Các phương pháp phân tích polyphenols trong nước ép trái cây, trong bia và rượu

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP H CHÍ MINH
C
HỒ
KHOA K THUẬT HĨA HỌC
KỸ

TIỂ LUẬN MƠN HỌC
ỂU
CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CƠNG C
ƯƠNG
NG
CỤ

ĐỀ TÀI:
Các phương pháp phân tích polyphenols
ương
ng
trong nước ép trái cây, trong bia và r
c
rượu
rư
GVHD: TS. HUỲNH KHÁNH DUY
Họ viên thực hiện:
ọc
Lê Hà Việt Luân

MSHV 13053072

Thành ph Hồ Chí Minh, 12/ 2013
phố

Tiểu luận Các phương pháp phân tích cơng cụ

MỤC LỤC
1. Tổng quan ........................................................................................................................ 3
2. Cấu trúc của các polyphenol chính trong quả nho và rượu vang .................................... 4
3. Chiết tách phenolics từ quả nho ...................................................................................... 8
3.1. Phương pháp chiết lỏng-rắn ...................................................................................... 8
3.2. Tinh chế dịch chiết .................................................................................................. 10
4 . Phân tích thành phần rượu vang và chiết xuất.............................................................. 11
4.1. Xác định tổng lượng hợp chất phenolics ................................................................ 11
4.2. Chiết tách và phân tích các hợp chất phenolics (kỹ thuật sắc ký) .......................... 17
4.2.3. Phân tích, xác định các hợp chất phenolic ........................................................... 20
5. Kỹ thuật tách mới .......................................................................................................... 26
6. Kỹ thuật để Thiết lập cấu trúc Tannin (Xác định mức độ trùng hợp) ........................... 28
7. Kết luận.......................................................................................................................... 30

Lê Hà Việt Luân

Trang 2


Tiểu luận Các phương pháp phân tích cơng cụ

1. Tổng quan
Các hợp chất phenolic là những chất chuyển hóa trung gian phổ biến nhất trong
giới thực vật. Các hợp chất này có cấu trúc chung bao gồm một vịng benzen thơm với
một hoặc nhiều nhóm thế hydroxyl. Cấu trúc này đại diện cho một nhóm lớn và đa dạng
của các phân tử khác nhau được chia làm hai họ chính: flavonoids dựa trên cấu trúc C6C3-C6 trên bộ khung carbon và nhóm non-flavonoids. Trong cơ thể thực vật, phenolics
đóng một vai trò trong sự phát triển, sinh sản và trong các phản ứng phòng vệ khác nhau

của thực vật nhằm bảo vệ chống lại các tác động bên ngoài như tia UV hoặc đe dọa sinh
học như động vật ăn thịt và các tác nhân gây bệnh tấn công. Chúng cũng cấu thành các
thành phần cơ bản của các hợp chất sắc tố, tinh chất và hương vị trong thực vật.
Đa số các hợp chất phenolic (như resveratrol , quercetin , rutin , catechin ,
proanthocyanidins) đã được cơng bố có nhiều hoạt tính sinh học, bao gồm cả khả năng
bảo vệ tim mạch , chống viêm , chống ung thư , kháng virus và kháng khuẩn do các hợp
chất này chủ yếu đóng vai trị là chất chống oxy hóa và ức chế sự hoạt hóa của gốc tự do.
Các hợp chất phenolic đóng vai trị rất quan trọng cho chất lượng của sản phẩm
thực phẩm có nguồn gốc từ cây trồng nhờ vào đặc tính của chúng giúp cho sự ổn định
của sản phẩm khơng bị oxy hóa và tạo nên các đặc tính cảm quan. Thật vậy, tính chất
cảm quan rượu chủ yếu liên quan đến các hợp chất phenolic được chiết xuất từ nho trong
quá trình sản xuất rượu vang . Trong số các hợp chất thuộc nhóm phenolics, flavonoid,
bao gồm anthocyanins và flavan-3-ols, đóng góp quan trọng nhất cho chất lượng của
rượu. Anthocyanins là các hợp chất sắc tố tạo nền màu đặc trưng của rượu vang đỏ và các
chất này chủ yếu nằm trong vỏ quả nho. Flavan -3- ols tồn tại không chỉ ở dạng đơn phân
tử mà còn ở dạng đa và cao phân tử, được gọi là tannin hoặc proanthocyanidins. Tannin
là các hợp chất có nguồn gốc từ quả nho đóng vai trò quan trọng đối với chất lượng rượu
vang đỏ do đặc tính làm se, tạo vị cay, đắng và vai trò của chúng trong sự ổn định màu
sắc lâu dài của sản phẩm. Cảm giác se và vị đắng là hai đặc điểm chính của nho và là yếu
tố cảm quan xác định chất lượng tốt của sản phẩm rượu. Se là một cảm giác xúc giác,
trong khi cay, đắng là một cảm giác vị giác. Kích thước phân tử của các
Lê Hà Việt Luân

Trang 3


Tiểu luận Các phương pháp phân tích cơng cụ

proanthocyanidins ảnh hưởng đến tính cay, đắng tương đối của chúng và mức độ se. Nhìn
chung, hợp chất đơn phân tử tạo cảm giác cay, đắng nhiều hơn là cảm giác làm se, trong

khi tính chất đó ngược lại đối với trường hợp của các chất dẫn xuất khối lượng phân tử
lớn. Đối với các hợp chất tanin của hạt nho, giảm mức độ galloylation làm giảm cảm giác
se.
Việc định danh và định lượng các thành phần cũng như nghiên cứu các yếu tố ảnh
hưởng đến thành phần của các chất có hoạt tính sinh học bằng cách sử dụng các phương
pháp phân tích có độ nhạy cao và độ chính xác đáng tin cậy đang được ưu tiên phát triển
hàng đầu. Một số cấu trúc chung của các hợp chất phenolics (catechin, proanthocyanidin,
anthocyanin, ...) đã được xác định và định lượng trong rượu vang nhưng những hợp chất
khác như phenol khối lượng phân tử cao hoặc các hợp chất mới được hình thành trong
q trình lão hóa rượu vang vẫn cịn đang được nghiên cứu. Nhiều phương pháp khác
nhau đã được cải thiện qua thời gian. Nhìn chung, các phương pháp cho phép xác định
một chỉ số tổng (ví dụ , "tổng số polyphenol") chủ yếu được thực hiện bằng cách phân
tích quang phổ, sau đó tiếp tục thực hiện các phép phân tích chi tiết hơn dựa trên phương
pháp phân tách từng hợp chất polyphenolic khác nhau được thực hiện bằng sắc ký lỏng
hiệu năng cao hoặc điện di mao quản và các cấu trúc này được xác định bởi máy dò khác
nhau, UV -vis và phổ khối lượng.

