tạo giống lúa chịu hạn bằng phương pháp dấu chuẩn phân tử

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
VIỆN LÚA ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG
CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG LĨNH VỰC NÔNG NGHIỆP
VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
****************


BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI
TẠO GIỐNG LÚA CHỊU HẠN BẰNG PHƯƠNG
PHÁP DẤU CHUẨN PHÂN TỬ

MÃ SỐ ĐỀ TÀI


Cơ quan chủ trì đề tài: Viện lúa Đồng bằng sông Cửu long
Chủ nhiệm đề tài: GS.TS. Nguyễn Thị Lang



7834
07/4/2010

Hà Nội - 2010

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VIỆN LÚA ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG
CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG LĨNH VỰC NÔNG NGHIỆP
VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI
TẠO GIỐNG LÚA CHỊU HẠN BẰNG PHƯƠNG PHÁP
DẤU CHUẨN PHÂN TỬ

MÃ SỐ ĐỀ TÀI

Chủ nhiệm đề tài: Cơ quan chủ trì đề tài
(ký tên) (ký tên và đóng dấu)





GS.TS. Nguyễn Thị Lang TS. Lê Văn Bảnh

Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ
(ký tên) (ký tên và đóng dấu khi gửi lưu trữ)



Hà N
ộ
i - 2010

i
MỤC LỤC
MỞ ĐẤU 1
Chương 1: GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 2
1.2.1. Mục tiêu tổng quát 2
1.2.2. Mục tiêu cụ thể 2
1.3. Sản phẩm của đề tài cần đạt 3
1.4. Nội dung nghiên cứu 3
Chươ
ng 2: TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 4
2.1. Sơ lược về cây lúa 4
2.2. Các phương pháp chọn tạo giống (Jennings và ctv, 1979) 4
2.2.1. Chọn giống bằng cách trồng dồn 4
2.2.2. Chọn tạo giống theo phả hệ 5
2.2.3. Phương pháp hồi giao (Backcross-BC) 6
2.2.4. Chọn giống bằng chỉ thị phân tử (MAS) 7
2.3. Nguyên tắc cơ bản và ứng dụng PCR (Lang và ctv, 2005) 8
2.4. Chỉ thị phân tử SSR (Simple Sequence Repeat hoặ
c Microsatellites) 11
2.5. Xác định tính trạng thành phần trong chống chịu hạn 12
2.6. Những chỉ thị phân tử và bản đồ QTL tính chống chịu hạn 15
2.7. Bản đồ QTL các tính trạng quan trọng của lúa chống chịu điều kiện khô
hạn 17
2.7.1. Bản đồ QTL đối với tính trạng rễ lúa 17
2.7.2. Bản đồ QTL đối với tính trạng điều tiết áp suất th
ẩm thấu 20
2.7.3. Bản đồ QTL năng suất và thành phần năng suất dưới điều kiện khô hạn21

2.8. Chuyển nạp gen mục tiêu 22
2.9. Cơ chế truyền tính hiệu 24
2.10. Gen và khám phá lộ trình thông qua genome học chức năng 25

ii
2.11. Chuyển nạp Trehalose vào trong cây lúa (Oryza sativa L.) 28
2.12. Ứng dụng MAS trong chọn giống 31
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 35
3.1. Vật liệu 35
3.2. Phương pháp 36
3.2.1. Tạo quần thể lai F2 và BC1F1 36
3.2.2. Phân tích kiểu hình 37
3.2.3. Đánh giá kiểu gen 43
3.2.4. Ước đoán sự liên kết khô hạn của quần thể BC
1
F
1
49
3.3. Giải mã DNA theo phương pháp của Lang 2007 và dùng máy
A3130/3130 50
3.4. Thiết kế primers 50
3.5. Tuyển gen khô hạn 50
3.6. Phân tích và xử lý số liệu 51
3.6.1. Phân tích kết quả PCR bằng phần mềm NTSYS-pc (Rolfh) 51
3.6.2. Phân tích số liệu tương tác kiểu gen và môi trường 52
3.7. Địa điểm nghiên cứu 55
Chương 4: Kết quả và Thảo luận 56
4.1. Nghiên cứu vật liệu lai 56
4.1.1. Nghiên cứu vật liệu lai bộ du nhập từ Viện lúa Quốc Tế 56
4.1.2. Nghiên cứu vật liệu lai từ các giống cao sản tại Viện lúa lai tạo 76

4.1.3. Nghiên cứu vật liệu lai từ lúa mùa 80
4.2. Đa dạng hóa nguồn gen 85
4.2.1. Phân nhóm kiểu hình trên bộ lowland 86
4.2.2. Phân nhóm kiểu hình trên bộ Upland 89
4.2.3. Phân nhóm kiểu hình trên bộ lúa cao sản 90
4.2.4. Phân nhóm kiểu hình trên bộ lúa mùa địa phương 91

