nghiên cứu khoa học '''' quy trình nhân giống in vitro cây thông caribaea (pinus caribaea) ''''

Đồ án tốt nghiệp
QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG
IN VITRO CÂY THÔNG
CARIBAEA (Pinus caribaea)











QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG
IN VITRO CÂY THÔNG CARIBAEA (Pinus caribaea)

Kiều Phương Nam, Cao Quốc Liêm, Trần Trung Hiếu, Bùi Văn Lệ

Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp. HCM
Kiều Thanh Tịnh

Trung tâm Khoa học Sản xuất Lâm nghiệp Đông Nam Bộ, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam

TÓM TẮT
Bài báo đề cập 3 yếu tố ảnh hưởng tới hiệu quả của quá trình nhân giống vô tính cây thông Caribê:
1. Tiền xử lý mẫu với acid benzoic, citric acid sẽ gia tăng hiệu quả khử trùng (93,33%); 2. Chồi con
có mang các búp chồi ngủ là vật liệu phù hợp cho quá trình khởi đầu quy trình nhân giống. Ở điều
kiện in vitro có thẻ tạo ra vật liệu này trên môi trường SH bổ sung 30g/l glucose + 10% nước dừa +
2mg/l BA + 0,5mg/l IBA; 3. Phương pháp shock hoomone có tác dụng gia tăng tỉ lệ chồi ra rễ
(80%).
Từ khóa: Nhân giống vô tính, Pinus caribaea
ĐẶT VẤN ĐỀ
Thông Caribê (Pinus caribaea) là một loài thực vật nhập nội, có nguồn gốc từ phía Tây
Cuba, một số đảo thuộc vùng Caribean và Trung Mỹ. Chúng được trồng thử nghiệm tại Lâm Đồng
từ năm 1965. Với nhiều ưu điểm về thích nghi, sinh trưởng ở điều kiện Việt Nam cây cho nhựa, gỗ
tốt,…. nên hiện nay thông Caribê được quan tâm và trồng ở nhiều nơi: Quảng Bình, Huế, Đà Nẵng,
Đồng Nai… (Trần Văn Minh 2003; Phạm Thị Kim Thanh 2007). Tuy nhiên, nguồn cây giống chủ
yếu là từ gieo hạt có một số bất lợi như giá thành cao, tỷ lệ nảy mầm thấp (45 – 50%), rừng trồng
thường bị phân hóa và quan trọng là rừng thông Caribê trồng tại Đông Nam Bộ không có khả năng
kết hạt. Vì vậy, phương pháp nhân giống vô tính in vitro là phương pháp tiềm năng nhất cho quá
trình sản xuất cây con có chất lượng cao và là phương pháp nền tảng cho việc cải tiến giống thông
bằng các kỹ thuật công nghệ sinh học.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Mẫu cấy
Đoạn chồi non có mang búp chồi của 8 cây thông Pinus caribaea var hondurensis tại vườn
thông khảo nghiệm của Trung tâm Khoa học Sản xuất Lâm nghiệp Đông Nam Bộ, thuộc Viện Khoa
học Lâm nghiệp Việt Nam, có trụ sở tại Thống Nhất, Đồng Nai.
Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy được sử dụng là môi trường Schenk & Hildebrandt (1972), ký hiệu SH.
Môi trường SH có khoáng đa lượng giảm một nửa ký hiệu là SH

1/2
; Đường sucrose hay glucose với
nồng độ 30g/l; Agar: 7g/l; Than hoạt tính: 1g/l; pH 5,7
0,1; Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ ngày;
Cường độ: 2500 – 3000lux; Nhiệt độ: 25 2
0
C; Độ ẩm trung bình: 70 – 80%.
Khử trùng mẫu cấy
Thí nghiệm được thực hiện để tìm thời gian xử lý citric acid và benzoic acid thích hợp trong
quá trình khử mẫu. Chỉ tiêu theo dõi sau 3 tuần là tỷ lệ mẫu sống khỏe mạnh và không nhiễm.


