nghiên cứu quy trình tạo hạt và các điều kiện tối ưu nhằm tăng cường khả năng kháng khuẩn của nano chitosan

i










LI CAM OAN



Tụi xin cam ủoan ủõy l ủ ti nghiờn cu ca tụi. Cỏc kt qu nghiờn cu
trong lun vn l trung thc v cha ủc ai cụng b trong bt kỡ cụng trỡnh
no khỏc. Mi s giỳp ủ v cỏc thụng tin trớch dn ủó ủc nờu rừ ngun
gc.


Ngi thc hin




Tửụỷng Ngoùc Thuùc Uyeõn

B GIO DC V O TO
TRNG I HC TY NGUYấN













TNG NGC THC UYấN




NGHIấN CU QUY TRèNH TO HT V CC
IU KIN TI U NHM TNG CNG KH
NNG KHNG KHUN CA NANO CHITOSAN

LUN VN THC S SINH HC









BUễN MA THUT, NM 2010




ii



LỜI CẢM ƠN


Để hoàn thành tốt luận văn này, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
-PGS.TS Nguyễn Anh Dũng, người hướng dẫn khoa học trực tiếp, ñã
tận tình hướng dẫn phương pháp nghiên cứu và ñóng góp nhiều ý kiến quý

báu, giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận
văn.
-Lãnh ñạo Trường Đại học Tây Nguyên, tập thể các Thầy Cô giáo
Phòng Sau ñại học, Khoa Khoa học tự nhiên -Công nghệ, Khoa Nông Lâm
nghiệp.
- Các Thầy Cô giáo ñã tận tâm giảng dạy, truyền thụ những kiến thức
quý báu trong quá trình học tập.
- Ban Giám hiệu Trường THPT chuyên Nguyễn Du.
- Các bạn bè, ñồng nghiệp và người thân ñã giúp ñỡ, ñộng viên tôi
trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Trân trọng cảm ơn.
Người thực hiện




Tưởng Ngọc Thục Uyên









iii

MỤC LỤC



Trang
LỜI CAM ĐOAN …………………………………………………………………… i
LỜI CẢM ƠN ……………………………………………………………………… ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC CÁC BẢNG …………………………………………………………… vi

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ viii
DANH MỤC CÁC HÌNH x
PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1
1.1.Tính cấp thiết 1
1.2. Mục tiêu ñề tài 2
1.3.Ý nghĩa khoa học 3
1.4.Ý nghĩa thực tiễn 3
1.5.Giới hạn ñề tài 3
PHẦN 2: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 4
2.1. Tổng quan về chitosan ………………………………………………. 4
2.2. Tổng quan về nano chitosan 6
2.2.1. Các phương pháp tạo vật liệu nano chitosan 6
2.3. Ứng dụng của chitin, chitosan và các dẫn suất trong y học 14
2.3.1.Hoạt tính kháng ung thư 16
2.3.2.Giảm cholesterol trong máu (hypocholesterolemic activity) 17
2.3.3.Đặc tính chống oxi hóa 17
2.3.4.Màng phủ làm lành vết thương (would healing) 18

2.3.5.Sử dụng trong cấy ghép răng 19

2.3.6. Ứng dụng trong ly giải chậm thuốc 19
2.3.7. Hoạt tính kháng khuẩn ……………………………………… 21


iv

2.3.8. Hoạt tính chống ñông máu của dẫn xuất sulfated chitosan 27
2.3.9.Ứng dụng làm tá chất cho vaccin 28
2.4. Tổng quan về Escherichia coli và Staphylococcus aureus 31
2.4.1 Vi khuẩn Escherichia coli 31
2.4.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus 36
PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40
3.1. Nội dung nghiên cứu 40
3.1.1. Nghiên cứu qui trình tạo hạt nano chitosan 40
3.1.2. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của hạt
nano chitosan 40
3.2. Phương pháp nghiên cứu 40
3.2.1. Hóa chất 40
3.2.2. Địa ñiểm nghiên cứu 41
3.2.3. Thời gian thực hiện 41
3.2.4. Phương pháp nghiên cứu qui trình tạo hạt nano chitosan 41
3.2.5. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của hạt nano
Chitosan 43
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50
4.1. Nghiên cứu qui trình tạo hạt nano chitosan 50
4.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến kích thước
hạt, ñiện tích và tính ổn ñịnh hạt nano chitosan 50
4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ CS:TPP (w/w) ñến kích thước và

