Đề tài : Nghiên cứu về listeria monocytogenes trong các sản phẩm thuỷ sản

Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm
thủy sản
CHƯƠNG I
GIỚI THIỆU
SVTH: Võ Thành Hưng 1
Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm
thủy sản
1.1. Đặt vấn đề
Các bệnh lý nhiễm trùng là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới.
Không chỉ có những bệnh nhiễm trùng mới phát sinh mà những bệnh nhiễm trùng cũ
gây chết người đã biết từ lâu cũng tái xuất hiện. Hơn nữa tỉ lệ vi khuẩn gây bệnh đề
kháng kháng sinh ngày càng tăng cao là nguy cơ lớn cho sức khỏe cộng đồng. Những
bằng chứng gần đây cho thấy các tác nhân gây bệnh mặc dù rất khác nhau đều sử dụng
những phương thức chung để phát động quá trình nhiễm trùng và gây bệnh. Những cơ
chế này tạo nên độc lực (virulence) của vi khuẩn. Tìm hiểu các cơ chế mà vi khuẩn sử
dụng để xâm nhập và gây bệnh có ý nghĩa quan trọng trong cuộc chiến chống lại các tác
nhân bé nhỏ này.
Listeria monocytogenes là tác nhân gây bệnh listeriosis. Vi khuẩn này được xếp
là tác nhân gây bệnh đứng thứ ba thuộc nhóm B sau Streptococcus và E. coli. Đồng thời
là nguồn chính lây nhiễm bệnh cho người trong các sản phẩm bảo quan lạnh, vi sinh vật
này có khả năng tồn tại tăng trưởng trong sản phẩm suốt quá trình bảo quản lạnh. Đối
với vi sinh vật ngộ độc thực phẩm khác, chúng sẻ phát bệnh khi con người hấp thu đủ
liều lượng, sau thời gian ủ bệnh các triệu chứng lâm sàn biểu hiện. Trong đó Listeria
monocytogenes hiện diện với số lượng nhỏ trong thực phẩm, khi vào cơ thể chúng
không bị đào thải mà tích lũy chờ cơ hội. Mặc dù bệnh do Listeria monocytogenes gây
ra là ở tầng số thấp, 2 - 5 trường hợp trên một triệu người một năm, nhưng tỉ lệ chết do
vi khuẩn này là rất cao, 25 - 30% trường hợp tử vong trong các ca nhiễm bệnh.
Đối tượng bị nhiễm bệnh do Listeria monocytogenes gây ra thường gặp ở trẻ em,
trẻ sơ sinh, người già, thai phụ và người có hệ miễn dịch kém. Listeria monocytogenes
gây ra bệnh nhiễm trùng máu, viêm màng não hoặc sốt viêm dạ dày ruột, đồng thời cũng
là nguyên nhân gây ra trẻ chết sau khi sinh, đẻ non và sẩy thai ở phụ nữ.

Do đó, với tính phân bố rộng và khả năng gây ra những tác hại nghiêm đối với
người bị nhiễm L. Monocytogenes và được sự chấp thuận của khoa Môi trường và Công
SVTH: Võ Thành Hưng 2
Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm
thủy sản
nghệ sinh học, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu về Listeria monocytogenes
trong các sản phẩm thủy sản”.
1.2. Mục đích
Cấu trúc và cơ chế gây bệnh của Listeria monocytogenes.
1.3. Nội dung nghiên cứu
− Khảo sát về cấu trúc của Listeria monocytogenes.
− Khảo sát về sự phân bố của Listeria monocytogenes.
− Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes trong sản phẩm thủy sản trên thế
giới và Việt Nam hiện nay.
− Một số phương pháp xác định Listeria monocytogenes.
SVTH: Võ Thành Hưng 3
Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm
thủy sản
CHƯƠNG II
TỔNG QUAN
SVTH: Võ Thành Hưng 4
Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm
thủy sản
2.1. Tổng quan về một số vi sinh vật nhiễm trong thực phẩm
2.1.1. Salmonella sp
Hình 2.1: Salmonella vi khuẩn chuyên chở bệnh thương hàn
2.1.1.1. Phân loại
 Giới: Bacteria
 Nghành: Proteobacteria
 Lớp: Gamma Proteobacteria

 Bộ: Enterobacteriales
 Họ: Enterobacteriaceae
 Chi: Salmonella
 Loài: Salmonella sp
2.1.1.2. Đặc điểm
Salmonella là trực khuẩn Gram âm. Hầu hết các loài Salmonella đều có lông
xung quanh thân (trừ Salmonella gallinarum và Salmonella pullorum), vậy có khả năng
di động, không sinh bào tử. Có kích thước tế bào vào khoảng 0,5 – 3 µm.
Salmonella là vi khuẩn hiếu khí hay hiếu khí tùy nghi, thích hợp ở 37
0
C, pH tối
ưu 7,2 - 7,6. Để mọc trên các môi trường thông thường.
SVTH: Võ Thành Hưng 5
Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm
thủy sản
 Đặc điểm sinh hóa:
Salmonella lên men glucose có sinh hơi (trừ Salmonella typhi lên men glucose
không sinh hơi) không lên men lactose, Indol âm tính, Methyl Red dương tính, VP âm
tính, Citrat thay đổi, Urease âm tính, H
2
S dương tính (trừ Salmonella paratyphi A: H
2
S
âm tính)
Lên men sinh hơi các đường glucose, manit, sorbitol, lên men không đều
sacharose, không lên men đường lactose, salicin, raffinose … (Tô Minh Châu và Trần
Bích Liên, 1999).
2.1.1.3. Cấu trúc kháng nguyên
 Kháng nguyên O
Mỗi Salmonella có thể có một hoặc nhiều yếu tố kháng nguyên. Hiện nay người