2. Cấu trúc của các polyphenol chính trong quả nho và rượu vang
Thành phần các hợp chất phenolics trong rượu vang phụ thuộc vào nguồn gốc loại
nho được sử dụng và quy trình sản xuất rượu. Cấu trúc của các hợp chất phenolics bao
gồm các vòng thơm đơn giản với trọng lượng phân tử thấp đến các tannin trọng lượng
phân tử cao với cấu trúc phức tạp. Hai nhóm các hợp chất phenolic được chia làm hai họ
chính: flavonoids dựa trên cấu trúc C6-C3-C6 trên bộ khung carbon và nhóm nonflavonoids.
Trong số các chất non-flavonoids, hợp chất chính là axit phenolic (axit
hydroxybenzoic), axit hydroxycinnamic và stilbens. Axit hydroxybenzoic có cấu trúc C6Lê Hà Việt Luân

Trang 4


Tiểu luận Các phương pháp phân tích cơng cụ

C1, bao gồm một vịng benzen với một nhóm thế -COOH trên vòng. Các dẫn chất acid
khác được phân biệt bởi các nhóm thế R1-R4 lần lượt trên vịng benzen tương ứng của
chúng. Vanillic, syringic và gallic acids là các hợp chất chính từ cấu trúc cơ bản này (cấu
trúc của chúng được minh họa trong hình 1). Một số axit hydroxycinnamic (C6-C3) có
mặt trong nho và rượu vang . Chúng được xác định tồn tại ở dạng tự do với lượng nhỏ,
chủ yếu là tồn tại ở dạng ester hóa, đặc biệt là với axit tartaric. Các hợp chất này cũng có
thể tồn tại ở dạng ester glycosides đơn giản của glucose. Một họ polyphenol cấu trúc
phức tạp hơn cũng có mặt trong nho, gỗ sồi và rượu đó là Stilbenes, các phân tử này có
hai vịng benzen, được liên kết bởi phân tử ethane, hoặc có thể là chuỗi ethylene. Trong
số các hợp chất đồng phân dạng trans, resveratrol, hoặc 3,5,4 - trihydroxystilben (Hình 1),
được cho là được sản xuất bởi dây nho như một phản ứng tự nhiên khi cây bị nhiễm nấm.

Lê Hà Việt Luân

Trang 5


Tiểu luận Các phương pháp phân tích cơng cụ

Hình 1 - Cấu trúc của một số phenolics đơn phân tử quan trọng trong nho và rượu vang

Flavonoids, các thành phần phenolics chính trong nho và các loại rượu vang, có
một cấu trúc khung carbon chung, bao gồm ba vòng (A, B, C). Họ phenolics này được
phân chia thành các phân nhóm thứ cấp khác nhau bao gồm, flavones , flavonols ,
flavanones , flavanols và anthocyanins phân biệt trong cấu trúc bởi độ chưa bão hịa của
vịng carbon và các nhóm thế khác nhau tương ứng (Hình 1).
Anthocyanins là hợp chất đặc trưng phân bố ở vỏ của các loại nho có sắc đỏ. Cấu
trúc của chúng là phân tử flavylium cation, bao gồm hai vòng benzen được liên kết bởi
một dị vịng có oxy chưa bão hịa ở dạng cationic, dẫn xuất từ phân tử 2-phenylbenzopyrylium (Hình 1) . Chúng là các dẫn xuất glucosylate hóa của năm aglycones hoặc

anthocyanidins bao gồm: cyanidin , peonidin , petunidin , delphinidin và malvidin.
Lê Hà Việt Luân

Trang 6


Tiểu luận Các phương pháp phân tích cơng cụ

Flavan-3-ols hình thành các phân nhóm flavonoid thứ cấp có cấu trúc phức tạp hơn (Hình
1). Các hợp chất này bao gồm đơn phân tử đơn giản như (+)-catechin và (-)-epicatechin

nhưng cũng có thể ở dạng đa phân tử hoặc các polymer cao phân tử gọi là
proanthocyanidins vì chúng bị phân hủy giải phóng anthocyanidins khi bị nung nóng
trong dung dịch có tính axit (Hình 2). Cấu trúc của các proanthocyanin khác nhau về bản
chất của các tiểu phân cấu tạo của chúng, và mức độ trùng hợp ( mDP ) trung bình và vị
trí liên kết.

Hình 2 - Cấu trúc của proanthocyanidins: flavan-3-ol được liên kết tại vị trí C4-C8 / C4-C6

Các hợp chất này phân bố trong tất cả các phần của quả nho nhưng phần vỏ có
chứa một lượng proanthocyanidins thấp hơn trong hạt và đặc điểm cấu trúc của chúng
cũng khác nhau. Proanthocyanidins trong hạt nho chỉ bao gồm procyanidin (tiểu phân
được cấu thành từ (+)-catechin (C) và (-)-epicatechin (EC)), trong khi proanthocyanidins
ở phần vỏ nho bao gồm cả prodelphinidins và procyanidinsand [tiểu phân cấu thành từ ()-epigallocatechin (EGC)]. Proanthocyanidins ở phần vỏ quả nho có mDP cao hơn và có
tỷ lệ của tiểu phân galloylated thấp hơn ở trong hạt. Tannin là các hợp chất có nguồn gốc
từ quả nho đóng vai trị quan trọng đối với chất lượng rượu vang đỏ do đặc tính làm se,
tạo vị cay, đắng và vai trò của chúng trong sự ổn định màu sắc lâu dài của sản phẩm.

Lê Hà Việt Luân

Trang 7


Tiểu luận Các phương pháp phân tích cơng cụ

3. Chiết tách phenolics từ quả nho
Để phân tích cấu trúc đặc trưng của các hợp chất phenolics, các thành phần
anthocyanins hoặc tannin trước tiên cần được chiết tách từ mẫu nho. Trong trường hợp
sản phẩm rượu vang, một số tác giả đề nghị rằng mẫu rượu không cần qua bất kỳ xử lý
đặc biệt nào trước mà có thể được bơm trực tiếp vào thiết bị phân tích trong khi những
tác giả khác cho rằng việc chiết tách, định lượng và định danh sẽ cho kết quả tốt hơn nếu
thực hiện một số bước tinh chế mẫu trước khi phân tích (điểm này sẽ được trình bày kỹ
hơn trong phần phương pháp phân tích).
3.1. Phương pháp chiết lỏng-rắn
Hạt nho và phần vỏ được tách riêng trước khi được chiết bằng các dung môi như
acetone trong dung môi nước và đôi khi được tiếp tục chiết tách với dung dịch methanol.
Anthocyanins và anthocyanidins thường được chiết từ phần vỏ hoặc phần pomaces với
dung mơi hữu cơ được axit hóa, thường là methanol.
Hiện nay, những phương pháp chiết tách rắn - lỏng trên được thay thế bằng các kỹ
thuật mới như chiết bằng chất lỏng được nén ở áp suất cao, phương pháp siêu âm, điện và
hỗ trợ vi sóng. Những kỹ thuật này giúp rút ngắn thời gian chiết, giảm lượng dung mơi
tiêu thụ, làm tăng hiệu quả q trình chiết tách.
Phương pháp chiết bằng chất lỏng được nén áp ở suất cao (PLE) trong thương mại
được gọi là phương pháp chiết dung mơi tăng tốc (ASE). Mơ hình của hệ thống này được
mơ tả trong Hình 3. Phương pháp này cho phép chiết tách nhanh chóng hợp chất cần phân
tích trong một mơi trường kín và trơ dưới áp lực cao (3,3-20,3 MPa) và nhiệt độ từ 40200 °C. Ưu điểm chính của kỹ thuật này là dung mơi vẫn cịn trong trạng thái lỏng ở
nhiệt độ cao hơn nhiệt độ sôi của chúng, điều này cho phép việc chiết tách thực hiện ở
nhiệt độ cao làm tăng khả năng hòa tan chất cần phân tích trong dung mơi và giải hấp
động học nhanh hơn từ hỗn hợp nền ban đầu.