ñiện thế hạt nano chitosan 56
4.2. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan .62
4 2.1.Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan ñến khả
năng kháng khuẩn 62
4.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ nano chitosan ñến khả


v

năng kháng khuẩn 64
4.2.3.Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan ñến khả
năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan 69
4.2.4.Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ CS: TPP ( 4:1; 5:1; 6:1) ñến khả
năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan 73
4.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng
khuẩn của hạt nano chitosan 76
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79
5.1. Kết luận 79
5.2 Kiến nghị
79

vi


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU , CÁC CHỮ VIẾT TẮT


Số thứ tự


Chữ ciết tắt

Nghĩa của các chữ viết tắt
1
2
3

4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
HPLC
MIC
DNA
pDNA
DEMC
TPP
PMAA
CS
CMC
CNP
TEM
SEM
kDa
E.coli
S.aureus
LMWC
Sắc kí lỏng cao áp

Nồng ñộ ức chế tối thiểu
Deoxyribo nucleic acid
Plasmide deoxyribo nucleic acid
Diethylmethylchitosan
Tri polyphosphate
Polymethacrylic axit
Chitosan
Cacboxymethyl cellulose
Chitosan nanoparticles
Kính hiển vi ñiện tử truyền quang
Kính hiển vi ñiện tử quyét
Kilo Dalton
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Khối lượng phân tử thấp












vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Tên bảng Trang


2.1. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan ñến kích thước, ñiện thế
và khả năng hấp phụ BSA 8
2.2. Tính chất vật lý của chitosan oligomer/CMC nanoparticles
hấp phụ với pDNA 11
2.3. Các tính chất cơ bản của chitosan liên quan ñến ứng
dụng trong sinh y học 15
2.4. Chỉ số MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) của chitosan và DEMC 24

2.5. Chỉ số MIC của một số dẫn suất chitosan trên một số vi khuẩn 25
2.6. Chỉ số MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) của kháng sinh
Doxycycline và Chitosan nanoparticles 27
4.1. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử của chitosan ñến tính
chất hạt nano chitosan 50
4.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ Chitosan: TPP ñến tính chất hạt nano
chitosan (Chitosan 30kDa) 56
4.3. Ảnh hưởng của nồng ñộ ñến khả năng kháng khuẩn
của chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli và
Staphylococcus aureus 62
4.4. Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan (CS:TPP = 6:1) và
chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 65
4.5. Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan (CS:TPP = 6:1) và
chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 67
4.6. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến khả năng

viii

kháng khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 70

4.7. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến khả năng kháng
khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 72
4.8. Ảnh hưởng của tỉ lệ CS:TPP ñến khả năng kháng khuẩn của
nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 74

4.9. Ảnh hưởng của tỉ lệ CS:TPP ñến khả năng kháng khuẩn của
nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 75
4.10. Ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng khuẩn
của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 76
4.11. Ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng khuẩn
của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 77

ix


DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

STT Tên ñồ thị Trang


4.1. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với trọng
lượng phân tử 20 kDa 53

4.2. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với trọng
lượng phân tử 30 kDa 54

4.3. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với trọng
lượng phân tử 300 kDa 55
4.4. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan
với tỷ lệ CS:TPP là 3:1 57

4.5. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ
CS:TPP là 4:1 58

4.6. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan
với tỷ lệ CS:TPP là 5:1 59
4.7. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ
CS:TPP là 6:1 60
4.8. Phân bố kích thước hạt nano chitosan với tỷ lệ CS:TPP là 7:1 61
4.9. Khả năng kháng khuẩn của chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli
và Staphylococcus aureus 63
4.10. Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan và chitosan
trên vi khuẩn Escherichia coli 66
4.11. Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan và chitosan
trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 67

