phương pháp khối phổ

NỘI DUNG CHÍNH
TỔNG QUAN VỀ KHỐI PHỔ
KHỐI PHỔ LÀ GÌ?
•
là phương pháp nghiên cứu các chất, bằng
cách đo chính xác khối lượng phân tử chất
đó, dựa trên điện tích của ion; dùng thiết bị
chuyên dụng là khối phổ kế.
•
Kĩ thuật này có nhiều ứng dụng, thường
được kết hợp với một số sinh học phân tử
khác như:
–
Khối phổ kết hợp với sắc ký khí.
–
Khối phổ kết hợp với sắc ký lỏng.
–
Khối phổ kết hợp điện di
SỰ HÌNH THÀNH VÀ
NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG
Sự ion hoá
•
nghiên cứu các chất bằng phương pháp khối
phổ, các phân tử chất nghiên cứu phải ở dạng
khí hoặc hơi, phải được ion hoá bằng các
phương pháp thích hợp(va chạm điện tử ,bằng
trường điện từ ,ion hoá học,chiếu xạ bằng các
photon.)

Phương pháp ion hoá bằng

va chạm điện tử
•
Trong buồng ion hoá, các điện tử phát ra từ
cathode làm bằng vonfram hoặc reni, bay về
anode với vận tốc lớn.
•
Các phân tử chất nghiên cứu ở trạng thái hơi
sẽ va chạm với điện tử trong buồng ion hoá,
có thể nhận năng lượng điện tử và bị ion hoá.
Ion hoá bằng trường điện từ
•
Tại buồng ion hoá đặt các “mũi nhọn” là bộ
phận phát từ trường dưới dạng dây dẫn mảnh
(2.5 µm) hay các lưỡi mảnh
•
đặt điện áp vào các “mũi nhọn”. cho một
trường điện từ có gradien 10
7
-10
10
V/cm
•
các điện tử sẽ bị bứt khỏi phân tử chất nghiên
cứu do hiệu ứng đường hầm nên không gây sự
kích thích,vẫn giữ nguyên ở trạng thái cơ bản,
do đó các vạch phổ sẽ rất mảnh.
Máy khối phổ
•
là một thiết bị dùng cho phương pháp phổ
khối, cho ra phổ khối lượng của một mẫu, để

tìm ra thành phần của nó.
•
Có thể ion hóa mẫu và tách các ion của nó
với các khối lượng khác nhau và lưu lại thông
tin dựa vào việc đo đạc cường độ dòng ion
. Một khối phổ kế thông thường gồm 3 phần:
•
phần nguồn ion
•
phần phân tích khối lượng
•
phần đo đạc.
Cấu tạo:
•
Máy gồm một đĩa đựng mẫu, máy bắn laser,
một ống tròn đảo chiều điện cực liên tục và
detector.
•
Bất kỳ máy khối phổ nào cũng có bốn khối
chức năng sau đây:
•
Hệ thống nạp mẫu
•
Buồng ion hoá
•
Bộ phân tích
•
Bộ ghi tín hiệu
Dựa vào bộ phận phân tích mà người ta chia các

loại máy khối phổ như sau:
•
Bộ phận tích từ.
•
Bộ phận tích tứ cực.
•
Bộ phận tích theo thời gian
•
Bộ phận tích cộng hưởng ion cyclotron.
Theo tính năng bộ ghi, người ta chia các máy
khối phổ thành hai loại:
•
Máy khối phổ ký ghi bằng kính ảnh.
Tín hiệu phổ được ghi bằng kính ảnh ở
dạng vạch có độ đen khác nhau.
•
Máy khối phổ kế: các tín hiệu của chùm
ion được ghi dưới dạng xung điện bằng
các dao động ký điện tử nhiều kênh,
hoặc đưa vào máy tính điện tử,tín hiệu
sẽ được đưa ra dưới dạng bảng số hoặc
đồ thị thích hợp.
Ngày nay trong phân tích khối phổ người
ta dùng các máy khối phổ kế.
nguyên lý hoạt động của máy khối phổ
•
Mẫu chất cần phân tích sẽ được chuyển thành
trạng thái hơi, sau đó mới bắt đầu quá trình
đo khối phổ
•

