NGHIÊN CỨU CHỌN CHỦNG VI KHUẨN LACTIC ĐỂ SẢN XUẤT AXÍT PHENYLLACTIC ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN NÔNG SẢN VÀ THỰC PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

MỞ ĐẦU
Lý do chọn đề tài
Công tác bảo quản nông sản, thực phẩm luôn là mối quan tâm hàng đầu
của các nước trên thế giới nói chung cũng như ở Việt Nam nói riêng, mà
trọng tâm là bảo quản nông sản và thực phẩm tránh khỏi sự xâm nhiễm của
các vi sinh vật (VSV) gây bệnh cho người, động vật và các VSV gây ảnh
hưởng đến giá trị dinh dưỡng, giá trị thẩm mỹ của nông sản, thực phẩm.
Hiện nay, thực phẩm tiêu thụ trên thị trường đang được bảo quản bằng
nhiều phương pháp khác nhau như: phương pháp vật lý, phương pháp hoá
học, trong đó việc bảo quản bằng các chất hóa học được sử dụng khá phổ
biến. Tuy nhiên do thiếu hiểu biết, nhiều nơi đã dùng cả các hóa chất không
được phép sử dụng hoặc dùng quá liều lượng quy định đã gây nguy hiểm cho
người tiêu dùng (Kỹ thuật và công nghệ bảo quản - chế biến – tiêu thụ - Số
3/III/2009). Một số chất bảo quản thường được sử dụng trong bảo quản các
loại thực phẩm chế biến như axit benzoic, sodium benzoat, sodium
propionate, potassium sorbate, methyl paraben, vv Các chất này có thể ức
chế hoạt động hoặc tiêu diệt vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm mà không làm
ảnh hưởng đến trạng thái bên ngoài cũng như mùi vị, chất lượng của thực
phẩm. Nhưng trên thực tế nhiều loại thực phẩm trên thị trường phần lớn sử
dụng những loại chất này với hàm lượng vượt quá mức quy định cho phép đã
gây ảnh hưởng đến sức khỏe của người sử dụng (Nguyễn Hương- Tạp chí
Công nghiệp hoá chất số 6/2003). Các phương pháp bảo quản này còn rất
nhiều hạn chế, đặc biệt bảo quản bằng phương pháp hoá học có thể làm ảnh
hưởng lâu dài tới sức khoẻ con người và môi trường.
Do đó, việc nghiên cứu, tìm ra và sử dụng các chất có nguồn gốc sinh
học để bảo quản nông sản và thực phẩm đã thu hút được sự chú ý của nhiều
nhà khoa học trên thế giới, bởi sự an toàn của nó đối với sức khỏe con người
và tính thân thiện với môi trường sống. Đó là những chất đã được tổ chức
1
lương thực thế giới (FAO) và tổ chức y tế thế giới (WHO) kiểm định là an
toàn, chúng có hoạt tính ức chế sự sinh trưởng của VSV hoặc bào tử, đôi khi

tiêu huỷ cả VSV gây bệnh trên nông sản và thực phẩm cũng như các VSV gây
ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng, giá trị thẩm mỹ của nông sản, thực phẩm.
Trong thời gian gần đây, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu
và bước đầu tìm ra một chất bảo quản mới có ứng dụng và đạt hiệu quả cao
trong công tác bảo quản nông sản và thực phẩm, đó là axít phenyllactic
(PLA).
PLA là một hợp chất kháng VSV, nó được chứng minh là có khả năng ức
chế sự sinh trưởng và phát triển của một số loài vi khuẩn Gram âm, Gram
dương trong đó có một số loài gây bệnh đường ruột cùng nhiều loài nấm men,
nấm mốc gây hại nông sản, thực phẩm [12]
Việc ứng dụng PLA trong bảo quản được xem là hướng ứng dụng mới
trong việc sử dụng hợp chất tự nhiên để kiểm soát, ngăn ngừa sự xâm nhiễm
của vi sinh vật gây hại nhằm kéo dài thời gian bảo quản nông sản và thực
phẩm. Đồng thời lại an toàn cho sức khoẻ người sử dụng, không gây ảnh
hưởng tới môi trường sống.
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu tuyển chọn và phân lập được các chủng vi
khuẩn lactic có khả năng sinh PLA đạt hiệu suất cao là mục tiêu và nội dung
nghiên cứu chính của đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu công nghệ sản xuất
chế phẩm Phenyllactic acid từ vi khuẩn lactic phục vụ bảo quản nông sản và
thực phẩm ” thuộc “Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong
lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020”. Chúng tôi đã tiến hành lựa
chọn đề tài “Nghiên cứu chọn chủng vi khuẩn lactic để sản xuất axít
phenyllactic ứng dụng trong bảo quản nông sản và thực phẩm”, với mong
muốn tìm ra các chất bảo quản nông sản và thực phẩm có nguồn gốc sinh học,
an toàn để thay thế các chất bảo quản hóa học đang sử dụng hiện nay.
2
Mục tiêu của đề tài: Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn thuộc
nhóm vi khuẩn lactic để sản xuất PLA có khả năng ức chế vi sinh vật gây hại,
phục vụ công tác bảo quản nông sản và thực phẩm.
Nội dung nghiên cứu chính của đề tài:

Nội dung 1: Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh PLA hiệu
suất cao từ các nguồn thực phẩm của Việt Nam.
Nội dung 2: Nghiên cứu đặc tính sinh học cơ bản của chủng vi khuẩn
lactic tuyển chọn được.
Nội dung 3: Nghiên cứu, lựa chọn các điều kiện lên men tối ưu sinh
tổng hợp PLA quy mô phòng thí nghiệm.
Nội dung 4: Bước đầu nghiên cứu khả năng ức chế vi khuẩn, nấm gây
hại nông sản và thực phẩm của PLA.
3
NỘI DUNG
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1.Thực trạng về ngộ độc thực phẩm và những tổn thất do ngộ độc thực
phẩm trên thế giới và ở Việt Nam
1.1.1. Trên thế giới
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của nền kinh tế thế giới, dân số
ngày càng đông, lối sống của con người thay đổi, nhu cầu cho cuộc sống tăng
lên, các hoạt động giao lưu, du lịch, sự phân phối thực phẩm trên phạm vi
rộng, các mầm bệnh do VSV ngày càng nhiều,… đó là những nguyên nhân
làm cho ngộ độc thực phẩm (NĐTP) dễ xảy ra và ngày càng trở lên nghiêm
trọng hơn trên toàn thế giới.
Vi khuẩn gây bệnh là nguyên nhân dẫn đầu gây ra NĐTP cho con
người. NĐTP có thể đe dọa đến tính mạng con người hoặc làm suy yếu sức
khỏe kéo dài, gây bệnh mãn tính, không chữa trị có thể dẫn đến tử vong, gây
tổn thất lớn về kinh tế cho các nước.
Theo uỷ ban Khoa học và Công nghệ Hoa Kỳ, ước tính rằng có tới 76
triệu trường hợp bị bệnh do NĐTP xảy ra hàng năm với 325.000 người phải
nhập viện và 5000 người tử vong. Thực phẩm chính là thịt lợn, thịt gia cầm,
trứng, hải sản và các sản phẩm sữa bị nhiễm khuẩn đã tiêu tốn từ 6,5 - 34,9 tỷ
đô la [38]
Nguyên nhân chủ yếu là do VSV gây ra, ở Mỹ có 3 tác nhân gây bệnh

