Quy trình nhân giống dâu tây in vitro

Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
LỜI MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
2. Đặt vấn đề
Cây dâu tây còn có tên khoa học là Fragaria thuộc chi
Fragaria, trên thế giới có khoảng 20 loài. Tại nước ta cây dâu tây chủ
yếu được trồng tại Đà Lạt (Lâm Đồng).
Cây dâu tây được coi như là cây trồng tiềm năng tại Đà Lạt.
Dâu tây được trồng khá lâu ở Đà Lạt. Tuy nhiên những năm gần đây
diện tích dâu tây giảm dần do thoái hóa giống, đồng thời thiếu nguồn
cung cấp giống dâu tây ổn định và sạch bệnh. Do vậy cần phát triển
nhân giống cây dâu tây theo công nghệ là vấn đề bức thiết đặt ra.
Việc áp dụng nghành công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
vào công nghệ nhân giống dâu tây, đã và đang được các nhà khoa học
áp dụng. Mang lại những kết quả khả quan cho việc cải thiện diện tích
dâu tây ở Đà Lạt.
3.Tình hình nghiên cứu
Cây dâu tây là cây có nhiều nguồn lợi kinh tế, chính vì nguồn
lợi kinh tế đó mà việc đầu tư cho những nghiên cứu tại các Cơ quan
nghiên cứu nhiều tiêu biểu trong đó có Phân viện sinh học Tây
nguyên, Trung tâm nghiên cứu Khoai tây rau và hoa, trung tâm nghiên
cứu và ứng dụng nông nghiệp Lâm Đồng…
Dự án “Hoàn thiện quy trình nhân giống và cung cấp cây
giống dâu tây sạch bệnh, số lượng lớn cho các vùng trồng dâu tây
trong tỉnh Lâm Đồng” do Viện Sinh học Tây Nguyên chủ trì đã đặt ra
-1-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
mục tiêu: Hoàn thiện công nghệ nhân giống và trồng dâu tây, tạo ra
cây giống dâu sạch bệnh có chất lượng tốt đồng thời, xây dựng một số
mô hình trong dân. Do PGS.TS Dương Tấn Nhựt - Phó Viện trưởng
Viện Sinh học Tây Nguyên chủ nhiệm. Qua dự án này dựa trên trên

công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật làm nền tảng thu hút nhiều
quan tâm của các nhà khoa học tại đây. Sau nhiều năm thực hiện dự án
việc tạo giống dâu bằng mô tế bào đã thành công. Không chỉ vậy, phân
viện sinh học Tây Nguyên ngày càng phát triển qui mô nhân giống cây
dâu tây.
Cũng như Phân viện sinh học Tây Nguyên việc áp dụng công
nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật vào quá trình công nghệ sản xuất
giống. Nhằm cung ứng giống dâu tây sạch cho nông dân trong vùng.
Ngoài ra dưới sự chỉ đạo của TS Phạm Xuân Tùng (Nguyên giám đốc
Trung Tâm Nghiên cứu Khoai tây Rau và Hoa Đà Lạt) những năm
2007-2008 dự án “Giữ quĩ gene giống dâu sạch bệnh tại Đà Lạt” tại
Trung Tâm nghiên cứu Khoai Tây, rau và Hoa (Trực thuộc Viện khoa
học kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam). Tại trung tâm, giống dâu tây
được xem là nguồn giống quan trọng, trung tâm đã phát triển nhiều
giống dâu nhưng chủ yếu là các giống như: Mỹ đá, Langbiang, New
Zealand Biện pháp nhân giống in vitro được thực hiện cho thấy thu
lại hiệu quả không nhỏ những năm sau đó.Hiện tại Trung Tâm là địa
chỉ đáng tin cậy trong việc cung cấp giống dâu tây in vitro.
Cây dâu tây được xây dựng nhiều dự án tại trung tâm ứng
dụng kỹ thuật nông nghiệp lâm đồng như các dự án “Xác lập qui trình
nhân giống dâu tây mới ở Đà Lạt”, hay dự án “Nâng cao tỷ lệ sống cây
-2-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
dâu tây giai đoạn sau ống nghiệm” dưới sự chỉ đạo của giám đốc Trần
Thị Kim Duyên, và sự tham gia của các kỹ sư tại trung tâm Nghiên
cứu Ứng dụng kỹ thuật nông nghiệp Lâm Đồng nhằm mục đích phát
triển nhân giống dâu tây nhằm chuyển giao công nghệ cho nông dân
tại Đà Lạt và Lạc Dương thuộc tỉnh Lâm Đồng.
4. Mục đích nghiên cứu
Tìm hiểu qui trình nhân giống cây dâu tây in vitro .