Lê Hà Việt Luân

Trang 8


Tiểu luận Các phương pháp phân tích cơng cụ

Hình 3 - Mơ hình hệ thống thiết bị PLE

Do đó, các dung mơi chiết tách bao gồm cả nước (ít hiệu quả khi sử dụng trong
chiết tách chất thực vật ở nhiệt độ thấp) có thể hiệu quả hơn nhiều khi áp dụng phương
pháp PLE. Trong nghiên cứu của mình, Ju và Howard cho thấy phương pháp PLE: ở
nhiệt độ cao (80-100 °C) và sử dụng nước axit hóa mang lại hiệu quả chiết tách tương
đương khi sử dụng methanol 60 % axit hóa trong chiết tách anthocyanin từ vỏ trái nho.
Trong các nghiên cứu khác, hiệu suất chiết tổng lượng polyphenol và flavonoid từ vỏ trái
nho Pinot thu được khi tiến hành tại 150 °C rất cao mặc dù các hợp chất flavonoids có xu
hướng phân hủy khi thời gian chiết kéo dài (hơn 210 phút). Bên cạnh đó, Pineiro và đồng
nghiệp cho thấy thí nghiệm chiết tách hạt nho bằng PLE sử dụng methanol như dung môi
cho kết quả về độ thu hồi của catechin và epicatechin đặc biệt cao hơn so với những
trường hợp thu được bằng phương pháp khuấy từ hoặc chiết tách dưới sự hỗ trợ của sóng
siêu.
Một phương pháp chiết khác là kỹ thuật hỗ trợ điện áp trong quá trình chiết tách.
Boussetta và đồng nghiệp nhận thấy rằng quá trình chiết tách vỏ trái nho Chardonnay với
sự hỗ trợ bằng xung điện trường (PEF) và điện áp cao (HVED) giúp tăng tốc quá trình
chiết tách các chất tan và polyphenol trong nước ở 20 °C về mặt độc học. Kỹ thuật
HVED được giải thích do có khả năng tạo ra các sóng xung kích giúp hỗ trợ sự phá vỡ
Lê Hà Việt Luân

Trang 9

Tiểu luận Các phương pháp phân tích cơng cụ

mơ và vách các tế bào trong trái nho, phóng thích polyphenols làm tăng tốc quá trình
khuếch tán polyphenols. Tuy nhiện, một số thơng số quan trọng phải được tối ưu hóa vì
phương pháp chiết tách hỗ trợ điện áp tiến hành quá lâu có thể ảnh hưởng làm phân hủy
polyphenols dẫn đến giảm nồng độ của chúng trong dịch chiết. Hơn nữa, các nghiên cứu
này được thực hiện chủ yếu trên catechin hoặc tổng lượng phenols chứ chưa áp dụng cho
việc chiết tách các hợp chất dễ bị oxy hóa như anthocyanins.
Cuối cùng, phương pháp chiết tách có hỗ trợ vi sóng giúp thúc đẩy q trình
truyền năng lượng trong tồn bộ môi trường chiết (dung môi và chất nền) một cách hiệu
quả và đồng đều. Ứng dụng các điều kiện tối ưu để chiết hạt nho Cabernet-Sauvignon,
Shiraz, Sauvignon blanc và Chardonnay công bố rằng khoảng 92 % trong tổng số
polyphenol được chiết tách, kết quả thu được tốt hơn so với các phương pháp chiết khác
(siêu âm, ... ).
3.2. Tinh chế dịch chiết
Sản phẩm thu được từ các phương pháp chiết tách rắn - lỏng trình bày ở trên là
một hỗn hợp thơ mà độ tinh khiết vẫn có thể được nâng cao bằng các phương pháp tinh
chế. Vì vậy, các phương pháp chiết lỏng/ lỏng ở các phân đoạn khác nhau có thể sử dụng
nhằm làm tinh khiết và tách các phân đoạn procyanidin khác nhau về khối lượng phân tử.
Như vậy, sau khi loại bỏ các chất ưa dầu bằng chloroform, Lorrain và đồng nghiệp sử
dụng ethyl acetate để phân tách các phần proanthocyanidin đơn và đa phân tử trong pha
hữu cơ với các phần proanthocyanidin cao phân tử trong pha nước.
Các phân đoạn tinh hơn (bảy phần từ DPM 3-12) có thể thu được bằng cách tiếp
tục thực hiện chiết lỏng / lỏng với tỷ lệ tăng dần của chloroform trong methanol. Ngồi
ra, có thể làm giàu và chiết tách phần dịch chiết thô bởi phương pháp sắc ký lỏng pha
thuận (C18) hoặc bằng phương pháp tách chiết pha rắn sử dụng chất hấp thụ đa dạng như
C18 , XAD hoặc PVPP.

Lê Hà Việt Luân

Trang 10


Tiểu luận Các phương pháp phân tích cơng cụ

4 . Phân tích thành phần rượu vang và chiết xuất
Hiện nay, hai phương pháp tiếp cận chung để phân tích và xác định tổng hàm
lượng polyphenolic trong dịch chiết và trong rượu vang được sử dụng. Một là phương
pháp xác định chỉ số polyphenol tổng bằng các phép phân tích quang phổ, hai là việc
chiết tách các thành phần hợp chất phenolics riêng biệt và phân tích từng thành phần.
4.1. Xác định tổng lượng hợp chất phenolics
Một số phương pháp quang phổ để định lượng các hợp chất phenolics trong
nguyên liệu thực vật đã được phát triển. Những phương pháp này dựa trên các nguyên tắc
khác nhau và được sử dụng để xác định các nhóm chức khác nhau hiện diện trong cấu
trúc các hợp chất phenolics. Nhìn chung, phương pháp đơn giản nhất cho kết quả dự đoán
nhanh tổng hàm lượng hợp chất phenolic trong rượu hoặc dịch chiết là đo độ hấp thụ ở
280 nm (với độ pha loãng mẫu thích hợp). Giá trị này được dựa trên phổ hấp thu đặc
trưng của các vòng benzen trong đa số cấu trúc hợp chất phenolics ở 280 nm.
Phương pháp này có ưu điểm là tiết kiệm thời gian và có tính lặp. Tuy nhiên, một
số các phân tử nhất định, chẳng hạn như axit cinnamic và Chalcone, khơng có độ hấp thụ
tối đa ở bước sóng này. Tuy nhiên, do chúng có mặt trong rượu ở nồng độ rất thấp, bất kỳ
sai biệt nào trong các giá trị kết quả thu được sẽ rất nhỏ và chấp nhận được. Mặt khác,
các phân tử khơng thuộc nhóm phenolics có thể có một vịng benzen (amino acid) do đó
có độ hấp thụ ở 280 nm sẽ gây sai biệt trong kết quả phân tích tổng hàm lượng.
Một phương pháp khác cho một phép xác định hàm lượng phenol tổng là thí
nghiệm Folin-Ciocalteu đặc hiệu cho các nhóm phenol do tính chất khử của chúng. Trên
thực tế, phương pháp này là phản ứng khử các axit phosphomolybdic của các hợp chất
phenolic trong môi trường kiềm tạo thành một phức chất màu xanh. Tuy nhiên, phương
pháp này vẫn khơng đặc trưng vì một số nhóm phenolic chiết từ protein hoặc các chất có

tính khử như acid ascorbic cũng có thể tham gia vào các phản ứng khử nêu trên. Các
phương pháp riêng biệt hơn như định lượng vanillin, DMACH, Bate-Smith đã được đề
xuất để xác định hàm lượng của proanthocyanidic tannin.