chủ yếu là Salmonella, Listeria và Toxoplasma gây tử vong, khoảng 1500
trường hợp mỗi năm. Các loại vi khuẩn gây bệnh trên rau và quả gồm:
Salmonella, Shigella, Escherichia coli, Campylobacter sp [40]
Năm 1999 tại Australia, trên 500 người ngộc độc do uống phải nước
cam nhiễm vi khuẩn Salmonela. Năm 2003 ở Hoa Kỳ, hành lá nhiễm khuẩn bị
quy là thủ phạm chính gây ra dịch viêm gan làm 400 người mắc bệnh và 3 ca
4
tử vong. Năm 2004, Hoa Kỳ và Canada, 3 đợt dịch nhiểm khuẩn Salmonela
liên quan tới cà chua Roma làm 561 người bị ngộ độc [40]
Trong những năm gần đây, tình trạng NĐTP có liên quan đến Listeria
monocytogenes đã bùng phát tại nhiều nước trên thế giới. Theo thống kê của
Mỹ, hàng năm tại nước này số bệnh nhân nhiễm bệnh do vi khuẩn Listeria
khoảng 2500 người với gần 500 người chết, còn tại Anh từ 2001 - 2005 đã có
1993 người mắc phải vi khuẩn này. Với đặc điểm dịch tễ học phức tạp, vi
khuẩn Listeria đã được Tổ chức y tế thế giới xếp vào nhóm tác nhân sinh học
có nguy cơ cao trong lĩnh vực an toàn vệ sinh thực phẩm. Listeria phân tán
rộng rãi trong môi trường đất, nước,… nên rất dễ lây nhiễm qua thực phẩm,
nguy cơ của loại vi khuẩn này không chỉ dừng lại ở việc gây ra ngộ độc thực
phẩm mà chúng còn gây ra các bệnh lý nguy hiểm như: viêm não, nhiễm
trong máu Do đó, việc nghiên cứu để đưa vào sản suất và ứng dụng các hợp
chất có nguồn gốc sinh học có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt Listeria là một
yêu cầu cấp thiết [34].
Trong những ngày cuối tháng 5 và đầu tháng 6, năm 20 vừa qua, ở một
số nước Châu Âu đã xảy ra tình trạng NĐTP do sử dụng thức ăn bị nghi ngờ
là nhiễm vi khuẩn E.coli, đã cướp đi sinh mạng của nhiều người và gây tổn
thất lớn cho nền kinh tế của các quốc gia đó.
Theo báo cáo, đợt bùng phát dịch E.coli tại châu Âu đã gây ra 24 trường hợp
tử vong và khiến 2.400 người bị lây nhiễm cho đến nay. Theo WHO, có
khoảng 3.255 người nhiễm khuẩn E.coli tại 14 quốc gia ở châu Âu, Mỹ và tại
Canada. Hầu hết trường hợp nhiễm khuẩn E.coli là ở những người đến từ Đức

hoặc từng du lịch đến nước này, nơi được coi là trung tâm đầu mối phát sinh
vi khuẩn E.coli [35]
1.1.2. Ở Việt Nam
5
Ở Việt Nam, cùng với mức sống của người dân từng bước được nâng cao,
vệ sinh an toàn thực phẩm đang trở thành vấn đề ngày càng bức xúc của toàn
xã hội, đặc biệt khi Việt Nam gia nhập WTO thì đây là một thách thức to lớn.
Ô nhiễm thực phẩm gây tổn thất về kinh tế, ảnh hưởng đến sức khoẻ người
tiêu dùng, an ninh xã hội và hội nhập kinh tế quốc tế của Việt Nam.
Từ năm 1997 đến năm 2000, thống kê cho thấy có 1364 vụ NĐTP với
24.514 người mắc và 207 người chết. Chỉ tính riêng 5 bệnh (tả, thương hàn, lỵ
trực trùng, lỵ amibe và tiêu chảy) đã có 3.540.719 người mắc và 205 người
chết, những tổn thất về NĐTP mỗi năm ước tính khoảng 500 tỷ đồng [4].
NĐTP xảy ra trên cả nước, với số lượng người mắc lên đến hàng trăm,
thậm chí hàng nghìn người. Theo tổng kết của Cục an toàn vệ sinh thực phẩm,
từ năm 1999 đến năm 2004, mỗi năm nước ta có từ 145 đến 327 vụ NĐTP với
số lượng người bị ngộ độc từ 3584 đến 7576 người và từ 37 đến 71 người tử
vong. Nguyên nhân do vi sinh vật (32,8-55,8%) [45].
Bảng 1. Tình hình ngộ độc thực phẩm ở nước ta từ 1999 đến 2005
Năm
Số vụ ngộ
độc
Số nạn nhân
Số người tử
vong
Số vụ ngộ
độc hàng
loạt
1999 327 7.576 71 -
2000 213 4.233 59 -

2001 245 3.901 63 30
2002 218 4.984 71 41
2003 238 6.428 37 42
2004 145 3.584 41 27
2005 144 4.304 53 32
(Cục An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm, Bộ Y Tế), (-): không thống kê được
Từ đầu năm 2008 tính đến tháng 7 năm 2008, ở nước ta đã có 106 vụ
NĐTP, gần 5000 người mắc và 43 người đã bị tử vong. Trong năm 2009, theo
thống kê của Cục vệ sinh an toàn thực phẩm, số vụ ngộ độc có giảm nhưng số
người mắc và tử vong lại tăng lên đến mức lo ngại. Trong tổng số 7.828
người mắc có đến 61 vụ tử vong [42]
6
Cùng với đó, từ ngày 21/3/2009 đến ngày 20/4/2009, nguyên Bộ
trưởng Bộ y tế Nguyễn Quốc Triệu cho biết cả nước xảy ra 4 vụ ngộ độc thực
phẩm tại 4 tỉnh với 936 người mắc, số người phải nhập viện là 859 người và
số người tử vong là 7 người. Tại Hà Giang xảy ra 5 vụ, Đồng Nai 1 vụ, Nghệ
An 1 vụ, thành phố Hồ Chí Minh 1 vụ [39]
Tình trạng NĐTP ngày càng gia tăng, thông tin từ Bộ Y tế cho biết
trong tháng 3/2010 đã xảy ra 9 vụ ngộ độc làm 161 người mắc, 149 người
phải nhập viện. Như vậy, từ ngày 17/12/2009 đến 17/3/2010 toàn quốc đã
xảy ra 23 vụ NĐTP với 738 người mắc, 686 người nhập viện, trong đó có
12 trường hợp tử vong[37].
Theo ông Nguyễn Quốc Triệu, nguyên Bộ Trưởng Bộ Y tế cho biết,
trong 3 tháng đầu năm 20, toàn quốc xảy ra 16 vụ ngộ độc thực phẩm với 442
người mắc và 5 người tử vong, trong đó có 1 vụ ngộ độc tập thể 30 người
[38].
Vì vậy, việc nghiên cứu, tìm ra những công nghệ bảo quản mới để ngăn
ngừa sự hư hỏng và nhiễm độc thực phẩm là vấn đề cấp bách. Vấn đề nghiên
cứu công nghệ sản xuất và sử dụng PLA, hoặc kết hợp sử dụng PLA với xử lý
hoá lý có thể là biện pháp hiệu quả để đảm bảo hàm lượng dinh dưỡng của