Khảo sát điều kiện sinh trưởng của cây dâu tây trong qui trình
trong phòng thí nghiệm.
5. Nội dung nghiên cứu:
Tiến hành khảo sát các bước nhân giống in vitro cây dâu tây từ
bước nhập mẫu cho đến lúc ra vườn ươm xuất giống.
6. Phương pháp nghiên cứu:
Theo dõi tỷ lệ sống xót của cây ở nồng độ khử trùng và thời
gian khác nhau.
Khảo sát sự phát triển của chồi ở nồng độ BA khác nhau.
Khảo sát khả năng ra rễ cây khi bổ sung NAA ở nồng độ khác
nhau.
7. Kết quả đạt được:
Theo dõi nồng độ và thời gian thích hợp để phát triển cây dâu
tây.
Chọn môi trường bổ sung chấ thích hợp quá trình nhân chồi và
phát triển của cây.
-3-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro
1.2.1.Giới thiệu
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nhân giống in vitro
đều là thuật ngữ mô tả nuôi cấy mô các bộ phận thực vật (tế bào đơn,
mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường chất dinh dưỡng
thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh
trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng.
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật cho pháp tái sinh chồi
hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng.
Trước kia người ta dùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính

cơ bản của tế bào như sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởng
của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy. Hiện
nay, các nhà khoa học sử dụng hệ thống nuôi cấy mô thực vật để
nghiên cứu tất cả các vấn đề liên quan đến sinh học, sinh hóa học di
truyền và cấu trúc thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật cũng mở
rộng tiềm năng nhân giống vô tính đối với các loại cây quan trọng, có
giá trị về mặt kinh tế và thương mại trong đời sống hàng ngày của con
người.
1.1.2. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào
-4-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
Năm 1902, nhà thông thái Haberlandt lần đầu tiên đưa ra ý
tưởng nuôi cấy mô của sinh vật ngoài cơ thể nhưng ông đã dùng tế bào
quá chuyên biệt nên không thành công.
Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự
sống của việc nuôi cấy tế bào cà chua.
Năm 1964, Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi
cấy ngọn. Ông đã thành công trong việc chuyển cây sen cạn từ môi
trường nuôi cấy tối thiểu. Tuy nhiên việc nhân giống vẫn chưa hoàn
chỉnh. Sau đó có rất nhiều nhà khoa học đã khám phá ra những thành
phần dinh dưỡng quan trọng cần thiết cho sự phát triển của tế bào được
nuôi cấy.
Năm 1951, Skoog và Miler đã phát hiện ra hợp chất để điều
khiển sự nhân chồi.
Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi
cấy đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trường
của họ đã được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn
còn được sử dụng rộng rãi cho đến nay.
Năm 1960- 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính
lan bằng nuôi cấy điỉnh sinh trưởng. Từ kết quả đó, lan được xem là

cây nuôi cấy mô đầu tiên thương mại hóa.Từ đó dến nay, công nghệ
nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên
nhiều và được ứng dụng thương mại hóa.
-5-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
Hình 1.1. Cây lan mô trong phòng thí nghiệm
1.1.3. Tầm quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào
Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa vô
cùng to lớn với việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời
đóng góp trực tiếp thực tiễn sản xuất và đời sống.
1.1.3.1. Về mặt lý luận sinh học cơ bản.
Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu
sắc bản chất của sự sống. Thông qua nuôi cấy mô và tế bào, ta có thể
so sánh đặc tính cơ thể với các hợp phần của chúng khi tách rời khỏi
cơ thể, từ đó rút ra những tương quan giữa các bộ phận trong cây.
Thực tế đã cho pháp tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh chồi từ
đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hóa là mô sẹo, từu mô sẹo có thể
kích thích để tái sinh cây hoàn chỉnh. Đây là ưu thế mà các nhà khoa
học sinh lý, hóa sinh và di truyền học dễ dàng sử dụng trong công việc
của mình.
-6-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
Trong một cơ thể rất khó phân biệt được từng giai đoạn một
cách cụ thể và chính xác theo chu kỳ phát triển của cá thể. Phương
pháp nuôi cấy mô có thể khắc phục được khó khăn trên và dễ dàng tạo
ra các bước phát sinh hình thái được phân biệt một cách rõ rệt. Điều
này tạo thuận lợi cho công tác nghiên cứu về các qui luật sinh trưởng,
phát triển cùng mối quan hệ giữa chúng với bên ngoài. Từ đó có thể
tìm ra các mấu chốt thúc đẩy sự phát triển của cây trồng theo hướng
mong muốn. Bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào, có thể nghiên

