Sản xuất thử nghiệm vắc xin vô hoạt phòng bệnh xuất huyết truyền nhiễm ở thỏ

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
DỰ ÁN SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC








BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ THỰC HIỆN CỦA DỰ ÁN

Tên dự án: "Sản xuất thử nghiệm vắcxin vô hoạt phòng bệnh
xuất huyết truyền nhiễm ở thỏ"
Mã số: DADL-2006/04
Lĩnh vực: Nông – Lâm – Ngư nghiệp.
Họ và tên Chủ nhiệm dự án: TS. Trần Thị Liên
Đơn vị chủ trì: Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương






7518
24/10/2009

Hà Nội, tháng 12 năm 2008
2
BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ THỰC HIỆN
I. THÔNG TIN CHUNG VỀ DỰ ÁN
1.Tên dự án: "Sản xuất thử nghiệm vắcxin vô hoạt phòng bệnh xuất huyết
truyền nhiễm ở thỏ".
Cấp quản lý : Nhà nước.
Thuộc chương trình : Dự án sản xuất thử nghiệm độc lập cấp Nhà nước.
2.Chủ nhiệm dự án: TS. Trần Thị Liên
3.Tổ chức chủ trì : Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương.
Địa chỉ: Đức Thượng – Hoài Đứ
c – Hà Nội
Số điện thoại: 04.33862381 - 04.33661562
4.Danh sách cán bộ tham gia chính (tên, học vị, chức danh, đơn vị công tác):
STT Họ và tên

Học vị Chức danh Cơ quan công tác

1 Trần Thị Liên Tiến sĩ Phó giám đốc Xí nghiệp thuốc thú y TƯ
2 Lê Minh Hồng Kỹ sư Giám đốc Xí nghiệp thuốc thú y TƯ
3
Nguyễn Thị
Minh Ước
Cử nhân Phó giám đốc Xí nghiệp thuốc thú y TƯ
4 Trần Danh Mạc Cử nhân Kế toán trưởng Xí nghiệp thuốc thú y TƯ
5
Nguyễn Đức
Thắng
Cử nhân

Trưởng phòng
cung tiêu
Xí nghiệp thuốc thú y TƯ
6 Cù Hữu Lương
Quản đốc phân
xưởng
Xí nghiệp thuốc thú y TƯ
7
Nguyễn Hồng
Minh
Thạc sĩ
Phó quản đốc
phân xưởng
Xí nghiệp thuốc thú y TƯ
8 Nguyễn Kim Lin Kỹ sư
Trung tâm nghiên cứu Dê
và thỏ Sơn Tây
9
Hoàng Minh
Thành
Kỹ sư
Trung tâm nghiên cứu Dê
và thỏ Sơn Tây

3
5.Thời gian thực hiện đã được phê duyệt:
Năm bắt đầu :2006 Năm kết thúc : 2008
6. Thời gian kết thúc thực tế (thời điểm nộp báo cáo kết quả): 31/12/2008
7. Kinh phí thực hiện dự án: 7.600 triệu đồng
Trong đó : Ngân sách sự nghiệp khoa học : 2.250,00 triệu đồng.

Vốn tự có của cơ quan chủ trì : 5.350,00 triệu đồng.
II. KẾT QUẢ THỰC HIỆN CỦA DỰ ÁN
1.K
ết quả nghiên cứu:
a. Hoàn thiện và ổn định các qui trình về giống virus
- Đánh giá, bổ sung các chỉ tiêu về giống virus.
+ Xác định đặc tính của giống.
Qua nhiều lần thí nghiệm, chúng tôi đã xác định được các đặc tính của giống
virus RHD như sau:
− Giống hoàn toàn vô trùng, không phát hiện bất kỳ một loại khuẩn lạc nào
trên các môi trường kiểm tra.
− Virus giống gây ngưng kết hồng cầu nhóm O của người, không gây ngưng
kết hồng cầu ngựa, bò, cừu hoặc hồng c
ầu người khác nhóm O.
− Khi gây nhiễm virus giống trên thỏ có những biểu hiện triệu chứng lâm
sàng và bệnh tích giống với thỏ bị nhiễm bệnh tự nhiên ở các ổ dịch.
+ Triệu chứng:Sốt, bỏ ăn, ủ rũ, thở gấp, thở ra bọt có nhiều dịch nhầy, có
dấu hiệu thần kinh, co giật, kêu rên, chảy nước mắt, nước mũi, xung huyết kết
mạ
c mắt.
+ Bệnh tích: Gan sưng to, xung huyết, thận sưng rất to, xung huyết, khí
quản, phổi xung huyết, nhiều dịch nhầy, một số cơ quan nội tạng xuất huyết.
Kết quả nghiên cứu về giống được tổng hợp trong bảng 1.
4
Bảng 1: Kết quả nghiên cứu về giống virus Xuất huyết truyền nhiễm thỏ.
Bệnh tích nội tạng thỏ được gây nhiễm
Lô thí
nghiệm
Số lượng
mẫu

HA
Gan Thận Lách Phổi Khí quản
1 5 +
2 5 +
3 5 +
4 5 +
5 5 +
Biến màu,
sưng to, xuất
huyết, các tiểu
thuỳ có hiện
tượng thoái
hoá
Sưng
to,
xung
huyết
Xung
huyết
Thuỷ
thũng,
xung
huyết
Có dịch nhầy,
thuỷ thũng
kèm theo xuất
huyết có bọt
khí
+ Xác định độc lực của giống.
Giống virus RHD ở dạng đông khô được pha loãng với dung dịch PBS vô

trùng thành dãy pha loãng từ 10
-1
- 10
-5
, mỗi nồng độ tiêm cho 10 thỏ khoẻ mạnh,
có độ tuổi từ 2 tháng trở lên, hiệu giá kháng thể kháng virus RHD trước khi tiêm
là âm tính, theo đường tiêm bắp, mỗi con 1 ml. Sau khi tiêm hàng ngày theo dõi
nhiệt độ và những biểu hiện lâm sàng của thỏ, thời gian theo dõi khoảng 6 ngày
Kết quả được ghi lại và tính toán theo công thức Reed & Muench xác định liều
gây chết thỏ 50% (LD
50
). Thí nghiệm được tiến hành lặp đi lặp lại nhiều lần. Kết
quả được chúng tôi thể hiện trên bảng 2.
Bảng 2. Kết quả xác định độc lực của giống.
Lô thí
nghiệm
Số thỏ thí
nghiệm (con)
Liều gây
nhiễm (ml)
Đường gây
nhiễm
Hiệu giá
(LD
50
/ 1ml)
1 50 1 10
4,0
2 50 1 10
3,6