ta biết có 67 yếu tố kháng nguyên O. Việc xác định các yếu tố kháng nguyên O là hết
sức quan trọng để định nhóm và định type.
 Kháng nguyên H
Chỉ có ở những Salmonella có lông. Kháng nguyên H của Salmonella có thể tồn
tại dưới 2 pha.
• Pha đặc hiệu (phase 1): là những yếu tố có tính chất đặc hiệu cho
từng loài vi khuẩn Salmonella, gồm 28 kháng nguyên lông được kí hiệu bằng chữ cái a,
b, c, g,….
• Pha không đặc hiệu (phase 2): được kí hiệu số 1, 2, 3,….
(Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên, 2001)
 Kháng nguyên Vi
Là kháng nguyên bề mặt bao bên ngoài vách tế bào vi khuẩn, dưới dạng một
màng mỏng không nhìn thấy được ở kính hiển vi thường. Kháng nguyên Vi chỉ có ở 2
type huyết thanh Salmonella typhi và S. paratyphi C.
Người ta dựa vào sự khác nhau về cấu trúc kháng nguyên để xếp loại Salmonella.
SVTH: Võ Thành Hưng 6
Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm
thủy sản
Bảng 2.1: Phân biệt các kháng nguyên O, H, Vi:
Kháng nguyên Tính chịu nhiệt
Tác động của
alcohol 50%
Formol 50%
O Ổn nhiệt 2h30 ở 100
0
C Kháng Bị ngăng trở ngưng kết
Vi Biến nhiệt 15’06” ở 100
0
C Nhạy cãm Kháng
H Biến nhiệt 2h ở 100

0
C Nhạy cãm Kháng
Hình 2.2: Các kháng nguyên bề mặt của Salmonella.
2.1.1.4. Yếu tố độc lực
Có hai loại độc tố là nội độc tố và ngoại độc tố
Ngoại độc tố đường ruột (entero toxin) có hai loại là LT và ST.
• Độc tố LT không bền với nhiệt, LT hoạt hóa enzyme adenylcuclase trong
tế bào niêm mạc ruột, làm gia tăng c-AMP (cyclo adenosine 5-monophosphate), c-AMP
SVTH: Võ Thành Hưng 7
Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm
thủy sản
sẽ kích thích tiết Cl
-
và HCO
3
-
ra khỏi tế bào, đồng thời ức chế Na
+
vào bên trong tế bào.
Hậu quả tích nước trong ống ruột dẫn đến tiêu chảy.
• Độc tố ST bền với nhiệt, cơ chế tác động tương tự như LT. ST hoạt hóa
enzyme guanosylcyclase làm tăng c-GMP (cycle guanosine 5-monophosphate) ở trong
tế bào dẫn tới hiện tượng tiêu chảy.
2.1.1.5. Khả năng gây bệnh
Salmonella xâm nhập vào cơ thể qua đường miệng và hầu hết là do ăn phải thức
ăn bị nhiễm như thực phẩm, sữa, nước uống…. Sau khi xuyên qua hàng rào acid dạ dày,
vi khuẩn di động về phía ruột non và sinh sản ở đó, tiếp tục chui qua 1 màng nhày và
vào thành ruột. Các tế bào Paneth của niêm mạc ruột tiết ra một loại peptide có tính
chống lại sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh.
Salmonella nhiễm vào cơ thể từ hai nguồn: từ phân người hoặc

động vật, từ người bệnh. Trong đó phải kể đến tác động của động vật
lông vũ, trứng và phân của chúng đã làm cho việc lan truyền
Salmonella dễ dàng hơn. Ngoài ra chuột, mèo, ruồi cũng là tác nhân
gián tiếp dẫn đến việc Salmonella lan rộng rãi hơn khi phân của chúng
nhiễm vào các thực phẩm không được bảo quản kỹ. trong quá trình
giết mổ củng cần đề phòng sự nhiễm Salmonella nếu không thực hiện
đúng quy trình an toàn thực phẩm.
 Bệnh thương hàn
SVTH: Võ Thành Hưng 8
Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm
thủy sản
Hình 2.3: Viêm dạ dày – ruột
Ở nước ta, bệnh thương hàn chủ yếu do S. typhi, sau đó đến S. paratyphi A, còn
S. paratyphi B và S. paratyphi C thì ít gặp. Bệnh lây từ người này sang người khác, qua
thức ăn, nước uống bị nhiễm khuẩn. Sau khi khỏi bệnh về mặt lâm sàng, khoảng 5%
bệnh nhân trở thành người lành mang vi khuẩn kéo dài hàng tháng hoặc hàng năm. Ở
họ, ổ chứa Salmonella là đường mật và vi khuẩn vẫn được tiếp tục đào thải theo phân ra
ngoại cảnh. Người lành mang vi khuẩn là nguồn lan truyền bệnh quan trọng.
Sinh bệnh học: Trực khuẩn thương hàn vào cơ thể qua đường tiêu hóa đến ruột
non thì chui qua niêm mạc ruột rồi vào các hạch mạc treo ruột. Ở đó chúng nhân lên và
một phần vi khuẩn bị dung giải, giải phóng ra nội độc tố. Nội độc tố kích thích thần kinh
giao cảm ở bụng, gây thương tổn mảng Peyer, xuất huyết tiêu hóa, có thể gây thủng
ruột. Ngoài ra, nội độc tố theo máu lên kích thích trung tâm thần kinh thực vật ở não
thất ba, gây ra trạng thái sốt kéo dài, li bì, và gây ra biến chứng trụy tim mạch Từ các
hạch mạc treo ruột vi khuẩn lan tràn vào máu gây nên nhiễm khuẩn huyết và lan đi khắp
cơ thể, rồi vi khuẩn vào mật và từ đó quay trở lại ruột. Vi khuẩn theo phân ra ngoại
cảnh.
 Các bệnh khác
SVTH: Võ Thành Hưng 9
Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm

thủy sản
Các bệnh không phải thương hàn do Salmonella gây ra thường là một nhiễm
trùng giới hạn ở ống tiêu hóa trong các trường hợp nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn mà
Salmonella typhimurium là tác nhân hay gặp nhất, sau đó là Salmonella enteritidis
Nhiễm trùng nhiễm độc do Salmonella có thời gian nung bệnh từ 10 đến 48 giờ. Bệnh
biểu hiện có sốt, nôn, tiêu chảy. Bệnh khỏi sau 2 - 5 ngày, không có biến chứng.
Ngoài ra, Salmonella có thể gây nên các tổn thương ở ngoài đường tiêu hóa như
viêm màng não, thể nhiễm trùng huyết đơn thuần, nhiễm trùng phổi
 Khả năng gây bệnh của một số loài:
− Salmonella typhi : Chỉ gây bệnh cho người. Ở nước ta bệnh thương hàn
chủ yếu do S.typhi gây ra.
− Salmonella paratyphi A : Chỉ gây bệnh thương hàn cho người và cũng hay
gặp ở nước ta sau S. typhi.
− Salmonella paratyphi B : Gây bệnh thương hàn chủ yếu cho người, đôi khi
ở cả súc vật. Bệnh thường gặp ở các nước châu Âu.
− Salmonella paratyphi C : Gây bệnh thương hàn, viêm dạ dày ruột và
nhiễm khuẩn huyết. Bệnh thường gặp ở các nước Đông Nam Á.
− Salmonella typhimurium và Salmonella enteritidis : Gây bệnh cho người
và gia súc, gặp trên toàn thế giới. Chúng là nguyên nhân gây nhiễm trùng, nhiễm độc
thức ăn do ăn phải thức ăn nhiễm Salmonella.
− Salmonella cholerae suis : Loại này hay gây nhiễm khuẩn huyết.
2.1.2. Campylobacter sp
SVTH: Võ Thành Hưng 10
Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm
thủy sản
Hình 2.4: Phẩy khuẩn Campylobacter
2.1.2.1. Phân loại
 Giới: Bacteria
 Nghành: Proteobacteria
 Lớp: Gamma Proteobacteria

 Bộ: Eubateriales
 Họ: campylobacteriaceae
 Chi: Campylobactes
 Loài: Campylobactes sp
2.1.2.2. Đặc điểm
Campylobactes là những vi khuẩn bé, mảnh, Gram âm, hình dấu phẩy nhọn hai
đầu, có kích thước 0,2-0,8µm x 0,5-5µm, rất di động nhờ có 1 lông ở 1 đầu, không
sinh bào tử. Nuôi cấy Campylobacters trên môi trường nhân tạo thường khó khăn vì vi
khuẩn đòi hỏi điều kiện vi hiếu khí (micro-aerophile). Mọc được ở 37
0
C nhưng mọc tốt
hơn ở 42
0
C, không mọc ở 25
0
C. Thường dùng các môi trường chọn lọc như thạch máu
Columbia, thạch máu tryptose để phân lập vi khuẩn. Campylobacters mọc chậm sau 2
đến 3 ngày.
SVTH: Võ Thành Hưng 11
Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm
thủy sản
Bảng 2.2: Đặc điểm sinh hóa – phân biệt loài và dưới loài của vi khuẩn
Campylobacter
Loài – dưới loài
Phát triển Tính chất sinh hóa
25
0
C
42
0

C
1%G 3.5%N Catalase Nitrate H H2S
C. fetus ss vene + - - - + - - -
C. fetus ss fetus + - + - + - - -
C. jejuni - + + - + - + -
C.coli - + + - + - - -
C. cryaerophila + - - - + + - -
C. faecalis - + + + + + - +
C. lari - + + - + + - -
C. hyointestinalis + + + - + + - +
C. spu ss spu + + - - - + - +
C. spu ss bu + + + + - + - +
C. upsaliensis - + + - - + - -
Chú thích: 1%G = 1% glycerin
3,5%N = 3,5% NaCl
H = Hippurate hydrolysis sinh H
2
S trên môi trường TSI (< 3 ngày)
C. fetus ss vene = C. fetus subsp venerealis
C. fetus ss fetus = C. fetus subsp fetus
C. Spu ss Spu = C. Sputorum subsp Sputorum
C. Spu ss bu = Sputorum subsp bubulus
Vi khuẩn dương tính Oxydase và Catalase, phân hủy nitrat, H
2
S dương tính,
không oxy hóa hoặc không lên men các loại đường.
2.1.2.3. Cấu trúc kháng nguyên
Các nghiên cứu về kháng nguyên của Campylobacter phần lớn dựa vào cấu trúc
của loài C. jejuni. Đến nay đã xác định được 3 loại kháng nguyên đó là:
 Kháng nguyên bề mặt LPS: có bản chất là lipopolysaccharide, gồm ít nhất