Để đo được đặc tính của các phân tử cụ thể,
máy khối phổ sẽ chuyển chúng thành các
ion,kiểm soát chuyển động của chúng bởi các
điện từ trường bên ngoài
•
quá trình được thực hiện trong môi trường
chân không
•
Trong khi áp suất khí quyển vào khoảng 760
mmHg, áp suất môi trường xử lý ion thường từ
10
-5
đến 10
-8
mmHg (thấp hơn một phần tỉ của áp
suất khí quyển).
•
Ion sau khi được tạo thành sẽ được phân tách
bằng cách gia tốc và tập trung chúng thành một
dòng tia mà sau đó sẽ bị uốn cong bởi một từ
trường ngoài.
•
Các ion sau đó sẽ được thu nhận bằng đầu dò
điện tử và thông tin tạo ra sẽ được phân tích và
lưu trữ trong một máy vi tính.
Ứng dụng của máy khối phổ trong phân tích
protein
•
protein được tinh chế rồi cắt bằng enzyme

pepsin . Enzyme pepsin cắt polypeptide tại
những điểm nhất định trên chuỗi (giống
enzyme giới hạn ở acid nucleic).
•
Ta có thể dự đoán được các mảnh
(fragments) polypeptide sau khi bị cắt
• Đưa mẫu đã xử lý pepsin vào đĩa và cho máy
chạy. Laser ion hoá các fragments làm cho chúng
tích điện dương và bật ra bay vào ống.
•
Ống này có chiều dài nhất định, 4 phía gắn 2 loại
điện cực (+) và (-)
•
ống có thể xoay tròn, do đó các cực điện đổi chiều
liên tục làm cho các mảnh polypeptide không bám
được vào thành mà bay theo chiều xoắn ốc
•
Vận tốc bay của 1fragment phụ thuộc 2 yếu tố
•
điện tích (z)
•
khối lượng (m)
•
Máy khối phổ đo được thời gian, biết trước
quãng đường => tính được vận tốc => xác
định được chỉ số m/z của fragment.
•
Các tín hiệu được phát hiện bởi detector và
khuếch đại, cuối cùng biểu diễn trên đồ thị ở
dạng các đỉnh (peak). Mỗi đỉnh tương ứng 1

fragment.
•
Với máy MS/MS (tandem MS) thì đây mới là
lần MS thứ nhất, cho phép hiển thị các
fragment của một polypeptide bị cắt bằng
pepsin. Lần MS thứ 2 cho phép khẳng định
chắc chắn 1 fragment nhất định nhờ hệ thống
lọc.
Figure : Schematic of a MALDI-TOF Mass Spectrometer
Phân tích kết quả:
•
Vì protein bao gồm 20 amino acid có khối
lượng khác nhau do đó khối lượng của một
trình tự đủ nhỏ cũng nói lên được trình tự của
nó. (Giả sử Valin có khối lượng là 3,
methionin là 5 thì một fragment có khối
lượng là 8 sẽ có trình tự Valin – Methionin
hoặc Methionin – Valin).
Sự kết hợp các phương pháp sinh học
phân tử khác_ ứng dụng
Khối phổ kết hợp với sắc kí khí(Gas
Chromatography Mass Spectometry)
•
Phương pháp Sắc ký khí kết hợp với Khối
phổ(viết tắt là GC-MS hoặc GCMS) là một
phương pháp mạnh mẽ với độ nhạy cao được
sử dụng trong các nghiên cứu về thành phần
các chất trong không khí.
•
Bản chất GC-MS là sự kết hợp của Sắc ký khí

(Gas Chromatography) và Khối phổ (Mass
Spectometry). Ngưỡng phát hiện của phương
pháp này là 1 picogram (0.000000000001
gram).
Cấu tạo của GC-MS
–
Sắc ký khí (GC): phân tách hỗn hợp hóa chất
thành một mạch theo từng chất tinh khiết
–
Khối phổ (MS): ) xác định định tính và định
lượng