3 50 1 10
3,8
4 50 1 10
3,7
5 50 1
Tiêm bắp
10
4,1
Hiệu giá trung bình 10
3,84
5
Qua bảng 2 chúng tôi xác định được hiệu giá trung bình của giống virus
RHD là 10
3.84
LD
50
/ 1 ml
+ Xác định tính kháng nguyên.
Virus giống RHD có tính kháng nguyên ổn định, qua nhiều lần tiếp đời
trên thỏ, virus giống RHD vẫn giữ được tính kháng nguyên , có tỷ lệ gây bệnh và
tử vong cao, gây ngưng kết hồng cầu người nhóm O. Sau khi vô hoạt đưa vào cơ
thể, vắcxin tạo miễn dịch nhanh và kéo dài.
+ Xác định hiệu giá ngưng kết hồng cầu người nhóm O
Phản ứng ngưng kết hồng cầu người nhóm O là phản ứng đầ
u tiên được
sử dụng để chẩn đoán bệnh Xuất huyết truyền nhiễm ở thỏ. Virus RHD chỉ gây
ngưng kết hồng cầu người nhóm O, còn các loại hồng cầu khác, virus gây ngưng
kết rất yếu hoặc không gây ngưng kết.
Qua các thí nghiệm, chúng tôi đã xác định hiệu giá ngưng kết với hồng
cầu người nhóm O cao của virus giống RHD là 1/4096.

- Kiểm tra sự ổn định về các đặ
c tính sinh học của giống trong những điều
kiện khác nhau.
Giống virus RHD được giữ ở hai dạng khác nhau: dạng tươi và dạng đông
khô, bảo quản ở nhiệt độ -85
0
C. Định kỳ 3, 6, 9, 12 tháng tiến hành kiểm tra các
đặc tính sinh học của chúng. Qua kiểm tra đều nhận thấy: Đối với giống tươi sau
6 tháng, giống đông khô sau 1 năm, vẫn ổn định và giữ nguyên các đặc tính sinh
học như hồ sơ giống gốc
- Lựa chọn phương pháp giữ giống.
Qua quá trình kiểm tra các đặc tính sinh học của giống trong những điều
kiện khác nhau, chúng tôi đã xác định được phương pháp giữ
giống tối ưu đó là:
+ Giống virus RHD giữ ở dạng đông khô
+ Giống bảo quản ở -85
0
C theo hệ thống lô giống gốc (Seed lot system)
+ Một năm cấy chuyển giống một lần
b. Hoàn thiện và ổn định quy trình sản xuất vắcxin
6
- Nuôi cấy virus.
+ Xác định nồng độ virus thích hợp khi gây nhiễm trên thỏ.
Giống virus RHD tươi hoặc đông khô được pha loãng với dung dịch PBS
vô trùng ở các độ pha loãng 1/5, 1/10, 1/20 sau đó tiêm cho 10 thỏ khỏe mạnh, có
độ tuổi ít nhất từ 2 tháng tuổi trở lên, mỗi thỏ 1 ml theo đường tiêm bắp (Trước
khi tiêm hiệu giá kháng thể của thỏ phải là âm tính). Sau khi tiêm hàng ngày theo
dõi nhiệt độ thỏ.
Kết quả thí nghiệm được trình bày trên bảng 3.
Bảng 3. Kế

t quả xác định nồng độ virus thích hợp khi gây nhiễm trên thỏ.
Số thỏ chết ở các thời điểm sau khi gây nhiễm
với các nồng độ pha loãng khác nhau (con)
Nồng độ
pha loãng
virus
Số lượng thỏ gây
nhiễm
(con)
24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ
1/5 10 0 7 3 0
1/10 10 0 4 4 2
1/20 10 0 0 2 8

Qua bảng 3, chúng tôi nhận thấy ở nồng độ pha loãng virus 1/5, thỏ nung
bệnh và chết tập trung ở thời điểm 48 – 72 giờ (10/10 con). Ở nồng độ pha loãng
virus 1/10 thỏ nung bệnh chết ở 48 – 96 giờ sau gây nhiễm. Còn ở nồng độ 1/20,
thỏ chết chủ yếu ở 96 giờ sau gây nhiễm.
Căn cứ lý lịch giống gốc, chúng tôi đã xác định được nồng độ pha loãng
virus 1/5 và tiêm mỗi thỏ 1 ml theo đường tiêm b
ắp là thích hợp nhất.
+ Xác định thời điểm thích hợp để thu hoạch virus
Chúng tôi bố trí 5 lô thí nghiệm, mỗi lô 10 thỏ, mỗi thỏ được tiêm 1ml
giống virus RHD được pha với dung dịch PBS vô trùng tỷ lệ 1/5 theo đường tiêm
bắp. Sau khi tiêm theo dõi nhiệt độ thỏ, những con bị chết được mổ thu hoạch nội
7
tạng như gan, thận, lá lách, phổi và kiểm tra hiệu giá virus ở các cơ quan đó. Kết
quả được trình bày trên bảng 4.
Bảng 4. Kết quả xác định hiệu giá virus ở một số cơ quan nội tạng của thỏ
sau khi chết ở thời điểm 48 giờ và 72 giờ.