4.12. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến khả năng kháng
khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 70
4.13. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến khả năng kháng


x

khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 73

4.14. Ảnh hưởng của tỉ lệ CS : TPP ñến khả năng kháng khuẩn
của nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 74
4.15. Ảnh hưởng của tỉ lệ CS : TPP ñến khả năng kháng
khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 75
4.16. Ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng khuẩn
của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 77
4.17. Ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng khuẩn
của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 78

xi


DANH MỤC CÁC HÌNH

STT Tên hình ảnh Trang

2.1. Sơ ñồ phương pháp tạo hạt nanochitosan 7
2.2. Cơ chế tạo hạt chitosan nanoparticles với axit methacrylic 9
2.3. TEM của hạt nanoparticles CS-PMAA 10
2.4. Sơ ñồ tạo giọt bằng phương pháp kết tủa 12
2.5. Sơ ñồ tạo giọt bằng phương pháp sấy phun 13
2.6. Sơ ñồ tạo hạt bằng phương pháp mixel ngược pha 14
2.7. Ảnh hưởng của chitosan và chitosan oligomer (COS) ñến tế
bào E.coli (Eaton,2008) 22

2.8. Cơ chế xâm nhập qua màng của chitosan mang vaccin
có kích thước nm khác nhau 29
2.9. Ảnh hưởng của các loại adjuvant lên ñáp ứng miễn dịch của
chuột với vaccin cúm H5N1 30
2.10. Ảnh hưởng của chitosan và các tá chất khác ñến ñáp ứng miễn
dịch của chuột với vaccin H5N1 và hiệu giá kháng thể (HIU) 31
4.1. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với trọng lượng phân
tử là 20 kDa 53

4.2. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với trọng lượng phân
tử là 30 kDa 54
4.3. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với trọng lượng phân
tử là 300 kDa 55
4.4. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS: TPP là 3:1 57
4.5. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS: TPP là 4:1 58

xii

4.6. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS: TPP là 5:1 59
4.7. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS: TPP làà 6:1 60
4.8. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS: TPP là 7:1 61

xiii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN








TƯỞNG NGỌC THỤC UYÊN




NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TẠO HẠT VÀ CÁC
ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU NHẰM TĂNG CƯỜNG KHẢ
NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA NANO CHITOSAN





LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC









BUÔN MA THUỘT, NĂM 2010

xiv








1

PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1.Tính cấp thiết
Khoa học và công nghệ nano là một lĩnh vực mới trong những năm gần
đây nhưng đã và đang phát triển nhanh chóng vì sự hiệu quả và những ứng
dụng rộng rãi của nó trong nhiều ngành như sinh y học, điện tử, vật lí, hóa
học. Vật liệu nano với kích thước nanomet siêu nhỏ đã thể hiện nhiều tính
chất mới lạ do hiệu ứng kích thước. Hiện nay nhiều nước trên thế giới đang
xem công nghệ nano là mục tiêu mũi nhọn để đầu tư phát triển.
Việt Nam là nước đang phát triển, vệ sinh an toàn thực phẩm ở mức rất
thấp và chịu sự chi phối của nhiều yếu tố như: môi trường ô nhiễm dẫn đến ô
nhiễm vào nông sản và vật nuôi, quy trình sản xuất và chế biến thực phẩm
còn nhỏ lẻ, không đáp ứng điều kiện vệ sinh an toàn thực phẩm, hủ tục lạc
hậu trong ăn uống hoặc vì lợi nhuận mà sử dụng phụ gia, bảo quản ngoài
danh mục bộ y tế, kiểm soát thực phẩm qua biên giới và trên thị trường chưa
chặt chẽ đang gióng lên hồi chuông báo động hơn bao giờ hết. Các thuốc
kích thích ở vật nuôi, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, melanin trong sữa và
nước mắm, 3-MCPD trong nước tương, urea, chlor, cloramphenicol, dipterex
trong thủy hải sản , đặc biệt thức ăn và nước uống nhiễm khuẩn đã gây ra

nhiều vụ ngộ độc tập thể, nguy hại cho sức khỏe của con người. Khái niệm
thực phẩm sạch ở Việt Nam vẫn là xa xỉ đối với người dân, nhất là dân nghèo.
Để chống lại sự nhiễm khuẩn, hiện nay việc sử dụng chất kháng sinh là
giải pháp phổ biến để đẩy lùi các bệnh dịch do vi khuẩn gây ra. Tuy nhiên
việc sử dụng thuốc kháng sinh cũng có những mặt trái là: do chất kháng sinh
tính chọn lọc thấp nên dễ dẫn đến hiện tượng các vi khuẩn có lợi cũng bị tiêu
diệt, gây ra trạng thái mất cân bằng khu hệ vi sinh vật, đặc biệt việc sử dụng
rộng rãi các loại thuốc kháng sinh dễ dẫn đến nguy cơ kháng thuốc của vi