cứu mối quan hệ giữa ký sinh và ký chủ. Như vậy rõ ràng nhiều vấn đề
về bệnh lý sẽ được giải quyết một cách cơ bản. Từ đó tìm ra những cơ
chế miễn dịch của thực vật giúp cho việc phòng bệnh cây tốt hơn và đỡ
tốn kém hơn.
1.1.3.2. Về mặt thực tiễn sản xuất
Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để đảm bảo và nhân
nhanh các cây quí, có kinh tế giá trị cao. Hiện nay, phương pháp này
ngày càng phổ biến trong công tac cây giống cây trồng. Bằng phương
pháp nuôi cây mô, trong thời gian ngắn có thể tạo được một sinh khối
lớn có họat chất: sinh khối tạo ra vẫn giữ nguyên thuộc tính, nghĩa là
vẫn giữ được khả năng tổ hợp các chất thứ cấp như alkaloid. Glycosid
dùng trong y học, chất dinh dưỡng trong công nghiệp thực phẩm,
những chất kìm hãm sinh truởng của các vi sinh vật trong nông nghiệp.
-7-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
Hình 1.2. Qui trình nhân giống cây chuối trong ống nghiệm
1.2. Các thiết bị cơ bản trong phòng nuôi cấy in vitro
1.2.1. Phòng rửa và cất nước
- Máy cất nước một lần.
- Máy cất nước 2 lần.
1.2.2. Phòng hấp sấy
- Nồi hấp Autoclave.
- Tủ sấy: 60
o
C-200
o
C.
1.2.3. Phòng chuẩn bị môi trường
- Cân phân tích (chính xác đến 0.0001).
- Cân kỹ thuật (chính xác 0.001).

- Máy đo pH.
- Tủ lạnh.
-8-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
- Lò vi sóng.
1.2.4. Phòng thí nghiệm và nuôi cấy
- Tủ cấy vô trùng.
- Quạt thông gió.
- Đèn tử ngọai treo trên tường.
Hình 1.3. Phòng nuôi cấy mô
(Phòng này để phân tích sinh hoá, phân tử và di truyền).
- Kính hiển vi hai mắt (độ phóng đại 1000 lần).
- Kính lúp hai mắt (độ phóng đại 75 lần).
- Hệ thống đèn chiếu.
- Máy phổ kế…
1.2.5. Phòng chứa mẫu
- Kệ chất mẫu.
- Bóng đèn, ổn áp…
-9-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
Hình 1.4. Phòng chất cây
1.3. Nuôi cấy mô tạo cây hoàn chỉnh
1.3.1. Nuôi cấy nốt đơn thân
1.3.1.1. Phương pháp
Sử dụng chồi ngọn hoặc chồi mang một đoạn thân ngắn. Chồi
này sẽ được kích thích tăng trưởng thành cây nguyên vẹn.
Chồi được thu từ chồi ngọn hoặc ở các nách lá, sau đó cấy lên
môi trường dinh dưỡng với các điều kiện thích hợp để tăng trưởng.
Chồi mới tăng trưởng mang nhiều lá và tiếp tụ nhân nhanh để đạt đến
số lượng cần thiết. Chồi sẽ được cảm ứng cho ra rễ để thành cây hoàn

chỉnh và được chuyển ra đất trồng.
1.3.1.2 . Những điểm chú ý trong phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân
- Phương pháp này không thể áp dụng với những cây có lá xếp như
hoa hồng (như cúc đồng tiền) và khi mẫu cấy có khả năng nhiễm cao.
Đối với những cây này phải sử dụng phương pháp nhân chồi đỉnh.
-10-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
- Để giảm khả năng nhiễm, nên chọn những ngọn còn khép kín. Nền
cây bị nhiễm từ bên trong thì tốt nhất là sử dụng phương pháp nuôi cấy
đỉnh sinh trưởng.
- Tốc độ nhân giống phụ thuộc vào sồ lượng chồi có sẵn. Chồi tăng
trưởng tạo ra càng nhiều lá thì số lượng chồi bên càng nhiều dẫn đến
sự tăng tốc độ nhân giống.
- Các chồi được trẻ hóa, đặc biệt là các chồi thân gỗ, tăng trưởng
nhiều hơn so với chồi trưởng thành.
- Sự tạo rễ trên các chồi trưởng thành khó thực hiện vì vậy cần trẻ
hóa chồi để cảm ứng sự ra rễ.
Phương pháp này đã thực hiện thành công trên một số đối tượng: cây
măng tây, khoai tây,lê, cà chua,dưa chuột
1.3.2. Nuôi cấy chồi bên
Về nguyên tắc phương pháp tương tự nuôi cấy nốt đơn thân.
Điểm khác nhau là trong phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân có sự
kéo dài chồi thông thường là cytokinin là yếu tố phát triển.
Trong phương pháp nhân nhanh chồi bên, chồi được cô lập
trong môi trường dinh dưỡng và các chồi bên của lá nách phát triển
dưới ảnh hưởng của cytokynin với nồng độ cao. Vai trò của cytokinin
lúc này là hạn chế ưu tính ngọn đề cho các chồi bên phát triển. Các
chồi bên này tiếp tục chuyển sang môi trường mới chứa cytokinin thì
các chồi bên mới lại tiếp tục tạo ra Sau đó các chồi được đưa ra môi
trường ra rễ và được đưa ra ngoài vườn ươm khi rễ đã dược hoàn