iii
4.2.5. So sánh sự biến động một số tính trạng nông học của các giống kháng
khô hạn với cao sản và lúa mùa địa phương trong điều kiện khô hạn 93
4.2.6. Đánh giá kiểu gen 94
4.2.7. Kiểm tra mức độ chính xác giữa việc đánh giá giống theo kiểu hình và
dựa vào chỉ thị phân tử 96
4.3. Tạo dòng con lai chống chịu khô hạn 98
4.3.1. Các cặp lai thu được thông qua phương pháp lai đơn 98
4.3.2. Đánh giá khả năng chịu hạn của thế hệ con lai F1 và F2 99
4.3.3. Đánh giá F2 của tổ hợp OM6468/BP225D-TB-6-8 101
4.3.4. Năng suất và thành phân năng suất 103
4.3.5. Đánh giá F2 của tổ hợp OM4102/IR78933-B-24-B-B-4 106
4.3.6. Đánh giá F2 của tổ hợp lai OM4495/IR65191-3B-2-2-2-2 111
4.3.7. Kết qua lai tạo thông qua phương pháp lai Diallel 115
4.3.8. Kết quả tạo các quần thể hồi giao chuyển gen khô hạn cho các giống
ngắn ngày 117
4.4. Cơ chế của gene kháng khô hạn 132
4.4.1. Sự thay đổi độ sâu và chiề
u dài của rễ 132
4.4.2. Cơ chế nở hoa của các giống chống chịu khô hạn 147
4.5. Nghiên cứu thiết lập bản đồ chống chịu khô hạn 149
4.5.1. Đánh giá tính chống chịu khô hạn trên bố mẹ 149
.5.2. Phân tích cấp độ chống chịu khô hạn trên các cặp lai BC (backcross) .150

4.5.3. Thiết lập bản đồ gen khô hạn bằng SSR chỉ thị phân tử 154
4.5.4. Phân tích QTL khô hạn 154
4.5.5. Quy trình xây dựng bản đồ QTL liên kết với gen khô hạn 165
4.6. So sánh b
ản đồ trên các nhiễm sắc thể 166
4.7. Tuyển gen khô hạn 168
4.7.1. Thiết lập BAC thư viện 169
4.7.2. Chứng minh và phân tích BAC clones 169

iv
4.7.3.Thiết kế primer 171
4.8. Đánh giá kiểu gen của các con lai và lựa chọn dòng chống chịu khô hạn175
4.8.1. Chọn lọc gia phả 176
4.8.2. Kết quả đánh giá sàng lọc cây mang gen kháng từ các quần thể cận giao
mang gen khô hạn 177
4.8.3. Liên kết gen và số vị trí của chỉ thị phân tử 182
4.8.4. Sản phẩm phản ứng PCR với chỉ thị phân tử RM38 184
4.8.5. Kết quả đánh giá sàng lọc cây mang gen kháng từ các quần thể hồi giao
mang gen khô hạn 186
4.8.6. Kết quả đánh giá và sàng lọc PCR trên các tổ hợp BC2 trên hai tổ hợp
OM 1490/WAB881 SG9, OMCS2000/IR 81025-B-116 và
OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1 187
4.8.7. Kết quả xét nghiệm PCR sàng lọc cây mang gen kháng khô hạn BC4F2193
4.8.8. Mối quan hệ giữa chọn giống cổ điển và chọn giống nhờ chỉ thị phân tử196
4.9. Đánh giá các dòng triển vọng 198
4.9.1. Giới thiệu một số giống đầu dòng hồi giao có triển vọng 198
4.9.2. Các tổ hợp thuộc bộ giống lúa chỉ thị khô hạ
n 203
4.9.3. Đánh giá các dòng khô hạn 207
4.9.4. Thanh lọc vật liệu khô hạn ở ngoài đồng từ giai đoạn trổ đến thu hoạch211

4.9.5. So sánh các dòng triển vọng trong vụ Đông xuân 2008 215
4.10. Kết quả khảo nghiệm quốc gia vụ Hè Thu 2009 219
4.10.1 Khảo nghiệm năng suất 219
4.10.2. Phản ứng sâu bệnh trên giống lúa OM 6840 219
4.10.3. Phẩm chất gạo của giống OM 6840 221
4.10.4. Phẩm chất gạo của giống OM 6840 và OM 6162 223
5. So sánh kế hoạch đề tài vớ
i kết quả thực hiện đề tài 224
5.1. Sản phẩm về giống đề tài yêu cầu 224
5.2. Sản phẩm về số liệu khoa học 224

v
5.3. Sản phẩm khoa học 225
5.4. Đào tạo thạc sĩ 225
5.5. Hiệu quả của đề tài 225
Kết luận và kiến nghị 226
TÀI LIỆU THAM KHẢO 230

vi
LIỆT KÊ TỪ VIẾT TẮT

Viết tắc Đầy đủ
ABA Abscisic acid
ASI Anthesis to silking interval
BC
BAC
BLAST
Backcross
Bacterial Artificial Chromosome
Basic Local Alignment Search Tool

CC Chiều cao cây
CDR Chiều dài rễ
CDR/CDT Chiều dài rễ/chiều dài thân
CDT Chiều dài thân
CL Cấp độ cuộn lá (héo lá)
CLRRI Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long.
CNSH Công nghệ sinh học
ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long
ĐBSH Đồng bằng sông Hồng
HC/B Hạt chắc /bông
HL/B Hạt lép /bông
IRRI International rice research instute
KL Cấp độ khô lá
KNTT Khả năng th
ụ tinh
KT Không trổ
KTT Không trổ thoát
KH Kiểu hình cây
LNTT Lượng nước trong thân
MAB marker-assisted backcrossing
MAS Marker Assisted Selection

vii
NS Năng suất
NT Ngày trổ
OA Osmotic adjustment
PCR Polymerase chain reaction
PPDK pyruvate orthophosphate dikinase
QTL Quantitative trait loci – QTLs
SB/b Số bông/bụi