50 serotype bền với nhiệt.
 Kháng nguyên lông H: có bản chất là protein với hơn 36 serotype
SVTH: Võ Thành Hưng 12
Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm
thủy sản
 Kháng nguyên màng ngoài OMP (Outer membrane protein): là loại
protein bề mặt chuyên biệt và duy nhất để sản xuất vacin. (Phan Hồng Diển, 2005)
2.1.2.4. Yếu tố độc lực
Độc tố của Campylobacter gồm hai loại độc tố: nội độc tố (endotoxin) và ngoại
độc tố (exotoxin). Trong ngoại độc tố có chứa độc tố đường ruột (enterotoxin) và độc tố
thần kinh (cytotoxin). Vai trò tác động của các loại độc tố này vẫn chưa được biết rõ.
Liều gây độc ở người là 500 – 1000 vi khuẩn. Khả năng của vi khuẩn
Campylobacter ở người có lẽ do số lượng lẫn độc tố (Hà Huy Khôi, 2004).
2.1.2.5. Khả năng gây bệnh
Campylobacters là một tác nhân gây viêm ruột cấp tính thường gặp ở người.
Chúng xâm nhập vào người do ăn uống các thức ăn và nước bị nhiễm khuẩn, do tiếp xúc
với động vật, chủ yếu là với gia cầm, gia súc.
Thời gian ủ bệnh 2 - 11 ngày. Thể lâm sàng thường gặp là bệnh cảnh của một
viêm ruột cấp tính với dấu hiệu đau bụng, tiêu chảy dữ dội, phân nước có khi có máu và
mủ. Có trường hợp xảy ra nhiễm khuẩn huyết. Tiêu chảy do C. jejuni kéo dài 5 - 10
ngày. Đa số trường hợp khỏi không cần điều trị bằng kháng sinh.
Cơ chế gây bệnh chưa rõ. Campylobacters có độc tố ruột, nhưng có ý kiến cho
rằng vi khuẩn này có khả năng xâm nhập giống như Shigella. Campylobacters nhân lên
chủ yếu ở hồi tràng và hổng tràng.
Bệnh viêm ruột do C. jejuni xảy ra ở nhiều nơi trên thế giới, gây tiêu chảy cấp ở
người, đặc biệt ở trẻ em và ở khách du lịch từ các nước phát triển đến các nước nhiệt
đới.
SVTH: Võ Thành Hưng 13
Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm
thủy sản

Bảng 2.3: Khả năng gây bệnh của Campylobacter.
Loài Nguồn nhiễm Bệnh trên người Bệnh trên động vật
C. fetus subsp fetus Trâu, bò, cừu
Nhiễm trùng máu,
sẩy thai, viêm
màng não và bệnh
dạ day ruột
Sẩy thai trên trâu,
bò, cừu và rối loạn
tiêu hóa
C. fetus subsp
venerealis
Trâu, bò Nhiễm trùng máu
Sẩy thai, chết phôi
và vô sinh
C. mucosalic Heo Không gây bệnh
Viêm ruột và hoại
tử trên heo
C. cryaerophila Trâu, bò, heo,
ngựa, cừu
Chưa xác định Trong phân gia súc
khỏe, đôi khi gây
SVTH: Võ Thành Hưng 14
Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm
thủy sản
chết phôi
C. jejuni subbp deylei
Gia cầm, heo,
trâu, bò, cừu,
chó, chim, côn

trùng, mèo và
trong môi
trường
Bệnh dạ dày ruột,
sẩy thai, viêm
màng não,viêm
khớp, hội chứng
cuillian-barre
Bệnh dạ dầy ruột,
viêm vú, sẩy thai
vào cuối giai đoạn
của mang thai hoặc
đẻ con yếu hoặc
chết vài ngày sau
khi sinh, gà thường
là vật mang trùng
C. jejuni subsp jejuni
C. Helvetius Chó, mèo Không gây bệnh Bệnh dạ dày ruột
C. laridis
Gia cầm, heo,
trâu, bò, cừu,
chó, chim, khỉ
Bệnh dạ dày ruột,
viêm nhiễm trùng
máu
Bệnh dạ dày ruột
C. upsaliensis Chó, mèo, người
Apse, nhiễm trùng
máu
Bệnh dạ dày ruột

(Verkens, 1996)
2.1.3. Escherichia Coli
Hình 2.5: Escherichia Coli
2.1.3.1. Phân loại
 Giới: Bacteria
SVTH: Võ Thành Hưng 15
Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm
thủy sản
 Nghành: Proteobacteria
 Lớp: Gamma Proteobacteria
 Bộ: Enterobacteriales
 Họ: Enterobacteriaceae
 Chi: Escherichia
 Loài: e. Coli
2.1.3.2. Đặc điểm
 Hình thái và đặc điểm nuôi cấy
E.coli là trực khuẩn Gram âm, di động do có lông quanh thân, một số chủng
E.coli có vỏ polysaccharide, không sinh bào tử.
E.coli là vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, phát triển dễ dàng trên
các môi trường nuôi cấy thông thường, một số có thể phát triển được ở môi trường tổng
hợp đơn giản. Thường sống trong ruột già của người và động vật, theo phân đi ra ngoài.
Đây là những vi sinh vật có khả năng phát triển ở nhiệt độ từ 7 – 50
0
C. Nhiệt độ
thích hợp 37
0
C, pH tối ưu là 4,4.
Phát triển mạnh trong môi trường Mac Conkey, EMB. Trên môi trường EMB, E.
coli cho khuẩn lạc có màu ánh kim, tròn, bờ đều, đường kính khoảng lớn hơn 0,5µm.
Trong môi trường lỏng, E. coli làm đổi màu môi trường, sinh hơi hoặc làm đục

môi trường.
 Đặc tính sinh hóa
E.coli lên men nhiều loại đường sinh axit và sinh hơi như: Glucose, lactose,
ramnose; khử nitrat thành nitric, gây nhầy nhớt hư hỏng thực phẩm, indol dương tính,
đỏ methyl dương tính, VP âm tính, citrat âm tính, urease âm tính, H
2
S âm tính.
2.1.3.3. Cấu trúc kháng nguyên
Gồm có các loại kháng nguyên
 Kháng nguyên O (somatic antigen): là kháng nguyên của thành tế bào, cấu
tạo bởi lipopolysaccharide. Các đặc tính của kháng nguyên O
− Chịu nhiệt, không bị hủy ở 100
0
C trong 2 giờ.
SVTH: Võ Thành Hưng 16
Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm
thủy sản
− Không bị hủy với cồn 50%.
− Bị hủy bởi focmol 5%.
− Rất độc (1/20mg gây chết chuột sau 24 giờ)
Kháng nguyên O gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ gây ra phản ứng ngưng kết
O. Kháng nguyên O giữ vai trò quan trọng đối với khả năng gây bệnh của dòng vi khuẩn
có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ.
 Kháng nguyên H (Flagellar antigen): được cấu tạo bởi protein, khi kháng
nguyên H gặp kháng thể tương ứng sẻ xảy ra hiện tượng ngưng kết H. kháng nguyên H
có các đặc tính sau
− Không chịu nhiệt.
− Bị hủy bởi cồn 50%.
− Bị hủy bởi protease.
 Không bị hủy bởi focmol 5%.

