nghiên cứu bệnh do phytoplasma hại tre luồng và biện pháp phòng trừ

LIÊN HIỆP CÁC HỘI KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT VIỆT NAM
TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU BẢO VỆ SỨC KHOẺ
CÂY TRỒNG VÀ VẬT NUÔI

BÁO CÁO TỔNG KẾT
THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ
Tên đề tài:
“Nghiên cứu bệnh do Phytoplasma hại tre luồng
và biện pháp phòng trừ”

CƠ QUAN CHỦ QUẢN: Liên

hiệp các hội Khoa học và kỹ thuật Việt Nam

CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: Trung

tâm nghiên cứu bảo vệ sức khoẻ

cây trồng và vật nuôi
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI:

TS. Hà Viết Cường

8170

HÀ NỘI, 12/2010
1


LIÊN HIỆP CÁC HỘI KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT VIỆT NAM
TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU BẢO VỆ SỨC KHOẺ

CÂY TRỒNG VÀ VẬT NUÔI

BÁO CÁO TỔNG KẾT
THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG
NGHỆ
Tên đề tài:
“Nghiên cứu bệnh do Phytoplasma hại tre luồng
và biện pháp phòng trừ”

CƠ QUAN CHỦ QUẢN: Liên

hiệp các hội Khoa học và kỹ thuật Việt Nam

CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: Trung

tâm nghiên cứu bảo vệ sức khoẻ

cây trồng và vật nuôi
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI:

TS. Hà Viết Cường

THỜI GIAN THỰC HIỆN: 5/2009

– 11/2010

HÀ NỘI, 12/2010
2

LIÊN HIỆP CÁC HỘI KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT VIỆT NAM
TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU BẢO VỆ
SỨC KHOẺ CÂY TRỒNG VÀ VẬT NI

THƠNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thơng tin chung:
- Tên đề tài: “Nghiên cứu bệnh do Phytoplasma hại tre luồng và biện pháp
phòng trừ”
- Chủ nhiệm: TS. Hà Viết Cường
- Cơ quan chủ trì: Trung tâm nghiên cứu bảo vệ sức khoẻ cây trồng và vật
nuôi
- Thời gian thực hiện: 5/2009 – 12/2010
2. Mục tiêu: Đề tài nhằm xác định tác nhân gây bệnh giống bị nhiễm
Phytoplasma trên tre luồng và đề xuất biện pháp kiểm soát bệnh.
3. Kết quả nghiên cứu:
- Các kết quả PCR và giải trình tự chứng tỏ rằng các mẫu biểu hiện triệu
chứng giống phytoplasma trên cây họ tre trúc thu thập một số tỉnh (Thanh Hố,
Hồ Bình, Phú Thọ, n Bái, Lào Cai, Hưng Yên) không bị nhiễm
Phytoplasma.
- Đã phát hiện được 7 bệnh giống bị nhiễm phytoplasma trên các cây họ tre
nứa miền Bắc. Các bệnh này bao gồm: chổi sể (tre, luồng, bương), sọc tím
luồng, lá nhỏ luồng, lá nhỏ tre, cựa gà (luồng), chổi phù thủy tre cảnh, và chổi
phù thủy trúc. Bệnh sọc tím luồng là bệnh có ý nghĩa kinh tế nhất nhưng chỉ giới
3


hạn tại 1 số huyện thuộc tỉnh Thanh Hóa. Bệnh chổi sể và cựa gà phổ biến tại tất
cả các điểm điều tra thuộc trung du miền núi (Thanh Hóa, Lào Cai, Phú Thọ,
Hịa Bình). Các bệnh cịn lại hiếm gặp.

- Đã thu thập, xử lý và số liệu hóa khoảng 200 mẫu bệnh giống bị nhiễm
phytoplasma trên cây họ tre nứa tại 6 tỉnh miền Bắc và 150 cá thể rầy tại khu
vực bị nhiễm bệnh luồng sọc tím tại Thanh Hóa.
- Bệnh sọc tím ảnh hưởng rất mạnh đến sinh trưởng, phát triển cây luồng.
Kết quả đo đếm cho thấy thời kỳ măng, mức độ ảnh hưởng là cao nhất với
đường kính giảm tới 47,1% và chiều dài lóng giảm tới 31,1%. Mức độ ảnh
hưởng giảm dần theo độ lớn tuổi cây luồng.
- Đã lần đầu tiên phát hiện được 2 loài rầy sống trên luồng ở Việt Nam. Hai
loài này đã được đặt tên tạm thời là rầy nâu vằn và rầy trắng. Nhờ sự giúp đỡ
của TS. Xiang-Sheng Chen (Đại học Guizhou), loài rầy trắng đã được xác định
là Purohita taiwanensis, còn rầy nâu vằn là một lồi mới hồn tồn, thuộc mơt
chi chưa xác định. Rầy nâu vằn chỉ cư trú trên măng, thường thấy ở chỗ mọng
nước, ẩm ướt như bẹ măng, tai măng, có thể ở gốc măng sát đất. Rầy có thể đạt
mật độ 33 - 35 con/măng. Không phát hiện thấy rầy trên cây trưởng thành và các
cây cỏ dại xung quanh.
- Đã tham khảo 6 mồi và thiết kế 5 mồi chung (universal primer) để nghiên
cứu chẩn đoán bệnh phytoplasma. Đã sử dụng kỹ thuật PCR với nhiều tổ hợp
mồi khác nhau, nhiều điều kiện phản ứng khác nhau và 3 loại PCR khác nhau
(PCR thường, PCR lồng và Touch-Down PCR) để phát hiện phytoplasma trên
mẫu cây bệnh và rầy. Kết quả nghiên cứu đã không phát hiện được phytoplasma
trên cây bệnh cũng như trên rầy.
- Đã lần đầu tiên phát hiện và xác định được ở cả mức hình thái và phân tử
nấm Heteroepichloe bambusae gây bệnh cựa gà trên cây luồng Thanh Hóa.
- Qua nghiên cứu giải trình tự đã phát hiện được một loạt các vi khuẩn và
nấm liên quan đên rầy và cây. Trong số này, có nhóm sống nội sinh, có nhóm là
tác nhân gây bệnh cây tiềm tàng và có nhóm có thể ứng dụng trong phòng chống
4


