỌC PHÂN TỬ
1. Định nghĩa phân loại phân tử:
Phân loại phân tử (Molecular systematics) là sự phát hiện, mô tả và giải thích sự đa

dạng sinh học ở cấp độ phân tử giữa các loài hoặc bên trong loài.
Trong những thập kỷ sau của thế kỷ XX, nhờ sự phát triển nhanh chóng của sinh
học phân tử, lĩnh vực phân loại học phân tử cũng đạt được nhiều thành tựu đáng kể. Các
công trình nghiên cứu, tiến hành trên các đối tượng động, thực vật và vi sinh vật, có ý
nghĩa to lớn trong việc phân biệt, phát hiện những loài mới hay những loài được xác định
là đã tuyệt chủng trong tự nhiên.
2. Các phương pháp nghiên cứu sử dụng trong phân loại phân tử:
Phân loại phân tử quan tâm đến 3 vấn đề chính sau:
- Nghiên cứu cấu trúc quần thể.
- Nhận biết ranh giới giữa các loài.
- Đánh giá mối liên quan tiến hoá và sự phát sinh chủng loại.
Để giải quyết những vấn đề này, các nhà nghiên cứu đã sử dụng các phương pháp
nghiên cứu gen hoặc nghiên cứu các sản phẩm của gen để đưa ra những kết luận cuối
cùng. Thông thường, khi đối tượng là động vật, người ta sử dụng các gen ty thể hoặc gen
nhân còn khi đối tượng là thực vật, người ta ưu tiên sử dụng các gen lục lạp và gen nhân.
Hiện nay, các phương pháp trên đã được xây dựng khá hoàn chỉnh bao gồm các phương
pháp chủ yếu sau đây:
2.1. Chỉ thị protein-enzyme: Phân tích isozyme
Isozyme là những dạng khác nhau của một enzyme, có cùng hoạt tính đặc hiệu cơ
chất nhưng khác biệt về cấu trúc bậc I của phân tử enzyme và do các locus gen khác nhau
quy định. Sự khác biệt này được thể hiện khi điện di trên gel agarose, tinh bột hay
polyacrylamide.
Đa hình isozyme là mô hình thuận lợi cho việc nghiên cứu do bản chất di truyền
đơn giản, không đòi hỏi phải biết kiểu gen của đối tượng nghiên cứu và tiết kiệm về mặt
kinh tế. Song, vì các isozyme chỉ biểu hiện trong những giai đoạn nhất định của quá trình
phát triển cá thể, số lượng không nhiều và không phản ánh chính xác bản chất di truyền
nên việc sử dụng chỉ thị isozyme trong phân loại phân tử gặp khá nhiều hạn chế.
2.2. Chỉ thị DNA:
Các chỉ thị DNA dựa trên cơ sở tính đa hình DNA, tức là sự sai khác trong genome
của các cá thể nghiên cứu. Người ta chia các chỉ thị DNA thành 3 loại chính:

7

- Chỉ thị dựa trên các trình tự nucleotide ngẫu nhiên: Đa hình các đoạn khuếch đại
ngẫu nhiên (RAPD- Random Amplified Polymorphic DNAs).
- Chỉ thị dựa trên các trình tự đơn lặp lại nhiều lần (vi vệ tinh): Các trình tự lặp lại
đơn (SSR- Simple Sequence Repeats).
- Chỉ thị dựa trên các trình tự nhận biết của các enzyme giới hạn, gồm có: Đa hình
các đoạn phân cắt giới hạn (RFLP- Restriction Fragment Length Polymorphism),
Đa hình các đoạn cắt giới hạn được khuếch đại ngẫu nhiên (AFLP- Amplified
Fragment Length Polymorphism).
Các chỉ thị này đều có nền tảng là kỹ thuật nhân gen in vitro (PCR). Bên cạnh đó,
người ta còn sử dụng các kỹ thuật lai DNA và phân tích trình tự DNA như là những chỉ
thị cho phân loại phân tử.
 PCR (Polymerase Chain Reaction) - kỹ thuật nền tảng:
Kỹ thuật PCR (hay còn gọi là kỹ thuật nhân bản gen in vitro), do Kary Mullis và cs
phát minh vào năm 1988, được xem là một phát minh có tính đột phá lớn, tạo ra một cuộc
đại cách mạng trong lĩnh vực nghiên cứu sinh học phân tử. PCR được ứng dụng rộng rãi
trong các nghiên cứu nhân dòng gen, các phân tích cận lâm sàng cũng như trong nghiên
cứu phân loại học phân tử và có lẽ phải mất một thời gian dài nữa mới xuất hiện một
phương pháp mới thay thế cho PCR.
Nguyên tắc:
Phản ứng PCR phối hợp khả năng lai đặc hiệu của DNA và khả năng tổng hợp
DNA in vitro của enzyme DNA polymerase để nhân bản in vitro các đoạn gen lên hàng
triệu lần qua một loạt các chu kỳ lặp lại.
Tuy nhiên, do enzyme DNA polymerase hoạt động cần các mồi (primer) nên người
ta phải biết được các trình tự nucleotide ở hai đầu DNA để thiết kế các cặp mồi đặc hiệu.
Trong điều kiện thích hợp và môi trường có chứa các nucleotide tự do, enzyme sẽ kéo dài
đoạn mồi thành sợi bổ sung với sợi làm khuôn.
Các giai đoạn:
Phản ứng PCR g

ồm một loạt chu kỳ lặp lại của ba giai đoạn cơ bản sau đây:
Giai đoạn biến tính (denaturing): tách sợi DNA kép thành dạng sợi đơn.
 Nhiệt độ: 94-95
o
C
 Thời gian: khoảng 1 phút
Giai đoạn gắn mồi (annealing): cặp mồi gắn đặc hiệu với trình tự bổ sung trên
DNA.
 Nhiệt độ: tuỳ thuộc Tm của mồi
 Thời gian: 20 giây đến 2 phút
Giai đoạn kéo dài (extending): lắp các dNTP tự do để tạo thành chuỗi mới.
 Nhiệt độ: 72
o
C, sau khi bổ sung Taq polymerase
8