SC Số chồi
SH/B Số hạt/bông
SOD superoxide dismutata
SSD single seed descent
SSR Simple Sequence repeat
TL1000 Trọng lượng 1000 hạt
TLB Trọng lượng bông
TLKT Trọng lượng khô thân
TLTT Trọng lượng tươi thân
YAC Yeast artificial chromosome


viii
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1: Các vị trí tính trạng số lượng (QTL) liên quan đến tính chống chịu
khô hạn của một số loài cây trồng (Reddy và ctv, 1999) 14
Bảng 2.2: Các dòng đơn bội kép (DH) được chọn lọc để lai hồi giao (Shen và
ctv, 1999) 18
Bảng 2.3: Những QTL đối với hình thái rễ lúa (Shen và ctv, 1999) 19
Bảng 2.4: Sự biểu hiện của các gen mục tiêu liên quan đến tính chống chịu
khô hạn, trong cây lúa chuyển gen (Redd và ctv, 1999) 23
Bảng 3.1: Danh sách các giống dùng để lai 35
Bảng 3.2: Quy trình sản xu
ất giống chống chịu khô hạn 37
Bảng 4.1: Các đặc điểm sinh trưởng của các giống kháng khô hạn 58
Bảng 4.2: Các đặc tính nông học của bộ giống kháng khô hạn 1 (tt) 1 (Xem
bảng đầy đủ các giống 62
Bảng 4.3: Năng suất và thành phần năng suất của bộ giống khô hạn 65
Bảng 4.4: Các đặc tính nông học của bộ giống kháng khô hạn Upland 71
Bảng 4.5: Các đặc tính nông học củ

a bộ giống kháng khô hạn Upland 72
Bảng 4.6: Năng suất và thành phần năng suất của các giống thuộc bộ kháng
khô hạn 74
Bảng 4.7: Năng suất và thành phần năng suất của các giống thuộc bộ kháng
khô 75
Bảng 4.8: Các đặc điểm sinh trưởng của các giống cao sản 77
Bảng 4.9: Các đặc tính sinh học của các giống cao sản 79
Bả
ng 4.10: Các đặc điểm sinh trưởng của các giống lúa mùa địa phương 81
Bảng 4.11: Các đặc điểm sinh trưởng của các giống lúa mùa địa phương 83
Bảng 4.12: Sự liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình của một số dòng lúa với
sự kháng khô hạn 97
Bảng 4.13: Tỷ lệ kháng khô hạn ở các tổ hợp lúa lai ở thế hệ F1 100

ix
Bảng 4.14: Các đặc tính nông học (thế hệ F2) của tổ hợp lai
OM6468/BP225D-TB-6-8 102
Bảng 4.15: Năng suất và thành phần năng suất (thế hệ F2) của tổ hợp lai
OM6468/BP225D-TB-6-8 104
Bảng 4.16: Các đặc tính nông học (thế hệ F2) của tổ hợp lai
OM4102/IR78933-B-24-B-B-4 107
Bảng 4.17: Năng suất và thành phần năng suất (thế hệF2) của tổ hợp lai
OM4102/IR78933-B-24-B-B-4 109
Bảng 4.18: Các đặc tính nông học của tổ hợp lai OM4495/IR65191-3B-2-2-2-
2 và khô hạn trên t
ổ hợp F2 112
Bảng 4.19: Năng suất và thành phần năng suất (thế hệ F2) của tổ hợp lại
OM4495/IR65191-3B-2-2-2 113
Bảng 4.20: Hệ số di truyền của 9 tính trạng năng suất và thành phần năng suất
của ba tổ hợp lai ở thế hệ F1 115

Bảng 4.21: Tương quan giữa các tính trạng nghiên cứu với năng suất trong
quần thể F1 của bộ giống lúa cao sản. 116
Bảng 4.22: Phân tích hệ thố
ng tương quan theo đường dẫn (path analysis)
giữa các tính trạng với năng suất hạt – bộ giống lai. 116
Bảng 4.23: Cấp độ héo lá của các tổ hợp 120
Bảng 4.24: Kết quả đánh giá kháng khô hạn bằng kiểu hình của các tổ hợp lai122
Bảng 4.25: Năng suất và thành phần năng suất tổ hợp BC1F1 của
OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-HB//OM1490 123
Bảng 4.26: Năng suất và thành phần năng suất tổ hợp BC1 của
OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-HB 124
B
ảng 4.27: Năng suất và thành phần năng suất tổ hợp BC1F1 của
OM1490/WAB881 SG9 125
Bảng 4.28: Năng suất và thành phần năng suất tổ hợp BC1 của
OM1490/WAB881 SG9 126

x
Bảng 4.29: Năng suất và thành phần năng suất tổ hợp BC1F1 của
OMCS2000/IR 81025-B-116//OMCS2000 127
Bảng 4.30: Năng suất và thành phần năng suất tổ hợp BC1 của
OMCS2000/IR 81025-B-116 128
Bảng 4.31: Kết quả thử phản ứng với kháng khô hạn trên các quần thể hồi
giao tại thế hệ BC1 129
Bảng 4.32: Thanh lọc khô hạn bộ lai BC2F2 131
Bảng 4.33: Số dòng được chọn lọc ngoài đồng cho khô hạn tại Tịnh Biên,
Đông Xuân 2007-2009 132
Bảng 4.34: Các đặc điểm sinh trưởng của các giống kháng khô hạn 136
Bảng 4.35: Các đặc tính sinh học của các giống kháng khô hạn 138
Bảng 4.36: Các đặc điểm sinh trưởng của các giống cao sản 140