nguyên liệu thô và thực phẩm, kéo dài thời gian bảo quản, kìm hãm vi khuẩn
làm hỏng, gây bệnh cho người tiêu dùng [16].
1.2. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng axít phenyllactic
từ vi sinh vật trên thế giới
1.2.1. Axít phenyllactic và hoạt tính kháng vi sinh vật
PLA là một loại axít thơm, thuộc nhóm chất bảo quản có nguồn gốc
sinh học được sinh tổng hợp bởi một số chủng vi sinh vật. PLA có công thức
phân tử là C
9
H
10
O
3
, trong phân tử có chứa vòng thơm (thể hiện ở hình 1 dưới
đây), nó là chất dễ dàng hoà tan trong nước tạo thành dung dịch, nhiệt độ tan
7
chảy là 121-125
0
C, khối lượng phân tử 166,2 đvc, có thể bảo quản ở nhiệt độ
2-8
0
C [31]
Hình 1. Công thức cấu tạo của PLA
PLA được chứng minh là có khả năng ức chế sinh trưởng và sự phát triển của
một số loài vi khuẩn gram âm, gram dương, cùng nhiều loài nấm men, nấm
mốc gây hại thực phẩm [14],[21]. Paola Lavermicocca cùng cộng sự (2002)
đã nghiên cứu và chỉ ra rằng PLA được sinh ra từ chủng Lactobacillus
plantarum có khả năng ức chế khả năng sinh trưởng và phát triển của 23
chủng nấm mốc thuộc 14 loài của 3 chi Aspergillus, Penicillium, và
Fusarium, đặc biệt có những loài sinh độc tố như Aspergillus ochraceus,

Aspergillus flavus, Penicillium roquefoti, Penicillium verrucosum và
Penicillium citrium phân lập từ các sản phẩm như bánh, bột và ngũ cốc. Với
liều lượng thấp hơn 7,5 mg/ml PLA có khả năng ức chế 90% sự phát triển của
các chủng này[20]. Dieuleveux và cộng sự (1998) đã chứng minh được rằng
PLA ở liều lượng 13mg/ml có khả năng ức chế Listeria monocytogenes và ở
nồng độ 20 mg/ml ức chế một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột ở người là
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, và Aeromonas hydrophila [12].
PLA có tác dụng gây ra những biến đổi trong cấu trúc và hoạt động của
vi khuẩn Listeria monocytogenes, cơ chế diệt khuẩn này được lý giải như sau:
khi có mặt PLA, vi khuẩn tập hợp thành các khối và các polysaccarit được
tách ra, thành tế bào mất đi tính chất mềm dẻo, tính linh hoạt, tính bán thấm,
8
làm cho tế bào trương nước, căng ra, cuối cùng các tế bào vi khuẩn bị vỡ và
tan rã [13]. Cũng trong nghiên cứu này đã chỉ ra rằng, ở nồng độ 7mg/ml,
PLA có thể tiêu diệt được Listeria monocytogenes trên môi trường dịch chiết
đậu tương và dịch chiết nấm men (TSB – YE). Mật độ Listeria
monocytogenes đã giảm 100 lần so với ban đầu sau 4 ngày nuôi cấy ở 25
0
C
trên môi trường TSB – YE có PLA, mật độ của vi khuẩn này cũng giảm 1000
lần khi có mặt PLA trong giai đoạn vi khuẩn đang tăng trưởng. PLA có tác
dụng kìm khuẩn trong sữa tiệt trùng, lượng vi khuẩn đã giảm 4,5 lần so với
lượng vi khuẩn ban đầu kiểm tra trong sữa [13].
1.2.2. Tính an toàn của Axít phenyllactic
Bên cạnh việc ứng dụng PLA như là chất kháng vi sinh vật trong thực
phẩm, gần đây PLA còn được sử dụng trong một số dược phẩm như thuốc
chữa bệnh Trung Quốc có tên là “Danshensu”[30] hay sản phẩm kem chống
nhăn da [26]. Hơn nữa, PLA còn được chứng minh là có ảnh hưởng có lợi đến
hệ thống miễn dịch và khả năng đẻ trứng của gà khi nó được bổ sung vào thức
ăn hàng ngày. Tỷ lệ đẻ trứng của gà tăng lên, độ cứng của vỏ trứng cũng tăng

hơn khi bổ sung 0,3% PLA vào khẩu phần ăn hàng ngày cho gà [29]. Một số
khảo sát nghiên cứu cho thấy PLA hoàn toàn không gây độc với con người và
động vật [24]. PLA có mặt trong một số loại mật ong tự nhiên với hàm lượng
tương đối cao [32], an toàn với môi trường.
Do đó, PLA hoàn toàn được phép sử dụng trong công tác bảo quản thực
phẩm và nông sản.
1.2.3. Công nghệ sản xuất PLA
Quá trình sản xuất PLA được biết đến thông qua hai con đường chính là
hoá học và sinh học.
1.2.3.1. Sản xuất bằng phương pháp hoá học
9
PLA được tổng hợp bằng con đường hoá học thông qua quá trình khử
của kẽm và axít hydrochloric và azlactone [10] hoặc quá trình hydrogen hoá
dưới sự xúc tác của Raney-N hoặc hợp kim của Pd-C [23]. Tuy nhiên, việc
sản xuất PLA theo phương pháp này còn nhiều hạn chế như điều kiện tiến
hành phản ứng phải tuân thủ một cách nghiêm ngặt và gây ảnh hưởng tới môi
trường.
1.2.3.2. Sản xuất bằng phương pháp lên men vi sinh vật
Ngược lại với phương pháp hoá học thì quá trình sinh tổng hợp PLA
bằng con đường sinh học tỏ ra có nhiều ưu điểm, bởi nó là phương pháp thân
thiện với môi trường và sản phẩm tạo ra lại an toàn với người sử dụng. Do
vậy chúng dễ dàng được người tiêu dùng chấp nhận [9]. Ở quá trình này, PLA
được sản sinh ra bởi một số loài vi sinh vật thông qua quá trình lên men trên.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng PLA là sản phẩm cuối cùng của quá trình
biến đổi phenlalanine, trong đó phenylalanine chuyển hóa thành axít
phenylpyruvic (PPA), rồi từ đó PLA được tạo ra nhờ sự hoạt hóa của enzym
D-phenyllactic axít dehydrogenase [27]. Do vậy, sản lượng PLA được tạo ra
phụ thuộc rất nhiều vào thành phần và điều kiện môi trường nuôi cấy của
chủng vi sinh vật sinh PLA. Cơ chế sinh tổng hợp PLA được minh họa ở sơ
đồ hình 2 dưới đây :