Lê Hà Việt Luân

Trang 11


Tiểu luận Các phương pháp phân tích cơng cụ

Định lượng Vanillin và DMACH dựa trên sự hình thành của các sản phẩm màu từ
phản ứng giữa tannin và các chất phản ứng họ aldehyde trong khi phương pháp BateSmith dựa trên sự depolymerization của proanthocyanidin qua sự phân hủy của các liên
kết flavonol nội phân tử trong mơi trường có tính axit khi được gia nhiệt. Sự phân hủy
này dẫn đến sự hình thành các carbon cation một phần được chuyển đổi thành cyanidins
đỏ (với sự hấp thụ đặc trưng tại 550 nm) nếu môi trường thuận lợi cho quá trình oxy hóa.
Các phương pháp khác dựa trên phản ứng tạo kết tủa chọn lọc với tanin bằng
protein (ví dụ albumin huyết thanh bò) hoặc các thuốc thử khác như polymer
(Polyetylenglycol, polyvinylpyrrolidone, ...). Methyl cellulose, một dạng polysacharride,
cũng được sử dụng để thực hiện phản ứng kết tủa cho việc định lượng tannin trong rượu
vang đỏ hoặc dịch chiết từ nho, gọi tắt là phương pháp định lượng tannin bằng MCP.
Phương pháp này được dựa trên tương tác polymer-tanin, tạo thành phức chất khơng tan.
Nhìn chung, tất cả các phương pháp trên đều phụ thuộc vào nhiều yếu tố bao gồm
pH, điểm đẳng điện, lực ion, cấu tạo protein và nhiệt độ. Nhìn chung, những phương
pháp này thiếu tính đặc trưng và lặp lại. Cuối cùng, liên quan đến định lượng
anthocyanins, các phương pháp hóa học dựa trên các thuộc tính đặc trưng của
anthocyanins: biến đổi màu sắc theo độ pH và phản ứng tẩy trắng bằng sulfur dioxide đã
được đề nghị.
Các phương pháp quang phổ truyền thống có thể dẫn đến kết quả xác định tế hàm
lượng tổng các polyphenol của dịch chiết thô cao hơn mức thực tế do sự ảnh hưởng bởi

các hợp chất có thể hấp thụ tia UV. Hơn nữa, các phương pháp này tiêu tốn thời gian và
nhiều dung môi (phương pháp Folin, Bate-Smith).Các phương pháp mới đang được phát
triển để quy trình thực hiện đơn giản hơn, cho kết quả phân tích đáng tin cậy và có thể
phổ biến trên phạm vi tồn cầu. Trong số đó, kỹ thuật phân tích điện và phổ hồng ngoại
(IR) được xem là có nhiều tiềm năng nhất.
Trong thời gian gần đây, các phương pháp điện hóa khác nhau đã được đề xuất để
định tính và định lượng polyphenol trong rượu vang trên cơ sở là tất cả các hợp chất
polyphenolic có trong rượu vang là hợp chất hoạt động điện hóa học. Thật vậy, các đặc
tính chống oxy hóa của các hợp chất này có liên quan đến khả năng của chúng có thể cho
Lê Hà Việt Luân

Trang 12


Tiểu luận Các phương pháp phân tích cơng cụ

đi điện tử. Vì vậy, hầu hết các đặc tính điện và sự oxy hóa điện hóa của các hợp chất này
được khai thác cho các thí nghiệm phân tích. Những đặc tính này cho phép phát hiện có
chọn lọc các polyphenol với độ nhạy cao, ngay cả trong các mẫu rất phức tạp, chẳng hạn
như rượu vang.
Clyclic voltametry (CV) là phương pháp điện hóa đầu tiên được sử dụng để phân
tích đặc tính của các chất polyphenols và xác định hàm lượng tổng polyphenol trong rượu
(Hình 4). Kilmartin và đồng nghiệp đầu tiên sử dụng kỹ thuật này để xác định một loạt
các nhóm hợp chất axit phenolic và flavonoid, acid ascorbic và metabisulfite natri, các
chất này có vai trị quan trọng đối với khả năng chống oxy hóa của rượu.

Hình 4 - Thiết bị Clyclic voltametry

Các tác giả chỉ ra rằng điện cực carbon thủy tinh là tốt nhất cho thí nghiệm này vì
nó giảm thiểu sự ảnh hưởng của ethanol do có khả năng ơxi hóa tại các điện cực kim loại

trơ như bạch kim và vàng. Kết quả cho thấy sự hiện diện của các tín hiệu điện tại các điện
thế tương ứng có tương quan với sự hiện diện của các chất polyphenolics có hoạt tính
chống oxy hóa cao, trong khi những hợp chất với tính chống oxy hóa thấp cho thấy tính
hiệu điện ở điện thế dương cao hơn.
Kết quả cho thấy rằng, các chất dễ bị oxy hóa như ortho-diphenols có một tính
hiệu ở điện thế thấp khoảng 400 mV, các anthocyanin trong rượu vang đỏ có tín hiệu cao
hơn ở 650 mV, và các hợp chất có nhóm chức khó bị oxy hóa có tín hiện ở điện thế cao
hơn cả, tính chất này giúp phân biệt các hợp chất này. Trong nghiên cứu của mình,
Inanother, De Beer và đồng nghiệp đã cố gắng so sánh kết quả xác định các chất phenolic

Lê Hà Việt Luân

Trang 13


Tiểu luận Các phương pháp phân tích cơng cụ

thu được bằng các phương pháp khác nhau. Họ cập đến việc sử dụng CV để đo tổng số
phenol sử dụng Q500 (500 mV) có những nhược điểm bởi kết quả chỉ phản ánh hàm
lượng tổng chất phenolics có chứa pyrogallol, gallate, và các nhóm catechol trong
monome, oligomer hoặc các polymer như flavanol, proanthocyanidins, flavonol và axit
phenolic. Thật vậy, phần lớn anthocyanins là hợp chất phenol trong rượu vang trắng chỉ
cho tín hiệu anốt tại điện thế cao hơn 500 mV không bao gồm trong kết quả phân tích
này.
Tuy nhiên, việc xác định lượng các chất phenol tại điện thế cao hơn là khá phức
tạp do sản phẩm của quá trình oxy hóa polyphenol tích tụ trên bề mặt điện cực anode tại
các điện thế cao. Tuy nhiên, mặc dù có những nhược điểm nhưng phương pháp CV có
thể cung cấp thơng tin định tính và bán định lượng về hàm lượng polyphenol và có mối
tương quan so với các phương pháp khác (Folin Ciocalteu, RP-HPLC).
Gần đây, Sanchez Arribas và đồng nghiệp trình bày phương án cải tiến phương

pháp CV bằng sự thay đổi điện cực cacbon thủy tinh với một ống nano carbon đa vách và
nối với một thiết bị phân tích tiêm mẫu. Họ cho thấy ưu điểm của điện cực cải tiến này là
cho phép cung cấp độ nhạy và độ ổn định cao được minh chứng bằng các kết quả phẩn
tích tổng số polyphenol trong rượu vang. Tác giả cho rằng có thể sử dụng thiết bị này để
ứng dụng thực tế trong phân tích mà kết quả ổn định được yêu cầu trong thời gian dài.
Phương pháp Differential pulse voltametry (DPV) cũng đã được ứng dụng trong phân
tích các polyphenol trong các loại thực phẩm cho đến khi Seruga và đồng nghiệp cố gắng
áp dụng phương pháp này cho phấn tích các loại rượu vang. Họ thực hiện một nghiên cứu
đầy đủ bởi phương pháp DPV, HPLC và phương pháp quang phổ trong 11 loại rượu vang
đỏ Croatia. Trong phương pháp DPV, họ nhận thấy ba đỉnh tính hiệu anốt oxy hóa lớn
trên voltammograms rượu (P1, P2, P3) (Hình 5).