 Thời gian: 30 giây đến vài phút, tuỳ thuộc chiều dài đoạn gen cần nhân
lên.
Hiện nay, kỹ thuật PCR đã được phát triển, cải tiến so với ban đầu. Người ta đưa
vào thêm một số bước phụ như khởi động nóng (hot start) nhằm làm sợi DNA kép biến
tính hoàn toàn, kéo dài thời gian tổng hợp chuỗi ở chu kì cuối cùng và giữ mẫu ở 4
o
C.
 Kỹ thuật RAPD - PCR:
Đây là kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR, nguyên tắc là sử dụng những đoạn
oligonucleotide ngẫu nhiên (dài khoảng 10 nucleotide) làm mồi cho phản ứng tổng hợp
DNA. Nếu 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, khi thực hiện phản ứng RAPD-PCR ở cùng
một điều kiện, sẽ tạo ra các đoạn DNA có kích thước và số lượng như nhau. Khi xảy ra
đột biến làm xuất hiện hoặc m
ất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra các đoạn gen có

kích thước, số lượng khác nhau giữa các cá thể. Sử dụng kỹ thuật RAPD có thể phát hiện
được các đột biến, do đó kỹ thuật này có thể ứng dụng trong nhận dạng sinh vật, xác định
các tính trạng khác nhau phục vụ công tác chọn giống vật nuôi và cây trồng.
 Kỹ thuật SSR:
Các trình tự lặp lại đơ
n (SSR-Simple Sequence Repeats), hay còn gọi là DNA vi vệ
tinh (microsatelite), là những đoạn trình tự ngắn, lặp lại nhiều lần tạo thành nhiều bản sao
trong genome. Các đoạn trình tự này xuất hiện do sai sót trong quá trình tự sao DNA, sửa
chữa hoặc tái tổ hợp gây ra bất thường trong cấu trúc không gian của phân tử DNA. Nếu
các trình tự lặp xuất hiện trong vùng dịch mã thì sẽ tạo thành các amino acid lặp lại nhiều
lần, ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của protein.
SSR cũng được sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền và lần đầu tiên vào năm
1989 được Litt M. và Luty J. A. nghiên cứu trên đối tượng người. Các nhà khoa học đã
chỉ ra rằng: Ở người, trình tự lặp đơn giản là TG với tần số lặp khoảng 10-60 lần, tạo
thành khoảng hơn 50000 bản sao phân bố khắp genome. Họ đã nhân trình tự SSR ở gen
tổng hợp actin bằng PCR và xác đị
nh được 12 alen trong 37 kiểu gen nghiên cứu.
 Kỹ thuật RFLP:
Kỹ thuật này lần đầu tiên được biết tới khi Botstein sử dụng để lập bản đồ các gen
có liên quan đến bệnh ở người.
Nguyên tắc:
Các enzyme giới hạn loại 2 (Endonuclease) có khả năng nhận biết và phân cắt phân
tử DNA tại những trình tự nucleotide nhất định, tạo thành các đoạn có chiều dài khác
nhau. Số lượng các đoạn tuỳ
thuộc vào số trình tự nhận biết trong genome. Khi nghiên
cứu các đối tượng khác nhau, sự khác biệt về cấu trúc genome, điển hình là sự khác biệt
về trình tự sắp xếp của các nucleotide dẫn đến việc thêm vào hoặc mất đi các điểm nhận
biết của các enzyme giới hạn. Do đó, nếu sử dụng các enzyme giới hạn để phân cắt DNA
của các đối tượng này, sau đó điện di ki
ểm tra và lai Southern, ta sẽ thu được các phổ

band riêng biệt, phản ánh sự sai khác về genome. Sự sai khác này gọi là sự đa hình. Các
9

phổ band được gọi là các “vân tay DNA” (DNA fingerprints) đặc trưng cho từng đối
tượng.


Hình 1. Mô hình các bước của kỹ thuật RFLP
Kỹ thuật RFLP có thể phối hợp với kỹ thuật PCR để phát hiện những khác biệt
trong genome.
Thực tế trong nhiều trường hợp, sử dụng từng enzyme riêng lẻ không thể phát hiện
sự khác nhau giữa các đối tượng, vì vậy phải phối hợp sử dụng nhiều enzyme mới cho kết
quả.
Kỹ thuật RFLP có thể ứng dụng trong nhiề
u lĩnh vực khác nhau, có thể kể đến là
trong nghiên cứu đa hình di truyền, nhận biết, chẩn đoán sớm các bệnh di truyền…
 Kỹ thuật AFLP:
Kỹ thuật AFLP là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, được Zebeau và Vos phát
minh vào năm 1993, sau đó tiếp tục được Vos và cộng sự (1995), Vos và Kuiper (1997)
hoàn thiện. Đây là một bước phát triển cao hơn của kỹ thuật RFLP, cũng dựa trên nền
tảng PCR, sử dụng các mồi đặc biệt được thiết kế sẵn để nhân bản có chọn lọc các đoạn
DNA được cắt giới hạn từ genome của đối tượng nghiên cứu. Các đoạn DNA được nhân
bản có độ dài khoảng 60-500 bp. Kỹ thuật AFLP giúp đánh giá độ đa dạng di truyền và
phát hiện chỉ thị phân tử với độ tin cậy cao.
 Kỹ thuật Microsatellite
10

Kỹ thuật chỉ thị phân tử microsatellite (MS) là các đoạn lặp lại được phân bố trong toàn
bộ hệ gen. Các trình tự lặp lại này bao gồm 1-6 bp và tổng độ dài không quá 100 bp ví dụ
như (CA)n, (GAA)m (Diethard Tautz, Manfred Renz, 1984). Microsatellite có thể tìm

thấy ở tất cả mọi nơi trong hệ genome, bao gồm cả vùng mã hoá và không mã hoá (Toth
và cộng sự, 2000) [115]. Sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện số lần lặp lại trong hệ gen
động v
ật và sự đa alen trong tự nhiên. Số lượng đơn vị lặp lại trên mỗi locus của các cá
thể đánh giá được trên gel polyacryamide. Từ kết quả chạy trên gel điện di chúng ta có
thể đánh giá được hai chỉ thị di truyền của các cá thể. Mỗi cá thể đều nhận một đoạn
nucleotide lặp lại từ bố và một đoạn từ mẹ (ở các cá thể chỉ thấy m
ột băng trên gel điện di
thì đây là băng chung của cả bố và mẹ).
Microsatellite được sử dụng để so sánh bản đồ di truyền và hệ gen ngay từ thời điểm nó
được sử dụng để nghiên cứu. Thứ nhất, các trình tự microsatellite được biết đến là các
đoạn gen có mức độ đa hình cao. Thứ hai, các trình tự microsatellite có sự phân bố rộng
và đều trên hệ gen. Sử dụng các chỉ thị microsatellite khi nghiên cứu trên quần thể gà có
thể thu được hơn 12 alen trên một locus và tần số dị hợp tử có thể lên đến 90% (Tayler và
cộng sự, 1994) [114],. Các chỉ thị microsatellite của gà có thể tìm được từ các cơ sở dự
liệu trên mạng Internet như: http:w3.tzv.fal.de/aviADNiv/index.html;
ttp:w3.tzv.fal.de/aviADNiv/index.html; http:/www.thearkdb.org/browse hoặc ở một số
báo các của các tác giả khác nhau: ví dụ Crooijmans và cộng sự (1996) ) [52], đã công
bố 101 chỉ thị microsatellite.
 Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp microsatellite
Các microsatellites được FAO sử dụng như là công cụ phân tử đầu tiên cho dự án
MoDAD để nghiêm cứu sự đa dạng sinh học. Hiện nay, các microsatellite cung cấp một
công cụ tốt nhất cho việc nghiên cứu các locus có các gen liên quan đến các tính trạng số
lượng và cho việc đánh giá sự đa dạng di truyền của các quần thể các loài vật
nuôi.(Maudet và cộng sự, 2002[82]; Javier Canon và cộng sự, 2001[72]; Meng-Hua Li và
cộng sự, (2002)[83
]; Guillaume Laval và cộng sự, 2000[67]; Han và cộng sự, 2002[69];
Groenen và cộng sự, 1995[65]).
Hiện nay đã có một số tác giả sử dụng các chỉ thị microsatellite trên gà như:
Zhou và Lamont (1999) [121], sử dụng 42 chỉ thị microsatellite để phân tích 23 dòng gà