10
Phenylalanine Axít phenylpyruvic

Axít D-phenyllactic dehydrogenase
Axít phenyllactic
Hình 2. Cơ chế sinh tổng hợp Axít phenyllactic
Kamata cùng cộng sự đã đề cập trong Patent No.603896, về việc sử dụng
những chủng đột biến của Brevibacterium lactofermentum để sản sinh ra PLA
với sản lượng đạt 1,94 g/l [18]. Geotrichum candidum sinh trưởng trên môi
trường dịch chiết đậu tương và dịch chiết nấm men cũng được phát hiện có
khả năng sinh PLA với sản lượng là 0,6 - 1 g/l [14]. Nhiều vi khuẩn thuộc
nhóm lactic đã được phát hiện có khả năng sinh PLA như Lactobacillus
plantarum, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus rhamnosus,
Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus hilgardii, Leuconostoc citreum,
Lactobacillus brevis [28]. Trong đó, có một số loài vi khuẩn thuộc nhóm
lactic có khả năng sinh PLA với hàm lượng cao. Lactobacillus plantarum
được phân lập từ sản phẩm bột mỳ lên men được xác định là có khả năng sinh
PLA [Valerio F. et al., 2008]. Lactobacillus plantarum FST1.7 được đánh giá
là có khả năng sinh 33,47mg PLA trong 1kg bột mỳ lên men [16].
Lactobacillus sp SK007 được phân lập từ môi trường lên men rau, củ chua có
khả năng sản sinh được 2,3 g/l PLA từ môi trường nuôi cấy tối ưu gồm: 30 g/l
glucose, 5 g/l axít phenylpyruvic, 47 g/l nước chiết ngô, 3 g/l K
2
HPO
4
, 3 g/l
CH
3
COONa, 30 g/l bột nấm men và 3 mL/l Tween-80 [30].

11
Với mục tiêu sản xuất PLA đạt hiệu suất cao, ngoài việc tối ưu hóa môi
trường nuôi cấy vi sinh vật và lựa chọn chủng vi sinh vật thích hợp, thì việc
lựa chọn công nghệ lên men tối ưu để đạt sản lượng PLA cao đồng thời giảm
thời gian cũng như giá thành sản xuất đóng vai trò hết sức quan trọng. Bo
Jiang et al. (2008) đã sử dụng phương pháp lên men gián đoạn 2 pha trong
tăng lên men có dung tích 1-10 lít, tốc độ cánh khuấy đạt 50-150 rpm, điều
chỉnh pH đạt 5,5-6,5, có bổ sung PPA sau 12-54 giờ lên men. Kết quả sau 70-
90 giờ lên men, hàm lượng PLA tạo ra đạt 6-20g/l [31]. Phương pháp lên men
gián đoạn chủng Lactobacillus sp SK007 có bổ sung dinh dưỡng là 100 g/l
PPA và 500 g/l glucose sau 2 giờ một lần và điều chỉnh pH tối ưu đạt 6.0 để
đạt được sản lượng PLA cao nhất là 17,38 g/l.
Gần đây nhóm nghiên cứu ở Nhật đã phân lập được gen mã hoá cho
enzyme D-phenyllactic axít dehydrogenase (D-PLDH) từ sợi nấm Mycelia
sterilia. Đây là enzyme có khả năng chuyển hoá trực tiếp PPA thành PLA.
Trong quá trình này, enzym tác động lên PPA và khử nó để chuyển hoá thành
PLA. PLA và đồng đẳng của nó như: axít p- aminophenyllactic, axít p-
nitrophenyllactic và axít p- hydroxyphenyllactic có thể được tạo ra nhờ quá
trình biến đổi của cơ chất. Để nâng cao sản lượng PLA, nhóm tác giả đã sản
xuất enzyme D-PLDH tái tổ hợp từ chủng E. coli và sử dụng enzyme này cho
chuyển hoá PPA và cũng thu được kết quả rất khả quan [27].
1.3. Thực trạng nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng axít phenyllactic để
bảo quản nông sản ở Việt Nam
Năm 2008, Bộ môn nghiên cứu công nghệ sinh học sau thu hoạch, Viện
Cơ điện nông nghiệp & Công nghệ sau thu hoạch, Bộ Nông nghiệp và phát
triển nông thôn đã bước đầu phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn
lactic có khả năng sinh PLA từ một số mẫu nước dưa, nước cà muối chua và
bột bánh mỳ. Kết quả đã tuyển chọn được 10 chủng vi khuẩn lactic có khả
12
năng sinh PLA. Thời gian lên men tối thích cho sự tạo PLA cao là 90 giờ, ở

32
0
C bằng phương pháp lên men tĩnh. Nhưng do điều kiện còn nhiều hạn chế,
hiệu suất sinh PLA của chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn được chưa cao, công
nghệ lên men và thu hồi sản phẩm chưa được nghiên cứu hoàn thiện, Vì
vậy, nhóm nghiên cứu mới dừng ở nghiên cứu công nghệ lên men yếm khí
chủng Lactobacillus sp phân lập được, mà chưa có điều kiện nghiên cứu sâu
về các yếu tố khác của công nghệ lên men trong sản xuất PLA. Vì những lý
do trên, nên sản lượng PLA của các chủng phân lập trên còn rất thấp (đạt
khoảng 0,46g PLA thô/l), hàm lượng của PLA trong dịch lên men rất thấp.
PLA đã và đang được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và ứng
dụng bảo quản nhiều loại thực phẩm để ngăn ngừa các vi sinh vật gây ngộ độc
thực phẩm ở người. Ở Việt Nam, sản phẩm này hoàn toàn mới chưa có trên
thị trường, việc nhập khẩu sản phẩm này đòi hỏi chi phí rất cao, hơn 40000
USD/kg PLA tinh khiết [36]. Do đó, việc chủ động sản xuất PLA trong nước
là rất cần thiết.
1.4. Vi sinh vật sinh tổng hợp axít phenyllactic
1.4.1. Phân loại vi khuẩn lactic
Các chủng thuộc loài vi khuẩn lactic đều là các loài ưu nhiệt, chúng hô
hấp yếm khí hoặc vi hiếu khí, phần lớn chúng đều thuộc họ lactobacillaceae
và chúng được xếp vào 4 chi là: Streptococus, pediococus, lactobacillus và
leuconostoc [1].
Một số giống vi khuẩn lactic thường gặp là:
Lactobacillus: Giống lactobacillus bao gồm 52 loài trực khuẩn phổ
biến nhất, hình dạng tế bào của chúng có thể thay đổi từ hình bầu dục cho đến
hình que dài, như loài lactobacillus plantarum tế bào hình que, kích thước
(0,7 – 1,0)x(3,0 – 8,0) µm xếp thành chuỗi hoặc đứng riêng lẻ.
13
Streptococus: Tế bào có hình tròn hoặc hình ôvan, đường kính 0,5 –
1,0 µm, tế bào thường tạo chuỗi dài hoặc xếp đôi, ít khi đứng đơn lẻ.