Lê Hà Việt Luân

Trang 14


Tiểu luận Các phương pháp phân tích cơng cụ

Hình 5 - Biểu đồ voltammograms của rượu vang đỏ: (a) Frankovka, (b) Pinot noir, (c)
Zweigelt, (d) Plavac Hvar, (e) Ivan Dolac

Seruga và đồng nghiệp cho thấy DPV là một phương pháp có độ nhạy cao và chọn
lọc để xác định tổng hàm lượng polyphenol trong rượu vang đỏ và là cải tiến đáng kể so
với phương pháp voltametry vòng (CV) và phương pháp Folin Ciocalteu. Nhìn chung, kỹ
thuật voltametry đã trở thành lựa chọn thay thế so với phương pháp quang phổ truyền
thống. Tuy nhiên, kinh nghiệm của người làm thí nghiệm cần thiết để đảm bảo tính lặp lại
và thống nhất kết quả.
Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) là kỹ thuật nhanh chóng, chính xác và khơng
phá hủy mẫu. Đây là một thay thế cho phân tích hóa học thơng thường đặc biệt để theo

dõi sự biến đổi trên thực tế của các thành phần khác nhau trong quá trình sản xuất rượu
vang cũng như q trình lão hóa của nho. Do đó, một số nghiên cứu thực hiện trên các
giống nho khác nhau đã chỉ ra rằng quan phổ hồng ngoại gần (NIR) và hồng ngoại trung
(MIR) kết hợp với phân tích đa biến là phù hợp để đánh giá sự phát triển của các thơng số
hóa học chính tham gia vào quá trình lên men rượu vang cũng như các hợp chất phenolic
(phenolic tổng, tổng tannin và anthocyanin tổng số) độc lập về những thay đổi liên tục
của ma trận trong quá trình sản xuất rượu vang và cung cấp thông tin quan trọng về chất
lượng của sản phẩm cuối cùng.
Lê Hà Việt Luân

Trang 15


Tiểu luận Các phương pháp phân tích cơng cụ

Phổ NIR còn được sử dụng để xác định các hợp chất phenolic trong vỏ, hạt hoặc
quả còn nguyên vẹn. Ferrer-Gallego và đồng nghiệp đã xác định nồng độ của các họ
phenolics chính (flavanol, anthocyanins, flavonol và axit phenolic) và tổng hàm lượng
hợp chất phenolic trong vỏ nho và quả nho đỏ trong q trình chín.
Các tác giả đã phát triển các mơ hình cho phép xác định nồng độ chính xác và
nhận định rằng kết quả tốt nhất thường thu được trực tiếp ghi quang phổ của nho còn
nguyên vẹn do sự vắng mặt thực tế của mẫu ofthe thao tác đó là cần thiết. Các tác giả
cũng có cơng bố một nghiên cứu về khả năng sử dụng NIR để đánh giá thành phần
flavanol monomeric và oligomeric trong hạt.
Rolle và đồng nghiệp đã phát triển một phương pháp để đánh giá tổng hàm lượng
phenol có trong hạt nho sử dụng quang phổ Fourier Transform-Near Infrared (FT-NIR).
Họ thu được kết quả đầy hứa hẹn nhưng nhấn mạnh sự cần thiết phải cải thiện mơ hình
này. Cuối cùng, quang phổ hồng ngoại đã được sử dụng trực tiếp trong quả nho để xác
định tổng hàm lượng anthocyanin cũng như các anthocyanins có thể chiết xuất được (pH
1 và 3.2) và tổng hàm lượng phenol. Họ báo cáo các kết quả khác nhau đối với các giống

nho khác nhau; anthocyanin chiết ở pH 1.0 và pH 3.2 có thể được dự đốn từ quang phổ
cận hồng ngoại của toàn bộ quả nho trong trường hợp của nho Syrah, trong khi họ không
thể được dự đoán giống như đối với các giống nho khác như Cabernet-Sauvignon, Merlot
và Carmenere.
Mặt khác, Cozzolino và đồng nghiệp cũng cho thấy giá trị thấp không phù hợp của
R trong kết quả ước tính tổng anthocyanins trong quả nho cịn nguyên vẹn. Nhìn chung,
sự phát triển và ứng dụng kỹ thuật hồng ngoại có thể trở thành một cơng cụ chính xác và
hiệu quả để hỗ trợ việc ra quyết định tại thời điểm thu hoạch và theo dõi quá trình sản
xuất rượu vang. Tuy nhiên, kết hợp các phương pháp hóa học và xử lý thống kê cần được
sử dụng để hiệu chuẩn cũng như là việc thu thập các bộ dữ liệu của các loài nho hoặc
rượu vang (khu vực khác nhau sản xuất, giống nho khác nhau, giai đoạn trưởng thành
khác nhau, loại rượu khác nhau đối với rượu vang) cần được sử dụng để hiệu chuẩn là rất
quan trọng để luôn luôn thu được kết quả đáng tin cậy.

Lê Hà Việt Luân

Trang 16


Tiểu luận Các phương pháp phân tích cơng cụ

4.2. Chiết tách và phân tích các hợp chất phenolics (kỹ thuật sắc ký)
Kỹ thuật HPLC được sử dụng rộng rãi cho việc chiết tách và định lượng các hợp
chất phenolic. Các công cụ hỗ trợ khác nhau, pha động, cột và thiết bị đầu dị để phân
tích các anthocyanins, procyanidin, flavonol, flavan-3-ols, và các axit phenolic. Một số
phương pháp tập trung ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm, bài viết sẽ tập trung đến
những tiến bộ gần đây liên quan đến phân tích trong nho và rượu.
4.2.1. Chuẩn bị mẫu
Đối với mẫu rượu vang, bước chuẩn bị mẫu trước khi phân tích đơi khi rất cần
thiết vì tính phức tạp của sắc ký đồ. Phương pháp chiết lỏng-lỏng và chiết pha rắn được

sử dụng rộng rãi nhất để đơn giản hóa các sắc ký đồ của mẫu rượu. Porgaly và
Büyüktuncel đã cho thấy chiết lỏng-lỏng rượu vang với ethyl acetate ở pH 2 thực sự cải
thiện dữ liệu sắc ký thu được của họ. Ngược lại, trong nhiều cơng trình, các loại mẫu
rượu vang được lọc và tiêm mà không cần bất kỳ sự chuẩn bị mẫu trước. Độ phân giải
của các đỉnh của hợp chất chính ln ln chấp nhận được. Liên quan đến nho hoặc từ
chiết xuất, một phương pháp đơn là giản hịa tan bột khơ trong dung mơi thích hợp, tiếp
theo bước lọc trước khi tiêm vào thiết bị phân tích.
4.2.2. Cột
Sắc ký lỏng đảo pha trên C18 hoặc pha tĩnh tương đương thích hợp là phương
pháp phổ biến nhất được sử dụng cho việc tách anthocyanins cũng như các hợp chất
phenolic chính (proanthocyanidins, flavonol, axit phenolic. Các cột này thường chứa chặt
các hạt hình cầu của silica liên kết nhờ chuỗi octadecyl (C18). Tuy nhiên, những phân
tích sắc ký này thường mất quá nhiều thời gian và đôi khi phải được bắt đầu bằng một
bước dọn rửa dũng cụ trước khi phân tích tốn thời gian. Trong quan điểm này, phương
pháp sử dụng cột đơn khối cho việc nhồi cột đã được đề xuất trong phân tích phenolic.
Các tính năng đặc trưng của vật liệu khơng hạt là một nhân vật liên tục của bộ
xương, đáp ứng đầy đủ các phòng tách biệt. Do cấu trúc cứng và xốp của các vật liệu này,
chúng cho phép các dịng dung mơi chảy qua cột nhanh hơn, thời gian thí nghiệm ngắn
Lê Hà Việt Luân