Bảng 4.37: Tỷ lệ rễ/chồi, tỷ lệ rễ dày trên tổng trọng lượng rễ, tỷ lệ rễ
dày/chồi của các gióng lúa đất khô và đất ẩm 142
Bảng 4.38: Ảnh hưởng của giống, độ
sâu và giai đoạn phát triển tỷ lệ chiều
dài/trọng lượng rễ của 4 giống được ghi nhận 142
Bảng 4.39: Sự phân chia thẳng đứng về mật số rễ của 7 giống lúa ở ruộng khô
hạn trong vụ Đông Xuân 2008 144
Bảng 4.40: Sự sắp của các
chỉ thị phân tử trên các NST của quần thể BC2F2
của tổ hợp OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-HB 154
Bảng 4.41: Xác định QTL của chống chịu khô hạn giai đoạn trỗ hoa bằng
phương pháp SMA của 218 dòng BC từ tổ hợp OM1490/WAB880-1-38-18-
20-P1-HB 160
Bảng 4.42: Xác định QTL của trọng lượng khô của rễ, (DR) bằng phương
pháp SMA của 218 dòng BC từ tổ hợp OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-HB160
Bảng 4.43: Xác định QTL của chiều dài của rễ bằng phương pháp SMA c
ủa
của 218 dòng BC từ tổ hợp OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-H 161

xi
Bảng 4.44: Xác định QTL của chiều cao (HP) bằng phương pháp SMA của
của 218 dòng BC từ tổ hợp OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-HB 161
Bảng 4.45: Xác định QTL năng suất (YG) bằng phương pháp SMA của của
218 dòng BC từ tổ hợp OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-HB 162
Bảng 4.46: QTL của các tính trạng được xác định bằng phương pháp phân
tích quãng (interval analysis) trên bản đồ di truyền 164
Bảng 4.47: Kết quả thử phản ứng với gen khô hạn trên
chỉ thị phân tử SSR 210
của các dòng hồi giao ở thế hệ BC3F2, vụ Đông Xuân năm 2008-200 189
Bảng 4.48: Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen khô hạn trong trong các

dòng hồi giao chuyển gen ở thế hệ BC3F1 bằng kỹ thuật PCR 191
Bảng 4.49: Tổng hợp kết quả PCRvới RM 201, RM 511 đánh giá và xác định
gen chống chịu khô hạn trên tổ hợp BC4 của OM 1490/ WAB 880-1-38-18-
20-PHB 194
Bảng 4.50. So sánh kiểu gen và kiểu hình trên 4 chỉ thị phân tử 198
Bảng 4.51: Bả
ng phân tích Anova của các tính trạng ở giai đoạn trổ và thu
hoạch của các dòng lúa làm vật liệu khô hạn 199
Bảng 4.52: Kết quả phân nhóm Duncan các tổ hợp dựa trên các đặc tính sinh
học 200
Bảng 4.53: Kết quả phân nhóm Duncan của các tổ hợp dựa trên các đặc tính
sinh học 201
Bảng 4.54: Bảng phân tích Anova các đặc tính sinh học ở giai đoạn mạ 203
Bảng 4.55: Các đặc tính sinh học ở giai đoạn mạ của các tổ hợp thuộ
c bộ
giống lúa chỉ thị khô hạn 204
Bảng 4.56: Các đặc tính sinh học ở giai đoạn mạ của các tổ hợp thuộc bộ
giống lúa chỉ thị khô hạn 205
Bảng 4.57: Bảng phân tích Anova Các đặc tính sinh học ở giai đoạn mạ của
các giống thuộc bộ giống lúa chỉ thị khô hạn 207

xii
Bảng 4.58: Các đặc tính sinh học ở giai đoạn mạ của các giống thuộc bộ
giống lúa chỉ thị khô hạn 208
Bảng 4.59: Các đặc tính sinh học ở giai đoạn mạ của các giống thuộc bộ giống
lúachỉ thị khô hạn 210
Bảng 4.60: Bảng phân tích Anova các đặc tính sinh học của các giống thuộc
bộ giống lúa chỉ thị khô hạn từ giai đoạn trổ đến thu hoạch 212
Bảng 4.61: Các đặc tính sinh học của các giống thuộc bộ giống lúa chỉ thị khô
hạn từ giai đoạn trổ đến thu hoạch 213

Bảng 4.62: Các đặc tính sinh học của các giống thuộc bộ giống lúa chỉ thị khô
hạn từ giai đ
oạn trổ đến thu hoạch 214
Bảng 4.63: Đặc tính nông học vụ Đông xuân 08-09 trên bộ giống khô hạn .216
Bảng 4.64: Sâu bệnh vụ Đông xuân 08-09 216
Bảng 4.65: Năng suất và thành phần năng suất 216
Bảng 4.66: Chất lượng của 8 giống lúa chống chịu khô hạn 217
Bảng 4.67: Đặc tính nông học vụ Đông xuân 08-09 217
Bảng 4.68: Sâu bệnh vụ Đông xuân 08-09 218
Bảng 4.69: Năng suất và thành phần năng suất 218
Bảng 4.70: M
ột số chỉ tiêu về phân tích phẩm chất của bộ giống khô hạn 219
Bảng 4.71: Một số đặc tính nông học của các giống lúa khảo nghiệm vụ ĐX08-09
(Nguồn: Nguyễn Quốc Lý và Nguyễn Văn Tuyển, 2009) 220
Bảng 4.72: Năng suất (tấn/ ha) của các giống lúa khảo nghiệm vụ ĐX08-09221
Bảng 4.73: Phản ứng của rầy nâu trên các giống khác nhau Hè Thu 2007 221
Bảng 4.74: Phản ứng rầy nâu 3 giai đoạn mạ qua các vụ từ 2007-2009
(Nguồn: Bộ môn Di truyền giống, 2009) 222
Bảng 6.75: Phản ứng của giống lúa đối với quần thể rầy nâu trong điều kiện
nhân tạo vụ ĐX08-09 222
Bảng 4.76: Phản
ứng của các giống với bệnh đạo ôn trong điều kiện nhân tạo
vụ ĐX08-09 (Nguồn: Nguyễn văn Tuyển và Nguyễn Quốc Lý, 2009) 223

xiii
Bảng 4.77: Chất lượng gạo các giống lúa khảo nghiệm năm 2009 (Nguồn:
Nguyễn Quốc Lý và ctv, 2009) 223
Bảng 4.78: Một số chỉ tiêu dạng cảm quan bên ngoài của các giống triển vọng
(Nguồn: Nguyễn Quốc Lý và ctv, 2009) 224
Bảng 4.79: Diện tích giống OM 6162 trên các tỉnh (Đơn vị: ha) (Nguồn: Sở