Leuconostoc: Có hình hơi dài hoặc hình ôvan, đường kính khoảng (0,5
– 0,8) µm và chiều dài khoảng 1,6 µm, nhưng đôi khi chúng lại có dạng hơi
tròn, xếp thành một chuỗi.
Pediococus: Có dạng hình cầu, có thể đứng riêng lẻ, kết đôi hay kết
chuỗi hoặc tạo đám tỷ cầu hay bát cầu khuẩn [7].
Vi sinh vật sinh tổng hợp axít phenyllactic
Nhiều vi khuẩn thuộc nhóm lactic đã được phát hiện có khả năng sinh
PLA như Lactobacillus plantarum, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus
rhamnosus, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus hilgardii,
Leuconostoc citreum, Lactobacillus brevis [29].
Vi khuẩn Lactobacillus plantarum được xếp vào họ Lactobacteriaceae,
thuộc chi Lactobacillus. Chi Lactobacillus là vi khuẩn lactic hiếu khí hoặc vi
hiếu khí. Chúng là loại vi khuẩn lành, là cư dân phổ biến ở trên và trong cơ
thể con người, động vật. Chúng hiện diện ở miệng, dạ dày và đặc biệt là ở hệ
đường ruột. Ngoài ra người ta còn thấy Lactobacillus ở các sản phẩm như
sữa, bơ, xác động thực vật phân hủy [19].
Vi khuẩn Lactobacillus plantarum có bề mặt khuẩn lạc rộng 0,9 ÷
1,2μm, dài 3 ÷ 8μm, khuẩn lạc tròn, nhẵn, màu trắng sữa đôi khi có màu vàng
nhạt hoặc vàng thẫm, là vi khuẩn vi hiếu khí, sinh trưởng ở 15
o
C, nhìn chung
không sinh trưởng ở 45
o
C, tối ưu ở nhiệt độ 30 ÷ 45
0
C, tế bào có dạng hình
que, bắt màu gram dương, không có khả năng di động, không sinh bào tử,
phản ứng catalase âm tính. Có khả năng đồng hoá cacbonhydrat amygdalin,
arabinnoza, xenlobioza, fructoza, glucoza, lactoza, maltoza, manitol,
melezitoza, saccaroza, nhưng không sử dụng sorbitoi. Chủng Lactobacillus có

14
khả năng sinh bacterioxin II, PLA, 4-hydroxy phenyllactic axít và có khả
năng sinh protein kháng khuẩn có trọng lượng phân tử 10 - 30 KDa [19].
Lactobacillus plantarum được phân lập từ sản phẩm sữa, rau lên men, cỏ
lên men, rau dưa, thức ăn ủ chua, sản phẩm cà chua bị lên men, bột chua,
miệng, đường ruột [19].
1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của Lactobacillus
plantarum và khả năng sinh axít phenyllactic của chúng
Để tổng hợp và thu nhận PLA từ Lactobacillus plantarum, người ta sử
dụng phương pháp nuôi cấy chìm gián đoạn với thành phần môi trường và
điều kiện nuôi cấy thích hợp để thu nhận PLA đạt hiệu suất cao nhất. Thành
phần môi trường là nhân tố quyết định tới quá trình sinh trưởng và phát triển
của Lactobacillus plantarum cũng như hiệu suất sinh PLA. Thành phần dinh
dưỡng bao gồm các yếu tố như nguồn cacbon, nguồn nitơ, nguồn khoáng…và
thành phần môi trường như ảnh hưởng của pH, thời gian lên men, chế độ
thông khí.
1.4.2.1. Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng
Các chất dinh dưỡng đối với vi sinh vật là bất kỳ chất nào vi sinh vật
hấp thụ từ môi trường xung quanh, được chúng sử dụng làm nguyên liệu để
cung cấp cho các quá trình sinh tổng hợp, tạo ra các thành phần của tế bào
hoặc để cung cấp cho các quá trình trao đổi chất, trao đổi năng lượng.
Lactobacillus plantarum đòi hỏi môi trường dinh dưỡng tổng hợp chứa
hydratcarbon, axít amin, peptide, vitamin, chất khoáng,… cho quá trình phát
triển sinh khối và tổng hợp PLA [2].
a. Nhu cầu về nguồn dinh dưỡng carbon
Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại nguồn carbon khác nhau để đáp
ứng nhu cầu dinh dưỡng carbon của chúng như: hexose (glucose, fructose,
manose, galactose), các đường đôi (saccharose, lactose, maltose) và cả các
15
polysaccharide (tinh bột, dextrin). Nguồn carbon quan trọng nhất đối với vi

khuẩn vẫn là monosaccharide và disaccharide. Nguồn thức ăn này được sử
dụng để cung cấp năng lượng, nguyên liệu để xây dựng cấu trúc tế bào và để
sinh tổng hợp các axít hữu cơ [7]
Vì vậy, những hợp chất carbon có ý nghĩa hàng đầu trong sinh trưởng của
vi sinh vật nói chung và của vi khuẩn Lactobacillus plantarum nói riêng.
b. Nhu cầu dinh dưỡng về nguồn nitrogen
Phần lớn vi khuẩn lactic đều là các vi khuẩn dị dưỡng nitơ, vì vậy để đảm
bảo cho quá trình phát triển và sinh tổng hợp axít hữu cơ được dễ dàng chúng
cần có nguồn nitơ sẵn có trong môi trường. Hơn nữa, chỉ có một số ít loài vi
khuẩn lactic có khả năng sử dụng nguồn nitơ vô cơ nên việc cung cấp nguồn
nitơ hữu cơ vào môi trường lên men là rất cần thiết.
Nguồn cung cấp dinh dưỡng nitơ là các axít amine, trong quá trình nuôi
cấy con người sẽ bổ sung các nguồn chứa nitrogen như: Cao nấm mem, cao
thịt, pepton, cao ngô, casein,…Nhưng trong môi trường chứa quá nhiều các
axít amin và protein thì nó sẽ ức chế sự trao đổi chất của vi khuẩn do các hợp
chất này tạo thành hệ keo bám trên bề mặt tế bào, làm giảm trao đổi chất của
tế bào với môi trường dinh dưỡng [7].
c. Vitamin
Hầu hết các vi khuẩn thuộc nhóm lactic không tự tổng hợp được các
vitamin, trong khi vai trò của các nhóm này đối với chúng lại rất có ý nghĩa,
Cũng như đối với các vi sinh vật khác, vitamin đóng vai trò là coenzyme của
các enzyme, các vitamin vừa kích thích sự phát triển, vừa điều hòa quá trình
cân bằng năng lượng của cơ thể. Chính vì vậy, trong môi trường nuôi cấy vi
khuẩn lactobacillus plantarum nói riêng vi khuẩn lactic nói chung người ta
phải bổ sung nguồn cơ chất chứa nhiều vitamin như dịch chiết khoai tây, cà
rốt, cao nấm men [7].
16
Nhu cầu về vitamin còn phụ thuộc nhiều vào môi trường và điều kiện nuôi
cấy. Các yếu tố có tác động mạnh đến nhu cầu vitamin như: Nhiệt độ, pH,
hàm lượng CO