Trang 17


Tiểu luận Các phương pháp phân tích cơng cụ

hơn và cột nhanh chóng tái cân bằng giữa chạy. Một số nghiên cứu chứng minh những ưu
điểm của loại cột này. Ví dụ, Castellari et al. báo cáo rằng cột nguyên khối có thể hoạt
động ở một vận tốc dịng chảy cao hơn so với dịng chảy trong cột RP thơng thường với
sự sụt giảm áp lực giảm và thời gian rửa ngắn hơn và cũng như tái cân bằng nhanh hơn.
Một kết quả chiết tách nhanh (36 phút) của các hợp chất phenol monomeric và cải

thiện tín hiệu / nhiễu đã đạt được nhờ sử dụng loại cột này. Liazid và đồng nghiệp phát
triển một phương pháp nhanh chóng hơn (8 phút) cho phép tách và định lượng 13 họ
polypheno trong rượu vang bằng cách sử dụng một cột nguyên khối RP-18E. Các tác giả
cho thấy rằng phương pháp của họ cung cấp kết quả đáng tin cậy, độ phân giải cao và có
tính lặp và có thể được áp dụng cho mẫu thực có chứa các họ khác nhau của hợp chất
phenolics.
Phương pháp LC pha đảo có thể cung cấp thơng tin cụ thể về các nhóm chất khác
nhau của các chất phenolics trong rượu vang đỏ nhưng giới hạn khả năng của phương
pháp này đối với phân tích các hợp chất có khối lượng phân tử cao. Kennedy và
Waterhouse đã đề nghị sử dụng phương pháp sắc ký pha thuận (NP-LC) cho phép phân
tích các proanthocyanidins cao phân tử khi có sự hiện diện của anthocyanin. Họ đã phát
triển một phương pháp mới sử dụng cột silica pha thuận và rửa giải cột với pha động
methylen clorua, metanol, axit fomic và axit heptanesulfonic, mà không cần làm tinh
khiết thêm. Dựa trên thứ tự rửa giải của proanthocyanidins và anthocyanins, phenol rửa
giải theo sự tăng dần khối lượng phân tử. Trong so sánh của mình về các phương pháp
phân tích xác định phenolics, De Beer và đồng nghiệp nhấn mạnh rằng NP-HPLC là
phương pháp phổ biến nhất cho polymer định lượng, bởi polyme với khối lượng phân tử
khác nhau có thể được tách ra.
Mặt khác, để phân tích favan-3-ols, kỹ thuật này ít thích hợp do các đỉnh tín hiệu
của "monomer" cũng bị nhiễu do bao gồm nhiều hợp chất đơn phân tử không phải họ
flavanol. Các giới hạn tương tự gặp phải khi phân tích hợp chất anthocyanins monomer
với lý do là các hợp chất riêng biệt cùng tồn tại tại đỉnh tín hiệu. Tuy nhiên, NP-HPLC có
thể là một cơng cụ hữu ích cho việc phân tích tuổi các loại rượu vang kể do nồng độ cả

Lê Hà Việt Luân

Trang 18


Tiểu luận Các phương pháp phân tích cơng cụ

hai nhóm chất monomer và polyphenol trọng lượng phân tử thấp đều bị giảm xuống liên
quan đến độ tuổi của rượu.
Việc sử dụng phương pháp tiên tiến cột đảo pha trao đổi ion hỗn hợp cũng đã
được ứng dụng bởi Vergare và đồng nghiệp. Các cột này có cấu trúc đặt biệt, được cấu
tạo bởi một nhóm chất điện tích dương nhúng trong một chuỗi kỵ nước cho thấy kết quả
đầy hứa hẹn cho việc chiết tách anthocyanin, bao gồm pyranoanthocyanidins trong rượu
vang Cabernet Sauvignon-và các loại rượu khác. Trong nghiên cứu này, Vergara và đồng
ghiệp cho thấy anthocyanins và pyranoanthocyanins xuất hiện trong các giai đoạn rửa
giải khác nhau và chọn lọc so với trường hợp dịch chiết thu được trong trường hợp sử
dụng C-18 làm pha tĩnh. Mặc dù thời gian phân tích gần gấp đơi thời gian như phương
pháp phân tích cổ điển, kỹ thuật này cho phép một rửa giải riêng biệt rõ ràng đầu tiên là
anthocyanins monoglucosides, sau đó là dẫn xuất acetyl của chúng, tiếp theo là dẫn xuất
coumaroyl. Pyranoanthocyanins xuất hiện giữa dẫn xuất coumaroyl và cuối cùng là đỉnh
tín hiệu của các hợp chất cao phân tử, xuất hiện tương quan với tuổi rượu vang.
Cuối cùng, cột lõi vỏ đã được thử nghiệm để phân tích thành phần hợp chất
phenolic của nước trái cây và rượu vang được sản xuất từ giống nho lai. Như một kỹ
thuật thay thế cho UHPLC (sắc ký lỏng hiệu suất cao), công nghệ cột lõi vỏ được thiết kế
để hoạt động trên các công cụ tiêu chuẩn HPLC trong hầu hết các trường hợp. Trong
những thiết kế này, một số phương pháp thông qua cột lõi vỏ được đánh giá để đạt được
phân tích tốt nhất của các thành phần phenolic khơng điển hình như anthocyanins
diglucoside được tìm thấy trong các giống nho lai. Kết quả cho thấy cột lõi vỏ C18 và
PFP (pentafluorophenyl) cải thiện độ chọn lọc đáng kể. Như vậy, anthocyanin /
anthocyanidin, các hợp chất đơn phân tử không thuộc họ anthocyanins hoặc tannin sau
khi phloroglucinolysis hóa, các thiết bị phân tích dạng cột lõi vỏ cung cấp một kết quả
nhanh chóng, tiêu thụ dung mơi ít hơn, ngưỡng nồng độ phát hiện thấp và độ lập lại kết
quả phân tích ....

Lê Hà Việt Luân

Trang 19


Tiểu luận Các phương pháp phân tích cơng cụ

4.2.3. Phân tích, xác định các hợp chất phenolic
Các phương pháp phát hiện khác nhau đã được áp dụng song song kết hợp cùng
với HPLC cho hợp chất phenolic. Phenolics trong rượu thường được phát hiện bằng phổ
UV-vis (tia cực tím có thể nhìn thấy), mảng photodiode (DAD), huỳnh quang và phân
tích khối lượng nhưng phương pháp UV vẫn cịn thơng dụng nhất vì các hợp chất
phenolic có phổ hấp thu đặc trưng trong vùng UV. Thật vậy, anthocyanins thấy hai dải
hấp thụ maximain tại 265-275 nm và vùng 465-560 nm trong khi flavanol cho hai dải hấp
thụ tại 210 nm và 278 nm. Các tính chất này được sử dụng, việc phát hiện và định lượng
các hợp chất này hiện tại được tiến hành giữa 520 nm và 546 nm cho anthocyanins và ở
280 nm cho flavanol. Tuy nhiên, phát hiện tia cực tím là khơng đặc trưng cho
proanthocyanidin khi có sự hiện diện của polyphenol khác.
Phương pháp thay thế bao gồm phát hiện huỳnh quang đã được đề xuất. Bằng cách
kết hợp thiết bị dò phổ hấp thu và phổ huỳnh quang, Porgaly và Büyüktuncel đồng thời
xác định 14 hợp chất phenolic trong rượu vang đỏ và phân biệt các đỉnh tín hiệu bị chồng
chéo thường xuyên gặp trong phân tích rượu. Guerrero cũng sử dụng một sự kết hợp của
phát hiện UV (ở 320 nm) và tín hiệu huỳnh quang (bước sóng kích thích = 290 nm, bước
sóng phát xạ = 320 nm) đặc trưng cho axit hydroxycinnamic và flavan-3-ols, tương ứng.
Silva và cộng sự. trình bày một phương pháp nhanh chóng và đơn giản cho việc định
lượng flavan-3-ols trong rượu vang. Bởi phổ huỳnh quang, họ đã có thể xác định số
lượng đơn phân tử flavanol, nhị phân và chất tam phân (bước sóng kích thích = 280 nm,
bước sóng phát xạ = 320 nm) cũng như (-)-epicatechin gallate và procyanidin B2-gallate,
hai hợp chất không bao giờ định lượng bằng cách phát hiện này cho đến bây giờ khi sử
dụng bước sóng kích thích / phát xạ tương ứng (270 nm / 377 nm) (Hình 6).