Hiệu giá virus trung bình ở các cơ quan nội tạng (HA)
Gan Lá lách Thận Phổi
Lô thí
nghiệm
48 giờ 72 giờ 48 giờ 72 giờ 48 giờ 72 giờ 48 giờ 72 giờ
1 1/4096 1/2048 1/512 1/256 1/2048 1/2048 1/256 1/64
2 1/4096 1/4096 1/256 1/128 1/2048 1/1024 1/512 1/128
3 1/4096 1/2048 1/512 1/128 1/2048 1/2048 1/512 1/128
4 1/2048 1/1024 1/512 1/64 1/4096 1/4096 1/1024 1/256
5 1/4096 1/2048 1/512 1/128 1/4096 1/4096 1/1024 1/128

Qua bảng 4, chúng tôi nhận thấy:
- Gan là cơ quan có hàm lượng virus cao nhất, sau đó là thận, lá lách và
phổi có hàm lượng virus thấp hơn.
- Những thỏ chết ở 48-72 giờ có hàm lượng virus tương đương nhau.
Như vậy, chúng tôi đã xác định được nội tạng thu hoạch để làm vắcxin là
gan và thận và thời điểm thích hợp nhất thu hoạch làm vắcxin là những thỏ chết
từ 48 - 72 giờ sau khi gây nhiễm.
+ Xây dựng phương pháp ti
ếp đời trên thỏ.
Giống virus RHD dùng làm giống gốc hoặc giống sản xuất được tiếp đời
định kỳ trên thỏ như đã nêu ở trên.
Khi tiếp đời lựa chọn thỏ khoẻ mạnh, có trọng lượng từ 1,8 - 2 kg, chỉ
chọn những thỏ có hiệu giá kháng thể đối với virus RHD âm tính để gây nhiễm
virus giống. Sau khi gây nhiễm 48 - 72 giờ, những thỏ chết được mổ thu hoạch
8
gan, thận và kiểm tra các đặc tính về giống sau đó đông khô và bảo quản ở nhiệt
độ -85
0
C.

- Vô họat kháng nguyên và bổ sung chất bổ trợ.
Trên cơ sở sản xuất các lô vắcxin thử nghiệm trong ba năm 2006 - 2008,
chúng tôi đã xác định được hoá chất, nồng độ hoá chất để vô hoạt kháng nguyên,
xác định được dung môi bổ trợ, nồng độ dung môi để bổ xung vào vắc xin:
+ Dung dịch Formalin là hoá chất thích hợp nhất để vô hoạt virus RHD.
+ Nồng độ Formalin 0,2% ở nhiệt độ 37
0
C trong thời gian 72 giờ được
khuấy liên tục trên máy khuấy từ sẽ có khả năng làm vô hoạt hoàn toàn virus
RHD nhưng vẫn giữ được tính kháng nguyên của nó.
+ Chất bổ trợ: Keo phèn được sản xuất tại Xí nghiệp thuốc thú y TU là
chất bổ trợ thích hợp đối với vacxin RHD, loại keo phèn này đã được sử dụng để
bổ sung vào vacxin
Tiêu chuẩn hạt keo bao gồm:
Hàm lượng clorua không vượt quá 0,3%
Hàm lượng sunfat không vượt quá 0,2 – 0,3%
Hàm lượng kim loại nặng không vượt quá một phần vạn
Hàm lượng sắt không vượt quá 0,03%
Độ pH từ 6,8 – 7,2
Sức hút có độ hấp phụ màu là đỏ Congo 0,077%
Hàm lượng Al
2
O
3
phải đạt từ 4,2 – 5,6%
+ Tỷ lệ chất bổ trợ keo phèn trong vắcxin là 15%.
+ Kiểm tra độ an toàn của chất bổ trợ keo phèn (Al(OH)
3
) trên thỏ, chuột
lang và chuột bạch cho thấy: chất bổ trợ keo phèn rất an toàn đối với cả 3 loại

động vật trên. Theo dõi sau 14 ngày số động vật trên đều khỏe mạnh, phát triển
bình thường.
c. Hoàn thiện và ổn định quy trình kiểm nghiệm vắcxin.
- Kiểm tra độ vô hoạt của virus trong vắcxin
Huyễn dịch virus RHD sau khi được vô hoạt bằng Formalin 0,2% ở 37
0
C/
72 giờ đã được lấy mẫu và tiến hành kiểm tra độ vô hoạt trên thỏ.
9
Chọn 10 thỏ khoẻ mạnh, trọng lượng 1,8 - 2 kg, có hiệu giá kháng thể âm
tính với virus RHD, tiêm mỗi con 2 ml huyễn dịch virus RHD vô hoạt, 10 thỏ đối
chứng không tiêm, theo dõi thỏ 14 ngày.
Kết quả kiểm tra vô hoạt của các lô vắc xin thử nghiệm trong 3 năm 2006
– 2008 được thể hiện trên bảng 5
Bảng 5. Kết quả kiểm tra vô hoạt các lô vắc xin RHD thử nghiệm trong ba
năm từ 2006 – 2008.
Số thỏ sống sau khi theo dõi 14 ngày
STT Lô vắc
xin RHD
Ngày
kiểm tra
Lô thí nghiệm
(con)
Lô đối chứng
(con)
Kết quả
1
01 29.03.06 10/10 10/10 Đạt
2
02 10.04.06 10/10 10/10 Đạt

3
03 27.04.06 10/10 10/10 Đạt
4
04 14.05.06 10/10 10/10 Đạt
5
05 18.06.06 10/10 10/10 Đạt
6 06 21.07.06 10/10 10/10 Đạt
7
07 21.08.06 10/10 10/10 Đạt
8
08 15.09.06 10/10 10/10 Đạt
9
09 30.10.06 10/10 10/10 Đạt
10
10 20.11.06 10/10 10/10 Đạt
11
11 27.01.07 10/10 10/10 Đạt
12 12 11.02.07 10/10 10/10 Đạt
13 13 21.03.07 10/10 10/10 Đạt
14 14 23.05.07 10/10 10/10 Đạt
15 15 02.07.07 10/10 10/10 Đạt
16 16 10/10 10/10 Đạt
17 17 10/10 10/10 Đạt

Từ kết quả bảng 5 cho thấy: Qua kiểm tra 17 lô vắc xin RHD thử nghiệm
sản xuất trong ba năm từ 2006 – 2008 với quy trình xử lý hoá chất như trên, các
10
lô vắc xin đã sản xuất đều cho kết quả kiểm tra vô hoạt. Tất cả số thỏ kiểm tra (cả
thí nghiệm, cả đối chứng) đều khoẻ mạnh, phát triển bình thường, không có bất
kỳ biểu hiện lâm sàng nào của bệnh RHD.