cao sản của các giống gà Leghorn, gà rừng, gà Fayoumi và gà Tây Ban Nha. Từ đó tính
được được khoảng cách di truyền giữa gà rừng với các dòng gà khác.
Wimmers và cộng sự (2000) [116], sử dụng 22 chỉ thị microsatellite
để xác định tần số
dị hợp tử và khoảng cách di truyền của các giống gà: Châu Phi, Châu Á và Nam Mỹ. Kết
quả cho thấy các giống gà có sự đặc trưng theo từng khu vực.
Zhang và cộng sự (2002) [119], nghiên cứu các giống gà nội địa Trung Quốc bằng việc
phân tích allozyme, RAPD và microsatellite. Kết quả cho thấy khi phân tích bằng
microsatellite thì tần số dị hợp tử quan sát được là cao nhất (75.91%), tiếp theo là phương
11

pháp RAPD (26.32%), cuối cùng là phương pháp phân tích allozyme (22.09%). Qua công
bố này cho thấy việc sử dụng microsatellite để đánh giá sự đa dạng di truyền, mối quan
hệ di truyền của quần thể cũng như giữa các quần thể là phù hợp nhất
Nhìn chung, mỗi phương pháp đều có những ưu, nhược điểm, không giống nhau
nhưng có thể bổ sung cho nhau. Do đó trong nghiên cứu, nên phối hợp các phương pháp
để hoàn thiện kết quả.
Bảng 1. Khả năng ứng dụng của các chỉ thị phân tử
Vấn đề nghiên cứu Isozyme

Lai
DNA

Phân tích vị
trí enzyme
giới hạn
Phân tích
các đoạn
DNA (a)
Phân tích

trình tự
DNA
Tiến hoá gen M - M -, M, - +
Cấp phân loại phụ của
quần thể
+

- +
M, +, -
+
Sự biến đổi địa lý + - + M, +, M +
Ranh giới giữa các loài + - + +, M, - +
Phát sinh chủng loại (0-
5 triệu năm)
+ M + -, M, - +
Phát sinh chủng loại (5-
50 triệu năm)
+ + + -, -, - +
Phát sinh chủng loại
(50-500 triệu năm)
M M M -, -, - +
Phát sinh chủng loại
(500-3500 triệu năm)
- - - -, -, - +
Chú thích:
(-): Phương pháp không phù hợp
(M): Phương pháp chỉ phù hợp 1 lần
(+): Phương pháp phù hợp và có hiệu quả
(a): Phân tích các đoạn DNA gồm các kỹ thuật lần lượt theo thứ tự: RAPD, vi vệ
tinh (microsatellite) và các “vân tay” DNA nhiều locus (multilocus DNA fingerprinting)

2.3. DNA ty thể trong phân loại phân tử:
2.3.1. Nguồn gốc và tiến hoá của ty thể:
Ty thể lần đầu tiên được mô tả bởi Alman vào năm 1894 và sau đó, cấu trúc siêu
hiển vi của ty thể đã được nghiên cứu cụ thể bởi Palad (1952) và Sjostand (1953). Đây là
bào quan quan trọng, có mặt trong tất cả các tế bào hô hấp hiếu khí, giữ vai trò như một
“nhà máy năng lượng” của tế bào. Nhờ chứa chuỗi truyền điện tử, các enzyme của chu
trình Krebs và phosphoryl hoá, ty thể thự
c hiện quá trình oxy hoá các hydratecarbon, các
12

acid béo, các acid amin… giải phóng ra năng lượng dưới dạng các liên kết phosphate cao
năng trong phân tử ATP. Đây là dạng năng lượng cần thiết cho mọi hoạt động sống của tế
bào. Phản ứng tạo thành ATP trong ty thể:
ADP + P
vô cơ
+ E → ATP
Theo quan điểm của sinh học hiện đại, ty thể có nguồn gốc từ sự cộng sinh giữa tế bào
và một loại vi khuẩn hiếu khí, xảy ra cách đây khoảng 2 tỷ năm. Đây là nội dung của thuyết
nội cộng sinh (Serial Endosymbiosis Theory – SET), được I. Wallin đề xuất vào năm 1920
và sau đó được L. Margulis lý giải rõ ràng hơn vào năm 1967. Thuyết nội cộng sinh cho
rằng, tế bào eukaryote nguyên thuỷ đã thực bào một số vi khuẩn hiếu khí nhưng không tiêu
hoá như bình thường mà thiết lập mối quan hệ cộng sinh. Theo thời gian, cùng với sự tiến
hoá của tế bào, vi khuẩn cũng dần biến đổi và trở thành một bào quan cung cấp năng lượng
cho tế bào chủ. Giả thuyết này được Margulis củng cố bởi 5 bằng chứng sau đây:
• Kích thước của ty thể tương đương với kích thước của vi khuẩn.
• Giống như vi khuẩn, ty thể có 2 lớp màng và thành phần lipid màng ty thể
không giống với các thành phần trong tế bào chất. Nếu ty thể có nguồn gốc phát sinh bên
trong tế bào, màng ty thể sẽ chứa các thành phần tương tự.
• Ribosome của ty thể là loại 70S chứ không phải loại 80S như trong tế bào.
• DNA ty thể (mitochondrial DNA- mtDNA) có dạng vòng, tỷ lệ G-C cao và

DNA không liên kết với protein histone. Điều này làm cho mtDNA giống DNA vi khuẩn
hơn là DNA nhân tế bào.
• Quá trình sao chép của mtDNA giống như ở vi khuẩn.