sinh học hoặc sử dụng để tạo các chế phẩm trong y học. Các vi khuẩn và nấm

phát hiện được bao gồm:
a. Hai vi khuẩn là Wolbachia spp. và Arsenophonus sp. từ rầy nâu vằn.
Đây là các vi khuẩn sống nội sinh trong côn trùng.
b. Bảy vi khuẩn là Pantoea ananatis, Rheinheimera sp., Enterobacter sp.,
Luteibacter, Xanthomonas albilineans, một vi khuẩn chưa định danh và
Acinetobacter từ cây bị bệnh. Trong số này, đáng chú ý nhất là X.
albilineans phát hiện từ cây luồng bị bệnh sọc tím. X. albilineans là một
vi khuẩn ký sinh thực vật quan trọng, đặc biệt trên cây 1 lá mầm, thuộc
nhóm vi khuẩn biệt dưỡng (khơng thể ni cấy trên mơi trường thơng
thường), thuộc nhóm giới hạn mạch xylem, lan truyền nhờ rầy. Đây có
lẽ là một tác nhân cần chú ý khi nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh sọc
tím trong tương lai.
c. Bảy nấm túi là Shiraia sp., Fusarium sp., F. equiseti, Microdochium sp.,
Xylaria feejeensis, một nấm thuộc họ Magnaporthaceae và một nấm
thuộc bộ Pleosporales từ cây bệnh. Tất cả các lồi nấm này khơng cảm
ứng mất cân bằng hormone trong cây tới mức làm biến đổi hình thái cây
giống như nhiễm Phytoplasma. Kết quả này, cùng với công bố của
Morakotkarn et al. (2007), chứng tỏ quần thể nấm nội sinh trên cây họ
tre nứa cực kỳ đa dạng. Trong số các nấm nội sinh phát hiện được trên
cây luồng, nấm Shiraia sp. có thể được thử nghiệm để sản xuất
Hypocrellin A, một chất rất cần trong y học làm thuốc chống ung thư.
- Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo đã chứng tỏ bệnh sọc tím khơng truyền qua
tiếp xúc cơ học. Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo với 2 nấm và 2 vi khuẩn (một vi
khuẩn chưa định danh và Acinetobacter ) phân lập được từ vết bệnh sọc tím đã
khơng tạo triệu chứng điển hình.
- Chế phẩm EXIN-R khơng có tác dụng làm giảm tác hại của bệnh sọc tím
trên cây luồng.
4. Sản phẩm:
5

- Đào tạo: 01 Sinh viên
- Bài báo: 01 bài báo
- Vật liệu: 194 mẫu bệnh và 50 mẫu rầy
5. Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp
dụng
Hà Nội, Ngày 2 tháng 12 năm
2010
Cơ quan chủ trì

Chủ nhiệm đề tài

(ký, họ và tên, đóng dấu)

(ký, họ và tên)

Đã ký

Đã ký

6


LIÊN HIỆP CÁC HỘI KH & KT VIỆT NAM

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU BẢO VỆ SỨC KHOẺ
CÂY TRỒNG VÀ VẬT NUÔI

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

__________________

Hà Nội, ngày 2 tháng 12 năm 2010

DANH SÁCH TÁC GIẢ THỰC HIỆN
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ
(Danh sách những cá nhân đã đóng góp sáng tạo chủ yếu cho đề tài, dự án
được sắp xếp theo thứ tự đã thoả thuận)
1. Tên đề tài, dự án: : "Nghiên cứu bệnh do Phytoplasma hại tre luồng và biện pháp
phòng trừ”

2. Thời gian thực hiện (Bắt đầu - Kết thúc): 5/2009 – 12/2010
3. Tổ chức chủ trì: Trung tâm Nghiên cứu bảo vệ sức khoẻ cây trồng và vật nuôi
4. Cơ quan chủ quản: Liên hiệp các hội khoa học và kỹ thuật Việt Nam
5. Tác giả thực hiện đề tài/dự án trên gồm những người có tên trong danh sách sau (ghi
không quá 10 người kể cả chủ nhiệm đề tài/dự án):

Số TT

Chức danh khoa học, học

Tổ chức công tác

vị, họ và tên

1

TS. Hà Viết Cường

Bộ môn Bệnh cây – ĐH NNHN

2

Th.S. Trần Thị Như Hoa

Trung tâm nghiên cứu bảo vệ sức khoẻ
cây trồng và vật nuôi

3

Th.S. Nguyễn Thị Ngọc Lan

Trung tâm nghiên cứu bảo vệ sức khoẻ
cây trồng và vật nuôi

4

Th.S. Hà Giang

Trung tâm nghiên cứu bảo vệ sức khoẻ
cây trồng và vật nuôi
7


5

Th.S. Ngô Thị Việt Hà

Trung tâm nghiên cứu bảo vệ sức khoẻ
cây trồng và vật nuôi

6

KS. Ngô Hải Anh

Trung tâm nghiên cứu bảo vệ sức khoẻ
cây trồng và vật nuôi

7

KS. Lê Văn Hải

Trung tâm nghiên cứu bảo vệ sức khoẻ
cây trồng và vật nuôi

8

KS. Mai Thị Hiếu

Hợp tác xã Phát triển nơng thơn Quan
Hố – Thanh Hố

9

KS. Chu Văn Sáu

Hợp tác xã Phát triển nơng thơn Quan
Hố – Thanh Hố

Chủ nhiệm đề tài/dự án

Thủ trưởng tổ chức chủ trì

(Họ, tên và chữ ký)

đề tài/dự án
(Họ, tên, chữ ký và đóng dấu)