- Kiểm tra vô trùng vắcxin RHD
Các lô vắc xin RHD đã sản xuất trong 3 năm (2006 – 2008) đều được
kiểm tra vô trùng theo quy trình như sau:
+ Lấy mẫu
Vắcxin được lấy m
ẫu theo TCN 160-92 "Vắcxin thú y - Quy trình lấy mẫu
và sử dụng mẫu trong kiểm nghiêm". Mỗi lô vắcxin lấy 1% số thành phẩm của
mỗi lô (Tối thiểu 3 mẫu, tối đa 10 mẫu).
+ Kiểm tra vi trùng
− Cấy huyễn dịch vắc xin vào các môi trường qui định (Thạch máu,
nước thịt, nước thịt gan yếm khí, thạch nấm), mỗi loại môi trường cấy 2 ống. Các
môi trường ở trên được chế theo qui định thông dụ
ng để phát hiện các vi khuẩn
dung huyết, hiếu khí, yếm khí và nấm có trong vắcxin.
− Lượng vắcxin cấy kiểm tra bằng 1 đến 2 % dung tích môi trường.
− Môi trường đã cấy kiểm tra đem bồi dưỡng trong tủ ấm 37
0
C, theo dõi
7 ngày. Riêng môi trường nấm để ở nhiệt độ phòng (25 - 30
0
C).
Kết quả kiểm tra vô trùng các lô vắc xin thử nghiệm được thể hiện trên
bảng 6.
11
Bảng 6. Kết quả kiểm tra vô trùng các lô vắc xin RHD sản xuất trong 3 năm
từ 2006 - 2008
Kết quả kiểm tra
Năm
Số lô vắc
xin

Ngày kiểm
tra
Thạch
máu
Thạch
nấm
Nước
thịt
Yếm
khí
1
01 29.03.06
⎯ ⎯ ⎯ ⎯
2
02 10.04.06
⎯ ⎯ ⎯ ⎯
3
03 27.04.06
⎯ ⎯ ⎯ ⎯
4
04 14.05.06
⎯ ⎯ ⎯ ⎯
5
05 18.06.06
⎯ ⎯ ⎯ ⎯
6
06 21.07.06
⎯ ⎯ ⎯ ⎯
7
07 21.08.06

⎯ ⎯ ⎯ ⎯
8
08 15.09.06
⎯ ⎯ ⎯ ⎯
9
09 30.10.06
⎯ ⎯ ⎯ ⎯
10
10 20.11.06
⎯ ⎯ ⎯ ⎯
11
11 27.01.07
⎯ ⎯ ⎯ ⎯
12
12 11.02.07
⎯ ⎯ ⎯ ⎯
13
13 21.03.07
⎯ ⎯ ⎯ ⎯
14
14 23.05.07
⎯ ⎯ ⎯ ⎯
15
15 11.07.07
⎯ ⎯ ⎯ ⎯
16
16
⎯ ⎯ ⎯ ⎯
17
17

⎯ ⎯ ⎯ ⎯
(-): Âm tính – không có khuẩn lạc mọc.
Kết quả kiểm tra cho thấy: Cả 17 lô vắc xin RHD sản xuất trong ba năm
(2006 – 2008) đều cho kết quả vô trùng, không có bất kỳ một khuẩn lạc hay nấm
nào mọc trên các môi trường kiểm tra.
- Kiểm tra an toàn trên thỏ.
Các lô vắc xin RHD đươch kiểm tra an toàn theo quy trình như sau:
12
Chọn 10 thỏ khoẻ mạnh, trọng lượng 1,8 - 2 kg, có hiệu giá kháng thể âm
tính với virus RHD, tiêm mỗi con 3 liều vắcxin sử dụng (3 ml) theo đường tiêm
bắp, 10 con đối chứng không tiêm. Tất cả số thỏ được theo dõi trong 21 ngày.
Kết quả được thể hiện trên bảng 7
Bảng 7. Kết quả kiểm tra an toàn các lô vắc xin RHD thành phẩm sản xuất
trong ba năm (từ 2006 – 2008)
STT
Lô vắc
xin
RHD
Ngày
kiểm tra
Lượng
vắc xin
sử dụng
(liều)
Đường
tiêm
Số lượng
thỏ kiểm
tra
(con)

Số lượng
thỏ đối
chứng
(con)
Kết quả
1 01 30.03.06 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn
2 02 11.04.06 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn
3 03 28.04.06 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn
4 04 15.05.06 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn
5 05 19.06.06 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn
6 06 22.07.06 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn
7 07 22.08.06 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn
8 08 16.09.06 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn
9 09 31.10.06 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn
10 10 21.11.06 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn
11 11 28.01.07 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn
12 12 12.02.07 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn
13 13 22.03.07 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn
14 14 24.05.07 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn
15 15 12.07.07 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn
16 16 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn
17 17 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn
13
Qua bảng 7 cho thấy, cả 17 lô vắc xin RHD được kiểm tra an toàn theo
quy trình trên đều cho kết quả an toàn, thỏ hoàn toàn khoẻ mạnh, phát triển bình
thường khi sử dụng 3 liều vắc xin theo đường tiêm bắp.
Như vậy, cả 17 lô vắc xin RHD sản xuất trong ba năm (2006 – 2008) đều
đạt tiêu chuẩn an toàn.
- Kiểm tra hiệu lực
Tất cả các lô vắcxin được kiểm tra hiệu lực theo quy trình như sau.