2

khuẩn và xa hơn nữa là gia tăng tính nguy hiểm của các triệu chứng lâm sàng
tạo bởi các loài vi khuẩn. Chính vì vậy, yêu cầu cấp thiết đặc ra hiện nay là
phải tìm một chất có khả năng ức chế sinh trưởng của vi khuẩn mà không gây
ra hiện tượng nhờn thuốc, không phá vỡ trạng thái cân bằng khu hệ vi sinh
vật, không tác dụng phụ, không độc hại, không gây ô nhiễm môi trường.
Chitosan là một polisaccharide tự nhiên, là dẫn xuất từ quá trình khử
acetyl của chitin. Chitin là thành phần cấu trúc chính vỏ tôm, cua, là một
polimer sinh học có nhiều trong tự nhiên, đặc biệt ở Việt Nam có bờ biển dài,
nhiều sông suối. Chitosan không độc, có khả năng tự phân hủy sinh học cao,
là chất ăn được. Chitosan mang điện tích dương, có ái lực cao với các axit
mang điện tích âm, tương tác với các thành phần polianion của vách tế bào vi
sinh vật, kết hợp DNA, gắn kết gây đông tụ, kết tủa tế bào vi khuẩn. Do đó,
chitosan có tính kháng khuẩn, kháng nấm rộng, làm con người trẻ lâu, hoạt
hóa tế bào cơ thể, gia tăng khả năng miễn dịch, giải độc , bảo vệ gan trong cơ
thể. Đặc biệt hạt nano chitosan có kích thước nano, có nhiều ưu điểm như
diện tích tiếp xúc và điện tích dương lớn hơn chitosan,

do đó có tiềm năng

tăng cường hoạt tính sinh học, trong đó có hoạt tính kháng khuẩn. Vì vậy,
việc nghiên cứu tạo hạt nano nhằm tăng cường tính kháng khuẩn của chitosan
ứng dụng trong bảo quản thực phẩm là vấn đề cấp thiết hiện nay. Ở Việt Nam,
Nguyễn Anh Dũng đã sử dụng chế phẩm chitosan để ức chế sinh trưởng của
vi khuẩn Escherichia coli, nghiên cứu tạo hạt nano chitosan làm tá chất miễn
dịch cho vaccin cúm A H5N1 và xây dựng mô hình thử nghiệm trên động vật.
Xuất phát từ đó tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu qui trình tạo hạt và các
ñiều kiện tối ưu nhằm tăng cường khả năng kháng khuẩn của nano
chitosan”
1.2. Mục tiêu ñề tài
1.2.1. Xây dựng quy trình tạo hạt nano chitosan bằng tripolyphosphate (TPP).


3

1.2.2. Xác định các điều kiện tối ưu để nâng cao hiệu quả kháng khuẩn của
hạt nano chitosan.
1.3.Ý nghĩa khoa học
Tạo hạt nano chitosan nhằm tăng cường hoạt tính kháng khuẩn là hoàn
toàn mới tại Việt Nam.
1.4.Ý nghĩa thực tiễn
Thành công của đề tài sẽ đẩy nhanh việc sử dụng vật liệu nano chitosan
trong bảo quản, phòng chống nhiễm khuẩn ở thực phẩm ở Việt Nam. Đây là
vật liệu an toàn cho sức khỏe con người và phổ biến, giá thành hạ phù hợp với
điều kiện kinh tế của nhân dân.
1.5.Giới hạn ñề tài
Do thời gian có hạn, thiết bị, hóa chất hạn chế nên tôi chỉ tiến hành
nghiên cứu quy trình tạo hạt nano chitosan, bước đầu thử nghiệm trên hai loại
vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus.