Nông nghiệp các tỉnh, 2009) 225

















xiv
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1: Những gen cảm ứng stress do khô hạn. Sản phẩn của gen có thể
chia thành hai nhóm: protein đóng vai trò chức năng và protein đóng vai trò
điều tiết các tính hiệu di truyền và sự thể hiện gen khi cây phản ứng với stress
(Yamaguchi-shinozaki, 1999) 24
Hình 2.2: Lộ trình truyền tín hiệu và sự thể hiện gen (Yamaguchi-Shinozaki
và Shinozaki,1999) 25
Hình 2.3: Mô hình cảm ứng của gen rd29A và hoạt động của các nhân tố hoạt
độngcó tính chất cis và trans trong hiện tượng thể hiện gen chống chị
u stress
(Yamaguchi-Shinozaki và Shinozaki,1999) 25

Hình 2.4: Đóng góp của ngành protein học và trancript học vào chiến lược
MAS và chọn giống cây trồng (Salekdeh và ctv, 2002) 26
Hình 2.5: Sự dung hợp chức năng sinh học TPSP, yếu tố biến nạp và
Southern-blot hybrization của lúa chuyển gen (In-Cheol Jang và ctv, 2003) .29
Hình 2.6: Mức độ chuyển mã của TPSP và các stress có thể suy ra từ gen của
các dòng lúa Ubi1::TPSP và không chuyển gen. A, phân tích Northern-blot
được hình thành trên tất cả RNA từ 5 dòng của Ubi1::TPSP. B, Northern blots
của tất cả RNA từ cây không chuyển gen trước và sau xử lý (In-Cheol Jang và
ctv, 2003) 30
Hình 3.1: Sơ
đồ tạo dòng lúa lai BC 37
Hình 4.1: Bể lúa trồng để thanh lọc khô hạn ở giai đoạn mạ 56
Hình 4.2: Giống lúa thể hiện kháng tốt khô hạn 59
Hình 4.3: Giống không kháng khô hạn 59
Hình 4.4: Phân nhóm kiểu hình của các giống kháng khô hạn dựa trên các tính
trạng nông học trong điều kiện khô hạn bằng phần mền NTSYS pc 2.1 86
Hình 4.5: Cây phân nhóm kiểu hình của các giống trong bộ kháng khô hạn 1
dựa vào các tính trạng nông học và năng suất trong điều ki
ện khô hạn bằng
phần mềm NTSYSpc 2.1 88

xv
Hình 4.6: Cây phân nhóm kiểu hình của các giống trong bộ kháng khô hạn 2
dựa vào các tính trạng nông học và năng suất trong điều kiện khô hạn bằng
phần mềm NTSYSpc 2.1 89
Hình 4.7: Phân nhóm kiểu hình của các giống cao sản dựa trên các tính trạng
nông học trong điều kiện khô hạn 91
Hình 4.8: Cây phân nhóm kiểu hình các tính trạng của các giống lúa mùa
trồng trong điều kiện khô hạn 92
Hình 4.9: Sản phẩm PCR của các dòng lúa ch

ống chịu khô hạn locus RM 201
liên kết với gen khô hạn trên nhiễm sắc thể số 9, vị trí hai băng 210bp và
225bp, trên gel agarose 3 %, TBE (1X.) 96
Hình 4.10: Sản phẩm PCR của các dòng lúa chống chịu khô hạn locus RM
328 liên kết với gen khô hạn trên nhiễm sắc thể số 9, vị trí hai băng 200bp và
210bp, trên gel agarose 3 %, TBE (1X) 96
Hình 4.11: Chương trình lai bộ khô hạn trong nhà lưới 98
Hình 4.12: Thanh lọc giai đoạn mạ và giai đoạn sinh thực và giai đoạn trỗ hoa
trên ba tổ hợp A, D, G: OM1490/WAB881 SG9,B, E, H:OMCS2000/OIR
81025-B-116 và C, F, I: OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-HB theo thứ tự121
Hình 4.13: Thanh l
ọc tính trạng khô hạn ngoài đồng quần thể con lai BC3F2128
Hình4.14: Đánh giá khô hạn ngoài đồng 131
Hình 4.15: Rễ của 3 giống chống chịu khô hạn 134
Hình 4.16: Rễ của 4 dòng kháng khô hạn, cao sản, lúa mùa và IR64 141
Hình 4.17: Rễ của 2 giống P1 trong các tổ hợp lai 146
Hình 4.18: Rễ của P1, P2 và BC1F1 của tổ hợp OM1490/WAB880-1-38-18-
20-P1-HB 146
Hình 4.19: Rễ của P1, P2 và BC1F1 của tổ hợp OM1490/WAB881 SG9 146
Hình 4.20: Rễ của P1, P2 và BC1F1 của tổ hợp OMCS2000/OM4495 146
Hình 4.21: Khác biệt giữa OM 1490 và WAB880-1-38-18-20-P1-HB)
trong hiện tượng mở bao phấn 148

xvi
Hình 4.22: IR64-DS: bao phấn đóng IR64-DS: hạt phấn bị dính lại, IR64-
WW: bao phấn mở hoàn toàn 148
Hình 4.23: Sự biến động của của BC 2 F2 trên khô hạn và khô lá trên quần
thể BC2F2 của OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-HB. Đánh giá tính trạng
chiều dài rễ của các giống lúa chịu khô hạn 151
Hình 4.24: Rễ của Bố mẹ và các thế hệ lai 1: WAB880-1-38-18-20-P1-HB., 2:

OM 1490, và con lai BC2F2 151
Hình 4.25: Sự biến động của của BC2F2 trên tỉ lệ thụ của hoa và chiều dài
của rễ (Thời gian 30 ngày sau khi cấy) qu
ần thể BC2F2 của
OM1490/OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-HB 152
Hình 4.26: Sự biến động trên năng suất và chiều cao của quần thể BC2F2 từ
OM1490/OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-HB 152
Hình 4.27: Bản đồ gen chống chịu khô hạn 156
Hình 4.28: So sánh ba kết quả trên nhiễm sắc thể số 2. Sự trùng hợp với quần
thể Bala/ Azucena 166
Hình 4.29: Tính trạng chiều cao cây và năng suất trên nhiễm sắc thể số 4 166
Hình 4.30: Bản đồ vật lý về sự liên kết các chỉ thị phân tử khô h
ạn 167
Hình 4.31. Khuyếch đại BAC clone của lúa ở vị trí: 1,4kb của RM201 170
Hình 4.32. Vị trí BAC clones được chứng minh bởi RM 201 170
Hình 4.33. Vị trí BAC clones được chứng minh bởi Southern Blot với Clone
RM 201. DNA của 3 clones được phân cắt với Hind III 170
Hình 4.34: Kết quả bản đồ vật lý được thiết lập trên hình 174
Hình 4.35: Chỉ thị phân tử 13A9F-R trên quần thể F2 của OM 4102/ WAB
8818G9. Bản đồ vật lý của gen khô hạn của BAC đã được chứng minh 174
Hình 4.36: Sản phẩm PCR củ
a chỉ thị phân tử RM 201 trên F3 của bốn tổ hợp
OM6468/BP225D-TB-6-8, OM4102/IR78933-B-24-B-B-4,
OM4495/IR65191-3B-2-2-2-2, OM6468/BP227D-MR-2-12 180

xvii
Hình 4.37: Sản phẩm PCR của chỉ thị phân tử RM 328 trên F3 trên F3 của
bốn tổ hợp OM6468/BP225D-TB-6-8, OM4102/IR78933-B-24-B-B-4,
OM4495/IR65191-3B-2-2-2-2, OM6468/BP227D-MR-2-12 180
Hình 4.38: Sản phẩm PCR của chỉ thị phân tử RM 344 trên F3 của bốn tổ hợp

OM6468/BP225D-TB-6-8, OM4102/IR78933-B-24-B-B-4,
OM4495/IR65191-3B-2-2-2-2, OM6468/BP227D-MR-2-12 180
Hình 4.39: Sản phẩm PCR của chỉ thị phân tử RM 511 trên F3 của bốn tổ hợp
OM6468/BP225D-TB-6-8, OM4102/IR78933-B-24-B-B-4,
OM4495/IR65191-3B-2-2-2-2, OM6468/BP227D-MR-2-12 180
Hình 4.40: Sản phẩm PCR của chỉ thị phân tử RM 17 và RM 181 trên F3 của
bốn tổ hợp OM6468/BP225D-TB-6-8, OM4102/IR78933-B-24-B-B-4,
OM4495/IR65191-3B-2-2-2-2, OM6468/BP227D-MR-2-12 181
Hình 4.41: Sản phẩm PCR trên gel agarose 3% c
ủa primer RM 272 cho tổ
hợp lai OM6468/BP227D-MR-2-12 183
Hình 4.42: Sản phẩm PCR trên gel agarose 3% của primer RM 204 cho tổ
hợp OM6468/BP227D-MR-2-12 183
Hình 4.43: Kết quả PCR đối với primer RM 38 184
Hình 4.44: Kết quả PCR đối với primer RM237 184
Hình 4.45: Sản phẩm PCR trên gel polyaromice của primer RM 334 cho tổ
hợp OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-HB 185
Hình 4.46: Sản phẩm PCR trên gel agarose 3% của primer RM 201 cho tổ
hợp OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-HB và 1490/WAB881 SG9 186
Hình 4.47: Sản phẩm PCR trên gel agarose 3% của primer RM 201 cho tổ
hợp OMCS2000/IR 81025-B-116 188
Hình 4.48: Sản phẩm PCR của RM 201 và RM 511 trên quần thể OM 1490/
WAB 880-1-38-18-20-PHB 195
Hình 4.49: Sản phẩm PCR của RM 201 và RM 511 trên quần thể OM 1490/
WAB 880-1-38-18-20-PHB 195

xviii
Hình 4.50: Sản phẩm PCR của RM 201 trên quần thể OM1490/WAB881 SG9196
Hình 4.51: Sản phẩm PCR củaRM 210 trên quần thể BC4 của OM 1490/IR
81025-B-116 196

Hình 4.52: Chọn giống khô hạn bằng
chỉ thị phân tử 209
Hình 4.53: Các dòng triển vọng thanh lọc tại Tri Tôn (Tỉnh An giang) 220