2
và thế oxy hóa – khử của môi trường [7].
d. Các chất khoáng
Khi sử dụng các môi trường tự nhiên để nuôi cấy vi sinh vật người ta
thường không cần thiết bổ sung các nguyên tố khoáng. Trong nguyên liệu
dùng làm các môi trường này (khoai tây, nước thịt, sữa, huyết thanh, giá đậu,
pepton) thường có đủ các nguyên tố khoáng cần thiết đối với vi sinh vật.
Ngược lại, khi làm các môi trường tổng hợp (sử dụng nguyên liệu là hoá chất)
bắt buộc phải bổ sung đầy đủ các nguyên tố khoáng cần thiết. Các nguyên tố
khoáng đòi hỏi phải cung cấp với liều lượng đủ lớn gọi là các nguyên tố đa
lượng. Còn những nguyên tố khoáng mà vi sinh vật đòi hỏi với liều lượng rất
nhỏ được gọi là các nguyên tố vi lượng [2].
Để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển đầy đủ của mình, vi khuẩn
lactobacillus plantarum cần phức hợp các hợp chất vô cơ như: photpho, lưu
huỳnh, kali, magie, mangan, đồng, sắt, natri,…đặc biệt là mangan [2].
- Photpho (P): Chiếm tỷ lệ cao nhất trong thành phần các nguyên tố
khoáng (50%) của tế bào vi sinh vật. Photpho có mặt trong cấu tạo nhiều
thành phần quan trọng của tế bào như: axit nucleic, photphoprotein,
photpholipit, coenzym (ADP, ATP,…) và một số vitamin: Biotin, tiamin.
Người ta thường bổ sung photphat vô cơ vào môi trường, ngoài tác dụng làm
đệm pH để ổn định pH của môi trường. Nồng độ P cao sẽ kích thích hình
thành ATP và cung cấp năng lượng cho tế bào, giúp tế bào sinh trưởng và
phát triển tốt hơn [2].
- Lưu huỳnh (S): Lưu huỳnh cũng là nguyên tố khoáng quan trọng trong
tế bào vi sinh vật. Lưu huỳnh có mặt trong một số axit amin: xixtin,
methionin và một số vitamin: biotin,…S là nguyên liệu xây dựng lên cấu trúc
17
của protein và là nguyên liệu có vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển
điện tử của quá trình oxi hoá. Các hợp chất hữu cơ có chứa lưu huỳnh ở dạng
oxi hoá thường có tác dụng độc đối với tế bào vi sinh vật. Trong khi đó các

muối sunphat vô cơ với nguyên tử lưu huỳnh cũng ở trạng thái oxi hoá thì lại
được vi sinh vật đồng hoá rất tốt [2].
Đối với vi khuẩn Lactobacillus plantarum sử dụng muối MgSO
4
và
MnSO
4
là nguồn cung cấp S cũng như nguồn cung cấp Mn, Mg.
- Magie (Mg): Mg tham gia vào nhiều phản ứng enzym có liên quan đến
các quá trình photphoryl hoá. Mg có thể làm hoạt hoá hexokinaza, ATP – aza,
pirophotphat, photphopheraza, transaxetilaza, photphoglucomutaza,
cacboxilaza, các enzim trao đổi protein, các enzim oxi hoá khử của chu trình
Krebs. Mg
2+
còn có vai trò quan trọng trong việc làm liên kết các tiểu phần
riboxom với nhau [2].
- Canxi (Ca): Ca là nguyên tố ít tham gia vào việc xây dựng nên các hợp
chất hữu cơ, nhưng nó có vai trò đáng kể trong việc xây dựng các cấu trúc
tinh vi của tế bào. Ca đóng vai trò cầu nối trung gian giữa nhiều thành phần
quan trọng của tế bào sống như: AND và protein trong nhân đối với việc hình
thành cấu trúc không gian ổn định của nhiều bào quan như riboxom, ti thể,
nhân [2].
- Kẽm (Zn): Zn tham gia vào nhiều quá trình. Kẽm có tác dụng đáng kể
trong việc hoạt hoá các enzim như: anolaza, photphataza kiềm [2].
- Sắt (Fe): Fe là nguyên tố cần thiết để vi sinh vật tổng hợp một số men
loại pocphirin chứa Fe: xitocrom, catalaza, peroxidaza [2].
- Mangan (Mn): Mn có chứa trong một số enzimi hô hấp, có vai trò quan
trọng trong việc hoạt hoá một số enzim như photphomonoesteraza,
cacboxylaza, ATP – aza, hydroxylamine reductaza,… Ngoài ra Mn còn ngăn
cản quá trình tự phân của tế bào và nó cần thiết cho quá trình sống bình

18
thường của vi khuẩn. Chính vì vậy, trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn này,
người ta thường bổ sung thêm muối MnSO
4
[2].
Tuy nhiên, sự tồn tại một cách dư thừa các nguyên tố khoáng là không cần
thiết và có thể dẫn đến những ảnh hưởng xấu. Chẳng hạn như việc dư thừa
photphore có thể làm giảm hiệu suất tích luỹ một số chất kháng sinh, thừa sắt
sẽ cản trở quá trình tích lũy vitamin B
2
hoặc vitamin B
12
[2].
Vi khuẩn Lactobacollus plantarum cần một nhu cầu rất lớn về các hợp
chất hữu cơ cho sự phát triển của chúng. Có thể nói axít axetic và axít xitric
có tác động thuận lợi đến tốc độ phát triển của vi khuẩn Lactobacillus
plantarum. Đó cũng là lý do mà trong môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo
quản các loại vi khuẩn lactic nói chung và vi khuẩn Lactobacillus plantarum
nói riêng thường có mặt của các muối acetate và citrate.
Một loại axit hữu cơ quan trọng có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của
hầu hết các vi khuẩn lactic là axít oleic, axít linoleic, hoặc axít linolenic. Do
đó, trong môi trường phân lập và nuôi cấy, người ta thường sử dụng Tween-
80, một dẫn xuất của axít oleic để tăng cường các axít béo không no cho sự
phát triển của nhóm vi khuẩn này [30].
1.4.2.2. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sinh trưởng và khả năng sinh
tổng hợp axít phenyllactic của vi khuẩn lactobacillus plantarum.
- Ảnh hưởng của pH.
Hoạt động của vi khuẩn lactic chịu tác động rất mạnh của pH môi
trường lên men. Độ pH của môi trường tác động đến quá trình trao đổi chất
của tế bào, đặc biệt là tác động đến hệ ezim của chúng, mỗi ezim đều có một