4


PHẦN 2. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

2.1. Tổng quan về chitosan
Chitin là thành phần cấu trúc nên vỏ côn trùng, tôm, cua, vách tế bào
nấm. Chitin có cấu tạo tương tự như cellulose, nhưng có khác biệt là đơn vị
cấu tạo nên chitin là N-acetyl-D-glucosamine, các đơn vị này nối với nhau
bằng liên kết β-1,4-glycoside.

Công thức cấu tạo của chitin và chitosan
Tính chất, hoạt tính sinh học của chitin, chitosan phụ thuộc rất nhiều
vào khối lượng phân tử (Mw) và mức độ deacetyl hóa (DD: degree of
deacetylation).
Mức độ deacetyl hóa dùng để chỉ % số nhóm acetyl trong phân tử

chitin, chitosan bị khử. Mức độ deacetyl hóa tỷ lệ thuận với mật độ của nhóm
NH
3
+
trong phân tử do đó ảnh hưởng đến tính chất đa điện phân và độ tan của
chitin, chitosan. Chitin có mức độ deacetyl hóa trung bình nằm trong khoảng
10-15%. Có sản phẩm chitin deacetyl hóa một phần (partially deacetyl chitin)
có mức độ deacetyl hóa từ 30-40%. Trong khi đó chitosan phải có mức độ
deacetyl hóa > 50%, với mức độ deacetyl hóa này chitosan mới dễ tan trong


5

một số acid hữu cơ loãng như acetic, lactic. Mức độ deacetyl hóa được xác
định bằng nhiều phương pháp khác nhau như: IR spectrophotometry, sắc ký
lọc gel, UV spectrophotometry,
1
H NMR,
13
C- NMR, phương pháp chuẩn độ
và HPLC theo Kumar (2000) [21].
Khối lượng phân tử của chitin, chitosan có thể xác định bằng HPLC.
Tuy nhiên phương pháp đơn giản nhất, nhanh là đo độ nhớt, dựa vào các hằng
số α và K trong phương trình Mark – Houwink:
[η] = K.M
α
= 1.81 x 10
-3
M
0.93

.
Trong đó: η là độ nhớt biểu kiến của chitin (intrisic viscosity) ; M: là
khối lượng phân tử.
Khối lượng phân tử trung bình của chitin biến động từ 1.0 – 2.5 x10
6
,
khối lượng phân tử của chitin sẽ giảm xuống khi mức độ deacetyl hóa tăng
lên.
Chitosan có ứng dụng rất rộng rãi trong các ngành công, nông nghiệp, y
dược, thực phẩm… nhờ vào những đặc tính sau (Rinaudo, 2006)
- Tính chất đa điện ly mang điện tích dương (cationic polyelectrolyte) cho
phép gắn kết với các thành phần sinh học mang điện tích âm.
- Có thể tái sinh theo các con đường sinh học trên trái đất.
- Có khả năng phân hủy sinh học bằng enzyme trong cơ thể.
- Có khả năng tương hợp sinh học với các cơ quan, mô và tế bào động thực
vật.
- Có khả năng kích thích quá trình làm lành vết thương và đông máu.
- Có khả năng tương tác chuyên biệt với các receptor trên màng
- Giảm chlolesterol do liên kết có chọn lọc với các acid béo


6

- Không gây độc do các sản phẩm sau thủy phân đều là các chất chuyển
hoá tự nhiên.
- Không gây đáp ứng miễn dịch trong mô và cơ quan động vật.
- Có tác dụng hỗ trợ trong điều hòa miễn dịch.
- Có thể sử dụng dưới nhiều dạng sản phẩm như dạng miếng, bột mịn, hạt,
màng, tấm xốp (scaffolds), bông, sợi và gel [43].
2.2. Tổng quan về nano chitosan