Tiền xử lý: các đoạn chồi non (3–4cm) 3 tuần tuổi mang búp chồi được ngâm trong citric
acid 0,5%, thời gian từ 0–60 phút. Sau đó, các đoạn chồi này được rửa sạch với xà phòng và nước
máy. Tiếp theo các đoạn chồi này được ngâm trong benzoic acid 0,25%, từ 0 – 60 phút. Rửa sạch
mẫu b”ng nước máy. Bước kế tiếp mẫu cấy được khử trùng trong tủ cấy với javel (1 javel: 3 nước),
cồn 70
0
, rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng. Các đoạn chồi được cắt bỏ phần mô chết, cấy vào môi
trường.
Khảo sát sự hình thành cụm chồi từ chồi ngủ
Thí nghiệm được thực hiện với mục tiêu khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố chất điều hòa
tăng trưởng thực vật (BA, IBA), đường và nước dừa lên sự tạo cụm chồi. Đánh giá dựa trên phần
trăm mẫu cấy tạo cụm chồi, số chồi hình thành mỗi mẫu và chiều cao chồi. Các đoạn chồi ngọn vô
trùng sau 3 tuần khử mẫu được sử dụng cấy vào môi trường SH bổ sung BA (0; 2; 3 và 4mg/l) và
IBA (0; 0,2 và 0,5mg/l). Sau 8 tuần quan sát và ghi nhận kết quả, chọn nghiệm thức tạo cụm chồi
tối ưu để tiếp tục khảo sát sự ảnh hưởng của đường và nước dừa. Sự kết hợp của một trong hai loại
đường glucose (0 và 30g/l) hoặc sucrose (0 và 30g/l) với nước dừa (0 và 10% V/V) (Bảng 1).

Bảng 1. Sự kết hợp giữa các yếu tố: sucrose, glucose và nước dừa

Nghiệm thức Glucose (g/l) Sucrose (g/l) Nước dừa (CW) %
S 0 30 0
SCW 0 30 10
G 30 0 0
GCW 30 0 10

Khảo sát sự tăng trưởng chồi
Chồi non in vitro cao 1–1,5cm được cấy lên môi trường SH dạng bán rắn và lỏng, bổ sung
30g/l đường glucose, 10% nước dừa và BA (0; 0,1; 0,2 và 0,5mg/l). Theo dõi sự gia tăng chiều cao
của chồi.
Tạo rễ in vitro và chuyển cây ra vườn ươm
Chồi non in vitro cao 4–6cm, không có nốt chồi, lá mọc đều, xanh tốt được cấy vào môi
trường bán rắn SH
1/2
bổ sung IBA (0; 0,2; 0,5; 1; 1,5 và 3mg/l), ủ tối 2 tuần. Tiếp theo chuyển mẫu
cấy sang môi trường SH
1/2
bổ sung 0,1 mg/l IBA, đặt trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt
độ 25 2
0
C, độ ẩm 70 – 80%, thời gian là 6 tuần.
Chuyển cây từ điều kiện in vitro ra vườn ươm. Trên giá thể là xơ dừa, tro trấu, đất rừng
thông theo tỷ lệ 1: 2: 1.
Theo dõi thời gian xuất hiện rễ, phần trăm chồi tạo rễ, số lượng và chiều dài rễ mỗi chồi. Tỷ
lệ sống ngoài vườn ươm.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Khử trùng mẫu cấy
Kết quả khử mẫu (Bảng 2) tốt nhất thu được từ nghiệm thức K8, thời gian ngâm mẫu trong
citric acid 0,5% và benzoic acid 0,25% lần lượt là 60 và 30 phút; 93,33% mẫu sống và không

nhiễm. Số lượng mẫu nhiễm tỷ lệ nghịch với thời gian ngâm benzoic acid và ngược lại số mẫu chết


li t l thun. Cỏc nghim thc kt hp thờm vic ngõm trong citric acid cng cú vai trũ lm gim
s mu b nhim.