dải pH tối ưu mà tại đó hoạt lực của enzim là cao nhất [2].
Nếu pH không thích hợp, vi khuẩn Lactobacillus plantarum có thể bị
ức chế, phát triển kém hay bị tiêu diệt. Chính vì vậy, điều chỉnh pH tối ưu để
thu được lượng PLA cao nhất là rất cần thiết. Có rất nhiều nhà khoa học đã
19
nghiên cứu cho rằng Lactobacillus plantarum sinh PLA cao nhất khi pH = 6,0
đến 6,5 [30].
- Ảnh hưởng của chế độ thông khí.
Vi khuẩn Lactobacillus plantarum là vi khuẩn có thể sống ở điều kiện môi
trường yếm khí đến hiếu khí, đó là chúng không có hệ enzimi oxy hóa – khử
xitocrom và catalase trong tế bào. Tuy nhiên, vi khuẩn lactic vẫn có thể oxy
hóa một số chất theo cách sử dụng oxy phân tử vì chúng có hệ enzim oxy hóa
FAD (Flavin Adenin Dinucleotid), hệ enzim peroxydase nội bào, có thể thực
hiện các chức năng thay cho hệ enzim dehydrogenase để vận chuyển H
+
, khi
đó oxy được sử dụng là chất nhận điện tử. Quá trình oxy hóa ở vi khuẩn lactic
xảy ra thường kèm theo hình thành H
2
O
2
. Tuy nhiên, ảnh hưởng của hàm
lượng oxy còn phụ thuộc vào điều kiện khác của môi trường như nhiệt độ [7].
Do đó, khi nuôi cấy khối lượng lớn vi sinh vật phải nuôi cấy trên máy lắc
hoặc phải thổi không khí vô khuẩn vào bình (hay nồi) nuôi cấy.
Việc xác định nhu cầu oxy của Lactobacillus plantarum trong từng giai
đoạn là một trong những cơ sở để đưa ra giải pháp công nghệ cho quá trình
lên men ở quy mô công nghiệp.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ.
Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến hoạt động sống của vi sinh vật, do tốc độ

phản ứng phụ thuộc vào nhiệt độ. Tốc độ phản ứng hóa sinh, hoạt lực ezim,
tốc độ của quá trình chuyển hóa phụ thuộc vào nhiệt độ.
Mỗi loài vi sinh vật thích hợp phát triển ở dải nhiệt độ khác nhau. Đã có
nhiều nhà khoa học nghiên cứu cho rằng vi khuẩn Lactobacillus plantarum có
thể phát triển trong dải nhiệt độ từ 30 - 45
0
C. Nhưng nhiệt độ tối ưu cho sự
sinh trưởng phát triển là 30
0
C. Nếu nhiệt độ thấp vi khuẩn sinh trưởng kém,
tốn thời gian. Nếu nhiệt độ quá cao trên 45
0
C thì vi khuẩn sẽ bị chết [11].
20
- Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu.
Do màng tế bào của vi khuẩn có tính bán thấm, hoạt động trao đổi chất của
tế bào phụ thuộc vào hệ enzyme pecmerase nằm trên màng tế bào và áp suất
thẩm thấu của từng cơ chất có trong môi trường. Áp suất thẩm thấu của môi
trường tỷ lệ với nồng độ chất khô hòa tan trong môi trường. Khi hàm lượng
NaCl > 5% thì vi khuẩn Lactobacillus plantarum không phát triển [7].
- Ảnh hưởng của thời gian lên men đến sự tích lũy hàm lượng PLA
trong môi trường.
PLA là một axít và khi nó được sinh ra trong điều kiện lên men nó sẽ làm
giảm pH của môi trường. Do đó, thời gian lên men là một yếu tố rất quan
trọng để PLA thu được với hiệu suất cao nhất. Nếu thời gian ngắn có thể sinh
khối Lactobacillus plantarum tạo ra ít, PLA chưa được tạo ra, còn nếu thời
gian quá dài thì lượng dinh dưỡng của môi trường giảm, không đủ thức ăn
cho vi khuẩn, vi khuẩn sẽ chết, đồng thời pH giảm mạnh sẽ ức chế vi khuẩn
hoạt động, gây tốn kém. Như những phân tích trên việc tối ưu hoá thời gian
lên men là rất cần thiết. Theo những nghiên cứu mới đây, PLA tạo ra đạt năng

suất cao khi thời gian lên men kéo dài từ 24 – 72
h
[30], [33].
21
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu.
2.1.1. Nguyên liệu
* Nguyên liệu chính
- Các mẫu nước dưa, nước cà muối chua thu thập tại các chợ trên địa
bàn Hà Nội (chợ Hà Đông, chợ Trâu Quỳ, chợ Sinh Viên, Chợ Long Biên,
chợ Hôm, chợ Hàng Bè). Các mẫu đưa về phòng thí nghiệm được phân lập
ngay, nếu chưa phân lập được ngay mẫu được đưa vào tủ lạnh bảo quản ở
5
0
C.
- Một số chủng nấm mốc thử nghiệm Aspergillus niger, Aspergillus
flavus, Penicillium digitatum thu thập từ bộ chủng giống vi sinh vật của bộ
môn nghiên cứu Công nghệ sinh học sau thu hoạch, Viện Cơ điện Nông
nghiệp và CNSTH.
- Một số chủng vi khuẩn gây bệnh đường ruột (E.coli, S.aureus) thử
nghiệm được thu thập từ bộ chủng giống của Khoa vi khuẩn, Viện Vệ sinh
dịch tễ Trung ương.
* Môi trường
a. Môi trường phân lập (ký hiệu là MT1)
Môi trường phân lập vi khuẩn Lactobacillus plantarum được lựa chọn
là môi trường MRS (Man – Rogosa – Sharpe), gồm: 20g Glucose, 10g
Pepton, 10g Cao thịt, 5g Cao nấm men, 2g (NH
4
)
3

C
6
H
5
O
7
, 2g K
2
HPO
4
, 5g
CH
3
COONa, 0,58g MgSO
4
.7H
2
O, 0,95g MnSO
4
.4H
2
O, 1ml Tween80, 20g
agar.
Các hóa chất được cân chính xác rồi phối trộn theo tỷ lệ trên vào nước
cất sao cho đủ 1000ml môi trường, khuấy đều cho tan hết hóa chất, điều chỉnh
22
pH = 6,5 sau đó đổ vào bình tam giác (200ml/bình), đem hấp tiệt trùng ở
121
0
C trong thời gian 20 phút.