Kháng nguyên K (Capsular antigen): loại này chỉ có ở một số ít vi khuẩn đường
ruột, được cấu tạo bởi polysaccharide hoặc protein. Nếu kháng nguyên K che phủ hoàn
toàn thân vi khuẩn sẽ ngăn cảng phản ứng ngưng kết O.
 Kháng nguyên tiêm mao F (Fimbrial antigen): có dạng hình roi, dài
khoảng 4µm, thẳng hay xoắn, đường kính 0,7 – 2,1µm, giúp vi khuẩn
bám vào tế bào niêm mạc ruột nên rất quan trọng trong khả năng gây
bệnh của vi khuẩn.
Hiện nay có khoảng 700 tuype huyết thanh của E. coli từ sự tổ hợp của các nhóm
kháng nguyên O, H, K, F. Dựa vào đó người ta có thể định danh vi khuẩn.
2.1.3.4. Yếu tố độc lực
Người ta chia E.coli thành nhiều nhóm, mỗi nhóm sinh ra các loại độc tố khác
nhau, hiện có 5 nhóm chính : STEC (Shiga toxin-producing E.Coli) hoặc VTEC
(Verotoxigenic E.Coli) và EHEC (Enterohaemorrhagic E.Coli), EPEC
(Enteropathogenic E.Coli), ETEC (Enterotoxigenic E.Coli), EAEC (Enteroaggregative
E.Coli) và EIEC (Enteroinvasive E.Coli)
SVTH: Võ Thành Hưng 17
Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm
thủy sản
 Nhóm STEC
STEC sản xuất độc tố Shiga-like toxin (Slt), còn gọi là Shiga toxin (Stx) hay
Verotoxin (VT). Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là
Stx1 và Stx2. Trong khi Stx1 có tính bảo tồn cao thì Stx2 rất thay đổi về trình tự, tạo ra
nhiều subtype như Stx2c, Stx2hb, Stx2e, Stx2g. Một dòng STEC có thể sản sinh Stx1,
Stx2 hoặc cả Stx1 và Stx2, và thậm chí nhiều dạng của Stx2.
Yếu tố khác có liên quan đến độc lực của STEC là việc tạo ra enterohaemolysin
(EHEC-Hly) và có thể cả độc tố ruột chịu nhiệt EAST1. EHEC-Hly được mã hóa bởi
gen trên plasmid 60 MDa (pO157) mà plasmid này được tìm thấy ở gần như tất cả các
dòng O157:H7 và cũng khá phổ biến cả những dòng STEC non-O157 nữa (Nataro và
Kaper, 1998). Trên plasmid này có sự hiện diện của một operon gồm 4 khung đọc mở
(open reading frame ORF) là hlyCABD. Trong đó hlyA là gen cấu trúc khởi đầu cho

haemolysin. Độc tố ruột chịu nhiệt EAST1 (đầu tiên được mô tả ở nhóm EAEC là
EAEC heat-stable enterotoxin 1), cũng được tìm thấy ở nhiều dòng STEC. Tầm quan
trọng của EAST1 đối với khả năng gây bệnh của STEC vẫn chưa được biết, nhưng có ở
một vài trường hợp tiêu chảy không có máu mà thường thấy ở những người nhiễm
STEC
 Nhóm EPEC
Các yếu tố độc lực chính bao gồm gen eae mã hóa protein itimin cần thiết cho
việc tạo ra tổn thương dạng A/E, plasmid 50 – 70 Mda ( EAF ) : mã hóa BFP ( bundle –
forming pilus ), PER ( plasmid – encoded regulator ) và Ler ( LEE – encorded
regulator). Các protein tiết : Tir, EspA, EspB, EspD, EspF, EspG và MAP
(mitochondria – associated protein), EAST – 1 có khả năng phá hủy tế bào biểu mô và
CDT ( Cytolethan distending toxin )
 Nhóm ETEC
Nhóm ETEC có hai nhóm quyết định độc lực chính là độc tố ruột (enterotoxin)
và yếu tố định vị (colonization factor – CF).
 Độc tố ruột enterotoxin
SVTH: Võ Thành Hưng 18
Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm
thủy sản
Nhóm ETEC gồm những E. Coli tạo ra ít nhất một trong hai loại độc tố đường
ruột là ST và LT. ETEC gây bệnh bằng cách vi khuẩn bám vào bề mặt màng nhầy ruột
non và tiết ra độc tố ruột, làm gia tăng tình trạng tiết dịch. Nhóm ETEC gây tiêu chảy
thông qua sự tiết độc tố đường ruột LT và ST. E.Coli nhóm này có thể chỉ tiết độc tố
LT, hoặc chỉ tiết ST, hoặc có thể tiết cả LT và ST.
 Độc tố không chịu nhiệt (Heat-labile toxin - LT): Độc tố LT của E.Coli là
oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức năng với độc tố tả (cholera toxin
- CT) do Vibrio cholerae tiết ra. LT và CT giống nhau nhiều đặc tính như cấu trúc, trình
tự acid amin (giống nhau khoảng 80%), tương đồng về receptor, hoạt tính enzym, và tác
động của nó trên thú hay nuôi cấy tế bào.
Sau khi độc tố đi vào nội bào, chúng di chuyển trong tế bào nhờ hệ thống vận