Bng 2. T l phn trm mu sng kho mnh, khụng nhim sau 3 tun

Thi gian ngõm mu
(phỳt)
Nghi
m thc
Citric acid
(0,5%)
Benzoic
acid
(0,25%)
S mu
khụng
nhim
S
mu
nhim
S mu
cht
T l phn
trm mu
sng khụng
nhim
K1 0 0 12 10 8 40,00

K2 0 30 17 4 9 56,67
K3 0 60 16 2 12 53,33
K4 30 0 21 6 3 70,00
K5 30 30 20 5 5 66,67
K6 30 60 23 1 6 76,67
K7 60 0 24 5 1 80,00
K8 60 30 28 1 1 93,33
K9 60 60 16 0 14 53,33

Nh vy, vic kt hp tin x lý citric acid v benzoic acid trc khi x lý vi javel cho
hiu qu kh trựng tt hn, t l t 93,33%, so vi s dng ch mt mỡnh javel, t l t cao nht
ch l 86,67% (Trn Trung Hiu v cng s, 2003). Phng thc kh mu ny va cho kt qu cao,
va m bo an ton vỡ khụng s dng HgCl
2
nh quy trỡnh ca Trn Vn Minh v cng s, 2003.
Benzoic acid cú vai trũ dit nm v loi b bt vi sinh vt trc khi x lý vi javel, citric acid cú tỏc
dng lm tan nha thụng, trỏnh s húa nõu ca mu giỳp kh mu tt hn.
Khảo sát sự hình thành cụm chồi từ chồi ngủ
Sau 10 tuần nuôi cấy trên môi trờng khoáng SH, bổ sung các nồng độ khác nhau của BA và
IBA, kết quả (Bảng 3) cho thấy số lợng chồi đạt cao nhất (37,60 0,81 chi/mu) trong nghim
thc C4 (3mg/l BA: 0,2mg/l IBA). Kt qu ny cao hn so vi quy trỡnh ca tỏc gi Trn Vn Minh
v cng s, 2003 (8 10 chi/ nh sinh trng). S kt hp ca auxin v cytokinin to nờn mt th
cõn bng mi phỏ v trng thỏi ng ca chi. ng thi cytokinin phi hp vi auxin nng thp
giỳp cho s tng trng chi non v khi phỏt s to mi mụ phõn sinh ngn chi t nhu mụ.
Nhng nng cao, auxin cn s phỏt trin ca phỏc th chi va mi thnh lp v kớch thớch s
to mụ so (Bựi Trang Vit, 2000). Cng chớnh vỡ vy m nghim thc C5 (3mg/l BA: 0,5mg/l
IBA) xut hin mụ so gc ca chi con. Mụi trng khoỏng SH b sung 2mg/l BA kt hp vi
0,2mg/l IBA giỳp chi tng trng tt (1,82 0,04cm).

Bảng 3. Sự tạo cụm chồi ngủ trên môi trường SH, sau 10 tuần nuôi cấy
Nghiệm
thức
BA
(mg/l)
IBA
(mg/l)
Phần trăm
mẫu tạo chồi
(%)
Số chồi/mẫu Chiều cao
chồi (cm)
C0 0 0 13,33 2,20±0,45 1,24±0,05
C1 2 0 40,00 5,40±0,55 1,34±0,05
C2 2 0,2 50,00 6,80±0,84
1,82±0,04
C3 3 0 56,67 22,00±1,58 0,52±0,04
C4 3 0,2 60,00 37,60±0,81
0,82±0,08
C5 3 0,5 53,33 4,00±0,71
*
0,56±0,09

C6 4 0 43,33 7,40±0,55 0,64±0,05
C7 4 0,2 46,67 11,00±0,79 1,04±0,09
(*) Chỉ tính số chồi trước khi mô sẹo hình thành chồi
Môi trường C5 (3mg/l BA + 0,5mg/l IBA) có sự hình thành mô sẹo từ phần gốc của chồi
con. Sau 10 tuần mô sẹo có đường kính 1,96 0,15cm. Chúng được cấy chuyền sang môi trường
SH bổ sung 30g/l glucose, 10% nước dừa và 3mg/l BA kết hợp với 0,2mg/l IBA. Sau 3 tuần nuôi
cấy, mô sẹo hình thành chồi, sau 6 tuần đạt 20,25 1,5 chồi, có chiều cao 0,63 0,02cm.
Dựa trên môi trường C4 (SH bổ sung 3mg/l BA với 0,2mg/l IBA) cho sự hình thành chồi
tốt, chúng tôi tiếp tục khảo sát sự ảnh hưởng của đường và nước dừa lên sự tạo chồi thông Caribê.