Lô thí nghiệm: Chọn 10 thỏ ít nhất 2 tháng tuổi, khoẻ
mạnh, có hiệu giá
kháng thể âm tính với virus RHD, mỗi thỏ tiêm 1 liều vắcxin sử dụng (1 ml) theo
đường tiêm bắp.
Lô đối chứng: 10 thỏ cùng nguồn gốc với lô thí nghiệm không tiêm làm
đối chứng.
Tất cả số thỏ của lô thí nghiệm và lô đối chứng sau 3 tuần được công
cường độc theo đường tiêm bắp, mỗi con 1 liều virus RHD cường độc chứa ít
nhất 100 LD
50
.
Toàn bộ số thỏ được theo dõi trong 14 ngày.
Kết quả kiểm tra hiệu lực các lô vắc xin thành phẩm sản xuất trong ba
năm 2006 - 2008 được thể hiện trên bảng 9.
14
Bảng 9. Kết quả kiểm tra hiệu lực các lô vắc xin RHD thành phẩm sản xuất
trong ba năm (2006 – 2008)

Như vậy, tất cả số thỏ được tiêm vắcxin đều sống khoẻ, phát triển bình
thường, không có bất kỳ triệu chứng lâm sàng và bệnh tích nào của bệnh RHD.
Thỏ đối chứng không tiêm vắcxin có tỷ lệ chết từ 80 – 100 %.
So sánh với tiêu chuẩn của OIE, chúng tôi nhận thấy các lô vắcxin chúng
tôi kiểm tra
đều đạt kết quả hiệu lực.
Kết quả theo dõi
Lô thí
nghiệm
Lô đối
chứng
STT

Lô
vắc
xin
RHD
Ngày
kiểm
tra
Ngày
công
cường
đôc
S C
S C
Kết quả
1 01 30.03.06 20.04.06 10/10 0/10 1/10 9/10 Đạt
2 02 11.04.06 02.5.06 10/10 0/10 2/10 8/10 Đạt
3 03 28.04.06 19.05.06 10/10 0/10 0/10 10/10 Đạt
4 04 15.05.06 05.06.06 10/10 0/10 0/10 10/10 Đạt
5 05 19.06.06 10.07.06 10/10 0/10 1/10 9/10 Đạt
6 06 22.07.06 12.08.06 10/10 0/10 1/10 9/10 Đạt
7 07 22.08.06 12.09.06 10/10 0/10 2/10 8/10 Đạt
8 08 16.09.06 07.10.06 10/10 0/10 2/10 8/10 Đạt
9 09 31.10.06 21.11.06 10/10 0/10 1/10 9/10 Đạt
10 10 21.11.06 12.12.06 10/10 0/10 1/10 9/10 Đạt
11 11 28.01.07 18.02.07 10/10 0/10 2/10 8/10 Đạt
12 12 12.02.07 05.03.07 10/10 0/10 1/10 9/10 Đạt
13 13 22.03.07 12.04.07 10/10 0/10 1/10 9/10 Đạt
14 14 24.05.07 14.06.07 10/10 0/10 1/10 9/10 Đạt
15 15 12.07.07 02.08.07 10/10 0/10 1/10 9/10 Đạt
16 16

17 17
15
- Xác định độ dài miễn dịch của thỏ sau khi được tiêm vắcxin.
Chọn 40 thỏ khoẻ mạnh, ít nhất 2 tháng tuổi có hiệu giá kháng thể âm tính
đối với virus RHD, tiêm mỗi con 1 liều (1 ml) vắcxin sử dụng theo đường tiêm
bắp hoặc tiêm dưới da. Sau khi tiêm kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng virus
RHD bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) tại các thời điểm khác
nhau.
Kết quả được thể hi
ện trên bảng 10.
Bảng 10. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của thỏ ở các thời điểm sau
khi tiêm vắcxin.
Thời điểm kiểm tra sau khi tiêm
(tuần)
Hiệu giá kháng thể trung
bình
(log
2
)
Tỷ lệ bảo hộ
(%)
2 7,8 100
4 9,3 100
6 9,97 100
8 10,6 100
10 11,5 100
12 11 100
14 10,5 100
16 9,7 100
18 8,6 100

20 6,2 75
22 5,4 50
24 5,1 40

Qua các thí nghiệm cho thấy độ dài miễn dịch của thỏ kéo dài đến 24 tuần
(6 tháng) sau khi tiêm vắcxin. Tuy nhiên, ở thời điểm 24 tuần hiệu giá kháng thể
16
trung bình và tỷ lệ bảo hộ thấp. Ở giai đoạn này, thỏ dễ bị tác động của virus
RHD ngoài môi trường. Do vậy, cần phải tiêm phòng vắcxin RHD cho thỏ vào
thời điểm này để thỏ có đủ kháng thể kháng lại virus RHD.
d. Hoàn thiện và ổn định quy trình sử dụng và bảo quản vắcxin.
- Khẳng định lại độ tuổi và thời gian tiêm phòng vắcxin
Chúng tôi tiến hành kiểm tra kháng thể của những th
ỏ con đẻ ra từ thỏ mẹ
đã được tiêm phòng vắcxin RHD ở các lứa tuổi khác nhau.
− Nhóm 1: 10 thỏ 1 tháng tuổi.
− Nhóm 2: 10 thỏ 1,5 tháng tuổi.
− Nhóm 3: 10 thỏ 2 tháng tuổi.
Các nhóm thỏ được lấy máu ở các thời điểm 0 ngày, 5 ngày, 10 ngày, 15
ngày, chắt huyết thanh và kiểm tra kháng thể thụ động. Kết quả kiểm tra được thể
hiện trên bảng 11.
Bảng 11. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể thụ
động kháng virus RHD
trong huyết thanh của thỏ.
Hiệu giá kháng thể trung bình của các nhóm thỏ thí nghiệm
Thời điểm
kiểm tra
(ngày)
Nhóm 1 Nhóm 2 Nhóm 3
0 7,2 log

2
5,8 log
2
4,5 log
2

5 6,6 log
2
5,4 log
2
4,2 log
2

10 6,2 log
2
4,6 log
2
3,6 log
2

15 5,7 log
2
4,4 log
2
3,2 log
2

Qua theo dõi, chúng tôi nhận thấy hiệu giá kháng thể trung bình của cả 3
nhóm thỏ đều giảm dần qua các thời điểm kiểm tra. Thỏ ở 1 tháng tuổi có hiệu
giá kháng thể trung bình là 7,2 log

