Đề cương Kĩ thuật di truyền

Câu 1: : Hãy trình bày khái niệm,cách gọi tên, các kiểu cắt và ứng dụng của enzym giới hạn
*Enzim cắt g/hạn (RE) : là enzim nhận biết trình tự ADN đ/trưng & cắt tại đó lần đtiên đc fát hiện
-Cách gọi tên:
+ Chữ viết hoa đtiên là tên ? giống VK mà RE đc tách chiết
+ 2 chữ kế tiếp ko viết hoa là tên Loài ? VK nói trên
+ Tiếp theo là 1 chữ số la .mã để chỉ TTự nhóm RE (sdụng ʘ T/hợp nhiều RE cùng tìm thấy ở 1 loài
VK)
+ Đôi khi còn thêm 1 chữ viết hoa trước số la mã để chỉ dòng VK
VD: BamHI : enzim đtiên đc tách chiết từ VK Bacillus(giống) , amyloliquèaciens(loài) , dòng H
-Cơ chế hđộng: có 2 kiểu cắt:
+ Cắt tạo đầu bằng: Các RE cắt 2 mạch của ADN tại cùng 1 điểm
VD: HeaIII
5’…….GGCC…… 3’
3’…….CCGG…… 5’



5’… GG CC……3’
3’… CC GG……5’
+ Cắt tạo đầu so le : các RE có vtrí cắt lệch nhau / 2 mạch. ʘ TH này các đầu dính bsung có thể bắt
cặp trở lại
VD: EcoRI
5’……GAATTG……3’
3’……CTTAAC…….5’

5’… G AATTG….3’
3’… CTTAA C….5’
-ƯD:
+ Kiểm tra điểm cắt của RE trong đoạn gen cần phân đoạn
+ Kiểm tra điểm cắt của RE trên vector
+ Thiết kế điểm cắt của RE vào mồi xuôi và ngược
+ Người ta thường bổ sung TT: GGGAATTC vào để khi có sự đứt gãy của nu nào đó thì điểm cắt đc BV
CCCTTAAG











Câu 2: Đặc điểm của vector tách dòng, kể tên 1 số vector tách dòng thường dùng
 Đặc điểm của vector tách dòng
- Vector phải có 1 vùng nhận biết với 1 enzym giới hạn loại II. Vùng này sẽ là vùng cài 1 DNA
đã được xử lý bởi cùng enzym giới hạn.
- Mang gen chỉ thị để dễ dàng chọn lọc (Lac2 và gen kháng kháng sinh)
- Vector phải tồn tại trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ và ít gây xáo trộn trong tế bào chủ.
- Vector phải có kích thước càng nhỏ càng tốt để thu nhận lượng DNA tối đa
- Vector phải có khả năng tự sao chép tích cực trong tế bào chủ, ko phụ thuộc vào sự sao chép bộ
gen của tế bào chủ.
- Đảm bảo sự di truyền bền vững của 1 DNA tái tổ hợp
- Có trình tự điều hòa tạo điều kiện thuân lợi cho việc phiên mã của gen được đưa.

- Khả năng biến nạp lớn và dễ biến nạp vào tế bào chủ
- Dễ theo dõi sự biểu hiện của gen tái tổ hợp, yêu cầu này là cần thiết cho việc phát hiện dòng cần
tìm.
- Tinh chế dễ dàng với khối lượng lớn bản sao của gen gắn vào vector
 Một số vector tách dòng thường dùng:
- Dựa vào nguồn gốc người ta chia vector tách dòng thành 3 nhóm:
+ Các vector là những plasmid
+Các vector là phage
+ Các vector nhân tạo
- Plasmid thế hệ 2: pBR332 có kích thước 4363bp và 2 gen kháng thuốc, 1 kháng được
compicilline (ampR) và 1 kháng đượcp tetracglline (tetR).
Có số lượng bản sao lớn, thực nghiệm cho thấy , cứ 15 plasmid tái tổ hợp được biến nạp trong
E.coli. Số lượng này có thể tăng lên từ 1000 đến 3000 bản sao trong điều kiện nuôi cấy tốt.
- Các plasmid thế hệ thứ 3: Gồm 3 nhóm lớn
+ Dãy pUC: là plasmid của University California, có kích thước 2,6kb. Có 2 Operon Lac 2, các
VK chủ yếu sử dụng các pUC dùng để tổng hợp enzym β – galactosidase có vùng polylenker với 13
vùng giới hạn của 13 enzym cắt hạn chế.
+ Plasmid pGEM : kích thước khoảng 3kb, mang gen kkhangs ampicilline(Amp) và vùng
polylinker. Gồm 13 trình tự nhận biết bởi 13 enzym cắt hạn chế. Hai promoter đặc trưng cho RNA –
plymerase sp6 và T7 ở 2 bên vùng polylinker. Vì vậy có ưu điểm là co phép phiên mã đoạn DNA gắn
trong vector thành nhiều RNA mà các RNA này thường được dùng làm mẫu dò hoặc dùng trong
nghiên cứu cấu trúc, chức năng của RNA.
- Nhóm các plasmid Bluescript: Kích thước khoảng gần 3kb, có 2 promotor là T7 và T3 ở 2 bên
vùng polylinker. Có ưu điểm là mạnh, hay dùng, sản xuất RNA
+Các vector M13: là phage thể sợi, xâm nhiễm đặc trưng E.coli DNA của phage mạch đơn, có
kích thước 6,4 kb . Trong đó có khoảng 10 gen.
+ Các cosmid: là những vector lai nhân tạo từ 1 plasmid với các trình tự cos của phage  . Các
trình tự cos này điều khiển sự đóng góc DNA tái tổ hợp vào đầu của phage, kích thước của cosmid
 5 kb có thể nhận được đoạn cài 35 – 45 kb có thể tới 47kb