chuyển của Golgi. Đích đến của LT trong tế bào là enzym adenylate cyclase nằm ở lớp
màng ngoài của tế bào biểu mô ruột. Peptide A1 có hoạt tính ADP-ribosyltransferase
chuyển phần ADP-ribosyl từ NAD đến của protein liên kết GTP (GTP-binding protein)
là GS, gây hoạt hóa enzyme adenylate cyclase, làm gia tăng AMP vòng (cAMP) trong tế
bào. Vì vậy enzyme cAMP-dependent protein kinase (A kinase) được họat hóa dẫn đến
sự phosphoryl hóa kênh chloride (Cl
-
) ở màng tế bào biểu mô vượt quá mức bình
thường. Kết quả dây chuyền là kích thích tế bào bên dưới tiết Cl- và ngăn cản sự hấp thụ
NaCl bởi những tế bào có lông nhung. Hàm lượng ion trong lòng ruột gia tăng kéo theo
sự di chuyển thụ động của nước từ tế bào vào lòng ruột, gây tiêu chảy (Nataro và Kaper,
1998). Mặc dù sự kích thích của Cl
-
do sự gia tăng lượng cAMP trong tế bào là cách giải
thích cổ điển về cơ chế gây tiêu chảy của LT và CT, ngày càng có nhiều bằng chứng cho
thấy rằng đáp ứng tăng tiết đối với những độc tố này có cơ chế phức tạp hơn. Một cơ
chế tác động khác của độc tố có liên quan đến những prostaglandin E (PGE1 và PGE2)
và yếu tố hoạt hóa tiểu cầu. Sự tổng hợp và phóng thích những chất chuyển hóa của acid
arachidonic như prostaglandin và leukotriene có thể kích thích sự vận chuyển các chất
điện giải và kích thích nhu động ruột. Cơ chế tác động khác thứ hai có liên quan đến hệ
SVTH: Võ Thành Hưng 19
Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm
thủy sản
thần kinh ruột (enteric nervous system – ENS) điều hòa nhu động và sự tiết ion ở ruột.
Cơ chế thứ ba là CT và LT gây đáp ứng viêm ruột dạng nhẹ.
 Độc tố chịu nhiệt (Heat-stable toxin - ST): Ngược với LT, ST có trọng
lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur của nó giải thích cho khả năng chịu nhiệt
của độc tố này. ST được chia thành 2 nhóm là STa và STb, khác nhau về cấu trúc và cơ
chế hoạt động. Gen mã hóa cho cả 2 nhóm được tìm thấy chủ yếu trên plasmid và vài
gen mã hóa ST cũng được tìm thấy trên transposon. Sta (hay còn gọi là ST-I) được tạo

bởi ETEC và một vài vi khuẩn Gram âm khác như Yersinia enterocolitica và V.
cholerae non – O1. ST giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu nhiệt EAST1 của
EAEC. Gần đây, còn có báo cáo cho rằng một vài dòng của ETEC cũng có thể sản sinh
độc tố EAST1 ngoài độc tố STa. Còn STb chỉ được tìm thấy ở ETEC.
 Yếu tố định vị (colonization factor – CF): Cơ chế mà ETEC kết
dính và cư trú trên lớp màng nhầy ruột đã được nghiên cứu kỹ. Để gây tiêu chảy, ETEC
đầu tiên phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ vào lông trên bề mặt của vi khuẩn, gọi là
yếu tố định vị (CF). CFA có thể được phân loại dựa trên đặc tính hình thái. Có 3 loại
chính gồm loại lông hình que cứng, lông hình que mềm có dạng bó, lông có cấu trúc
mảnh mềm. Gen của CFA thường được mã hóa trên plasmid, cũng là nơi mã hóa cho
độc tố ST và/hoặc LT.
 Nhóm EAEC
Những yếu tố độc lực chính của EAEC bao gồm các diềm bám dính kết tập AAF
(aggregative adhesion fimbriae), yếu tố điều hòa bám dính kết tập aggR, protein Pet và
độc tố EAST – 1 (enteroaggregative heat – stabe toxin – 1). AFF được xem là yếu tố
quyết định độc lực. Ba loại AAF đã được biết đến gồm AAF/I, AAF/II và AAF/III,
trong đó loại I và loại II có cấu trúc bó, loại III có cấu trúc dạng sợi riêng biệt. Các AAF
tạo nên kiểu bám dính hình chồng gạch lên tế bào Hep – 2. Yếu tố aggR có vai trò điều
hòa sự biểu hiện của các AAF. Protein Pet được tiết ra màng ngoài vi khuẩn gây ra sự tụ
dịch và gây độc cho biểu mô tiêu hóa. EAST – 1 có khả năng phá hủy tế bào biểu mô.
Ngoài các yếu tố độc lực nêu trên, EAEC còn tiết ra một protein làm tan máu và làm
SVTH: Võ Thành Hưng 20
Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm
thủy sản
mất thăng bằng vận chuyển protein qua màng. Các yếu tố độc lực nêu trên của EAEC
chủ yếu được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid có phân tử lượng 60 MDa. Một số
yếu tố độc lực được mã hóa trên các gen trên nhiễm sắc thể đang được nghiên cứu
 Nhóm EYIC
EIEC gây bệnh chủ yếu do khả năng xâm nhập vào niêm mạc đại tràng. Khả
năng xâm nhập được mã hóa bởi gen trên plasmid 140 MDa. Các gen trên plasmid này