Đã ký
Đã ký

8


Môc lôc
PHẦN I: MỞ ĐẦU ...............................................................................................1
1. Đặt vấn đề..........................................................................................................1
2. Mục tiêu của đề tài ............................................................................................3
3. Nội dung nghiên cứu chính ...............................................................................3
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.....................................................................4
2.1. Lịch sử nghiên cứu Phytoplasma ...................................................................4
2.2. Hình thái Phytoplasma ...................................................................................5
2.3. Tầm quan trọng của Phytoplasma ..................................................................5
2.4. Phân loại Phytoplasma ...................................................................................6
2.5. Hình thái của Phytoplasma.............................................................................8
2.6. Triệu chứng bệnh do phytoplasma .................................................................8
2.7. Lan truyền.......................................................................................................9
2.8. Chẩn đoán.......................................................................................................9

2.9. Phòng chống .................................................................................................10
2.10. Nghiên cứu bệnh Phytoplasma trên cây họ tre nứa ...................................10
2.12. Nghiên cứu bệnh Phytoplasma ở Việt Nam...............................................12
2-13. Nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh sọc tím luồng.....................................12
PHẦN III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................................14
3.1 Phương pháp điều tra xác định mức độ nhiễm bệnh....................................14
3.2 Phương pháp thu mẫu bệnh hại....................................................................14
3.3 Phương pháp phân lập mẫu (Doungporn Morakotkarn, 2006).....................14
3.4 Phương pháp chiết DNA ..............................................................................15
3.5 Phương pháp PCR ( Polymerase Chain Reaction) xác định Phytoplasma, vi
khuẩn ...................................................................................................................16
3.6 Phương pháp PCR ( Polymerase Chain Reaction) xác định nấm. ................18
3.7 Chạy điện di trên gel agarose để kiểm tra sản phẩm PCR. ...........................19
3.8 Nhân dòng sản phẩm PCR trong vi khuẩn E.coli .......................................20
3.9 Giải trình tự DNA.........................................................................................20
9


3.10 Phân tích trình tự ........................................................................................20
3.11 Phương pháp lây bệnh nhân tạo .................................................................20
3.12 Thí nghiệm phịng trừ..................................................................................20
PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................22
CHƯƠNG 1. ĐÁNH GIÁ TÌNH HÌNH BỆNH, ĐIỀU TRA, THU THẬP MẪU
BỆNH CÁC BỆNH GIỐNG BỊ NHIỄM PHYTOPLASMA .............................23
4 Triệu chứng các bệnh giống như nhiễm Phytoplasma .....................................23
4.2 THU THẬP MẪU BỆNH .............................................................................30
4.3 MỨC ĐỘ PHỔ BIẾN CỦA CÁC BỆNH.....................................................31
4.3.1 Bệnh lá nhỏ tre, chổi phù thủy tre cảnh và trúc quân tử ............................31
4.3.2 Bệnh lá nhỏ hại luồng.................................................................................32
4.3.3 Bệnh chổi sể và sọc tím..............................................................................32

4.4 ĐÁNH GIÁ TÁC HẠI CỦA BỆNH SỌC TÍM .............................................34
4.4.1 Sự phát triển của bệnh sọc tím theo thời kỳ sinh trưởng của cây ..............34
4.4.2 Ảnh hưởng bệnh sọc tím đến kích thước thân cây luồng...........................35
CHƯƠNG 2. XÁC ĐỊNH NGUYÊN NHÂN PHYTOPLASMA......................38
4.5 ĐIỀU TRA VECTOR TRUYỀN BỆNH.......................................................38
4.5.1 Xác định vector truyền bệnh ......................................................................38
4.5.2 Điều tra vị trí cư trú của rầy nâu vằn .........................................................39
4.6 PHÁT HIỆN PHYTOPLASMA LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH .......................40
4.6.1 Chọn lọc và thiết kế các cặp mồi chẩn đoán phytoplasma. .......................40
4.6.2 Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi U3/U5..............................................44
4.6.3 Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR (U3/U5) .............................46
4.6.4 Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi P1/P7 (kết hợp với Nested – PCR) .49
4.6.5 Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi SN01119 / SN910601 .....................52
4.6.6 Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi SN910601/P7 ..................................54
4.6.7 Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi U5/Phy1R.........................................58
4.6.8 Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi Phy1F/Spacer1R và cặp mồi
Phy1F/Phy1R.......................................................................................................59
10


4.6.9 Kiểm tra PCR với cặp mồi Phy1F/Spacer2R và Phy1F/Spacer3R............64
4.6.10 Dịng hóa và giải trình tự..........................................................................73
4.6.11 Thảo luận kết quả phát hiện Phytoplasma ...............................................78
CHƯƠNG 3. XÁC ĐỊNH NẤM liên quan đẾN BỆNH.....................................80
4.7 PHÂN LÂP NẤM .........................................................................................80
4.7.1 Bệnh sọc tím luồng.....................................................................................80
4.7.2 Bệnh chổi sể ...............................................................................................82
4.7.3 Bệnh cựa gà ................................................................................................85
4.8 XÁC ĐỊNH NẤM BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG RNA RIBOSOME ......87
4.8.1 Lựa chọn mồi và vùng gien nghiên cứu.....................................................87

4.8.2 Phản ứng PCR ............................................................................................87
4.8.3 Nhân dòng sản phẩm PCR các mẫu nấm trong vi khuẩn E.coli ...............90
4.8.4 Giải trình tự mẫu nấm được nhân bởi cặp mồi ITS4/ITS5 ........................91
4.8.5 Thảo luận kết quả phát hiện và xác định nấm............................................94
CHƯƠNG 4. XÁC ĐỊNH VI KHUẨN LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH SỌC TÍM .99
4.9 PHÂN LẬP VI KHUẨN ...............................................................................99
4.10 XÁC ĐỊNH VI KHUẨN BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG MÃ HĨA RNA
RIBOSOME ......................................................................................................100
4.10.1 PCR và dịng hóa....................................................................................100
4.10.2 Giải trình tự ............................................................................................100
CHƯƠNG 5. LÂY NHIỄM NHÂN TẠO VÀ THÍ NGHIỆM PHỊNG TRỪ
BỆNH SỌC TÍM ...............................................................................................103
4.11 LÂY NHIỄM NHÂN TẠO.......................................................................103
4.12 THÍ NGHIỆM PHỊNG TRỪ ...................................................................104
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..............................................................107
5.1. Kết luận ......................................................................................................107
5.2. Đề nghị .......................................................................................................109
PHẦN VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO ..............................................................110