Hình 2. Sơ đồ nguồn gốc và tiến hoá của ty thể
13

2.3.2. Đặc điểm mtDNA gà:
Trong tế bào, các ty thể cũng có hệ genome riêng, chiếm 1-5% DNA của tế bào.
MtDNA của động vật có xương sống nói chung có dạng vòng kép, gồm 1 chuỗi nặng
(chuỗi H) giàu G và 1 chuỗi nhẹ (chuỗi L) giàu C, có chiều dài khoảng 5µm. Phân tử
mtDNA không liên kết với protein histone, có khả năng tái bản theo cơ chế bán bảo toàn
nhờ sử dụng các enzyme DNA polymerase trong chất nền ty thể. Ở đa số các động vật,
phân tử mtDNA chứa khoảng 16-17kb, mã hoá cho các loại protein/enzyme tham gia vào
các quá trình tổng hợp năng lượng, trao đổi chất … của tế bào, trong đó gồm 22 loại
tRNA, 2 loại rRNA 16S và 12S, 13 chuỗi polypeptide, Chinnery & Schon, (2003)[49] và
giữa các gen không có intron. Tuy nhiên, trật tự sắp xếp các gen trên giữa các loài lại có
sự sai khác rõ rệt, đặc biệt khi so sánh trình tự genome ty thể các taxon bậc bộ trở lên.
Bên cạnh đó, phân tử mtDNA còn có đặc đặc điểm đơn bội, không tái tổ hợp,di truyền
theo dòng mẹ và tốc độ tiến hoá nhanh hơn 5 lần so với các gen nhân, do đó mtDNA có
thể được sử dụng như một dấu hiệu để nhận biết các sai khác di truyền.
Năm 1990, trình tự genome mtDNA lần đầu tiên được công bố trên đối tượng gà
Leghorn trắng bởi các tác giả Desjardins và Morais. MtDNA có chiều dài khoảng 16,8 kb
và ngoài các gen cấu trúc còn có 1 vùng điều khiển không mang mã di truyền gọi là vùng
D-loop. Tuy có nhiều đặc điểm tương đồng với hệ genome mtDNA của các động vật có
xương sống, hệ genome mtDNA gà vẫn mang những điểm khác biệt đáng kể:
- Đầu tiên đó là trật tự các gen trên mtDNA. Trên chuỗi nhẹ, trật tự gen theo
chiều 5’-3’ là NADH dehydrogenase (ND5), Cytochrome b (Cyt b), tRNA
Thr
,

tRNA
Pro
, ND6, tRNA
Glu
và vùng điều khiển trong khi ở các động vật khác, gen Cyt
b lại nằm gần vùng điều khiển hơn.
- Thứ hai, ở gà thiếu 1 điểm khởi đầu sao chép nằm giữa 2 gen tRNA
Cys
và
tRNA
Asn
như ở các động vật có xương sống khác.
- Cuối cùng, gen Cytochrome oxydase I (COI) có bộ 3 mở đầu là GTG thay vì
ATG.


14

Hình 3. Sơ đồ trật tự các gen trong genome mtDNA gà
ND: NADH dehydrogenase
CO: Cytochrome oxydase
2.3.3. Gen cytochrome b (Cyt b)
Gen cytochrome b có chiều dài 1143 bp, mã hoá cho một protein tham gia vào sự
vận chuyển electron trong chuỗi hô hấp ở ty thể. Đây là gen được nghiên cứu nhiều nhất
của mtDNA.



Hình 4. Vị trí gen Cyt b
Cyt b là gen được sử dụng phổ biến trong các phân tích xác định nguồn gốc tiến

hoá cũng như sự đa hình của các quần thể khác nhau trong loài vì :
- Tốc độ tiến hoá trong vùng silent (slient position) tương đối nhanh.
- Cơ sở dữ liệu về gen Cyt b rất phong phú nên việc so sánh giữa các đối
tượng nghiên cứu hết sức thuận lợi.
- DNA Cyt b chứa đầy đủ thông tin cần thiết để nghiên cứu sâu hơn về mối
quan hệ chủng loại giữa các loài.
Kimball và cs (1999) đã nghiên cứu quan hệ chủng loại của một số loài trĩ và gà
gô dựa trên sự phân tích trình tự đầy đủ của gen cytochrome b gồm 1143 bp.
Scott (1997) cũng dựa trên sự phân tích vùng điều khiển mtDNA và một đoạn 307 bp
của gen cytochorome b để nghiên cứu mối quan hệ có hệ thống của một số loài trĩ Việt Nam.
Năm 2002, Shen và cs đã nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng loại của các
giống gà sinh sản dựa trên phân tích trình tự đầy đủ của gen cytochrome b
Cho đến nay, tổng chiều dài 1143 bp của gen Cyt b đã được đọc trình tự tạo điều kiện
thuận lợi cho các nghiên cứu sâu hơn về quan hệ chủng loại giữa các loài. Trình tự gen
Cyt b đã được phân tích khá đầy đủ trên nhiều đối tượng sinh vật tuy nhiên những nghiên
cứu về gen Cyt b ở Việt Nam còn rấ
t hạn chế do đó cần có những nghiên cứu sâu hơn về
trình tự đặc biệt này trên các đối tượng sinh vật ở Việt Nam.
2.3.4. Đoạn trình tự D-loop và khả năng sử dụng nó trong phân loại và đánh
giá đa dạng di truyền gà:
Vùng điều khiển hay còn gọi là đoạn D-loop trên mtDNA gà nhà là 1 vùng không
mang mã di truyền, có chiều dài 1227 bp, chứa điểm khởi đầu sao chép và các promoter
15

cho quá trình phiên mã của cả chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, L’abbe et al. (1991)[73]. Về cấu
trúc, theo Baker và Marshall (1997)[47], vùng trình tự D-loop có thể chia thành 3 domain
I, II và III. Trong đó domain II bảo thủ nhất, chứa một số đơn vị cấu trúc không thay đổi
ngay cả ở bậc phân loại họ. Ngược lại, domain III được coi là biến đổi nhiều nhất.
Đoạn trình tự D-loop là vùng tiến hoá nhanh nhất trong phân tử mtDNA. Trung
bình, nó tích luỹ các đột biến nhanh hơn 5-10 lần so với bất kì gen nào trong hệ gen ty thể