chỉnh.
-11-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
Thực tế, cả hai phương pháp này thường được áp dụng chung:
Đầu tiên chồi tăng trưởng bình thường, sau đó bổ sung cytokinin vào
môi trường nuôi cấy kích thích chồi bên.
Phương pháp nhân giống chồi bên được tiến hành đầu tiên trên cẩm
chướng, dâu tây, cúc đồng tiền Hiện nay, phương pháp này được áp
dụng nhiều loài thực vật phổ biến là cây ăn trái.
1.3.3. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Nhiễm virus là một trong những nguyên nhân gây ảnh hưởng
lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Đặc biệt, virus
chuyển sang cac thế hệ kế tiếp trong quá trình thực vật sinh sản hữu
tính và ngay cả vô tính in vitro.
Trong đỉnh sinh trưởng của mô thực vật có dự cạnh tranh giữa
sự sinh sản của virus và sự phân chia tế bào của mô phân sinh để tạo tế
bào con. Ở vùng mô phân sinh trong suốt quá trình phân chia tế bào,
khả năng sinh tổng hợp nucletic acid được tận dụng để phân chia tế
bào sẽ gây bất lợi cho quá trình tăng sinh của virus.
Để có được nhiều đỉnh sinh trưởng sạch virus làm nguồn mẫu
cho nuôi cấy in vitro, trước tiên phải tiến hành tạo chồi bất định, sau
đó thu đỉnh sinh trưởng từ các chồi bất định này. Nếu đỉnh sinh trưởng
cô lập đang ở trạng thái hoạt động thì cơ hội loại trừ virus sẽ lớn hơn.
Nếu như đỉnh sinh trưởng được cô lập có kích thước lớn thì cơ hội thu
được cây sạch bệnh thấp.
Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được áp dụng những
cây trồng cây trồng quan trọng như: khoai tây, thuốc lá, lily Một số
-12-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
cây thân gỗ như anh đào, mâm xôi, nho cũng được nuôi cấy đỉnh

sinh trưởng để nuôi cấy sạch bệnh.
1.3.4. Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn
Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là kỹ thuật tạo cây đơn
bội kép (DH, double haploid). Phương pháp tạo cây đơn bội kép và
chọn lọc là phương pháp chọn tạo giống có hiệu quả chọn lọc rất cao
đặc biệt là nếu được kết hợp với các biện pháp tạo biến dị di truyền
khác như lai hữu tính gây đột biến nhân tạo. Đây là kỹ thuật không
phức tạp nhưng có hiệu quả trong chọn lọc cây trồng, nhất là với cây
trồng có hạt như lúa. Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn đã được
phát triển thành phương pháp chọn tạo giống đơn bội. Sử dụng phương
pháp này các nhà chọn tạo giống lúa đã rút ngắn thời gian và cũng
giảm bớt chi phí về lao động, không cần thiết tạo ra các dòng thuần.
1.4. Một số hệ thống nuôi cấy mới
1.4.1. Nuôi cấy lỏng sục khí- Bioreactor
Hiện nay, hầu hết các hệ thống vi nhân giống được thực hiện
trên những hệ thống bình nuôi cấy khác nhau nhưng đều có điểm
chung mẫu cấy phát triển trên môi trường đặc.
Nuôi cấy trên môi trường đặc chủ yếu trên những thiết bị nuôi
cấy có kích thước nhỏ nên môi trường không đủ đáp ứng cho sự phát
triển lâu dài của mẫu cấy. Hơn nữa nuôi cấy trên môi trường đông đặc,
môi trường bị lãng phí do cây không hấp thu hết các chất dinh dưỡng ở
đáy bình nuôi cấy.
-13-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
Các hệ thống nuôi cấy trong môi trường lỏng trên máy lắc ban
đầu dựa trên mô hình cấy vi sinh và tế bào động vật nhằm phục vụ cho
nghiên cứu nuôi cấy và thu nhận các hợp chất thứ cấp.
Mẫu cấy trong môi trường lỏng có khả năng tăng trưởng nhanh
hơn môi trường đông đặc. Có thể do mẫu cấy tiếp xúc hoàn toàn trong
môi trường.

Ngày nay, hệ thống bioreactor với cấu trúc của các bình lên
men và các cánh khuấy bằng kim loại được thay bằng silicon sục khí,
có thể điều khiển được tốc độ dòng khí để hạn chế những tương tác bất
lợi của mẫu cấy, hạn chế sự tổn thương của mẫu. Vì thế, hệ thống
bioreactor được sử dụng rộng rãi với nhiều mục đích khác nhau như:
nuôi cấy chồi và phôi thực vật, chồi hoa thu hải đường, nhân củ khoai
tây in vitro, hoa lily, một số cây thân gỗ và đặc cấy thu nhận các hợp
chất có hoạt tính sinh học như nuôi cấy rễ nhân sâm.
1.4.2. Nuôi cấy quang tự dưỡng
Nuôi cấy quang tự dưỡng Đã được giáo sư Kozai và các cộng
sự đẩy mạnh nghiên cứu trong thập niên 90. Từ đó đến nay có rất
nhiều nghiên cứu thành công trong ứng dụng phương pháp vi nhân
giống quang tự dưỡng vào sản xuất cây trồng.
Phương pháp vi nhân quang tự dưỡng có nhiều ưu điểm hơn so
với phương pháp truyền thống. Nó thúc đẩy sự tăng trưởng cây in
vitro, rút ngắn thời gian nuôi cấy và đồng thời làm hạ giá thành cây in
vitro.
Phương pháp này chú trọng đến các tác nhân vật lý của môi
trường nuôi cấy (ion, sự khuyếch tán khí hòa tan) và các yếu tố ảnh
-14-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
hưởng đến sự phát triển của cây con trong bình cấy (cường độ ánh
sáng, thời gian chiếu sáng, thành phần không khí, độ ẩm, nhiệt độ và
tốc độ luân chuyển của không khí trong bình nuôi cấy, ) thay vì chỉ
nghiên cứu thành phần hóa học của môi trường cấy như độ đường,
muối khoáng, vitamin hay các chất điều hòa sinh trưởng thực vật mà
các nhà nuôi cấy quan tâm. Trong vi nhân giống quang tự dưỡng,
đường không sử dụng trong môi trường nuôi cấy. Nói đúng hơn sử
dụng chất hữu cơ bao gồm cả chất điều hòa sinh trưởng thực vật,
vitamin, amino acid, ngoại trừ các chất khoáng được cho vào môi