11


Danh mục chữ viết tắt

bp:

Base pair

DNA:

Deoxyribonucleic acid

E.coli

Escherichia coli

ha

Hec ta

PCR

Polymerase

RNA

Rebonucleic acid

Ta

Nhiệt độ gắn mồi

12


DANH MơC H×nh
Hình 2-2. Bệnh chổi phù thủy do phytoplasma trên cây trúc đen tại Hàn Quốc
(Jung et al., 2006)................................................................................................11
Hình 1-1

Bệnh chổi sể trên luồng (2 ảnh hàng trên, Thanh Hóa, 2009), trên

bương (ảnh góc trái hàng dưới, Lào Cai, 2010) và trên tre (ảnh góc phải hàng
dưới, Lào Cai, 2010) ...........................................................................................25
Hình 1-2. Bệnh sọc tím trên luồng tại Thanh Hóa (2009). A) Sọc tím trên thân,
B) Măng bất thường phát triển thành các cây rất nhỏ, C) Các măng bất thường
hình thành nhiều trên đốt thân; D) Các cành tăm mọc từ đốt thân. ....................26
Hình 1-3. Bệnh lá nhỏ trên luồng Thanh Hóa (2009) .........................................27
Hình 1-4 Bệnh chổi sể (cựa gà) trên luồng Thanh Hóa (2009)...........................28
Hình 1-5 Bệnh lá nhỏ trên tre Thanh Hóa (2009) ..............................................28
Hình 1-6 Bệnh chổi phù thủy tre cảnh tại Hà Nội – Lá bệnh và lá khỏe...........29
Hình 1-7 Bệnh chổi phù thủy trên trúc quân tử (Hưng Yên, 2009)...................29
Hình 1-8. Điều tra thu thập mẫu cây bệnh và rầy tại Thanh Hóa, Phú Thọ (2009,
20010)..................................................................................................................30
Hình 1-9 Ảnh hưởng của bệnh sọc tím đến kích thước luồng ............................35
Hình 2-1 Rầy nâu vằn (hàng trên) và rầy trắng (hàng dưới) phát hiện trên luồng
tại Ngọc Lặc – Thanh Hóa .................................................................................39
Hình 2-2 Sơ đồ cụm gen rDNA của Phytoplasma, vị trí tương đối của các mồi
và ước lượng kích thước các sản phẩm PCR ......................................................43
Hình 2-3 PCR lần thứ 5 (với cặp mồi U3/U5) trên mẫu tre, luồng. M = Thang
DNA (GeneRuler 1 kb, Fermentas). 8: Tre cảnh (P-20): chổi phù thủy, Đông
Anh (Hà Nội); 9: Luồng (P-28): lá nhỏ, Phù Đổng, Gia Lâm (Hà Nội); 11:
Luồng (L5): Sọc tím, Ngọc Lặc (Thanh Hóa) ....................................................45
Hình 2-4. Kiểm tra PCR lần 6 (với cặp mồi U3/U5). M: Thang DNA
(GeneRuler 1 kb DNA, Fermentas). Thứ tự các mẫu trình bày trong bảng 2.4 .45

13


Hình 2-5. Điện di sản phẩm PCR dùng cặp mồi U3 và U5 nhằm tạo đủ lượng

DNA cho giải trình tự. M: Thang DNA (GeneRuler 1 kb DNA, Fermentas), 1:
Luồng (P-28); 2: Tre cảnh (P-20), 3: Luồng (L5), 4: Luồng (L4) ......................46
Hình 2-6 Ước lượng sản phẩm PCR tinh chiết (U3/U5) bằng điện di agarose. M
là thang DNA, trong đó M1, M2 và M3 tương ứng với lượng dùng 1 µL, 0.5
µL và 0. 25 µL. Các mẫu đều được chạy với lượng 2 µL theo thứ tự sau: 1:
Luồng lá nhỏ (P-28), 2: Tre cảnh chổi phù thủy (P-20), 3: Luồng sọc tím (L5).46
Hình 2-7. Đồ thị trình tự nucleotide của 3 mẫu PCR được giải trình tự bằng mồi
U5 (Lần 1). ..........................................................................................................48
Hình 2-8 Sơ đồ cụm gen DNA ribosome (rDNA) của Phytoplasma và vị trí
tương đối của mồi cũng như sản phẩm PCR trong Nested-PCR dùng 2 cặp mồi
P1/P7 và U3/U5...................................................................................................49
Hình 2-9 PCR với cặp mồi P1/P7 ở nồng độ MgCl2 = 1,5µL/25µL (150 µM).
M là Thang DNA (GeneRuler 1 kb DNA Ladder, Fermentas). 1: Luồng lá nhỏ
(P-28), 2: Tre cảnh chổi sể (P-20), 3: Luồng sọc tím (L6). Băng có sản phẩm với
kíc thước mong muốn ~ 1.8 kb được chỉ bằng mũi tên ......................................52
Hình 2-10 Kết quả điện di PCR lần 1 bằng cặp mồi SN01119 / SN910601. Sản
phẩm mong đợi ~ 1,8 kb. M = Thang DNA (GeneRuler 1kb, Fermentas). Số thứ
tự các giêng tương ứng theo thứ tự các mẫu trong bảng 2-8. ...........................54
Hình 2-11 Kết quả kiểm tra PCR lần 1 với cặp mồi SN910601 / P7. M là thang
DNA (1 kb, Fermentas. Số thứ tự các cột tương ứng số thứ tự mẫu ở Bảng 2-9) . 57
Hình 2-12 Kết quả kiểm tra PCR lần 3 với cặp mồi SN910601 / P7. M là thang
DNA (1 kb, Fermentas. Số thứ tự các cột tương ứng số thứ tự mẫu ở Bảng 2-9) . 57
Hình 2-13 Kết quả kiểm tra PCR lần 1 với cặp mồi U5/Phy1R. M là thang DNA
(1 kb, Fermentas. Số thứ tự các cột tương ứng số thứ tự mẫu ở Bảng 2-10........... 59
Hình 2-14 Kết quả PCR bằng cặp mồi Phy1F/ Spacer1R và cặp mồi................60
Phy1F/Phy1R trên mẫu cây.................................................................................60
Hình 2-15 PCR bằng cặp mồi Phy1F/Phy1R trên mẫu rầy. Chỉ minh họa 8 trong
38 mẫu rầy thí nghiệm. Từ 1-3 và 6-14 là rầy nâu vằn. Từ 4-5 là rầy trắng ......61
14