vì vậy có thể xem trình tự nucleotide của vùng D-loop là một công cụ quan trọng để đánh
giá đa dạng di truyền, sự phân hóa bên trong loài và giữa các quần thể cùng loài.
Trước đây, việc phân loại gà chủ yếu dựa và đặc điểm bộ lông của con trống. Tuy
nhiên đây là những đặc điểm sinh dục thứ cấp và biến đổi nhanh chóng qua các thế hệ
nên không thể là căn cứ để xác đị
nh mối liên hệ di truyền trong tiến hoá giữa các loài.
Trong những năm cuối thế kỷ XX, cùng với sự phát triển rộng rãi các nghiên cứu về
mtDNA, điển hình là vùng trình tự D-loop các nhà khoa học đã có trong tay công cụ hữu
hiệu để từng bước khắc phục những nhược điểm của phân loại học cổ điển.
Trong những nghiên cứu định loại dựa trên marker mtDNA, người ta đặc biệt quan
tâm đế
n hai trình tự là vùng điều khiển mtDNA (D-loop) và gen cytochrome b.
3. Các nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới, đã có rất nhiều công trình khoa học sử dụng mtDNA của các đối
tượng khác nhau làm đối tượng nghiên cứu.
Năm 1993, M. Ron và cộng sự đã nghiên cứu sự ảnh hưởng theo dòng mẹ đối với
sản lượng sữa ở bò Holstein, Israel. Họ chọn ra 4 giống bò có sản lượng sữa cao nhất và 4
giống có sản lượng sữa thấp nhất, tiến hành nhân bản đoạn D-loop bằng PCR và đọc trình
tự 719 nucleotide. Các nhà nghiên cứu đã phát hiện được 80 điểm đa hình với 17 vị trí
thay thế và 1 vị trí thêm nucleotide. Tuy nhiên không vị trí đa hình nào có ảnh hưởng rõ
ràng tới sản lượng sữa.
Năm 2001, D. Niu và cs[56] đã tiến hành nghiên cứu nguồn gốc và đánh giá đa
dạng di truyền 6 giống gà bản địa của Trung Quốc. Họ giải trình tự 539 nucleotide vùng
trình tự D-loop của 6 giống gà, so sánh với trình tự nucleotide của các giống gà G. gallus,
G. sonneratii,
G. varius, G. lafayettei lưu trữ trong GenBank và thiết lập cây chủng loại
phát sinh giữa các giống. Đồng thời, dựa trên đoạn trình tự phân tích được, họ cũng nhận
thấy sự khác biệt đáng kể về mặt di truyền giữa các giống gà chuyên trứng và các giống
nuôi với mục đích khác, chủ yếu là do sự khác biệt về dòng mẹ giữa các giống.
Năm 2003, M. Ingman và U. Gyllensten [65] đã tiến hành nghiên cứu lịch sử

tiến
hóa của người bản địa Australia và New Guinea, sử dụng công cụ mtDNA. Họ phân tích
trình tự nucleotide đầy đủ của các nhóm người Australia, New Guinea, Châu Phi, Ấn Độ,
Châu Âu, Châu Á, Melanesia và Polynesia. Sự đa dạng di truyền trong trình tự nucleotide
người Australia rất cao và khá tương đồng với người Châu Á. Kết quả này chỉ ra, dân bản
16

địa Australia được hình thành khoảng 40-70 nghìn năm trước, do sự di cư của các nhóm
người nhỏ qua thời gian dài.
Năm 2003, S. Moulin và cộng sự đã sử dụng 800 bp của đoạn D-loop và 400 bp
của gen cyt b để nghiên cứu sự phát sinh chủng loại của 2 loài gà lôi Lophura nycthemera
và L. leucomelanos. Các kết quả thu được đã góp phần phân biệt 2 loài trên và đồng thời
làm sáng tỏ nguồn gốc của một số phân loài thuộc 2 loài này
Năm 2003, T. Komiyama[77] và cộng sự cũng dựa trên trình tự đầy đủ của vùng
D-loop để nghiên cứu nguồn gốc tiến hoá và quá trình thuần hoá của 3 giống gà
Naganakidori của Nhật Bản. Trên cơ sở cây chủng loại phát sinh xây dựng được, các nhà
nghiên cứu cho rằng tuy có nhiều điểm khác biệt đáng chú ý, 3 giống gà trên đều có
nguồn gốc từ giống gà chọi Shamo. Kết quả này còn dẫn đến kết luận 3 giống gà được
đưa từ các vùng lân cận miền nam Trung Quốc hoặc Đông Dương qua Okinawa vào Nhật
4. Các nghiên cứu ở Việt Nam
Tuy nhiều quốc gia trên thế giới đã tiến hành nhiều nghiên cứu phân loại phân tử
sử dụng các chỉ thị mtDNA nhưng ở Việt Nam, các nghiên cứu này mới chỉ được sử dụng
nhiều trong vài năm gần đây.
Năm 1999, Kim Thị Phương Oanh[22]đã sử dụng phương pháp đa hình các đoạn
cắt giới hạn (RFLP) nghiên cứu vùng D-loop của 3 loài gà lôi Việt Nam gồm: gà lôi lam
đuôi trắng, trĩ bạc và gà lôi hông tía. Các k
ết quả thu được cho thấy sự sai khác về trình
tự nhận biết các enzyme trong vùng trình tự nói trên;
Năm 1999, một nhóm các nhà khoa học Pháp, kết hợp với Vũ Triệu An, Đại học Y
Hà Nội, đã tiến hành nghiên cứu đa hình DNA ty thể người Việt Nam. Dựa trên những

kết quả thu được về đa hình các điểm phân cắt của các enzyme giới hạn, so sánh với các
dân tộc khác thuộc khu vực Đông Á và kết hợp với các bằng chứng về miễn dịch, đã góp
phần làm sáng tỏ giả thuyết về nguồn gốc của dân tộc Việt Nam.
Năm 2003, Trần Thị Mỹ Linh và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu xác định trình
tự nucleotide vùng siêu biến I trên mtDNA ở người Việt Nam. Đề tài mang lại những kết
quả đầu tiên trong việc xây dựng phương pháp nghiên cứu vùng siêu biến I trong mtDNA
người Việt Nam, từ đó giúp xác định đặc trưng di truyền ngoài nhân của mỗi dân tộc ở
các vùng địa lý khác nhau và sự liên quan tới tần suất xuất hiện các bệnh hiểm nghèo,
phục vụ cho phòng ngừa và điều trị.
Năm 2003, Quyền Đình Thi và cộng sự đã sử dụng một số chỉ thị như
Microsatellite, RFLP với các gen mtDNA và RAPD-PCR để nghiên cứu đa hình di
truyền các quần thể tôm sú và cá tra nuôi tại Việt Nam. Kết quả thu được từ các nghiên
cứu trên đã giúp phân biệt được các quần thể cá tra nuôi ở những trại cá khác nhau và có
khả năng đi sâu, mở rộng hướng nghiên cứu nhằm phục vụ công tác chọn giống.
17