1
MỞ ĐẦU
Chương 1: GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Quản lý khô hạn là một thách thức lớn cho những vùng đất nông
nghiệp chủ yếu nhờ vào nước trời và cải thiện năng suất cây trồng. Vì thế khô
hạn được xem như là nguyên nhân chính dẫn đến thiệt hại về kinh tế của cây
trồng, đe dọa nền an ninh lương thực, trì hoãn hệ thống canh tác và nhất là
ả
nh hưởng đến nông dân trên vùng cao. Khô hạn đã ảnh hưởng đến đời sống
nông dân trồng lúa trong vùng cao, vùng chỉ có nước mưa cho sinh hoạt và
trồng trọt. Tất cả họ đều nghèo khổ, ít đất và giới hạn bởi khoa học kỹ thuật.
Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và họ đã tìm ra nhiều vị trí tính
trạng số lượng (quantitative trait loci – QTLs) cho tính trạng chống chịu khô
hạn (Lilley và ctv, 1996; Shen và ctv, 1999; Adam và ctv, 2002; Jonalica và

ctv, 2004)[47][12][31][65], đa số họ dự
a trên quần thể đơn bội kép (DH) giữa
IR64 x Azucena và CT9993-510-1-M x IR62266-42-6-2; đã chuyển thành
công gen chống chịu khô hạn vào cây lúa (Oryza sativa L.) (In-Cheol Jang và
ctv, 2003; Z.Y. Li và S.Y. Chen, 2000)[30].
Khô hạn sẽ là yếu tố quan trọng bậc nhất ảnh hưởng đến an ninh lương
thực của thế giới, nó có thể làm giảm 70% năng suất cây trồng nói chung
(Bray và ctv. 2000)[16].
Sự khan hiếm về nước tưới phục vụ cho nông nghiệp đã được báo động
trong nhiều hội nghị khoa h
ọc của thế giới gần đây. Đối với Việt Nam không
phải là ngoại lệ.
Chống chịu khô hạn là tính trạng cực kỳ phức tạp, bị ảnh hưởng bởi sự
thể hiện đồng thời cả một hệ thống gen mục tiêu (Thomashow 1999; Xiong và
ctv. 2002)[70][81] và bị ảnh hưởng bởi các yếu tố về mội trường, vật lý, hóa
học (Soltis và Soltis 2003)[69].

2
Mặt khác, nước ta nằm trong vùng nhiệt đới, lượng mưa hàng năm rất
lớn và hầu hết đất nông nghiệp tập trung chủ yếu tại Đồng Bằng Sông Hồng,
Sông Cửu Long và Duyên Hải Miền Trung nên việc nghiên cứu chọn tạo
giống lúa chống chịu khô hạn ít được quan tâm. Bên cạnh đó nông dân vùng
núi đa số là dân tộc thiểu số sống chủ yếu vào nông nghiệp, trình độ khoa học
kỹ thuậ
t còn hạn chế, thường xuyên gặp thiên tai, trong đó chủ yếu nguồn
nước không đáp ứng kịp thời cho người dân canh tác cây trồng. Khô hạn làm
giảm phẩm chất và năng suất của cây trồng, đôi khi cây trồng không cho trái,
đặt biệt là cây lúa giai đoạn ra hoa là giai đoạn rất mẫn cảm với điều kiện khô
hạn. Hạt lúa thường trổ không thoát cổ bông hoặc trổ nhưng bị lép thất thoát
n

ăng suất.
Vì thế, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Tạo giống lúa chịu hạn bằng
phương pháp dấu chuẩn phân tử” nhằm giới thiệu và đồng thời áp dụng
những phương pháp đánh giá mới nhanh và tiện lợi nhờ vào kỹ thuật phân tử,
làm cơ sở cho việc phát triển các giống lúa chống chịu khô hạn đáp ứng nhu
cầu thực tế sản xuất
ở những vùng cao và đảm bảo an ninh lương thực với sự
phát triển dân số ngày càng tăng.
1.2. Mục tiêu đề tài
1.2.1. Mục tiêu tổng quát
- Chọn tạo giống lúa chống chịu khô hạn trên cơ sở bản đồ di truyền
QTL và dấu chuẩn phân tử.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
- Xác định vật liệu lai mang gen chịu hạn từ tập đoàn giống mùa cao
sản và kháng khô hạn tại ngân hàng gen của Viện Lúa Đồ
ng Bằng Sông Cửu
Long bằng phương pháp phân tích kiểu hình và đánh giá kiểu gen.
- Xác định tính đa hình DNA của vật liệu lai trong ngân hàng gen của
Viện Lúa ĐBSCL

3
- Áp dụng kỹ thuật lai hồi giao (backcross) tạo dòng lúa mang gen chịu
hạn từ các giống lúa: OMCS2000, OM4495, OM1490, WAB880-1-38-18-20-
P1-HB và WAB881 SG9.
- Xác định lúa lai BC
1
F
1
mang gen chịu hạn bằng phương pháp phân
tích kiểu hình và đánh giá kiểu gen.