2
, sau đó giảm dần đến 1,5 tháng tuổi là 5,7 -
5,8 log
2
và đến 2,5 tháng tuổi chỉ còn 3,2 log
2
.
Theo kết quả bảng 10, chúng tôi đã xác định được hiệu giá kháng thể của
thỏ là 6,2 log
2
có tỷ lệ bảo hộ là 75%, 5,4 log
2
là 50%. Như vậy, vào thời điểm
17
1,5 tháng tuổi, hàm lượng kháng thể thụ động của đã giảm, một số thỏ đã không
còn đủ khả năng chống đỡ lại virus RHD khi virus xâm nhập vào cơ thể.
Do đó, chúng tôi đã xác định được thời gian tiêm mũi vắcxin RHD đầu
tiên cho thỏ con từ 1,5 - 2 tháng tuổi để thỏ kịp thời có đáp ứng miễn dịch kháng
lại virus RHD.
- Khẳng định lại đường tiêm, liều tiêm vắcxin cho th
ỏ
+ Khẳng định lại liều tiêm vắcxin cho thỏ.
Bố trí 4 lô thỏ thí nghiệm, mỗi lô 10 con thỏ khoẻ mạnh, 2 tháng tuổi.
+ Lô thí nghiệm 1: Tiêm 0,5 ml vắcxin sử dụng theo đường tiêm bắp.
+ Lô thí nghiệm 2: Tiêm 1 ml vắcxin sử dụng theo đường tiêm bắp.
+ Lô thí nghiệm 3: Tiêm 1,5 ml vắcxin sử dụng theo đường tiêm bắp.
+ Lô thí nghiệm 4: Không tiêm vắcxin làm đối chứng.
Sau 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày, 28 ngày, lấy máu kiểm tra kháng thể kháng
RHD. Kết quả được thể hiện trên bảng 12
Bảng 12. Hiệu giá kháng thể trung bình của thỏ sau khi tiêm với các liều

tiêm khác nhau
Hiệu giá kháng thể trung bình ở các thời điểm kiểm tra
Lô thí nghiệm
7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày
Lô thí nghiệm 1
(tiêm 0,5 ml)
5,2 5,6 6 7
Lô thí nghiệm 2
(tiêm 1 ml)
7 7,4 9,2 9,4
Lô thí nghiệm 3
(tiêm 1,5 ml)
7,2 7,6 9,2 9,6
Lô thí nghiệm 4
(Không tiêm)
3 3,3 3 2,8

18
Qua bảng 12 cho thấy với liều tiêm là 0,5 ml vắcxin sử dụng, hàm lượng
kháng thể của thỏ sau 28 ngày vẫn chưa đạt mức bảo hộ 100%. Còn ở lô thí
nghiệm 2 và 3 sau 7 ngày tiêm vắcxin thỏ đã đủ lượng kháng thể bảo hộ kháng
lại virus RHD. Nhưng để tính hiệu quả kinh tế và tránh gây sốc cho thỏ khi tiêm
vắcxin, chúng tôi đã xác định liều tiêm thích hợp cho thỏ là 1 ml.
+ Khẳng định lại đường tiêm vắcxin cho thỏ
Khi xác định được liều tiêm thích hợp, chúng tôi tiếp tục bố trí 2 lô thỏ thí
nghiệm, mỗi lô 10 con thỏ khoẻ mạnh, ít nhất hai tháng tuổi, trọng lượng 1,8 - 2
kg.
Lô thí nghiệm 1 tiêm 1 ml vắcxin sử dụng theo đường tiêm dưới da cổ.
Lô thí nghiệm 2 tiêm 1 ml vắcxin sử dụng theo đường tiêm bắp.
Sau 7, 14, 21, 28 ngày tiến hành lấy máu chắt lấy huyết thanh và kiểm tra

kháng thể kháng virus RHD.
Kết quả được thể hiện trên bảng 13.
Bảng 13. Hiệu giá kháng thể trung bình c
ủa thỏ sau khi tiêm theo các đường
tiêm khác nhau
Hiệu giá kháng thể trung bình ở các thời điểm kiểm tra
Lô thí nghiệm
7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày
Lô thí nghiệm 1
(tiêm dưới da cổ)
7,2 8,2 8,6 9,4
Lô thí nghiệm 2
(tiêm bắp)
7 7,8 8,4 9

Qua hai thí nghiệm đều cho thấy sau 7 ngày tiêm vắcxin lượng kháng thể
trung bình của hai lô thỏ thí nghiệm đã đạt mức bảo hộ 100%.
Do vậy, chúng tôi đã xác định đường tiêm vắcxin thích hợp cho thỏ là
tiêm dưới da cổ hoặc tiêm bắp.
- Theo dõi thỏ sau khi tiêm vắcxin.
19
Sau khi được tiêm vắcxin RHD với liều và đường tiêm đã khẳng định, thỏ
được theo dõi trong vòng 3 tuần. Tất cả thỏ đều khoẻ mạnh, phát triển bình
thường, không có con nào có biểu hiện lâm sàng của bệnh RHD.
- Khẳng định nhiệt độ và thời gian bảo quản vắcxin
Vắcxin RHD là vắcxin vô hoạt có chất bổ trợ là keo phèn (Al(OH)
3
), do
đó vắcxin phải được bảo quản ở nhiệt độ 2 - 8
0

C, không được làm đông đá.
Cứ sau 3 tháng, 6 tháng, 9 tháng và 12 tháng, các lô vắc xin được lấy mẫu
và kiểm tra hiệu lực theo quy trình. Kết quả được trình bày trên bảng 14.
Bảng 14. Kết quả xác định tính bền vững của vắcxin Xuất huyết truyền
nhiễm thỏ bảo quản ở nhiệt độ 2-8
o
C.
LôTN
Thời gian bảo quản
(tháng)
Số lượn
g
mẫu kiểm tra
(n)
Tỷ lệ bảo hộ
(%)
0 5 100
3 5 100