PHẦN III. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
A. CÁC CHỈ TIÊU THEO DÕI:
Thu thập số liệu về ban đầu về ngoại hình, sinh trưởng phát dục, tính năng sản xuất,
hướng sử dụng, trong các tài liệu đã công bố và trực tiếp cân đo tại các cơ sở chăn nuôi
các giống gà trên, cập nhật số liệu định kỳ hàng năm. Tất cả các cá thể được tuyển chọn
lấy mẫu đều được chụp ảnh và đo định vị thông tin địa lý toàn cầu GPS
1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu
Bảng 2: Địa điểm lấy mẫu
Giống Địa điểm
Ác Tiền Giang
Long An
Trung tâm Nghiên cứu gia cầm Thuỵ Phương
Chọi Quy Nhơn – Bình Định
Tản Lĩnh – Ba Vì – Hà Nội

Thuận Thành Bắc Ninh
Đông Tiến – Đông Hưng – Thái Bình
H’mông Trung tâm nghiên cứu và Bảo tồn vật nuôi
Trung tâm gà Xương đen - Quyết Tiến - Quản Bạ - Hà Giang
Hồ Thuận Thành - Bắc Ninh
Đông Tảo Khoái Châu – Hưng Yên
Tre Ba Vì – Hà Nội
Từ Liêm – Hà Nội
Trung tâm Nghiên cứu và Bảo tồn vật nuôi
Bến Tre
Mía Đường Lâm – Sơn Tây – Hà Nội
Tàu Vàng Châu Thành – Long An
Ri Trung tâm nghiên cứu và huấn luyện chăn nuôi - Vạn Phúc

18

Bảng 3. Địa điểm cân đo cập nhật số liệu
Giống Địa điểm
Ri
Trung tâm Nghiên cứu và huấn luyện Chăn nuôi- Vạn Phúc
Xã Tam Tiến -Yên Thế - Bắc Giang
Vụ Bản – Nam Định
Hồ
Làng Lạc Thổ Thị trấn Hồ huyện Thuận Thành tỉnh Bắc Ninh
Trung tâm NC Huân luyện Chăn nuôi, Vạn Phúc
Gà Đông Tảo
Xã Đông Tảo huyện Khoái Châu – Hưng Yên
Trung tâm NC Huân luyện Chăn nuôi, Vạn Phúc
Gà Mía
Xã Đường Lâm thị xã Sơn Tây – Hà Nội

Trung tâm NC Huân luyện Chăn nuôi, Vạn Phúc
Gà Ác
Trung tâm Gia cầm Thụy Phương – Hà Nội
Các hộ chăn nuôi Đại Mạch huyện Đông Anh
Gà H’mông
Trung tâm Nghiên cứu và Bảo tồn vật nuôi – Hà Nôi
Trung tâm gà Xương đen xã Quyết Tiến - Quản Bạ - Hà Giang
Gà Chọi
Các hộ nông dân Xã Đông Tiến – Đông Hưng - Thái Bình
Các hộ nông dân Thị trấn Hồ huyện Thuận Thành tỉnh Bắc Ninh
Các hộ nông dân Xã Tản Lĩnh huyện Ba Vì - Hà Tây (cũ)
Gà Tre
Trung tâm Nghiên cứu và Bảo tồn vật nuôi
Các hộ gia đình tại xã Thụy Phương huyện Từ Liêm – Hà Nội
Trại thú quý hiếm – Trung tâm nghiên cứu Bò va Đồng cỏ Ba Vì – Hà
Tây (cũ)
Gà Tàu Vàng Các hộ nông dân xã Phú Ngãi Trị huyện Châu Thành tỉnh Long An

19


 Theo dõi Sinh trưởng và sinh sản
Bảng 4: Bố trí thí nghiệm
Sinh trưởng Sinh sản
Giống n Địa điểm Giống n Địa điểm
Ri 80 Gà Ri 557
Trung tâm Nghiên cứu
và huấn luyện chăn
nuôi - Vạn phúc – Hà
Đông – Hà Nội

Hồ 76 Gà Ác 290
Trung tâm Gia cầm
Thụy Phương – Hà
Nội
Đông Tảo 100
Gà
H‘mông
67
Trung tâm nghiên cứu
và bảo tồn vật nuôi
Mía 176
Trung tâm Nghiên cứu
và huấn luyện chăn
nuôi - Vạn phúc – Hà
Đông – Hà Nội

Ác 80
Các hộ nông dân Đông
Anh – Hà Nội

H’mông 86
Trung tâm nghiên cứu
và bảo tồn vật nuôi

Chọi 70
Đông Hưng – Thái
Bình

Tre 110
Trung tâm nghiên cứu

và bảo tồn vật nuôi

Tàu Vàng 52
Phú Ngãi Trị huyện
Châu Thành tỉnh
Long An


Các lô thí nghiệm được bố trí với cùng khẩu phần ăn và điều kiện chăm sóc nuôi
dưỡng
 Khảo sát chất lượng thịt gà:
14 tuần tuổi của 2 giống gà Ri và H’mông (10 con gồm 5 trống, 5 mái với mỗi giống)
tại Bộ môn di truyền giống vật nuôi – Khoa Chăn nuôi – Thủy Sản trường Đại học Nông
nghiệp Hà Nội và phòng Phân tích thức ăn - Viện Chăn nuôi
2. Nội dung nghiên cứu
 Theo dõi sinh trưởng, sinh sản
Theo dõi sinh sản
- Tuổi thành thục về tính (ngày)
- Khối lượng khi thành thục về tính (kg)
- Số trứng đẻ/lứa (quả)
- Số lứa đẻ/mái/năm (lứa)
- Số trứng/mái/năm (quả)
- Khối lượng trứng (g)
Theo dõi sinh trưởng
- Theo dõi khối lượng cơ thể theo tuần
20

- Theo dõi số đầu gà theo tuần
- Theo dõi thu nhận thức ăn theo tuần
 Khảo sát chất lượng thịt