Lê Hà Việt Luân

Trang 20


Tiểu luận Các phương pháp phân tích cơng cụ

Hình 6 - Phổ HPLC-Fluo chromatograms của rượu vang Merlotand a Sauvignon

Thông tin cấu trúc để xác định các hợp chất phenolic có thể thu được nhờ sử dụng
khối phổ (MS). Sự phát triển và thơng tin sẵn có của sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS)
và phổ khối lượng nhiều (MS / MS và MSN) cung cấp các công cụ rất hữu ích để nghiên
cứu cấu trúc polyphenol cũng như cơ chế mà chúng có liên quan đến q trình lão hóa
rượu. ESI (electrospray ion hóa) là một phương pháp đặc biệt hiệu quả và kỹ thuật được
sử dụng để phân tích các flavan-3-ols và anthocyanin trong các phương thức ion dương
và âm. Chế độ ion hóa này đã trở thành một lựa chọn tốt để FAB (nhanh bắn phá nguyên
tử) được sử dụng vào đầu những năm 1990, đòi hỏi nhất thiết phải có bước làm tinh khiết
và hịa tan mẫu trong một nền phân cực.
Như vậy, trong năm 1997, Cheynier và đồng nghiệp nghiên cứu tannin (oligome
và polyme flavan-3-ols) trong chiết xuất hạt nho sử dụng hệ thống LC-MS được trang bị
với một nguồn ESI hoạt động ở chế độ ion âm và một máy phân tích khối tứ cực. Họ xác
định một loạt các đỉnh tín hiệu do procyanidin khơng có nhóm thế từ trimers đến
hexadecamers và dẫn xuất acyl hóa của chúng có chứa một, hai hoặc ba dư lượng acid
galic. Gần đây, NP-HPLC-ESI-MS cho phép Nunez và đồng nghiệp xác định hợp chất
khơng galloylate hóa và monogalloylate hóa của flavan-3-ols lên đến octamers, và di-và

Lê Hà Việt Luân

Trang 21

Tiểu luận Các phương pháp phân tích cơng cụ

trigalloylated flavan-3-ols đến heptamers trong chiết xuất từ hạt nho Graciano,
Tempranillo và Cabernet Sauvignon.
Họ quan sát thấy nồng độ của monogalloylated flavan-3-ols thấp hơn gấp 10 lần
non-galloylated flavan-3-ols: hiện tượng giảm nồng độ này được quan sát ở tất cả các
mẫu nhưng nó có thể là kết quả của sự giảm hiệu quả q trình ion hóa của dạng
galloylate hóa so với dạng khơng galloylate hóa. Tuy nhiên, do thiếu mẫu galloylate hóa
tiêu chuẩn, giả thuyết này khơng thể kiểm tra được. Dựa trên so sánh tương đối của các
nồng độ, người ta nhận thấy rằng sự phân bố của flavan-3-ols trong hạt giống bị chi phối
bởi các yếu tố như di truyền, và cũng bị ảnh hưởng bởi điều kiện khí hậu .
Các cơng trình khác gần đây kết hợp kỹ thuật ESI-MS và ESI-song song (MS /
MS) được ứng dụng cho việc xác định / định lượng của procyanidin được galloylate hóa
trong hạt nho. Thật vậy, khối phổ song song cho phép có được thơng tin cấu trúc cụ thể
hơn của một hợp chất đặc biệt trong hai giai đoạn phân tích khối lượng. Các ion kích
thích, tạo thành từ bước ion hóa đầu tiên được cơ lập bởi giá trị m / z đặc trưng của chúng
và sau đó lại bị phân mảnh và xách định trong bước phân tích thứ hai. Tandem MS có thể
được thực hiện trong hai quang phổ kế khối lượng lắp ráp song song (ví dụ: hai
quadrupoles) hoặc trong một thiết bị phân tích khối lượng duy nhất có khả năng lưu trữ
ion (ví dụ: ion bẫy tứ cực).
Trong cơng trình của Guerrero và đồng nghiệp, MS-MS phân mảnh có hiệu quả để
phân biệt một số hợp chất như quercetin-3-glucuronide và isorhamnetin-3 glucoside mà
hiện nay có cùng khối lượng và ion mẹ đầu tiên (m / z = 477) nhưng được phân biệt bởi
các ion phổ khối lượng sau (301 cho quercetin-3-glucuronide và 315 cho isorhamnetin-3glucoside). Gần đây (năm 2012), Delcambre và Saucier chứng minh hiệu suất của
UHPLC kết hợp với ESI và Q-TOF (thời gian bay gấp 4 lần) trong chế độ MS / MS để
xác định cấu trúc mới. Phổ khối lượng thời gian bay dựa trên một nguyên tắc tách khối
lượng đơn giản. Xem xét loại ion hóa bắt đầu từ vị trí tương tự tại cùng một thời gian và
được tăng tốc bằng một trường tĩnh điện đồng nhất không đổi, vận tốc của chúng một
cách rõ ràng liên quan đến tỷ lệ khối lượng trên điện tích và thời gian đến trực tiếp tại
Lê Hà Việt Luân

Trang 22


Tiểu luận Các phương pháp phân tích cơng cụ

một máy dị cho thấy khối lượng của chúng. Các cơng cụ của thiết bị này sở hữu một số
lợi thế đặc biệt hơn hầu hết các loại máy phân tích khối lượng. Về mặt lý thuyết, kỹ thuật
này có thể cho phép xác định phạm vi khối lượng rộng hơn vì khơng cần chùm tia ion
qt, cho phép có được một quang phổ khối lượng đầy đủ cho mỗi quá trình ion hóa.
Độ truyền cao, độ nhạy cao và sự cần thiết sử dụng một lượng mẫu rất nhỏ (<1018 mol trong các công cụ hiện đại nhất) là những lợi thế khác được biết đến của kỹ thuật
này. Do đó, Delcambre và Saucier xác định riêng biệt lần đầu tiên 14 hợp chất glycosyl
hóa flavanol monomeric dựa trên bốn aglycons ((+)-catechin-, (-)-epicatechin-, (-)epigallocatechin-gallate và epicatechin monoglycosides) trong rượu vang đỏ và chiết xuất
hạt nho bởi ESI-MS/MS. Chế độ MS / MS targeted cung cấp thêm thông tin về cấu trúc
của các hợp chất này. Các mảnh vỡ từ các phân mảnh của các hợp chất này cung cấp một
tín hiệu đặc trừng cho phép xác định tốt hơn.
Tuy nhiên, phương pháp này, dựa trên khối lượng chính xác và mơ hình phân
mảnh cụ thể khơng thể cung cấp thơng tin về vị trí chính xác của nhóm glucose. Việt kết
hợp phương pháp HPLC với khối phổ cũng là một phát triển quan trọng để xác định
thông tin về cấu trúc và xác định cấu trúc của anthocyanins, anthocyanidins và dẫn xuất
anthocyanin. Năm anthocyanins chung trong nho từ Vitis: viniferaare delphinidin (Dp),
cyanidin (Cy), petunidin (Pt), peonidin (Pn) và malvidin (MV), hiện nay 3-Omonoglucosides, 3-O-acetylmonoglucosides và 3 monoglucosides-O-(6-Op-coumaroyl).
Trong năm 2010, Ông và các cộng sự. khẳng định sự tồn tại của một anthocyanin thứ sáu,
pelargonidin-3-O-glucoside trong lồi nho khơng teinturier V. vinifera (Cabernet
Sauvignon và Pinot Noir. Trong vinifera không Vitis, anthocyanin với một liên kết
glucose bậc 2 đếnnhóm hydroxyl -C 5 có thể tồn tại.
Gần đây, De Freitas và Mateus đã báo cáo sự đa dạng của pyranoanthocyanins
trong rượu vang. Sự hình thành các sắc tố anthocyanin có nguồn gốc từ tự nhiên xảy ra
trong q trình lão hóa rượu vang đỏ và một loạt các cấu trúc (cụ thể là
carboxypyranoanthocyanins, methylpyranoanthocyanins, pyranoanthocyanin-flavanol,