Hình 2-16 Đồ thị kết quả giải trình tự sản phẩm PCR với cặp mồi Phy1F/Phy1R
đối với mẫu luồng sọc tím, rầy nâu vằn và rầy trắng (Chỉ 1 phần đồ thị trình tự
được minh họa)....................................................................................................63
Hình 2-17 Kết quả PCR thường bằng cặp mồi Phy1F/ Spacer2R và cặp mồi
Phy1F/Spacer3R. M là thang DNA (1 kb, Fermentas). Số thứ tự của các cột
tương tự như ở bảng 2-14. Mũi tên trên và dưới lần lượt chỉ sản phẩm 1.67 kb và
1.53 kb .................................................................................................................65
Hình 2-18 Kết quả TouchDown-PCR bằng cặp mồi Phy1F/Spacer3R. M là
thang DNA (1 kb, Fermentas). Băng sản phẩm mong muốn được chỉ bằng mũi
tên. Số thứ tự của các mẫu tương tự như ở bảng 2-14 ........................................66
Hình 2-19 Kết quả PCR bằng cặp mồi Phy1F/Space2R và TrueStart Taq DNA
Polymerase (Fermentas). Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ gắn mồi là 54 0C
và lượng MgCl2 (25 mM) là 1.5 µL/ 25 µL). Kích thước sản phẩm PCR mong
muốn là 1.67 kb và được chỉ rõ bằng mũi tên. M là thang DNA (GeneRuler 1
kb, Fermentas). Số thứ tự của các cột tương tự như ở bảng 2-15 (mẫu số 14
được kiểm tra trên 1 bản gel khác cho phản ứng âm). ........................................68
Hình 2-20 Đồ thị kết quả giải trình tự sản phẩm PCR với cặp mồi
Phy1F/Spacer2R (Chỉ 1 phần đồ thị trình tự được minh họa) ............................72
Hình 2-21 Đồ thị kết quả giải trình tự sản phẩm PCR được dịng hóa(Chỉ 1 phần
đồ thị trình tự được minh họa) ............................................................................78
Hình 3-1 Đặc điểm tản nấm phân lập từ mẫu sọc tím trên mơi trường T2. (A.
Tản nấm trắng, mọc thưa; B. Tản nấm màu nâu nhạt, gợn sóng, sợi mọc dẹt, tản
nấm nổi)...............................................................................................................81
Hình 3-2 Triệu chứng và dấu hiệu của bệnh “chổi phù thủy” trên cây tre tại Nhật
Bản do nấm A. take gây ra (Tanaka, 2009). DS (deseased shoots): các chồi
bệnh; AS (ascostroma): tử tọa và CS (conidiomata): khối sinh bào tử. .............82
Hình 3-3 Đặc điểm tản nấm phân lập được từ mẫu bệnh chổi sể nuôi cấy trên
mơi trường T2.( thứ tự mẫu theo bảng 3-3) ........................................................84
Hình 3-4 Mẫu nấm số 5 hình thành quả thể dạng gạc hươu. ..............................84

15


Hình3-5 Bệnh cựa gà trên luồng Thanh Hóa (trái) và bệnh “chổi phù thủy” trên
tre do nấm Heteroepichloë gây ra tại Nhật Bản (phải) (Tanaka et al., 2002) ...85
Hình 3-6 So sánh đặc điểm nấm cựa gà trên luồng Thanh Hóa (cột trái) và nấm
Heteroepichloë (cột phải, theo Tanaka et al., 2002). Hai ảnh hàng trên cùng là
hình dạng và cách xắp xếp của quả thể (perithecium) trên tử tọa. Hai ảnh hàng
giữa là một phần của túi. Hai ảnh hàng dưới cùng là bào tử túi (chú ý vẫn cịn 1
túi ở nấm Heteroepichl)...................................................................................86
Hình 3-7 Tổ chức vùng rDNA của nấm và vị trí tương đối của cặp mồi ITS4 và
ITS5 .....................................................................................................................87
Hình 3-8 Minh họa kết quả PCR bằng cặp mồi ITS4/ITS5 trên mẫu nấm thuần
phân lập từ bệnh chổi sể và sọc tím. M là thang DNA 1 kb (Fermentas). Số thứ
tự các cột tương ứng số thứ tự mẫu ở Bảng 3-4. Sản phẩm PCR (~ 0.6 kb) được
chỉ bằng mũi tên. ................................................................................................89
Hình 3-9 Minh họa kết quả PCR bằng cặp mồi ITS4/ITS5 trên các mẫu cựa gà.
M là thang DNA 100bp (Fermentas). Số thứ tự các cột tương ứng số thứ tự mẫu
ở Bảng 3-5. Kích thước sản phẩm PCR ~ 0.6 kb được chỉ bằng mũi tên..........89
Hình 3-10. Kết quả biến nạp 6 mẫu nấm vào vi khuẩn XL1-blue (không thể hiện
đĩa đối chứng và đĩa cựa gà 6) ............................................................................90
Hình 3-11 Minh họa kiểm tra PCR khuẩn lạc vi khuẩn tái tổ hợp. Băng PCR
dương (~0.6 kb) được chỉ bằng mũi tên..............................................................91
Hình 3-12 Đồ thị kết quả giải trình tự sản phẩm PCR các mẫu nấm (mồi ITS4/ITS5)
(chỉ minh họa 1 phần đồ thị trình tự của các phản ứng giải trình tự) ......................... 98
Hình 4-1 Phân lập vi khuẩn từ vết bệnh sọc tím .................................................99
Hình 4-2 PCR nhân gen mã hóa RNA ribosome của 2 mẫu vi khuẩn ST4 và ST5
bằng cặp mồi Phy1F/Phy1R. M là thang DNA 1 kb (Fermentas). Băng sản phẩm
PCR (~ 1 kb) được chỉ bằng mũi tên.................................................................100
Hình 4-3 Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR 2 mẫu vi khuẩn (mồi