b. Môi trường lên men (ký hiệu là MT2)
Môi trường lên men sử dụng là môi trường MRS lỏng. Thành phần:
20g Glucose, 10g Pepton, 10g Cao thịt, 5g Cao nấm men, 2g (NH
4
)
3
C
6
H
5
O
7
,
2g K
2
HPO
4
, 5g CH
3
COONa, 0,58g MgSO
4
.7H
2
O, 0,95g MnSO
4
. 4H
2
O, 1ml
Tween80.
Các hóa chất được cân chính xác rồi phối trộn theo tỷ lệ trên vào nước

cất sao cho đủ 1000ml môi trường, khuấy đều cho tan hết hóa chất, điều chỉnh
pH = 6,0 sau đó đổ vào bình tam giác (200ml/bình), đem hấp tiệt trùng ở
121
0
C trong thời gian 20 phút.
c. Môi trường giữ giống: Môi trường giữ giống vi khuẩn Lactobacillus
plantarum chúng tôi sử dụng là môi trường MT1
d. Môi trường hoạt hóa giống: Môi trường hoạt hóa vi khuẩn
Lactobacillus plantarum chúng tôi sử dụng là môi trường MT2
e. Môi trường nuôi cấy nấm mốc, nuôi cấy vi khuẩn
+ Môi trường PDA có thành phần (g/l): Glucoza 20; khoai tây 200; agar 20
+ Môi trường thạch thường (g/l): Pepton 10; NaCl 5, nước chiết thịt 125
ml; glucoza 1; thạch 20; nước 1 lít.
2.1.2. Hóa chất
Hóa chất dùng trong thí nghiệm thuộc bộ môn Công nghệ sinh học sau
thu hoạch, Viện cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đạt tiêu
chuẩn chất lượng gồm có: Pepton, Cao nấm men, CaCO
3
, K
2
HPO
4
.3H
2
O,
(NH
4
)
3
C

6
H
5
O
7
, CH
3
COONa, Nước chiết thịt, Tween 80, MgSO
4
.7H
2
O, Agar,
MnSO
4
.4H
2
O, KOH, Fucsin kiềm, NaOH, tinh thể Phenolphtalein, H
3
PO
4
,
Glucose, Cao thịt, MgCl
2
, C
4
H
9
OH, axit phenylpyruvic, H
2
SO

4
, Etyl axetat,
23
Ete, Cloroform, cồn 75
0
, 96
0
, Butanol, Metanol, Ca(OH)
2
0,1N, Etanol,
NaHSO
3,
giấy đo pH,…
2.1.3. Thiết bị
Máy đo pH Ohaus (Thụy Điển), Cân phân tích Ohaus (Thụy Điển),
Máy đông khô Edwards (Anh), Máy ly tâm (Đức), Tủ lạnh sâu -20
0
C(Nhật),
Tủ nuôi cấy (Nhật Bản), Máy khuấy trộn Vontex RotoLab (OSI), Lò vi song
(Trung Quốc), Tủ cấy vô trùng (Nhật), Máy lắc ổn nhiệt (Đức), Tủ sấy (Việt
Nam), Nồi khử trùng (Trung Quốc), Hệ thống HPLC Thermo Finigan (Mỹ),
Thiết bị cô quay chân không Buchi RE 1(Thụy sỹ), Máy đo OD Merck
(Trung Quốc), Thiết bị đông khô Christ (Đức), Máy lắc Gyrmax (Mỹ), Tủ cấy
Box (Đức), Tủ nuôi cấy Sanio (Nhật), Kính hiển vi Olympus (Nhật), Nồi khử
trùng Study (Nga), Bể ổn nhiệt Teech (OSI), Kính hiển vi Olympus(Nhật), Tủ
mát 5
0
C (Việt Nam), Tủ sấy Memmert (Trung Quốc), Pipetman các loại
(Đức),…
Các dụng cụ dùng cho nuôi cấy vi sinh: Hộp petri, ống nghiệm, pipet,

que cấy, que trang, đèn cồn, bình tam giác, ống đong, giấy thấm, giấy lọc,…
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh
2.2.1.1. Phương pháp thu thập mẫu
Mục đích: Thu thập các chủng vi khuẩn thuộc nhóm lactic sinh PLA
hiệu suất cao có trong nước dưa, nước cà muối chua.
Phương pháp tiến hành: Lấy ngẫu nhiên các mẫu nước dưa, cà muối
chua thuộc 6 chợ trên địa bàn Hà Nội (Chợ Hà Đông, chợ Trâu Quỳ, chợ Sinh
Viên, chợ Long Biên, chợ Hôm, chợ Hàng Bè). Mỗi mẫu khoảng 100ml vào
túi nilon, các mẫu được dánh dấu theo địa điểm và ngày lấy mẫu. Mẫu được
đưa về phòng thí nghiệm của bộ môn nghiên cứu Công nghệ sinh học sau thu
24
hoạch, Viện Cơ điện Nông nghiệp và CNSTH để tiến hành phân lập ngay, nếu
chưa phân lập mẫu sẽ được bảo quản trong tủ lạnh ở 4
0
C.
2.2.1.2. Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn [26]
- Mục đích: Tuyển chọn và đưa các chủng vi khuẩn về dạng thuần
khiết.
- Chuẩn bị:
+ Chuẩn bị dãy ống nghiệm có chứa 9ml nước cất vô trùng, được đánh
số theo thứ tự.
+ Nấu môi trường MT1 đổ vào các ống nghiệm vô trùng để làm thạch
nghiêng và đổ vào bình tam giác, tất cả được đem hấp vô trùng ở 121
0
C trong
thời gian 20 phút. Môi trường MT1 trong bình tam giác sau khi hấp để nguội
45
0
C rồi đổ vào các hộp lồng gọi là các đĩa thạch.

- Phương pháp tiến hành:
+ Lấy 1ml nước dưa hoặc nước cà muối chua cho vào ống nghiệm chứa
9ml nước cất đã vô trùng, lắc đều bằng máy voltex với tốc độ 1800v/phút
trong 5 phút, thu được dung dịch gốc có nồng độ pha loãng 10
-1
.
+ Hút 1ml dung dịch gốc cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô
trùng, lắc đều 1800v/phút trong 5 phút bằng máy voltex, thu được dung dịch
có nồng độ pha loãng 10
-2
. Tiếp tục lấy 1ml ở ống nghiệm có nồng độ 10
-2
cho
vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng tiếp theo ta được dung dịch có
nồng độ pha loãng 10
-3
. Cứ tiếp tục như vậy ta thu được dung dịch có nồng độ
10
-4
.
+ Tiến hành phân lập: Dùng pipet hút lấy 10µl dịch pha loãng ở nồng
độ 10
-4
nhỏ lên bề mặt môi trường MT1 đã được vô trùng trong đĩa petri.
Dùng que gạt trang đều trên môi trường cho đến khô, sau đó gói báo và đặt
vào trong tủ nuôi ở nhiệt độ 30
0
C trong thời gian 48 giờ. Mỗi mẫu 3 lần lặp
lại.
25