6 5 100
9 5 95
I
12 5 90
0 5 100
3 5 100

6 5 100
9 5 100
II
12 5 95

0 5 100
3 5 100

6 5 100
9 5 95
III
12 5 90
20
Qua bảng 14 cho thấy, sau 1 năm bảo quản ở nhiệt độ 2 - 8
0
C, vắcxin vẫn
tạo miễn dịch cho thỏ và có tỷ lệ bảo hộ 90 - 95%. Theo tiêu chuẩn OIE, vắc xin
vẫn đạt tiêu chuẩn hiệu lực.
Như vậy, chúng tôi đã xác định được hạn sử dụng vắcxin là 12 tháng kể từ
khi xuất xưởng.
e. Thử nghiệm vácxin tại cơ sở.
Là một dự án được triển khai nghiên cứu và sản xuất ngay trong điều kiện
sản xuấ
t của Xí nghiệp thuốc thú y Trung Ương. Vì vậy việc nghiên cứu phải gắn
liền với phục vụ sản xuất cũng như nhu cầu kinh doanh của Xí nghiệp, do đó
vácxin sau khi sản xuất sẽ được kiểm tra chất lượng ngay tại Xí nghiệp và cũng
đã gửi mẫu các lô vắcxin đại diện kiểm nghiệm tại Trung tâm kiểm nghiệm
Trung ương 1.
Chúng tôi cũng đã cho thử nghiệm vácxin ngay trên trại th
ỏ của Xí nghiệp
và thử nghiệm ở một số cơ sở nuôi thỏ khác theo một quy trình sử dụng như sau:
+ Tiêm miễn dịch vácxin 2 lần cho thỏ, mỗi lần 1 liều.
+ Lần đầu khi thỏ được 2 hoặc 3 tháng tuổi. Lần thứ 2 nhắc lại sau 2
tuần.
+ Vị trí tiêm: Bắp đùi hoặc vùng dưới da ở cổ.

Việc thử nghiệm vácxin trên đàn thỏ
của Xí nghiệp được tiến hành từ năm
2005 - 2008 cho kết quả tốt, đàn thỏ được sử dụng vácxin đều khoẻ mạnh, sinh
sản và phát triển bình thường.
Ngoài việc thử nghiệm tại Xí nghiệp, chúng tôi đã thử nghiệm ở một số
địa điểm nuôi thỏ thường xuyên có dịch bệnh này xảy ra như: Thị trấn Phùng
huyện Đan phượng – Hà Tây, huyện Phú Bình tỉnh Thái Nguyên, Trung tâm
nghiên cứ
u dê thỏ Sơn Tây,Viện kiểm nghiệm thuốc thuộc Viện vệ sinh dịch tễ
Hà nội, trại dê thỏ An Việt thuộc tỉnh Bình Phước,… Các cơ sở đã sử dụng
vácxin Xuất huyết truyền nhiễm thỏ đều cho biết bệnh không xảy ra và đàn thỏ
sinh trưởng phát triển bình thường.
Kết quả thử nghiệm vắcxin Xuất huyết trên đàn thỏ ở một s
ố cơ sở được
trình bày ở bảng 15:
21
Bảng 15: Kết quả thử nghiệm vácxin tại một số cơ sở.
Địa điểm và thời gian sử dụng
vácxin
Số lượng
con
Tuổi sử
dụng
Liều sử
dụng
Kết quả
an toàn
2006 200 >3 tháng 1 ml An toàn
2007 220 >3 tháng 1 ml An toàn
Trại thỏ thí nghiệm

(Xí nghiệp thuốc thú y
Trung Ương)
2008 300 >3 tháng 1 ml An toàn
Viện kiểm nghiệm thuốc
(Viện Vệ sinh dịch tễ)
300 >3 tháng 1 ml An toàn
Trại dê thỏ An Việt
(Chơn Thành – Bình Phước)
5.000 >3 tháng 1 ml An toàn
Trịnh Văn Huân
(Kim Bảng – Hà Nam)
1000 >3 tháng 1 ml An toàn
Tân Đức – Thái Nguyên (ông Phú
và ông Tài)
210 2 tháng 1 ml An toàn
Thị trấn Phùng – Hoài Đức
(Chị Mơ)
150 > 3 tháng 1 ml An toàn
Trung tâm dê và thỏ Sơn Tây 1000 > 3 tháng 1 ml An toàn
Trạm thú y huyện Ba Vì 1000
2 – 3
tháng
1 ml An toàn
Tổng cộng 9.380

22
* Kết luận

- Giống dùng để sản xuất vácxin Xuất huyết truyền nhiễm thỏ trong dự án
thử nghiệm là giống virus Xuất huyết truyền nhiễm ở thỏ, giống được sản xuất

theo hệ thống lô giống Seed lot system dưới dạng tươi hoặc đông khô, bảo quản
giống ở nhiệt độ 85
0
C. Giống hoàn toàn vô trùng, có hiệu giá từ 1/4096 trở lên
- Thời gian gây chết thỏ và có hiệu giá virus cao nhất là 48 - 72 giờ.
- Hàm lượng virus nhiều nhất là tổ chức gan và thận.
- Dung dịch Formalin 0,2% là thích hợp nhất để vô họat virus trong vắcxin.
- Vắcxin an toàn tuyệt đối khi sử dụng 3 liều đối với thỏ.
- Vắcxin đạt tiêu chuẩn vô trùng, an toàn, hiệu lực khi kiểm nghiệm trên
thỏ.
- Vắcxin xuất huyết truyền nhiễm thỏ đã đượ
c thử nghiệm tại một số cơ sở
chăn nuôi đều cho kết quả tốt.
2. Ý nghĩa khoa học của kết quả nghiên cứu
- Đã xác định được các đặc tính sinh học của chủng virus giống xuất huyết
truyền nhiễm thỏ.
- Xây dựng được quy trình giữ giống, bảo quản và sử dụng giống trong
sản xuất vắc xin.
- Xây dựng được quy trình sản xuấ
t vắc xin xuất huyết truyền nhiễm ở thỏ
với quy mô lớn (4 – 8 triệu liều vắc xin/ 3 năm).
- Xây dựng được quy trình kiểm nghiệm vắc xin xuất huyết truyền nhiễm
ở thỏ.
- Xây dựng được quy trình bảo quản, sử dụng vắc xin xuất huyết truyền
nhiễm ở thỏ.
3. Ý nghĩa thực tiễn và khả năng ứng dụng kết quả khoa học.
Sau khi d
ự án thành công, Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương đã hoàn
thiện được quy trình sản xuất vắc xin xuất huyết truyền nhiễm ở thỏ từ khâu
giống đến khâu hoàn thiện sản phẩm cuối cùng. Trên cơ sở đó, Xí nghiệp sẽ mở