Phy1F/Phy1R) và minh họa 1 phần đồ thị trình tự của các phản ứng giải trình tự
có chất lượng tốt................................................................................................102
16


Hình 5-1 Thử nghiệm phun thuốc EXIN-R phịng trừ bệnh sọc tím luồng tại đồi
Phịng Khơng – Kiên Thọ - Ngọc Lặc – Thanh Hóa. .......................................106

17


DANH MơC B¶NG
Bảng 2.1. Các nhóm phả hệ của Phytoplasma ......................................................7
Bảng 1-1 . Các bệnh giống bị nhiễm phytoplasma trên cây họ tre trúc..............23
Bảng 2-3. Kiểm tra PCR dùng cặp mồi U3/U5 (5 lần thử đầu tiên)...................44
Bảng2-4 Kiểm tra PCR dùng cặp mồi U3/U5 (lần 6) ........................................45
Bảng 2-5 Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR (cặp mồi U3/U5)........48
Bảng 2-6 PCR ở các ngưỡng nhiệt độ gắn mồi khác nhau .................................50
Bảng 2-7 PCR với cặp mồi P1/P7 ở các nồng độ MgCl2 khác nhau ................51
Bảng 2-8 Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi SN01119 / SN910601 ..............53
Bảng 2-9 Kết quả kiểm tra PCR với cặp mồi SN910601/P7 ..............................56
Bảng 2-10 Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi U5/Phy1R ...............................58
Bảng 2-11 Kiểm tra PCR bằng cặp mồi Phy1F/Spacer1R và cặp mồi
Phy1F/Phy1R trên mẫu cây.................................................................................60
Bảng 2-12 Kiểm tra PCR trên mẫu rầy bằng cặp mồi Phy1F/Phy1R.................61
Bảng 2-13 Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR nhân bằng cặp mồi
Phy1F/Phy1R.......................................................................................................62
Bảng 2-14 PCR bằng cặp mồi Phy1F/Spacer2R và Phy1F/Spacer3R................65
Bảng 2-15 Kết quả kiểm tra PCR dùng cặp mồi Phy1F/Spacer2R và TrueStart
Taq DNA Polymerase (Fermentas) .....................................................................67

Bảng 2-16 Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR nhân bằng cặp mồi
Phy1F/Spacer2R..................................................................................................71
Bảng 2-17 Kiểm tra vector tái tổ hợp (miniprep) bằng BamHI và E.coRI.......75
Bảng 2-18 Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR được dịng hóa.........................77
Bảng 3-1. Phân lập mẫu bệnh sọc tím luồng ở tỉnh Thanh Hóa .........................81
Bảng 3-2 Phân lập mẫu chổi sể trên cây luồng ...................................................83
Bảng3-3 Đặc điểm tản nấm phân lập được từ mẫu bệnh chổi sể nuôi cấy trên
môi trường T2......................................................................................................83
Bảng 3-4 Kết quả PCR bằng cặp mồi ITS4/ITS5 trên mẫu nấm nuôi cấy thuần .. 88
18


Bảng 3-5 Kết quả PCR bằng cặp mồi ITS4/ITS5 trên các mẫu cựa gà trên nấm
cựa gà...................................................................................................................89
Bảng 3-6 Kết quả giải trình tự mẫu nấm và tìm kiếm chuỗi tương đồng trên
Ngân Hàng Gen ...................................................................................................96
Bảng 4-1Kết quả giải trình tự mẫu nấm và tìm kiếm chuỗi tương đồng trên Ngân
Hàng Gen...........................................................................................................101
Bảng 5-1 Ảnh hưởng của thuốc EXIN-R đến sinh trưởng cây măng bệnh ......106

19


PHẦN I: MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Việt Nam là một trong các quốc gia có diện tích cây họ tre nứa lớn và mức
độ đa dạng cao. Cây họ tre nứa thuộc họ hịa thảo (Poaceae). Theo thống kê, có
khoảng 1250 loài thuộc 75 chi trên toàn thế giới. Việt Nam ước tính có 216 lồi
thuộc 25 chi (Nguyễn Hồng Hộ, 2005). Tổng diện tích cây họ tre nứa năm
2004 khoảng 1,6 triệu ha, trong đó 800,000 ha rừng tự nhiên thuần loài, 700.000