trường. Điều này dựa trên cơ sở tự nhiên tất cả các cây xanh chứa diệp
lục tố đều có khả năng quang hợp để tồn tại và phát triển. Tất cả các cơ
quan dùng trong môi trường nuôi cấy mô có diệp lục tố đều có khả
năng quang hợp. Chúng đều có thể nhận CO
2
không khí làm nguồn
trong carbon trong quá trình quang hợp mà không cần đường và
vitamin trong quá trình nuôi cấy.
Phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng tạo điều kiện tối đa
cho cây trong bình nuôi cấy sử dụng khí CO
2
có sẵn trong không khí
làm nguồn carbon cho chính quá trình tăng trưởng và phát triển của
cây. Sự loại bỏ đường trong môi trường nuôi cấy dẫn đến tỷ lệ nhiễm
nấm, khuẩn trong quá trình nuôi cấy giảm. Điều này đem lại ý nghĩa
rất lớn trong sản xuất vì chi phí công lao động sẽ giảm đáng kể song
song với việc giảm nguyên vật liệu.
Theo khái niệm về nuôi cấy mô quang tự dưỡng thì hộp chứa
cây cấy được xem như là nhà kính thu nhỏ. Với phương pháp này sự
tăng trưởng phát triển của cây in vitro phần lớn chịu ảnh hưởng của
-15-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
các tác nhân vật lý trong môi trường nuôi cấy như ánh sáng, nhiệt độ,
độ ẩm, nồng độ CO
2
sự trao đổi khí.
Nồng độ CO
2
và ánh sáng là hai nhân tố chính quan trọng nhất
trong nuôi cấy quang tự dưỡng cùng với cơ quan có diệp lục tố, sự gia

tăng khác biệt giữa nồng độ CO
2
bên trong và bên ngoài hộp cấy và sự
gia tăng của ánh sáng làm cho hiệu quả quang hợp tăng lên.
1.5. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Hệ số nhân giống cao: Từ một mẫu vật sạch bệnh ban đầu,
bằng con đường nuôi cấy mô có thể nhân nhanh và cung cấp một
lượng giống lớn trong thời gian ngắn trên một quy mô mặt bằng hạn
chế. Đối với khoai tây chẳng hạn, từ một cây sạch bệnh trong ống
nghiệm (in vitro) trong vòng một năm có thể nhân lên hàng ngàn cây
trong phòng thí nghiệm.
Chất lượng giống tốt: Mẫu cây ban đầu (có thể sạch hoặc
không sạch bệnh) được nhập in vitro và nhân nhanh. Khi đạt một số
lượng nhất định cần thiết, mẫu được kiểm tra bệnh virus bằng các
phương pháp huyết thanh (ELISA, ngưng kết antigene – antibody),
hoặc cây chỉ thị. Mẫu không nhiễm tiếp tục được nhân nhanh cho mục
đích sử dụng (sản xuất giống hoặc phục vụ các nghiên cứu lai tạo
giống). Mẫu đồng nhất về mặt di truyền, dòng cây mong muốn, có khả
năng ra hoa và tạo quả sớm.
Khả năng chủ động trong nhân giống: Trong điều kiện phòng
thí nghiệm có kiểm soát, kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép nhân giống
quanh năm. Vì vậy, hoàn toàn có thể chủ động trong việc lập kế hoạch
sản xuất, cung cấp giống
-16-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
1.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trinh nuôi cấy mô tế bào thực
vật
Các nhân tố trong nuôi cấy mô tế bào thực vật có 3 nhân tố chính:
- Đảm bảo điều kiện vô trùng
- Chọn đúng môi trường và chuẩn bị đúng cách