Bảng 4. Ảnh hưởng của đường và nước dừa lên sự tạo cụm chồi thông Caribê trên môi trường
SH bổ sung 3mg/l BA và 0,2mg/l IBA, sau 10 tuần nuôi cấy

Nghiệm
thức
Tỉ lệ phần trăm mẫu
cấy phát sinh chồi
Số chồi/mẫu cấy Chiều cây trung
bình của chồi
(cm)
S 60,00 37,60±0,81 0,82±0,08
SCW 68,10 43,00±5,42 1,18±0,13
G 62,25 41,25±4,11 0,93±0,10
GCW 65,00 112,50±9,57
< 0,5

Kết quả thí nghiệm cho thấy (Bảng 4), nếu đường sucrose được thay bằng glucose và bổ
sung 10% nước dừa thì số chồi/mẫu sẽ tăng gấp 3 lần. Glucose cho kết quả tốt hơn sucrose là vì
glucose tham gia trực tiếp vào con đường biến dưỡng sinh ATP, dinh dưỡng thiết yếu cho tăng
trưởng và phát triển của cây. Còn sucrose thì phải trải qua một phản ứng thủy giải tạo glucose và

fructose thông qua enzyme sucrase. Sự kết hợp thêm nước dừa cho hiệu quả tốt hơn vì nước dừa có


chứa nhiều amino acid, các chất kích thích tố thực vật, đặc biệt là cytokinin, zeatin, myo-inosytol,
scycle-inosytol. Sau 8–10 tuần nuôi cấy, chồi con ngừng tăng trưởng chiều cao (chỉ đạt 0,5–1cm).
Nguyên nhân có thể là do sự cạn kiệt dinh dưỡng và sự cạnh tranh dinh dưỡng giữa các chồi. Ngoài
ra, trên môi trường 30g/l glucose + 10% nước dừa + 2mg/l BA + 0,5mg/l IBA sau 6 tuần có sự xuất
hiện của nhiều búp chồi ngủ, loại vật liệu cho hệ số nhân chồi cao, chính khả năng tạo được
vật liệu khởi đầu trong diều kiện in vitro sẽ là một yếu tố giúp quy trình nhân giống in vitro
cây thông Caribê thêm hoàn chỉnh.
Khảo sát sự tăng trưởng chồi
Thông qua bảng kết quả (Bảng 5), chúng tôi nhận thấy sự chênh lệch rõ rệch về chiều cao
của chồi thông trong hai dạng môi trường là bán rắn và lỏng. Chồi được nuôi cấy trên môi trường
lỏng tăng trưởng tốt hơn và nhanh hơn (SH1: 4,74 0,05cm) so với môi trường bán rắn (SH1: 2,65

0,14cm). Môi trường thích hợp hơn hết cho sự tăng trưởng chồi là môi trường SH1 dạng lỏng, bổ
sung 0,1 mg/l BA, chiều cao chồi đạt 4,74 0,05cm.
Qua những thí nghiệm trước, chúng tôi nhận thấy sự cạn kiệt dinh dưỡng và nồng độ chất
điều hòa tăng trưởng thực vật cao có thể là nguyên nhân chính gây ức chế tăng trưởng chồi. Do đó,
sự đầy đủ về dinh dưỡng và nồng độ chất điều hòa tăng trưởng thực vật thích hợp sẽ kích thích chồi
tăng trưởng. Môi trường SH3 có nồng độ cytokinin cao (BA: 0,5mg/l) ức chế sự kéo dài thân, nên
chồi có chiều cao thấp hơn so với chồi trên môi trường khác. Đạt được hai yêu cầu thiết yếu về dinh
dưỡng và chất điều hòa tăng trưởng, môi trường SH1 chứng tỏ phù hợp nhất để tăng trưởng chồi.
Trong môi trường SH0, tuy không có chất chất điều hòa tăng trưởng nhưng chồi vẫn tăng trưởng,
nhưng chậm hơn so với môi trường SH1 và SH2, vì môi trường này chỉ đảm bảo về nhu cầu dinh
dưỡng, thiếu hụt hẳn lượng hoormone ngoại sinh.