ha rừng tự nhiên hỗn loài và 100.000 ha rừng trồng (Nguyễn Ngọc Bình và
Phạm Đức Tuấn, 2007).
Ở Việt Nam, ngồi ý nghĩa văn hóa, nhiều lồi cây họ tre nứa cịn có giá trị
kinh tế lớn như tre, nứa, bương và đặc biệt là luồng. Cây luồng (Dendrocalamus
membranaceous) được trồng để lấy măng, nguyên liệu cho xây dựng, sản xuất
đồ mỹ nghệ và chế biến giấy. Cây luồng được trồng ở nhiều nơi nhưng đặc biệt
nhiều tại tỉnh Thanh Hóa. Tại tỉnh này, luồng là 1 trong những cây lâm nghiệp
chiến lược, cây xóa đói giảm nghèo. Năm 2006, diện tích luồng của tỉnh lên tới
69,000 ha , tập trung tại 3 huyện Quan Hóa, Lang Chánh và Ngọc Lặc. Hiện
nay, cây luồng bị một số bệnh tấn cơng trong đó đặc biệt nghiêm trọng là các
bệnh sọc tím. Ngồi ra, một số bệnh khác cũng cơng bố thấy trên luồng tại
Thanh Hóa là bệnh chổi xể (chổi phù thủy) và bệnh lá nhỏ. Bệnh sọc tím mới
xuất hiện vài năm tại các khu vực trồng luồng tại Thanh Hóa nhưng ảnh hưởng
đáng kể đến năng suất, chất lượng luồng. Đối với bệnh sọc tím, các triệu chứng
chính của bệnh là măng mọc nhiều từ gốc cây con (trên một tuổi) và mọc thành
chùm trên đốt cây trưởng thành cách mặt đất 1-2 m và ngừng sinh trưởng khi đạt
chiều cao khoảng 20-30cm; cây măng mọc từ đất có thể đạt 5-6 m nhưng đường
kính giảm mạnh. Đặc biệt trên thân măng có các sọc tím chạy từ các đốt phía
dưới lên trên. Cây bị bệnh khoảng 2-3 năm rất còi cọc. Trên cây bệnh, lá mọc ít
và nhỏ.

20


Vì các bệnh trên có triệu chứng khá giống với triệu chứng do Phytoplasma
gây ra nên năm 2007, một nghiên cứu thăm dò nhằm xác định nguyên nhân gây
bệnh đã được thực hiện. Trong nghiên cứu này, Vũ Triệu Mân và ctv (2007) đã
sử dụng kỹ thuật quan sát lát cắt siêu mỏng mơ bệnh dùng kính hiển vi điện tử
và PCR dùng một cặp mồi đặc hiệu gen mã hóa RNA ribosome nhằm kiểm tra
sự có mặt của Phytoplasma trên 2 mẫu luồng bị bệnh sọc tím. Nghiên cứu cho

thấy (i) sự có mặt của các thể vơ định hình trong tế bào mẫu bệnh và (ii) phản
ứng PCR dương tính đối với mẫu DNA chiết từ mơ cây bệnh. Dựa trên các kết
quả này, các tác giả cho rằng ngun nhân gây bệnh sọc tím tại Thanh Hóa có lẽ
do một Phytoplasma gây ra.
Phytoplasma là loại vi khuẩn đặc biệt không thể nuôi cấy được trên môi
trường nhân tạo. Vì vậy, các nghiên cứu xác định nguyên nhân thường dựa vào
các cơng cụ chẩn đốn sinh học phân tử. Hơn nữa triệu chứng do phytoplasma
gây ra thường liên quan tới sự mất cân bằng phytohormone của cây, một hiện
tượng cũng có thể do một số đối tượng khác như nấm, vi khuẩn, virus và nhện
hại gây ra nên việc chẩn đốn bệnh nhìn chung phức tạp.
Nhằm xác định chính xác tác nhân gây bệnh giống bị nhiễm Phytoplasma
trên cây họ tre nứa, đặc biệt là luồng, làm cơ sở khoa học cho việc áp dụng các
biện pháp phòng chống, được sự phê duyệt của Liên hiệp các Hội Khoa học và
Kỹ thuật Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu bệnh do
Phytoplasma hại tre luồng và biện pháp phòng trừ”

21


2. Mục tiêu của đề tài
Đề tài nhằm xác định tác nhân gây bệnh giống bị nhiễm Phytoplasma trên
tre luồng và đề xuất biện pháp kiểm soát bệnh.
3. Nội dung nghiên cứu chính
1. Điều tra, thu thập bệnh giống bị nhiễm Phytoplasma trên cây họ tre nứa, tập
trung bệnh trên luồng tại Thanh Hóa và một số tỉnh miền Bắc.
2. Đánh giá tình hình bệnh sọc tím, bệnh luồng lá nhỏ, chổi phù thuỷ trên
luồng tại Thanh Hoá.
3. Xác định nguyên nhân gây bệnh sọc tím, lá nhỏ, chổi phù thuỷ, tập trung
vào đối tượng phytoplasma.
4. Xác định vector và phương thức truyền bệnh do phytoplasma

5. Thử nghiệm và đề xuất biện pháp phòng trừ bệnh do phytoplasma

22


PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Lịch sử nghiên cứu Phytoplasma
Năm 1967, các nhà khoa học người Nhật đã khám phá ra một loại tác
nhân gây bệnh hại cây trồng hiện được gọi là Phytoplasma (trước đây được gọi
là Mycoplasma) là nguyên nhân của nhiều bệnh biến vàng cây trồng. Trước khi
khám phá ra tác nhân gây bệnh này tất cả các bệnh biến vàng cây trồng đã được
xem như là do có ngun nhân virus. Việc nghiên cứu tìm hiểu về Phytoplasma
được bắt đầu vào những năm cuối thập niên 80 và đầu thập niên 90 của thế kỷ
XX. Đầu tiên, các phân tích phả hệ dựa trên các chuỗi gen 16S rRNA và gen mã
hóa protein ribosome đã xác định chính xác vị trí của Phytoplasma là thành viên
của lớp Mollicutes. Các phân tích phả hệ đã tạo cơ sở cho việc phân loại
Phytoplasma. Tiếp theo các mồi chung (universal primer) đã được thiết kế dưạ
trên các vùng bảo thủ của gen 16S rRNA và được sử dụng trong PCR (phản ứng
trùng hợp chuỗi). PCR cho phép phát hiện Phytoplasma trên cây trồng và vectơ
côn trùng (Bertaccini, 2007; Lee et al., 2000)
Một hệ thống phân loại rõ ràng đối với Phytoplasma đã được xây dựng
dựa trên phân tích đa hình các đoạn cắt giới hạn (Restriction Enzyme Length
Polymorphic, RELP) từ gen 16S rRNA được tổng hợp bằng PCR trong những
năm 1990. Dựa trên phân tích RLFP, lần đầu tiên danh tính của nhiều
Phytoplasma gây ra hàng trăm bệnh trên cây trồng đã được xác định rõ. Điều
này đã tạo điều kiện cho việc nghiên cứu sinh thái và đa dạng di truyền của
Phytoplasma cũng như dịch bệnh học của bệnh Phytoplasma (Bertaccini, 2007;
Lee et al., 2000)
Từ năm 1967 đến năm 1994, tên Mycoplasma hay MLOs đã được sử
dụng để nghiên cứu tác nhân của nhiều bệnh biến vàng cây trồng. Năm 1994 tên