2.2.1. Các phương pháp tạo vật liệu nano chitosan
Chitosan nanoparticles là các hạt chitosan có kích thước nanomet.
Chitosan nanoparticles do có kích thước siêu nhỏ nên dễ dàng đi qua màng tế
bào, diện tích và điện tích bề mặt cực lớn nên được ứng dụng nhiều trong sinh
y học mang thuốc, vaccine, trong công nghệ sinh học làm vector chuyển gen.
Hiện nay có nhiều phương pháp tạo nano chitosan. Theo Sulnin (2004)
5 phương pháp chủ yếu để tạo hạt nano chitosan là: Phương pháp khâu mạch
nhũ tương (emulsion cross linking), phương pháp tạo giọt (coacervation)
trong NaOH-methanol, phương pháp sấy phun (dry spraying), phương pháp
tạo gel ionic (ionic gel) trong tripolyphosphate (TPP) và phương pháp rây
(sieving method). Trong đó phổ biến nhất là phương pháp tạo hạt gel trong
tripolyphosphate[43].
2.2.1.1. Phương pháp tạo chitosan nanoparticles bằng liên kết cộng hóa trị
Ohya đã nghiên cứu tạo nano chitosan để nhốt thuốc chống ung thư 5-
FU bằng cách cho dung dịch chitosan khâu mạch cộng hóa trị với
glutaraldehyde. Nhóm kép - CHO của glutaraldehyde sẽ phản ứng với nhóm –
NH
2
của chitosan để khâu mạch (cross-linking) tạo nano chitosan. Phương
pháp này có ưu điểm là kích thước và tính chất hạt nano chitosan rất ổn định
[11].


7

2. 2.2.1.Phương pháp tạo gel ion
Phương pháp này dựa trên khả năng tạo gel ion giữa chitosan điện tích
dương và TPP, polyacrylic acid, polyaspartic acid, plasmid DNA (pDNA)
mang điện tích âm.
Để tạo nano chitosan –TPP: Dung dịch chitosan được hỗn hợp với dung

dịch TPP và hỗn hợp được khuấy từ trong 10-60 phút sẽ thu được nano
chitosan. Có thể ly tâm 15.000 vòng /phút trong 1 giờ để thu được hạt nano
chitosan.


Hình 2.1. Sơ ñồ phương pháp tạo hạt nano chitosan
Quan Gan (2005) nghiên cứu tạo hạt nanon chitosan trong TPP với
nồng độ chitosan khác nhau, khối lượng phân tử chitosan khác nhau và tỷ lệ
chitosan/TPP khác nhau. Kết quả cho thấy khối lượng phân tử và nồng độ
chitosan càng lớn thì kích thước hạt nano chitosan càng lớn [41].
Theo Quan Gan thì tỷ lệ chitosan/TPP càng lớn thì kích thước hạt nano
chitosan càng lớn. pH cũng có ảnh hưởng nhất định đến kích thước hạt nano
chitosan, pH thích hợp nhất để tạo hạt nano chitosan là 5.5.


8

Quan Gan (2007) nghiên cứu tạo nano chitosan làm chất mang protein,
thuốc bằng phương pháp tạo hạt nano trong TPP. Kích thước hạt nano
chitosan cũng như điện tích của hạt nano chitosan phụ thuộc vào nồng độ và
khối lượng phân tử của chitosan. Nồng độ càng thấp thí kích thước hạt càng
nhỏ và điện tích càng dương lớn[42].
Bảng 2.1. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan ñến kích thước, ñiện thế và khả
năng hấp phụ BSA
Nồng độ
chitosan
(mg/ml)
Kích thước hạt
(nm)
Điện thế

(mV)
Không
có
BSA
Phương
pháp hợp
nhất với
BSA
phương
pháp ủ
với
BSA
Không
có
BSA
Phương
pháp hợp
nhất với
BSA
Phương
pháp ủ
với
BSA
3,0 222,6 338,4 691,4 + 46,3

+ 46,3 + 43,2
2,5 210,5 344,5 623,7 + 47,9

+ 48,3 + 46,3
2,0 191,1 292,5 540,5 + 52,0

+ 50,6 + 48,8
1,5 182,7 236,1 401,2 + 53,3

+ 53,2 + 52,6
1.0 175,6 203,7 136,7 + 55,7

+ 54,1 + 53,2
Điều kiện chuẩn bị hạt: Nồng ñộ BSA = 1,0mg/ml, tỷ lệ chitosan/TPP = 3:1,
T=20 ± 1
0
C, pH 5,5
Bao (2008) cũng nghiên cứu tạo nano chitosan –TPP. Nồng độ chitosan
sử dụng là 0.5-2 mg/ml. Kích thước hạt nano chitosan nằm trong khoảng 100-
300 nm[16].