- Chọn mô cấy và xử lí mô cấy thích hợp với trước và sau khi cấy.
1.6.1. Yếu tố vô trùng
1.6.1.1. Ý nghĩa của việc nuôi cấy vô trùng tế bào nuôi cấy mô tế bào
thực vật
- Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật chứa đường, các chất
khoáng, vitamin… là điều kiện thuận lợi để các vi sinh vật phát triển
mạnh mẽ.
- Do tế bào nấm và vi khuẩn hơn nhiều so với tế bào thực vật nên chỉ
cần nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn, thì chúng nhanh chóng
phủ đầy trên toàn bề mặt môi trường, bề mặt mô tế bào thực vật. Các
vi sinh vật lấn áp tế bào nuôi cấy mô thực vật sẽ làm cho mô thực vật
phát triển chậm lại và chết dần.
1.6.1.2. Nguồn tạp nhiễm
Có 3 nguồn tạp nhiễm chính:
- Dụng cụ, nút đậy, môi trườn nuôi cấy không được vô trùng tuyệt
đối.
- Trên bề mặt mô có chứa các sợi nấm, bào tử nấm và bào tử vi
khuẩn.
- Trong quá trình thao tác làm nhiễm các bào tử nấm hoạc vi khuẩn
vào môi trường nuôi cấy.
-17-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
1.6.2. Kỹ thuật vô trùng
1.6.2.1. Vô trùng thuỷ tinh, nút đậy, môi trường
Dụng cụ thuỷ tinh: thông thường dụng cụ thuỷ tinh dùng trong các
phòng thí nghiệm bằng dung dịch sulfocromate một lần trước khi đưa
vào sử dụng, về sau chỉ cần rửa sạch để ráo trước khi sử dụng .
Trong trường hợp các dụng cụ thủy tinh dùng trong thí nghiệm nuôi
cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi phải vô trùng, có thể khử trùng bằng
cách đưa vào tủ sấy sấy trong nhiều giờ dụng cụ phải được gói trong

giấy nhôm hoặc cất trong hộp kim loại để tránh bị nhiễm trơ lại sau khi
khử trùng.
Bảng 1.1 Thời gian khử trùng dụng cụ thủy tinh bằng nhiệt độ và nhiệt
độ khử trùng.
Nút đậy: thường là nút đậy không thấm nước. Nút đậy phải chặt để
bụi đi qua được đồng thời nước ở môi trường cũng không bốc hơi dễ
dàng trong quá trình nuôi cấy. Bông thấm nước là một loại chất đơn
giản nhất nhưng có những nhược điểm sau:
- Nếu khi nút bông bị ướt hoạc dính môi trường thì sẽ bị nấm
nhất là đối với những thí nghiệm lâu dài.
- Thao tác nút bông chậm không thể sản xuất trên qui mô lớn.
-18-
Nhiệt độ khử trùng
(
o
C)
Thời gian khử trùng
(Phút)
160 45
170 20
180 10
190 7,5
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
- Chỉ dùng vài lần rồi bỏ.
Môi trường : Môi trường nuôi vấy thường được hấp khử trùng trong
nồi autoclave, khử trùng bằng áp suất hơi bão hòa. Thời gian thường
15 -30 phút ở áp suất 1atm nhiệt độ 121
o
C.
Bảng 1.2: bảng thể tích và thời gian hấp khử trùng( Autoclave)

Thể tích môi trường (ml) Thời gian hấp khử trùng (phút)
<50 15
75 20
250 - 500 25
1000 30
Việc hấp khử trùng này không hợp với các chất nhạy cảm với
nhiều như: acid amin, các vitamin, hormone tăng trưởng, các chất
kháng sinh.
Các chất này thường được khử bằng cách lọc qua màng lọc
polyethylen hoặc sợi cellulose. Các lỗ màng này có thể giữ lại các vi
sinh vật.
1.6.2.2. Khử trùng nơi thao tác cấy và dụng cụ cấy
Nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi
vào dụng cụ thuỷ tinh chứa môi trường trong khi mở nắp hoặc nút
bông để thao tác cấy. Người ta áp dụng nhiều biện pháp khác nhau để
chống lại nguồn nhiễm tạp này. Phòng cấy thường là buồng có diện
tích hẹp, rộng từ 10-15m
2
, có hai lớp cửa để tránh không khí chuyển
-19-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
động từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào. Sàn và tường lát gạch men để
có thể lau chùi thường xuyên.
Vô trùng phòng cấy:
Trước khi đưa vào sử dụng hoặc cứ sau 2-3 tháng, phòng cấy
phải được xử lý hơi formalin bằng cách rót formol 40% ra một số đĩa
petri để rải rác vài nơi trong phòng cho bốc hơi tự do, đóng kín cửa
phòng cấy trong 24h, sau đó bỏ formalin đi và khử hơi formalin thừa
bằng dung dịch amoniac 25% cũng để rải rác trong phòng 24h.
Để đảm bảo mức độ vô trùng cao, trong phòng cấy ngoài đèn tử