Bảng 5. Sự tăng trưởng của trên môi trường SH bổ sung các nồng độ BA khác nhau, ở
hai dạng bán rắn và lỏng sau 4 tuần nuôi cấy

Chiều cao trung bình (cm) Nghiệm
thức
BA
(mg/l)
Môi trường bán rắn Môi trường lỏng
SH0 0 2,55±0,10 3,13±0,08
SH1 0,1 2,65±0,14 4,74±0,05
SH2 0,2 2,62±0,12 4,43±0,08
SH3 0,5 2,14±0,10 2,41±0,14

Tạo rễ chồi thông Caribê in vitro và chuyển cây ra vườn ươm
Với phương pháp tạo rễ thông qua hai giai đoạn: (1) Cảm ứng tạo rễ sơ khởi trên môi trường
bán rắn, có nồng độ auxin cao (0–5mg/l IBA), ủ tối trong 2 tuần và (2) kích thích kéo dài rễ trên
môi trường auxin có nồng độ thấp (0,1mg/l IBA) trong 6 tuần tiếp theo, chúng tôi đã thu được kết
quả khả quan như sau:











Bảng 6. Sự tạo rễ của chồi trên môi trường SH
1/2
, sau 8 tuần nuôi cấy

Nghiệm
thức
IBA
(mg/l)

Tỉ lệ
mẫu cấy
ra rễ
(%)
Thời gian
xuất hiện
rễ (tuần)
Số rễ/cây Chiều dài
rễ (cm)
Ghi chú
R0 0,0 0 0 0 0
R1 0,2 0 0 0 0
R2 0,5 40 6 5,43±0,53 0,94±0,15 Có 10-12 rễ nhánh
R3 1,0 80 4 1,57±0,53 2,69±0,24 Có 3-4 rễ nhánh
R4 1,5 70 4 5,57±0,53 2,03±0,37 Không rễ nhánh
R5 3,0 30 4 1,93±0,45 1,96±0,21 Không rễ nhánh
R6 5,0 0 0 0 Mẫu chết

Kết quả cho thấy môi trường R3 và R4 có thể sử dụng cho mục đích ra rễ (Bảng 6). Trong
đó R3 là môi trường thích hợp hơn vì sau 8 tuần nuôi cấy đạt 80% chồi thông ra rễ; mỗi cây có 1,57
0,53 rễ và rễ dài 2,69 0,24cm. Ở các môi trường R0, R1 có nồng độ auxin chưa đủ cao để kích
thích sự hình thành rễ sơ khởi từ chồi in vitro. Đối với môi trường R2, nồng độ IBA là 0,5mg/l có
thể kích thích sự hình thành rễ từ chồi nhưng tỷ lệ vẫn còn thấp. Nghiệm thức R5, môi trường có
lượng auxin cao (3mg/l IBA) ức chế sự tạo rễ nên tỷ lệ giảm so với R3 và R4. Môi trường R6, nồng
độ auxin quá cao (5mg/l IBA) làm mẫu chết sau hai tuần ủ tối. Chúng tôi nhận thấy quy trình này có

hiệu suất tạo rễ và số rễ mỗi cây cao hơn so với quy trình sử dụng IAA và IBA của Trần Văn Minh
(2003) (chỉ tạo được một rễ) và quy ảtình chưa tạo được rễ của tác giả Phạm Thị Kim Thanh (2007)
Cây con ra rễ sẽ có tỷ lệ sống ngoài vườn ươm lần lượt là 90% cho cây 8 tuần tuổi và 100%
cho cây 14 tuần tuổi. Tuần đầu tiên, thực hiện phun sương theo chu kỳ 60 phút, thời gian phun là 2
phút. Tuần thứ hai trở đi chỉ tưới mỗi ngày 3 lần, sau 30 ngày bón phân N–P–K (16–16–8), liều
lượng 3g trong 1 lít nước. Việc bổ sung thêm đất rừng thông vào giá thể còn là điều kiện cho nấm rễ
tương tác với thông con, giúp cây phát triển và thích ứng tốt.