9

Marcia (2008), nghiên cứu tạo nano chitosan sử dụng polymethacrylic
acid (PMAA) . Cơ chế của quá trình tạo hạt nano chitosan tương tự như với
TPP, theo sơ đồ sau:


Hình 2.2. Cơ chế tạo hạt nano chitosan với acid methacrylic .
CS: Chitosan. PMAA (polymethacrylic acid).
Marcia cũng nghiên cứu ảnh hưởng của pH và tỷ lệ chitosan đến kích
thước hạt nano chitosan. Kết quả nhận thấy pH trong khoảng từ 3-6 ít ảnh
hưởng đến kích thước hạt nano CS-PMAA. Tuy nhiên, khi pH tăng >6 có sự

gia tăng đột biến kích thước hạt nano CS-PMAA. Khác với phương pháp tạo
hạt nano chitosan –TPP, tỷ lệ CS càng cao thì kích thước hạt càng nhỏ trong
khoảng pH<6 và ngược lại. Kết quả này được minh chứng rõ ràng bằng hình
chụp TEM của hạt nano CS-PMAA. Kích thước hạt nano CS-PMAA biến
động từ khoảng 20 nm – 140 nm ở pH <6 [31].


Chitosan
nanoparticl


10







Hình 2.3. TEM của hạt nano CS-PMAA; a) CS 0.2%; b) CS 0.5%.
Nano chitosan cũng có thể thực hiện bằng cách tạo phức hợp
chitosan/pDNA nhờ khả năng tạo gel ion giữa DNA mang điện tích âm và
chitosan mang điện tích dương. Phương pháp này thường được ứng dụng
trong kỹ thuật chuyển gen, liệu pháp gen. Russell Mumper (2001) đã công bố
sử dụng chitosan, chitosan oligomer phối hợp với carboxymethyl cellulose
(CMC) với tỷ lệ khác nhau có hấp phụ trên bề mặt pDNA để tạo nanoparticles
ứng dụng trong chuyển gen. Các thông số vật lý của chitosan oligomer/nano
CMC phủ pDNA cũng được xác định (bảng 2.2).
Yongli Zheng (2007) cũng nghiên cứu tạo nano bằng cách tạo phức hợp
giữa chitosan và polyaspartic dựa trên nguyên lý tạo gel ion. Kích thước hạt

nano chitosan đạt từ 85-300 nm, sử dụng để thải chậm 5-FU trong điều trị ung
thư.
Zheng sử dụng chitosan (45 kDa và 230 kDa) và trimethylchitosan có
nồng độ 1mg/ml ở pH=5.6 sau đó nhỏ vào dung dịch đệm phosphate chứa 10
microgam pDNA (plasmide DNA). Kích thước hạt nano chitosan nhỏ hơn
200 nm [54].





11
Bảng 2.2.Tính chất vật lý của chitosan oligomer/nano CMC hấp phụ với
pDNA.
Tỷ lệ
chitosan/CMC
(w/w)
pDNA
(µg/ml)
Kích thước
nanoparticles
(nm)
Điện tích
(mV)
Hiệu suất hấp
phụ DNA
(%)
4:1 50 182 ± 3 27 99.5
100 300 ± 9 21 99.9
200 915 ± 171 12 100.0

300 299 ±53 -7 96.1
400 178 ± 15 -25 99.1
3:1 50 275 ± 11 20 99.9
100 949 ± 155 16 100.0
200 225 ± 31 -2 99.9
300 134 ±12 -24 85.7
400 162 ± 8 -29 99.1

2.2.1.3. Phương pháp tạo giọt coasecva (phương pháp kết tủa)
Phương pháp này sử dụng tính chất của chitosan là không tan trong
dung dịch có pH kiềm tính. Bởi vậy, chitosan sẽ bị kết tủa, tạo giọt coasecva
ngay khi dung dịch chitosan tiếp xúc với dung dịch kiềm. Dung dịch kiềm có
thể là NaOH, NaOH-methanol hoặc ethandiamine. Dung dịch chitosan sẽ
được một thiết bị nén phun vào dung dịch kiềm để tạo hạt nano chitosan như
hình 2.4.