pyranoanthocyanin phenol, portisins, oxovitisins và pyranoanthocyanidin liên hợp bậc 2)
đã được xác định trong hai thập kỷ qua. Hoạt động thông thường trong chế độ ion dương
Lê Hà Việt Luân

Trang 23


Tiểu luận Các phương pháp phân tích cơng cụ

và trong môi trường axit, anthocyanin được phát hiện ở dạng cation flavylium, M + để
cung cấp tín hiệu với cường độ cao. Bằng cách kết hợp HPLC và electrospray với một
máy dò khối lượng, sáu mươi sáu anthocyanins khác nhau đã được phát hiện trong rượu
vang đỏ Vitis viniferaDornfelder từ năm 1997. Những anthocyanin đã được xếp vào các
nhóm cấu trúc chứa đơn và diglucosides (dạng acetyl-và-coumaryl) các loại rượu vang.
Ngoài ra, các este của axit axetic và este của axit coumaric 3-glucosides đã được phát
hiện. Sản phẩm lão hóa như vitisin A (m / z = 561) và vitisin B (m / z = 517) và
acetylvitisinA (m / z = 603) và B (m / z = 559), đã được xác định trong các cơng trình
khác cũng được xác định trong loại rượu này. Fulcrand et al. cho thấy vitisin Một kết quả
từ tạo vịng giữa cacbon 4 và nhóm 5-hydroxyl của flavylium phân nưa
originalanthocyanin với các liên kết đôi của mẫu enolic acid pyruvic, tiếp theo là
dehydratation và rearomatization bước. Cuối cùng, bằng cách áp dụng một quá trình thủy
phân axit với rượu vang, Heier et al. chỉ ra rằng tất cả các pigmentsdetectable tại 525 nm
được lấy từ xương của delphinidin, cyanidin, peonidin, petunidin, malvidin và derivates
của họ acid pyruvic và acetaldehyd. Gần đây hơn, Xu và đồng workersattempted để phát
triển một phương pháp nhanh chóng và chính xác để định lượng anthocyanidin trong nho
và nước ép nho thơng qua một q trình thủy phân hỗ trợ sử dụng LC / MS. Trong điều
kiện tối ưu, năm anthocyanidins lớn (Dp, Cy, Pt, Pn, MV) được phân tách hoàn tồn
trong 25 phút và định lượng thành cơng. Phương pháp này đã được đề xuất như một
phương pháp tiếp cận toàn diện để xác định số lượng anthocyanidins để tránh những khó
khăn ofseparation / nhận dạng của nhiều anthocyanin có trong ma trận nho và rượu vang.

Sau khi phân đoạn của vật liệu màu rượu vang đỏ, sự tồn tại của anthocyanins dimeric
(A-A +), trước đây được phát hiện trong vỏ của trái nho đã được thể hiện bởi AlcaldeEon et al.. Nhờ vào việc phát hiện hàng loạt trong loạt (MSN, n = 1-4), oligomer mới
được phát hiện trong rượu vang. Chúng bao gồm một flavanol (catechin, epicatechin,
gallocatechin hoặc epigallocatechin), liên kết thơng qua C4position của mình cho các vị
trí ái nhân của các đơn vị trên của một anthocyanin dimeric (FA-A +). Tất cả các hợp
chất được xác định có chứa malvidin là một trong những tiểu đơn vị anthocyanin, trong
khi phân nưa anthocyanin khác có thể là một trong hai Dp, Cy, Pt, Pn hoặc Mv. Nghiên
Lê Hà Việt Luân

Trang 24


Tiểu luận Các phương pháp phân tích cơng cụ

cứu này là một ví dụ thú vị về sức mạnh utilityand của ESI / MSN phân tích cùng hoặc
khơng để HPLC.
Trong nghiên cứu của Villiers và cộng sự. Điều kiện sắc ký tối ưu được phát triển
và áp dụng cho một loại rượu Pinotage 2 tuổi, để cho phép tách và xác định hơn một trăm
anthocyanin và các chất màu có nguồn gốc từ một lần chạy mẫu duy nhất. Như vậy, theo
cách này, các tác giả dự kiến xác định 17 họ anthoycanin-glucosides và diglucosides, bảy
anthocyanins oligomeric, 24 anthocyanin-tanin trực tiếp như Mv-GLC-(epi) gallocatechin
(A-Ttype), chín tanin acetaldehyde qua trung gian , 10 sản phẩm ngưng tụ anthocyaninvinylflavanol, tám sản phẩm ngưng tụ anthocyanin-vinylphenol (pyranoanthocyanins), 12
sản phẩm axit anthocyanin-pyruvic (vitisin dẫn xuất A), năm dẫn xuất anthocyaninacetaldehyd (vitisin dẫn xuất B) và 2 dẫn xuất anthocyanin có acetone.
Acevedo de la Cruz và đồng nghiệp gần đây đã cho thấy hiệu quả của sự kết hợp
của khối phổ và quang phổ NMR trong việc xác định 33 anthocyanin trong bốn Loài
Vitis khác nhau. Đặc biệt, mới được báo cáo là đồng phân cis của p-coumaric-dẫn xuất đã
được xác định (petunidin-, peonidin và malvidin-3 (6-p-coumaroyl)-5-diglucoside). Cuối
cùng, các cơng trình gần đây đề nghị thay thế cho chế độ ion hóa dương điện cổ điển
bằng cách áp dụng chế độ âm điện đối với đặc tính của anthocyanins. Trong chế độ
dương điện, glycosides flavonol, ví dụ quercetin glycosides, có các ion phân tử tương tự

và mơ hình phân mảnh giống như các anthocyanin tương ứng, ví dụ như, glycosides
delphinidin ([M] + chất anthocyanins và [M + H] + glycosides flavonol) đều giống nhau.
Đổi lại, phổ MS thu được ở chế độ ion âm được chứng minh là một cơng cụ có giá trị cho
sự phân biệt các anthocyanin với các polyphenol khơng anthocyanin (Hình 7). Cụ thể, các
ion kép của [M-2H] và [M-2H + H2O] - đặc trưng tới anthocyanin trong khi một ion
phân tử duy nhất [M-H]-chiếm ưu thế trong quang phổ của các chất polyphenol không
anthocyanin.

Lê Hà Việt Luân

Trang 25