- Đánh giá năng suất thịt
- Đánh giá các chỉ tiêu hóa học, lý học của chất lượng thịt gà
3. Phương pháp nghiên cứu
 Các chỉ tiêu theo dõi: Sử dụng các phương pháp thường quy trong chăn nuôi
Đặc điểm ngoại hình
- Mô tả đặc điểm ngoại hình của các giống gà dựa trên quan sát trực tiếp và
chụp ảnh
- Tiến hành đo kích thước các chiều cơ thể khi xác định chính xác tuổi gà
o Dài lưng: đo từ đốt xương sống cổ cuối cùng đến đốt sống đuôi đầu
tiên
o Dài lườn: từ đầu xương lưỡi hái đến hết xương lưỡi hái
o Vòng ngực: đo một vòng quanh ngực, sát nách gà
o Dài cánh: từ mỏm xương bả vai đến đầu mút xương cánh
o Dài đùi: từ khớp khuỷu đến khớp đùi gắn với xương chậu
o Dài chân: từ khớp khuỷu đến sát bàn chân
o Vòng ống chân: đo một vòng quanh ống chân, sát nơi các ngón chân
 Các chỉ tiêu đánh giá thân thịt:
Khối lượng móc hàm, tỷ lệ thân thịt, thịt ngực, thịt đùi, tim, cật được tác riêng từng
phần và cân bằng cân điện tử có độ chính xác 0.01g
Tỷ lệ móc của từng phần dược tính theo công thức chia khối lượng từng phần cho
khối lượng thân thịt nhân với 100%.
Với thịt ngực và thịt đùi xác định khối lượng được tiến hành như sau: Tiến hành lọc
thịt đùi và thịt ngực bên trái, sau đó tính tỷ lệ thịt đùi và ngực bằng cách nhân đôi. Việc
lọc thịt ngực và đùi được thực hiện sau khi đã đo pH
15
(ở thời điểm 15 phút sau khi giết
mổ). Phần thân thịt bên phải còn lại được đựng trong túi nhựa kín và bảo quản nhiệt độ 2-
4
0
C trong 24 giờ để sử dụng xác định màu sắc và pH

24
(sau 24 giờ giết mổ).
* Chất lượng thịt:
Xác định pH cơ ngực:

Xác định tỷ lệ mất nước sau 24 giờ bảo quản:
Đo màu sắc thịt
Xác định độ dai của thịt: Đánh giá chất lượng hoá học của thịt
Chúng tôi tiến hành đánh giá chất lượng hoá học của thịt đùi
Phương pháp xác định độ ẩm ban đầu theo TCVN 4326-2001, ẩm tổng số theo TCVN
4326-86
Phương pháp xác định tỷ lệ Protein thô theo TCVN 4328 – 2001
Xác định hàm lượng lipit thô được tiến hành theo (TCVN-4331 - 2001).
Xác định hàm lượng khoáng tổng số được tiến hành theo TCVN 4327 - 93.
4. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu thập được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học bằng phần
mềm Excel 2003, Minitab 14 và SAS 8.0 (2000).
Các tham số thống kê được tính toán: dung lượng mẫu (n), số trung bình (
X
), sai số
tiêu chuẩn (SE), hệ số biến động (Cv%) và so sánh sự sai khác giữa các giá trị trung bình
21

theo phương pháp Duncan.
B. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ADN TRONG HỆ GEN
1. Nguyên liệu:
Tổng số mẫu phân tích: 500, trong đó:
- Gà Hồ: 56 mẫu; - Gà Tre: 56 mẫu; - Gà Ác: 56 mẫu; - Gà H’mông: 56 mẫu; Gà
Chọi : 56 mẫu; gà Đông Tảo : 55 mẫu, Gà Mía : 55 mẫu; Gà Ri : 55 mẫu; Gà Tàu
Vàng : 55 mẫu;

- Các hoá chất, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu được đặt từ các hãng: Fermentas,
Merk, Qiagen, Beckman
2. Chuẩn bị mẫu, hóa chất chạy máy CEQ8000
1. Đĩa đệm: 2
2. Đĩa mẫu: 2
3. SLS: 3500ul
4. Size-400: 25ul
5. Buffer: 2lọ
6. Gel: 2 lọ
7. Đầu côn, Trip PCR các loại
Số lượng hóa chất và dụng cụ sử dụng cho phân tích: 96 phản ứng
Các dụng cụ và thiết bị cần sử dụng:
1. Pipet các loại
2. Máy ủ nhiệt
3. Máy đo quang phổ
4. Máy li tâm lạnh
5. Máy PCR
6. Máy CEQ-8000
3. Phương pháp:
 Phương pháp lấy mẫu:
Chuẩn bị ống lấy mẫu: Các ống lấy mẫu có thể là ống eppendorf 1,5 hoặc 2ml có
nắp kín. Cho vào mỗi ống 50µl dung dịch EDTA 0,5M.
Lấy mẫu: Chọn các cá thể gà đại diện cho từng giống. Các cá thể lấy mẫu không
có họ hàng thân thuộc với nhau và đươc chụp ảnh từng con. Sử dụng loại kim và ống lấy
mẫu chuyên dụng, các mẫu máu được lấy từ tĩnh mạch cánh của gà và mỗi con gà lấy
khoảng 1ml máu. Sau khi lấy được mẫu máu, chuyển ngay mẫu vào ống có chứa dung
dịch EDTA 0,5M, lắc nhẹ, đều. Sau đó chuyển mẫu vào hộp lạnh để bảo quản ë 4
0
C vµ
chuyÓn vÒ phßng thÝ nghiÖm b¶o qu¶n ë -20

0
C.
 Tách chiết ADN
Mẫu máu sau khi thu thập mang về phòng thí nghiệm được ly tâm thu lại huyết thanh và
huyết tương để phục vụ cho các thí nghiệm khác còn hồng cầu và bạch cầu được bảo
22

quản và sử dụng để tách chiết ADN tổng số.
Các mẫu máu sau xử lý được tách chiết bằng Kit Quiagen. Các bước tiến hành:
- Lấy 50µl máu gà (đã loại bỏ huyết tương và huyết thanh) và 150 µl dung dịch đệm TE
cho vào ống eppendorf 1,5ml. Bổ sung 20µl protein K và 200µl đệm AL. Lắc đều khoảng
15 giây và ủ ở 56
0
C trong 10 phút.
- Bổ sung 200µl cồn tuyệt đối (96-100%) vào ống mẫu. Lắc đều, sau đó ly tâm nhẹ để các
dung dịch trên thành ống xuống hết.
- Dùng Pipet hút hết dung dịch trong ống mẫu cho vào cột lọc (Dneasy Mini spin
column) đặt trong ống 2ml. Ly tâm 8000 vòng trong 1 phút sau đó chuyển cột lọc sang
một ống mới.
- Bổ sung 500µl đệm AW 1, ly tâm 8000 vòng trong 1 phút. Chuyển cột lọc sang ống
mới.
- Bổ sung 500µl đệm AW 2, ly tâm 14000 vòng trong 3 phút. Chuyển cột lọc sang ống
1,5ml mới.
- Bổ sung 200 µl đệm TE. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút. Sau đó ly tâm 8000 vòng
trong 1. Bỏ cột lọc giữ lại ống có dung dịch chứa ADN. Bảo quản ADN trong tủ -20
0
C.
 Đánh giá chất lượng ADN
- Đánh giá chất lượng ADN thông qua việc kiểm tra trên gel agarose 1%.
- Để xác định độ tinh sạch và nồng độ của ADN, ta tính chỉ số OD của ADN ở bước sóng