mã hóa cho các kháng nguyên xâm nhập (IpaA đến IpaD, Ipa : Invasion plasmid
antigen). EIEC còn có khả năng sản xuất độc ruột giống một số Shigella. Gen mã hóa
cho độc tố này có tên là sen (Shigella enterotoxin), cơ chế gây bệnh giống vi khuẩn lỵ.
EIEC xâm nhập vào trong tế bào biểu mô đại tràng, làm tiêu các túi thực bào và nhân
lên trong bào tương, phá hủy tế bào và xâm lấn sang các tế bào khác.
2.1.3.5. Khả năng gây bệnh
Khả năng gây bệnh rất đa dạng: gây nhiễm khuẩn đường tiểu, với cơ thể yếu thì
gây nhiễm khuẩn máu, gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh, gây tiêu chảy.
 Bệnh tiêu chảy do E.coli
Các E.coli gây bệnh tiêu chảy ở người gồm có:
 Enterotoxigenic E.coli (ETEC)
Là loại E.coli sinh độc tố ruột. ETEC là một nguyên nhân quan trọng gây tiêu
chảy nặng giống triệu chứng do Vibrio cholerae 01 gây ra ở người. Bệnh tiêu chảy do
ETEC xảy ra chủ yếu ở các xứ nhiệt đới và có thể gặp ở các lứa tuổi khác nhau, nhưng
đặc biệt ở trẻ nhỏ thường thấy bệnh cảnh lâm sàng nặng dễ dẫn tới tình trạng kiệt nước
và rối loạn điện giải.
ETEC còn là một nguyên nhân thường gây tiêu chảy cho khách du lịch từ các
nước phát triển sang các nước đang phát triển.
Cơ chế gây bệnh: ETEC vào ruột sẽ gắn vào niêm mạc ruột nhờ các yếu tố bám
dính, đồng thời sản sinh ra độc tố ruột tác động lên tế bào niêm mạc ruột gây xuất tiết ra
một số lượng lớn một chất dịch đẳng trương với huyết tương. Bệnh nhân nôn, tiêu chảy
liên tục, phần lớn có đau nhức bắp cơ, đau bụng và sốt nhẹ.
SVTH: Võ Thành Hưng 21
Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm
thủy sản
Có hai loại độc tố ruột đã được nghiên cứu kỹ về tính chất sinh lý, sinh hóa và
tính truyền bằng plasmid đó là :
Độc tố ruột LT (Heat - labile)
Độc tố ruột ST (Heat - stable)
Những chủng ETEC có thể sinh ra một hoặc hai loại độc tố ruột tùy thuộc vào

plasmid mà chúng mang.
LT loại độc tố ruột bị hủy bởi nhiệt, là một protein gồm 2 tiểu phần A (Active) và
B (Binding) có chức năng riêng biệt. Tiểu phần A có hai tiểu đơn vị A1 và A2, tiểu phần
B có 5 tiểu đơn vị B1, B2, B3, B4 và B5. Các tiểu đơn vị B có chức năng gắn với thụ
thể ganglioside GM1 ở bề mặt tế bào biểu mô ruột và chuẩn bị mở đường cho tiểu phần
A mà chủ yếu là A1 xâm nhập vào bên trong tế bào. Tiểu đơn vị A tác động tới vị trí
đích ở mặt trong màng bào tương nơi điều h.a enzymee adenylate cyclase. Adenylate
cyclase bị hoạt hóa và làm tăng hàm lượng adenosine monophosphate vòng (AMP
vòng). Hiện tượng này dẫn tới sự tăng thấm của các điện giải và nước qua màng ruột,
gây tiêu chảy cấp và kiệt nước, rối loạn điện giải.
ST loại độc tố ruột kháng nhiệt, là một phân tử có trọng lượng thấp nhất và không
có tính kháng nguyên. Thụ thể dánh cho ST khác với thụ thể LT. Sau khi được gắn với
thụ thể, ST sẽ hoạt hóa guanylate cyclase trong tế bào niêm mạc ruột. Hiện tượng này
dẫn tới sự tăng guanosine monophosphate vòng (GMP vòng) và do đó xảy ra tình trạng
tăng tiết dịch ở ruột.
 Enteropathogenic E.coli (EPEC)
EPEC hiện nay được biết gồm một số type huyết thanh thường gây bệnh tiêu
chảy cấp (bệnh viêm dạ dày - ruột) ở trẻ em lứa tuổi nhỏ (trẻ dưới một tuổi), có thể gây
thành dịch. Các vụ dịch do EPEC thường hay gặp trong bệnh viện, cơ chế gây bệnh của
EPEC chưa được biết rõ. Các EPEC phân lập từ các vụ dịch thường là thuộc các typee
huyết thanh:
O26 : B6 O111 : B4 O126 : B16
O55 : B5 O119 : B4 O127 : B18
SVTH: Võ Thành Hưng 22
Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm
thủy sản
O86 : B7 O125 : B15 O128 : B12
 Enteroinvasive E.coli (EIEC)
Là loại E.coli gây bệnh bằng cơ chế xâm nhập tế bào biểu mô niêm mạc ruột, gây
tiêu chảy ở người lớn và trẻ em với những triệu chứng bệnh l. giống Shigella: nghĩa là