ngoại trong box cần có 4 đèn tử ngoại 40W trên trần. Chỉ cho các đèn
tử ngoại làm việc khi không có người làm việc trong box cấy. Nên bật
đèn tử ngoại 30 phút và tắt trước 30 phút trước khi làm việc hoặc bật
sau khi đã ngưng làm việc. Cần hạn chế chuyển động không khí trong
phòng cấy đến mức tối thiểu. Các dụng cụ làm việc phải chuẩn bị đầy
đủ, bố trí hợp lý, thuận tiện để làm việc và hạn chế đi lại khi cấy, ra
vào buồng cấy, đóng cửa cẩn thận.
Phòng nuôi cũng phải được khử trùng trước là bằng xà bông
bột, sau đó lau bằng dung dịch calcium hypochlorite loãng hoặc cồn
70%. Tất cả trần, sàn đều phải được lau như vậy mỗi tuần. Không
được khuấy động những nơi bị nhiễm để tránh phát tán bào tử.
Khử trùng các dụng cụ kim loại và môi trường khoáng:
Các dụng cụ kim loại được khử trùng bằng không khí nóng
(130
o
– 170
o
C). Các dụng cụ này phải được gói kín trước khi khử
trùng, nên gói trong giấy nhôm là tốt nhất. Không nên hấp khử trùng
-20-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
dụng cụ kim loại vì điều kiện nóng ẩm sẽ làm kim loại bị rỉ sét và bị ăn
mòn.
Autoclave là phương pháp khử trùng bằng hơi nước dưới một
áp suất nhất định nút gòn, khăn vải, các vật dụng phòng thí nghiệm
bằng thủy tinh, các bình nuôi cấy bằng plastic, nút cao su, các bộ lọc,
nước, môi trường khoáng đều có thể khử trùng bằng nồi hấp. Gần như
tất cả vi sinh vật đều bị tiêu diệt bởi hơi nước trong nồi hấp thời gian
từ 10 - 30 phút ở nhiệt độ 121
o

, 1,5 atm.
Môi trường sau khi pha chế có thể chuyển vào bình cấy với
lượng cần thiết trước khi hấp tiệt trùng, cũng có thể hấp trước với khối
lượng lớn và rót chuyển vào bình cấy trong box cấy. Thời gian hấp tiệt
trùng phụ thuộc dung tích môi trường trong dụng cụ đựng khi hấp ở
nhiệt độ 121
o
, 1,5atm.
Thời gian tối thiểu này gồm cả thời gian cần thiết để nhiệt độ
nồi hấp đạt đến 121
o
C và 15 phút tiệt trùng.
Đối với môi trường khoáng, áp suất không nên cao quá 1atm vì
áp suất cao sẽ làm phân hủy carbohydrate và các phức hợp nhạy cảm
với nhiệt độ.
Sau khi tiệt trùng, môi trường được chuyển ngay sang phòng
cấy để làm nguội và sử dụng theo yêu cầu. Nếu là môi trường thạch
hấp với khối lượng lớn trước khi chia vào bình cấy, thì chuyển ngay
vào box cấy đã được vô trùng để tránh nhiễm.
Trên bàn thường xuyên có một đèn cồn để sử dụng khi cấy và
cốc đựng cồn 90% để nhúng các dụng cụ làm việc. Các dụng cụ khác
để cấy như bình môi trường, ống nghiệm, bình đựng mẫu cấy
-21-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
chuyền… Đều được xử lý khử trùng bề mặt bằng cách lau bằng cồn 70
% trước khi đưa vào trong box cấy.
1.6.3. Yếu tố môi trường
Một trong nghững yếu tố quan trọng nhất đối với sự tăng trưởng
và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là
thành phần môi trường. Thành phẩn này thay đổi tùy theo loài và bộ

phận nuôi cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí
nghiệm mà thành phần môi trường cũng thay đổi. Tuy nhiên tất cả các
môi trường nuôi cấy thành phần dinh dưỡng bao gồm 5 phần: khoáng
đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, đường (nguồn carbon) và các chất
điều hòa sinh trưởng thực vật.
Có một số công thức môi trường thường được sử dụng chủ yếu
trong nuôi cấy mô tế bào thực vậtnhư môi trường MS (Murashige và
skoog), B5 (Ganborg và cộng sự), SH (Schenk và Hilderbrandt) có
hàm lượng cao và một số môi trường khác mô tả bởi White, Gautheret,
Nitach Loyd và Mc Cown có hàm lượng khoáng đa lượng thấp.
1.6.3.1.Khoáng đa lượng
Nhu cầu khoáng của mô, tế bào tách rời không khác nhiều so
với cây trồng trong tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải cung
cấp N, P, K, Ca, Mg và Fe.
1.6.3.2. Khoáng vi lượng
Nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật in vitro là
lĩnh vực còn ít được nghiên cứu. Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mô
mới ra đời, người ta không nghĩ đến việc bổ sung khoáng vi lượng vào
môi trường nuôi cấy. Các thí nghiệm thành công do argar và hóa chất
-22-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
dùng để pha môi trường không tinh khiết mà có lẫn một số nguyên tố
vi lượng cung cấp phần nào cho môi trường nuôi cấy cung cấp phần
nào cho môi trường nuôi cấy. Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp
cho tế bào là: Zn, Cu, B, Mn, Co, Mo
1.6.3.3.Carbon và nguồn năng lượng
Trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp mô và tế bào thực
vật tổng hợp nên các chất hữu cơ để tế bào phân chia, tăng sinh khối
không phải từ quá trình quang hợp mà chính là nguồn carbon bổ sung
vào môi trường dưới dạng đường. Hai dạng đường thường hay gặp