260nm và 280nm, sau đó tính tỷ số giữa hai chỉ số OD đó.
+ Nồng độ của dung dịch axit nucleic được xác định bằng cách đo độ hấp thụ tại bước
sóng 260 nm trong máy quang phổ kế . Một đơn vị (1,0) giá trị hấp thụ bước sóng 260nm
(A260) tương đương với nồng độ 50µg/ml của ADN. Nếu giá trị hấp thụ bước sóng
280nm (A280) cũng được xác định, thì tỷ số A260/A280 là chỉ số cho thấy độ lẫn các
chất như phenol hoặc protein. Tỷ lệ A260/A280 là 1,8 – 2 là ADN đạt độ tinh khiết theo
tiêu chuẩn Quốc tế (Lê Đình Lương, 2004).
 Phương pháp PCR multiplex
Để phân tích 500 mẫu máu gà bằng 20 cặp mồi được giới thiệu (FAO-
và từ Chicken Genome Mapping Home page (http://www.
ri.bbsr.ac.uk/chickemap) và sử dung phương pháp PCR-multiplex với các mix như sau:
Bảng 5.Tên mồi và trình tự mồi.
Tên mồi Trình tự mồi Tên mồi Trình tự mồi
ADL112FD2 GGCTTAAGCTGACCCATTAT ADL112R ATCTCAAATGTAATGCGTGC
ADL268FD3 CTCCACCCCTCTCAGAACTA ADL268R CAACTTCCCATCTACCTACT
LEI094FD2 GATCTCACCAGTATGAGCTGC LEI094R TCTCACACTGTAACACAGTGC
LEI166FD3 CTCCTGCCCTTAGCTACGCA LEI166R TATCCCCTGGCTGGGAGTTT
23

LEI192FD4 TGCCAGAGCTTCAGTCTGT LEI192 GTCATTACTGTTATGTTTATTGC
LEI234FD2 ATGCATCAGATTGGTATTCAA LEI234R CGTGGCTGTGAACAAATATG
MCW014FD3 TATTGGCTCTAGGAACTGTC MCW014R GAAATGAAGGTAAGACTAGC
MCW037FD2 ACCGGTGCCATCAATTACCTATTA MCW037R GAAAGCTCACATGACACTGCGAAA
MCW067FD3 GCACTACTGTGTGCTGCAGTTT MCW067R GAGATGTAGTTGCCACATTCCGAC
MCW078FD2 CCACACGGAGAGGAGAAGGTCT MCW078R TAGCATATGAGTGTACTGAGCTTC
MCW081FD2 GTTGCTGAGAGCCTGGTGCAG MCW081R CCTGTATGTGGAATTACTTCTC
MCW098FD3 GGCTGCTTTGTGCTCTTCTCG MCW098R CGATGGTCGTAATTCTCACGT
MCW111FD3 GCTCCATGTGAAGTGGTTTA MCW111R ATGTCCACTTGTCAATGATG
MCW183FD4 ATCCCAGTGTCGAGTATCCGA MCW183 TGAGATTTACTGGAGCCTGCC
MCW206FD2 ACATCTAGAATTGACTGTTCAC MCW206R CTTGACAGTGATGCATTAAATG

MCW216FD4 GGGTTTTACAGGATGGGACG MCW216R AGTTTCACTCCCAGGGCTCG
MCW222FD3 GCAGTTACATTGAAATGATTCC MCW222R TTCTCAAAACACCTAGAAGAC
MCW248FD3 GTTGTTCAAAAGAAGATGCATG MCW248R TTGCATTAACTGGGCACTTTC
MCW295FD3 ATCACTACAGAACACCCTCTC MCW295R TATGTATGCACGCAGATATCC
MCW330FD2 TGGACCTCATCAGTCTGACAG MCW330R AATGTTCTCATAGAGTTCCTGC

24

Bảng 6. Thành phần phản ứng PCR của 4 phản ứng.
Mix 1 Mix 2 Mix 3 Mix 4 Thành phần
Mồi Thể
tích
(µl)
Mồi Thể
tích
(µl)
Mồi Thể
tích
(µl)
Mồi Thể tích
(µl)
12,5 12,5 12,5 12,5
ADL112 1 LEI094 0,75 ADL268 0,75 LEI166 1,0
LEI234 0,7 MCW078 1,25 LEI192 1,0 MCW081 1,0
MCW014 0,8 MCW111 1,0 MCW037 1,0 MCW248 0,8
MCW098 0,95 MCW183 1,0 MCW067 1,25 MCW330 1,2
MCW216 1,25 MCW222 1,0 MCW206 1,0 - -
PCR-Mas
MCW295 1,0 - - - - - -
DNA 1 1 1 1

H
2
O 0,1 2,5 2,5 2,5
Thể tích phản
ứng
25 25 25 25
Chu trình nhiệt 94
0
C/5’;
35x(94
0
C/45”,
55
0
C/1’, 72
0
C/1’);
72
0
C/10’
94
0
C/15’;
35x(94
0
C/45”,
57
0
C/1’, 72
0

C/1’);
72
0
C/10’
95
0
C/15’;
35x(94
0
C/1’,
58
0
C/1’, 72
0
C/1’);
72
0
C/10’
95
0
C/5’;
35x(94
0
C/1’,
60
0
C/1’30”,
72
0
C/1’); 72

0
C/10’
Sản phẩm PCR được phân tích phân đoạn trên máy giải trình tự gen CEQ8000.
 Xác định kích thước, tần số allele, sự đa dạng di truyền giữa các giống gà.
Kết quả được xử lý phần mềm FSTAT phiên bản 2,9,3 và phần mềm Genetic phiên
bản 4,03 (Belkhir, 2004) [43]. Tính tần số dị hợp tử mong đợi (Nei, 1987)[91]
()
2
1
2
1
21
k
i
i
n
Hx
n
−
⎡⎤
⎡⎤
=−
⎢⎥
⎢⎥
−
⎣⎦
⎣⎦
∑

Trong đó: n: số lượng các cá thể; x: tần số allele ở locus 1; k: số lượng các allele ở locus 1.

 Phương pháp Nei’s, 1972 [90]để vẽ cây phân loại.
⎥
⎥
⎥
⎥
⎥
⎥
⎦
⎤
⎢
⎢
⎢
⎢
⎢
⎢
⎣
⎡
⎥
⎦
⎤
⎢
⎣
⎡
⎥
⎦
⎤
⎢
⎣
⎡
−=

∑∑∑∑
∑∑
2
1
2
2
2
1
2
2
ln
mi
mi
m
lmi
mi
milmi
pp
pp
D


Trong đó: m số allele nghiên cứu, i là số allele của mỗi locus; P1mi: tần số allele thứ i ở
locus thứ m trong giống 1; P2mi: tần số allele thứ i ở locus thứ m trong giống 2.