rộng quy mô sản xuất với số lượng lớn đáp ứng đầy đủ nhu cầu về vắc xin phòng
23
bệnh xuất huyết truyền nhiễm cho đàn thỏ trong cả nước với chất lượng cao đảm
bảo các chỉ tiêu kỹ thuật của Nhà nước.
III. TÌNH HÌNH TỔ CHỨC THỰC HIỆN DỰ ÁN
1. Tổ chức thực hiện
a. Thuận lợi:
Cơ quan chủ trì dự án là cơ sở chuyên sản xuất và cung cấp các loại
vacxin thú y cho gia súc, gia cầm với thiết bị công nghệ hiện đại, độ
i ngũ cán bộ,
công nhân lành nghề, cơ sở vật chất kỹ thuật hiện có tương đối đầy đủ, năng lực
khoa học, kỹ thuật về sản xuất vắc xin chuyên sâu nên việc thực hiện dự án có rất
nhiều thuận lợi.
b. khó khăn.
Tuy nhiên thời điểm thực hiện dự án tiến hành khi dịch cúm gia cầm
hoành hành do đó việc ấp nở vịt con bị c
ấm, số lượng đàn vịt bị giảm do đó làm
ảnh hưởng đến khả năng tiêu thụ sản phẩm, số lượng sản phẩm tiêu thụ chưa đạt
với yêu cầu mong muốn của cơ quan chủ trì dự án.
2. Sử dụng kinh phí.
Dự án sản xuất thử nghiệm vắc xin xuất huyết truyền nhiễm ở thỏ thuộc
chương trình Dự án sản xuấ
t thử nghiệm độc lập cấp Nhà Nước có thu hồi 60%
kinh phí hỗ trợ. Thời gian thực hiện Dự án trong 3 năm : 2006-2008. Tổng số
kinh phí dự án được cấp và đã sử dụng trong ba năm như sau:
24

2006 – 2007
(triệu đồng)
2008

(triệu đồng)
Tổng 3 năm
(triệu đồng)
Kinh phí đã sử dụng 1.895,84 230,47 2.126,31
- Hỗ trợ công nghệ 399,96 50,04 450,00
- Chi phí lao động 426,62 53,38 480,00
- Nguyên vật liệu, năng lượng 1.048,28 115,94 1164,22
- Chi khác 20,98 11,11 32,09
Kinh phí chưa sử dụng 104,16 19,53 123,69
- Nguyên vật liệu 23,272 0 23,272
- Xăng dầu 0,008 0 0,008
- Chi phí đào tạo công nhân 8,89 1,11 10,00
- Hội thảo chuyên đề 13,33 0 13,33
- Chi phí nghiệm thu 13,33 10,07 23,40
- Chi khác 3,77 3,77
- Quản lý phí 4,58 4,58
Sản phẩm của dự án
2006 - 2007 2008 Tổng ba năm
Vắc xin thành phẩm (liều) 5.054.000 858.000 5.858.000
Doanh thu (đồng) 332.751.000 148.486.500 481.237.500
3. Các trang thiết bị được mua sắm từ kinh phí của dự án:
Trong quá trình thực hiện dự án, Xí nghiệp đã sửa chữa và nâng cấp được
một số trang thiết bị như sau:
25
+ Xí nghiệp đã xây dựng và và hoàn thiện mô hình nuôi thỏ sạch để cung
cấp thỏ làm nguyên liệu cho sản xuất và phục vụ kiểm nghiệm vắcxin vô hoạt
Xuất huyết truyền nhiễm .
+ 01 phòng thí nghiệm để mổ thỏ sau gây nhiễm virus.
+ Đã đầu tư được một số thiết bị, máy móc để phục vụ cho việc sản xuất
vacxin xuất huyết truyền nhiễm ở thỏ nh

ư:
− 01 máy xiết nút nhôm bán tự động,
− 01 máy bơm chân không,
− 01 cối xay để nghiền gan, thận trong sản xuất vacxin,
− 01 hộp phin lọc cấp 2 HEPA cho hệ thống lọc không khí phòng vô
trùng,
− Hai máy khuấy từ của Mỹ.
IV. ĐÁNH GIÁ, KIẾN NGHỊ
1. Đánh giá về việc thực hiện dự án.
Trong thời gian thực hiện dự án, cơ quan chủ trì và chủ nhiệm dự án đã
thực hiện tuần tự các phần nội dung công việc mà dự án yêu cầu.
Phần nghiên cứu để ổn định chất lượng sản phẩm và xây dựng các qui trình
công nghệ được tiến hành nghiêm túc và theo đúng tiến độ, các kết quả thu được
bổ sung đáng kể cho việc hoàn thiện công nghệ.
Sản phẩm vacxin của Dự án đã được sản xuất và cung cấp theo yêu cầu
thực tế chăn nuôi .
Các chương trình quảng bá sản phẩm cũng được tiến hành theo kế hoạch
của dự án.
Chương trình đào tạo chuyên môn sản xuất vacxin xuất huyết truyền
nhiễm ở thỏ cũng được tri
ển khai kịp thời đáp ứng yêu cầu của từng giai đoạn
thực tế sản xuất của dự án.
2. Đề nghị.
Đề nghị Bộ Khoa học và Công nghệ xem xét, công nhận kết quả nghiên
cứu của Dự án.