gọi Phytoplasma đã được công nhận bởi nhóm nghiên cứu Phytoplasma
(Phytoplasma Working Team) tại hội nghị lần thứ 10 của tổ chức quốc tế về
23


ngành Mycoplasma học (Mycoplasmology) thay cho tên gọi “ mycoplasma like
organism” hay MLO (Lee et al., 2000).
2.2. Hình thái Phytoplasma
Phytoplasma là vi khuẩn thiếu vách nên có hình dạng khơng cố định. Khi
quan sát dưới tiêu bản cắt ngang, chúng có dạng hình cầu, với đường kính trung
bình từ 200µm đến 800µm. Chúng cũng có thể có dạng hình sợi, hình dây, phân
nhánh (Lee et al., 2000).
2.3. Tầm quan trọng của Phytoplasma
Phytoplasma là nguyên nhân gây bệnh của hàng trăm cây trồng quan trọng
như: cây lương thực, cây rau, cây ăn quả, cây trang trí, cây gỗ và cây tre bóng
mát. Trong những năm gần đây, nhiều bệnh mới xuất hiện đã được xác định là
do Phytoplasma (Bertaccini, 2007; Lee et al., 2000).
Bệnh Phytoplasma là yếu tố hạn chế đầu tiên cho sản xuất của nhiều cây
trồng quan trọng trên tồn thế giới. Ví dụ như Phytoplasma gây vàng cây cúc tây
là một trong những yếu tố quan trọng làm giảm lợi nhuận kinh tế của nhiều loại
cây rau (như cây cà rốt, cây rau diếp, cây cần tây), cây hoa và cây cảnh (như cây
hoa lay ơn, cây tú cầu, cây hoa cúc Trung Quốc) ở Bắc Mỹ và một phần Châu
Âu. Thiệt hại kinh tế thường ở mức 10 – 25%, cá biệt có khi lên tới 80 – 90%.
Bệnh vàng cây đào làm giảm chất lượng đào và bệnh X ở cây đào làm giảm
phẩm chất và làm thất thu vụ mùa ở Mỹ. Bệnh vàng lùn lúa làm giảm sản lượng
thóc trong vài vùng ở Đơng Nam Á, bệnh chổi phù thủy ở khoai tây và bệnh ngô
lùn mọc rậm rạp làm giảm sản lượng khoai và bắp ở miền Trung và Nam Mỹ,
bệnh chổi phù thủy ở cây khoai lang và bệnh liên quan làm giảm sản lượng
khoai ở Châu Á và Austraylia, bệnh chổi phù thủy ở cây sắn làm giảm sản lượng
sắn ở Nam Mỹ. Bệnh vàng nho làm giảm chất lượng nho ở Châu Âu và

Australia. Bệnh cây lê còi cọc, cây táo phát triển quá mức và các loại cây ăn quả
khác bị còi cọc làm giảm chất lượng, sản lượng quả ở Mỹ, Châu Âu. Bệnh
Phytoplasma gây hại ở cây họ đậu như chồi phù thủy ở cây lạc, cây vừng, cây
24


đậu tương làm giảm sản lượng thu hoạch ở Châu Á, Phytoplasma gây vàng cây
đu, bệnh vàng chết cây dừa và lùn cây dâu tằm làm giảm sản lượng thu hoạch
của cây (Bertaccini, 2007; Lee et al., 2000).
Thiệt hại của Phytoplasma gây bệnh trên mỗi loại cây trồng khác nhau là
khác nhau. Có những cây trồng khi bị Phytoplasma gây hại thì bị mất trắng như
cà rốt (thiệt hại lên đến 90%), khi thì chỉ làm giảm chất lượng sản phẩm, giảm
sản lượng, từ đó làm giảm lợi ích kinh tế của người trồng trọt. Đa số các loại
bệnh do Phytoplasma gây ra thường gây ảnh hưởng đến phẩm chất và sản lượng
cây trồng, do đó dẫn đến thiệt hại về lợi ích kinh tế của người nơng dân. Nhưng
trong một vài trường hợp đặc biệt thì bệnh do Phytoplasma gây ra trên cây trồng
lại là có lợi cho sự phát triển của cây từ đó làm tăng giá trị của cây trồng như
bệnh Phytoplasma làm lùn cây hoa trạng nguyên. Bệnh làm cho cây hoa trạng
nguyên mọc rậm rạm hơn, cây lùn hơn, hoa đơn màu, đây là tính trạng có lợi mà
những người làm vườn muốn có để tạo ra những cây hoa trạng nguyên có thế
của một cây cảnh trang trí (Bertaccini, 2007; Lee et al., 2000).
2.4. Phân loại Phytoplasma
Theo khóa phân loại vi khuẩn của Bergey’s (2004), tất cả các Phytoplasma
đều được xếp vào chi Candidatus Phytoplasma (Ca. Phytoplasma), Bộ
Acholeplasmatales, Lớp Mollicutes, Ngành Firmucutes, Giới Bacteria (Vi
khuẩn).
Trên cơ sở so sánh chuỗi RNA ribosome 16S (16S rRNA), các lồi Ca.
Phytoplasma được xếp vào ít nhất 15 nhóm phả hệ (ký hiệu từ 16SrI đến
16SrXV) (Bảng 2-1), mỗi nhóm có tên riêng chẳng hạn nhóm 16SrI là nhóm
Aster yellowing (biến vàng cây cúc tây) và trên 38 phân nhóm (Bertaccini,

2007; Lee et al., 2000).

25