KẾT LUẬN
Vật liệu khử mẫu thích hợp: đoạn chồi non 3 tuần tuổi mang búp chồi.
Phương thức khử mẫu tốt nhất: Tiền xử lý, ngâm trong citric acid 0,5% (30 phút) và benzoic
acid 0,25% trong 60 phút. Tỷ lệ javel thích hợp cho bước khử mẫu tiếp theo là (1 javel: 3 nước).
Môi trường SH bổ sung 30g/l glucose + 10% nước dừa + 3mg/l BA + 0,2mg/l IBA thích
hợp tạo cụm chồi và tái sinh chồi từ mô sẹo. Tạo búp chồi con trên môi trường SH có 30g/l glucose
+ 10% nước dừa + 2mg/l BA + 0,5mg/l IBA sau 6 tuần.


Môi trường SH lỏng bổ sung 30g/l glucose + 10% nước dừa + 0,1mg/l BA thích hợp cho
tăng trưởng chồi.
Môi trường bán rắn SH
1/2
bổ sung 1mg/l IBA giai đoạn 1 thích hợp cho việc tạo rễ sơ khởi
rễ. Kết hợp với giai đoạn 2 sử dụng môi trường SH
1/2
bổ sung 0,1mg/l IBA để kích thích kéo dài rễ.
Kết quả sau 8 tuần nuôi cấy, mỗi cây có 1,57 0,53 rễ và rễ dài 2,69 0,24cm.
Cây con 8 tuần tuổi chuyển ra vườn ươm sống 90%. Cây 14 tuần tuổi sống 100%.
Hệ số nhân chồi trong môi trường SH bổ sung 30g/l glucose + 10% nước dừa + 3mg/l BA +
0,2mg/l IBA là 112 chồi/ mẫu sau 10 tuần. Vậy hệ số nhân chồi lý thuyết là 112
5

chồi/ năm.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trần Trung Hiếu, Nguyễn Xuân Thương, Kiều Phương Nam, Bùi Văn Lệ, 2003. Bước đầu
nhân nhanh giống thông Caribê (Pinus caribaea) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. Báo
cáo khoa học hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc. NXB Khoa học Kỹ thuật. Trang 880
– 883.
Trần Văn Minh, Hà Thị Loan, 2003. ứng dụng công nghệ tế bào thực vật phát triển cây
nguyên liệu giấy thông Caribê (Pinus caribaea). Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong
khoa học sự sống. Báo cáo hội nghị khoa học toàn quốc lần 2. Nghiên cứu cơ bản trong sinh
học, nông nghiệp, y học. NXB Khoa học Kỹ thuật. Trang 372 – 376.
Bùi Trang Việt, 2000. Sinh lý thực vật đại cương, phần II. Tủ sách trường Đại học Khoa học
Tự nhiên. Trang 78 – 110.
Phạm Thị Kim Thanh, Huỳnh Đức Nhân, 2007. Nhân giống thông Caribê (Pinus Caribaea)
bằng phương pháp nuôi cấy mô, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn,
Số 12+13. Trang 91-94. ISSN 0866-7020

IN VITRO PROPAGATION OF CARIBEAN PINE (PINUS CARIBAEA)
Kieu Phuong Nam, Cao Quoc Liem, Tran Trung Hieu, Bui Van Le

Department of Biology, University of Science, Ho Chi Minh city
Kieu Thanh Tinh
Centre of South Eastern Forest Science and Production, Forest Science Institute of Vietnam
SUMMARY
Our aim in this study is to reveal the role of three factors that dramatically
affect the efficacy of in vitro propagation process of Pinus caribaea. These
are: 1. the effect of increasing effectiveness of sterilization of benzoic
acid treatment (93.33%); 2. for the initial step of the process, young shoots
carrying bud dormancy are the most suitable material, which can be obtained on
SH medium with 30g/L glucose: 10% coconut water, 2mg/L BA, 0.5mg/L IBA; and

finally; 3. an increase in root development can be achieved through hormone
shock (80%).
Keywords: Vitro propagation, Pinus caribaea






Hình 1: Quy trình nhân giống in vitro cây thông caribaea