nhất là glucose và surcose. Các nguồn carbonhydrate khác cũng được
tiến hành thử nghiệm như: Lactose, galactose, rafinose, maltose và tinh
bột nhưng nguồn carbohydrate này có hiệu quả kém hơn so với
glucose và sucrose. Sucruse là nguồn carbon quan trọng đối với mô tế
bào nuôi cấy. Nồng độ sucrose ban đầu có thể ảnh hưởng đến một số
tham số nuôi cấy như tốc độ tăng trưởng và sản lượng hợp chất thứ cấp
trong nuôi cấy tế bào thực vật.
1.6.3.4.Vitamin
Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự
tăng trưởng và phát triển của chúng. Chúng cần vitamin để xúc tác
nhiều quá trình biến dưỡng khác nhau. Khi tế bào và mô được nuôi cấy
in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn cho sự phát triển
của chúng.các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy
mô là thiamin (B1), acid nicotinic, piridorxite (B6) và mio- inositol.
1.6.3.5. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
-23-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
Trong nuôi cấy mô thực vật có 5 nhóm chất điều hòa quan trọng
trong nuôi cấy mô thực vật: auxin, gibberellin, cytokinin, abscisic acid
và ethylen. Miller là người đầu tiên nhận thấy tỉ lệ auxin và cytokinin
bổ sung vào môi trường để kích thích sự phát sinh hình thái và tỷ lệ
phytohormone sử dụng để kích thích sự tạo chồi hay sự tạo rễ không
giống nhau.
Auxin: Tự nhiên là hợp chất tương đối dơn giản: indol-3-
acetic acid (IAA). Các chất có cấu trúc gần giống như IAA và có cùng
vai trò với IAA trong cơ quan đều được gọ là auxin (như: IBA, NAA.
2,4-D, 2,4,5- t và phenoxyacetic acid) auxin phối hợp với cytokinin
giúp sự tăng trưởng chồi non và khôi phục tạo mới mô phân sinh chồi
từ nhu mô. Tuy nhiên, ở nồng độ cao auxin cản trở sự phát triển của
các phát thể chồi vừa được thành lập hay các chồi nách (các chồi ở

trạng thái tiềm sinh), auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khỏi rễ
(phát thể non của rễ) nhưng cũng cản trở sự tăng trưởng của các sơ
khởi này. Trong sự tạo rễ auxin cần phối hợp với các vitamine (như
thiamine mà rễ không tạo được), amino acid (như arginin), và nhất là
các hợp chất othordiphenollic (như cafeic acid, chlorogenic acid)
Cytokinin: là một loại chất sinh trưởng thực vật thực vật kích
thích tế bào phân chia. Các hợp chất này xuất phát từ purine adenin,
một trong cac base của DNA và hợp chất cytokinin đầu tiên được
khám phá ra là kinetine, tiếp theo là zeatin một chất có trong phần lớn
thực vật và một vài vi khuẩn cấu trúc gần giống kinetine nhưng hoạt
tính cao hơn gấp 10 lần. Sau zeatin hơn 30 cytokinin khác nhau được
cô lập. Ngày nay, cytokinin để chỉ một hợp chất tự nhiên hay nhân tạo,
-24-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
có đặc tính sinh lí giống kinetin. Nhiều hợp chất có hoạt tính
cytokinin, chúng đều là apminopurin được thay thế ở vị trí thứ 6, ví dụ
như BA. Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có
auxin và cytokinin tác động trên cả 2 bước của sự phân chia tế bào:
phân nhân và phân bào. Trong nuôi cấy mô nghèo cytokinin (mô lõi
thuốc lá, vỏ rễ đậu) auxin kích thích sự phân đôi nhiễm sắc thể, thậm
chí là tạo tế bào hai nhân, nhưng không có sự phân vách: sự phân vách
chỉ xảy ra khi cytokinin ngoại sinh. Cytokinin giúp đỡ sự gia tăng kích
thước tế bào và sinh tổng hợp protein. Trong thân và rễ, cytokinin cản
trở sự kéo dài nhưng kích thích sự tăng rộng lá tế bào lá trưởng thành.
Trong các nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật, tỷ lệ auxin/cytokinin
(A/C) là một yếu tố rất quan trọng: A/C cao sự tao rễ, A/C thấp sự tạo
chồi, vậy cytokinin hỗ trợ auxin trong tăng trưởng nhưng đồng thời
nhưng đồng thời cũng có sự đối kháng giữa auxin( giúp tạo rễ) và
cytokinin giúp tạo chồi. Sự cân bằng giữa 2 phytohormone này là một
trong những yếu tố kiểm soát phát triển.

(2,4- diclorophenoxy) acetic acid Napthalene acetic acid
-25-