đau bụng quặn, mót rặn, đi tiêu nhiều lần, phân có nhiều mũi nhầy và máu.
Người ta đã chứng minh được rằng khả năng xâm nhập tổ chức ruột của EIEC
được chi phối bởi plasmid. EIEC có thể không lên men lactose, không di động và giống
Shigella về nhiều mặt kể cả cấu trúc kháng nguyên. Do vậy những vụ dịch tiêu chảy do
EIEC gây nên dễ bị lẫn lộn với tiêu chảy do Shigella.
 Enteroadherent E.coli (EAEC)
Là loại E.coli bám dính đường ruột gây bệnh do bám vào niêm mạc và làm tổn
thương chức năng ruột.
 Enterohemorrhagic E.coli (EHEC)
EHEC là một trong những tác nhân gây tiêu chảy có thể dẫn tới viêm đại tràng
xuất huyết và hội chứng tan máu - ure huyết. EHEC là những chủng E. coli có khả năng
sản xuất một độc tố gây độc tế bào Vero (Verocytotoxin), gọi là VT.
 Các nhiễm khuẩn khác do E.coli
E. coli có thể gây nên nhiễm khuẩn đường tiết niệu: sự ứ động nước tiểu do sỏi,
thai nghén tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh nhiễm khuẩn đường tiết niệu dễ xảy ra .
Mặt khác, khi thông niệu đạo, người ta có thể gây ra nhiễm khuẩn ngược dòng.
E. coli có thể gây ra nhiễm khuẩn đường sinh dục, nhiễm khuẩn gan mật, viêm
màng não ở trẻ còn bú, nhiễm khuẩn huyết
2.2. Giới thiệu về Listeria monocytogenes
2.2.1. Lịch sử phát hiện
L. monocytogenes lần đầu tiên được mô tả bởi E.G.D Murray vào năm 1926 dựa
trên sáu trường hợp đột tử ở trẻ. Murray giới thiệu Vi khuẩn monocytogenes trước khi
JH Harvey Pirie thay đổi tên chi là Listeria năm 1940. Mặc dù L. monocyotogenes
nhiễm ở cả động vật và con người đã được nói đến vào những năm 1920, nhưng cho đến
SVTH: Võ Thành Hưng 23
Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm
thủy sản
năm 1952 tại Đông Đức đã công nhận L. monocyotogenes là một nguyên nhân quan
trọng gây ra nhiễm trùng và viêm màng não của trẻ sơ sinh. Ở người lớn mắc bệnh do vi
khuẩn này nguyên nhân là do tổn thương hệ thống miễn dịch, chẳng hạn như người lạm

dụng thuốc ức chế miển dịch và Corticosteroid cho khối u ác tính hoặc cấy ghép nội
tạng, và những người nhiễm HIV.
Mãi cho đến năm 1981 L. monocytogenes được xác định là một nguyên nhân
gây bệnh từ thực phẩm, liên quan đến 41 trường hợp mắc bệnh và 18 ca tử vong, chủ
yếu ở phụ nữ mang thai và trẻ sơ sinh. Từ đó một số trường hợp nhiễm Listeria từ thực
phẩm đã được báo cáo, và L. monocytogenes đã được công nhận rộng rãi như là một
mối nguy hiểm quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm.
Listeria được xem là vấn đề nghiêm trọng nhiễm vào các sản phẩm thịt và thịt gia
cầm vào những năm 1980. Những năm 1990, Bộ Nông nghiệp Mĩ cho biết có một trận
dịch bệnh này từ bánh mì kẹp xúc xích nóng và có thể là các cửa hàng bán thịt ngon dẫn
đến ít nhất 101 người bị bệnh khiến 15 người lớn tử vong và 6 thai nhi bị sinh non.
Năm 1999, loài L. monocytogenes đặc biệt cực độc đã tiến triển báo động các
viên chức y tế và họ buộc những nhà sản xuất thực phẩm phải giải quyết vấn đề. Mặc dù
“quy định tạm thời” đối với các sản phẩm thịt và thịt gia cầm chế biến sẵn phát hành
năm 2003 giúp kiểm soát sự bùng phát vi khuẩn, nhưng rõ ràng đã không thể loại bỏ
được bệnh hoàn toàn. Theo Trung tâm y tế dự phòng CDC, ước tính 2.500 người bị
bệnh listeriosis nặng mỗi năm, trong số đó có 500 người tử vong. Người có nguy cơ cao
có thể mắc bệnh này sau khi ăn thực phẩm thậm chí chỉ nhiễm vài con vi khuẩn.
Năm 2006, trong một nỗ lực bảo vệ cộng đồng, Cơ quan lương thực và dược
phẩm FDA phê chuẩn tán thành việc sử dụng thuốc xịt khử trùng giúp giảm nhiễm
khuẩn các sản phẩm thịt và thịt gia cầm chế biến sẵn. Thuốc phun bao gồm 1 hỗn hợp
gồm 6 loại virus vô hại diệt khuẩn L. monocytogenes.
2.2.2. Phân loại
Theo George M. Garrity, Julia A.Bell và Timothy G.Lilburn, phân loại học của
Listeria spp. Trong giới vi sinh vật như sau:
SVTH: Võ Thành Hưng 24
Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm
thủy sản
 Giới: Bacteria
 Ngành: Fitmicutes

 Lớp: Bacilli
 Bộ: Bacillales
 Họ: Listeriaceae
 Giống: Listeria
Lúc đầu Listeria chỉ được biết đến với một hay hai loài chủ yếu là Listeria
monocytogenes, về sau thì xác định được 6 loài gồm:
Listeria monocytogenes
Listeria innocua
Listeria seeligeri
Listeria ivanovii
Listeria grayi
Listeria welshimeri
Các loài có tính tương đồng về di truyền nên giúp giải thích được kiểu hình tương
tự nhau giữ các loài. Khả năng tan huyết là đặc tính nhằm phân biệt giữ các loài.
Đến nay chỉ có loài L. monocytogenes cho thấy là tác nhân chính gây bệnh cho
người và động vật, khi đó L. invanovii chi gây bệnh cho động vật đặc biệt là thú.
2.2.3. Đặc điểm
SVTH: Võ Thành Hưng 25