- Xác định chỉ thị phân tử liên kết với QTL điều khiển chống chịu khô
hạn, tập trung chủ yếu trên nhiễm sắc thể số 9.
- Chọn được dòng lúa mang gen chịu hạn thông qua phương pháp hồi
giao.
1.3. Sản phẩm của đề tài cần đạt
 Sản phẩm về giống
Đánh giá các dòng triển vọng chố
ng chịu khô hạn: 1-2 dòng
 Sản phẩm về số liệu khoa học: 1 bản đồ QTL chống chịu khô
hạn, 1 Trình tự DNA của 1 gen (1 chỉ thị phân tử)
 Sản phẩm khoa học: 5 báo cáo
 Đào tạo thạc sĩ: 1 thạc sĩ, 2 kỹ sư
1.4. Nội dung nghiên cứu
 Nghiên cứu vật liệu lai
 Đa dạng di truyền
 Tạo dòng con lai chống chịu khô h
ạn
 Cơ chế của gene kháng khô hạn
 Nghiên cứu thiết lập bản đồ chống chịu khô hạn
 So sánh bản đồ trên các nhiễm sắc thể
 Tuyển gen khô hạn
 Đánh giá kiểu gen của các con lai và lựa chọn dòng chống chịu
khô hạn
 Đánh giá các dòng triển vọng


4
Chương 2: TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU
2.1. Sơ lược về cây lúa
Cây lúa có nguồn gốc từ Châu Á, được tìm thấy sớm nhất tại Non Nok

Tha của Thái Lan 3500 năm trước công nguyên. Lúa trồng (Oriza sativa) đầu
tiên được công nhận tại Ấn Độ và Đông Nam Á tại Neolithic Chirand, Bắc
Bihar (2000-1300 năm trước công nguyên) và cũng được ghi nhận tại
Hastinapur (1100-800 năm trước công nguyên) và một vài nơi khác
(Randhawa, 1980)[59]. Hầu hết 90% diện tích đất trồng lúa ở Châu Á, năm
1999 diện tích lúa trên th
ế giới được trồng khoảng 152 triệu ha trong đó Châu
Á chiếm 136 triệu ha. Vì thế, sản lượng lúa trên thế giới đạt trên 582 triệu tấn,
533 triệu tấn được sản xuất tại Châu Á. Ấn Độ là quốc gia có diện tích trồng
lúa lớn nhất trên thế giới.
Phân loại về cây lúa
Lúa thuộc về genus Oryza, 20 loài và 23 loài được liệt kê bởi
Chatterjee (1948)[18]. Dựa trên cơ sở này, Tateoka (1963, 1964)[73] công
nhận 22 loài Oryza là căn bả
n. Trong số đó, chỉ có 2 loài được trồng, Oryza
glaberrima Steud được trồng giới hạn tại một số nơi ở Châu Phi, hầu hết lúa
trồng là O. sativa L. có tiềm năng năng suất cao hơn và khả năng thích nghi
rộng hơn. Số nhiễm sắc thể của genus Oryza là 12 (2n = 24).
Giống lúa trồng O. sativa L. được chia làm 3 kiểu sinh thái: indica,
japonica và javanica được trồng rộng khắp các vùng nhiệt đới và cậ
n nhiệt
đới.
2.2. Các phương pháp chọn tạo giống (Jennings và ctv, 1979)[33]
2.2.1. Chọn giống bằng cách trồng dồn
Phương pháp trồng dồn đã được các nhà chọn tạo giống sử dụng từ lâu
ở các vùng nhiệt đới và ôn đới. Mặc dầu, phương pháp này có lợi là rất đơn
giản nhưng thông qua nhiều năm sử dụng tại vùng Châu Á nhiệt đới đã luôn
luôn thất bại không đưa năng suất toàn quố
c lên được. Tuy nhiên vài chương

5
trình lai tạo giống lúa japonica đã thành công đôi chút nhờ dùng những giống
có liên hệ gần và hình thái tương tự các dòng lai rất ít cạnh tranh nhau nên từ
từ cũng cho những giống tốt, ổn định.
Phương pháp trồng dồn chưa đưa đến nhiều tiến bộ đáng kể trong nền
sản xuất lúa vùng nhiệt đới vì các nhà khoa học đã không để ý đến hai nguyên
tắc căn bản của cải tiến gi
ống:
1. Ảnh hưởng của hình thái của thân trên khả năng cho năng suất và sự cần
thiết phải thay thế những dạng cây cao quá, lá rủ bằng những dạng hình có
sản lượng cao hơn.
2. Tác dụng loại trừ của sự cạnh tranh trong quần thể phân ly làm giảm đi
những cây phân ly có giá trị.
Những kiểu cây có tiềm năng cho năng suất cao luôn luôn đã xuất hiện
trong quần thể
cây F
2
trong các chương trình lai giống vùng nhiệt đới; vài cá
thể phân ly đôi khi được tìm thấy trong tổ hợp giữa các cây cha mẹ cao, lá rủ.
Những nhà chọn giống thường không nhận ra giá trị của nhóm phân ly
nhỏ hơn này hoặc bị mất chúng vì chúng bị lấn át thiếu ánh sáng. Vì vậy
phương pháp trồng dồn không đem lại những bước tiến về năng suất mặc dù
có thể dùng một cách hữu hiệu để chọn nhữ
ng tính trạng kiểu hình không phụ
thuộc vào mật độ như kích thước hạt, phẩm chất nấu, thời gian sinh trưởng,
tính không quan cảm, tính kháng và tính không lông.
Gần đây, do nhận thức được sự tương tác của kiểu hình, khả năng cho
năng suất và sự cạnh tranh, đa số các nhà chọn tạo giống đã tránh không dùng
hoặc không cải tiến phương pháp trồng dồn thông thường. Phương pháp trồng
dồn không giới h

ạn được coi như vô hiệu quả nếu muốn tìm những dạng cây
có tiềm năng năng suất cao trong tổ hợp phân ly mạnh về kiểu hình.
2.2.2. Chọn tạo giống theo phả hệ
Phương pháp tuyển chọn theo phả hệ được sử dụng rộng rãi và thành
công nhất trong việc cải tiến giống lúa. Tuy nhiên tuyển chọn theo phương