- YAC: là các vector tạo dòng mạch thẳng dựa trên cấu trúc NST tự nhiên của nấm men. Có thể
được cắt thành 2 đoạn hoặc 2 nhánh NST để nhận các đoạn rất lớn có kích thước lên đến 2000
kb.
- BAC: Hệ thống NST nhân tạo của VK dựa trên cơ sở plasmid F – factor. Nó có thể tái bản
trong E.coli với các đoạn chèn có kích thước lên đến 300kb. Thể tái tổ hợp BAC được biến nạp
vào trong TB VK bằng xung điện.
Các BAC thuận lợi cho việc xây dựng thư viện, lập bản đồ, phân tích genome.
Câu 3: Giải pháp tách dòng nào tốt nhất? Vì sao?
- Không có giải pháp tách dòng nào tối ưu, tùy thuộc vào mục đích thí nghiệm mà ta chọn giải
pháp tách dòng phù hợp.
+ Nếu phục vụ cho việc chuyển gen: sử dụng giải pháp tách dòng từ mRNA
+Nếu muốn xác định trình tự intron, vùng điều khiển, các trình tự lặp lại
 Tách dòng từ mRNA
- Ưu điểm: mRNA chứa đựng thông tin DT đặc hiệu cho kiểu TB chứa nó
+ Nếu gen nghiên cứu hoạt động mạnh thể hiện ở hàm lượng mRNA sẽ giúp cho việc tách dòng
dễ dàng hơn.
+ mRNA không chứa các intron
- Nhược điểm: mRNA ko đại diện cho toàn bộ hệ gen của đối tượng
- Các bước tách dòng từ mRNA
B1: Tách RNA, tổng hợp cDNA từ mRNA, nhân gen
- Sử dụng enzym phiên mã ngược nhờ kĩ thuật nuclease S1
- Sử dụng kĩ thuật Gubler – Hoffman

B2: Gắn cDNA vào vector
- Ghép nối đầu bằng
- Dùng linker hoặc adapter
- Tạo đuôi homopolymer
B3: Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào vật chủ
- Các loại tế bào vật chủ E.coli, nấm men, tảo…
- Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vật chủ, hóa biến nạp; và điện biến nạp
 Các bước tách dòng từ DNA
B1: tách DNA, nhân gen
B2: Gắn cDNA vào vector
- Ghép nối đầu bằng
- Dùng linker hoặc adapter
- Tạo đuôi homoppolymer
B3: Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào vật chủ
- Các loại Tb vật chủ: E.coli, nấm men, tảo.
- Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào TB vật chủ: hóa biến nạp và điện biến nạp.











Câu 4: Đặc điểm của plasmid và ứng dụng của nó trong KTDT. Cách gọi tên plasmid nhân tạo.
 Đặc điểm của plasmid:
- Plasmid là những DNA nhỏ, ngắn, dạng vòng khép kín, sợi đôi, nằm ngoài NST được tìm thấy

đầu tiên trong TB 1 số VK.
- Chúng sao chép được là nhờ 1 số enzym có mặt trong TB VK và ko phụ thuộc vào sự sao chép
của VK.
- Một số plasmid chỉ có 1 bản sao duy nhất vì chúng tự tái bản chỉ 1 lần trong mỗi lần phân bào.
Một số khác có số bản sao lớn vì chúng tái bản được nhiều lần trong mỗi chu kì phân bào.
- Mỗi plasmid đều có 1 chuỗi mã DT mang chức năng tự tái bản DNA. Nếu ko có vị trí khởi đầu
phiên mã (ori) này. DNA ko thể tự tái lập trong tế bào chủ.
+Với tính chất tự tái bản, plasmid là 1 vector tạo dòng DNA cần thiết. Do kích thước nhỏ nên
plasmid chỉ chứa rất ít gen chọn lọc thường đặc tính chọn lọc là kháng kháng sinh.
+ Từ kkhi được phát hiện đến nay, các plasmid ko ngừng được cải tiến và ngày càng được có
thêm nhiều đặc tính quý cho việc tạo dòng.
- Ưu điểm:
+ plasmid được sử dụng để nhân bản hoặc biểu hiện các gen cần quan tâm
+ Sản xuất
 Ứng dụng: Tạo vetor tách dòng, vector chuyển gen, vector biểu hiện gen
 Cách gọi tên plasmid nhân tạo:
VD:pBR322 ( B- Bolivar , R – Rodriguez)
Trong đó: - p: viết thường (plasmid)
-1,2,3 chữ kép chỉ tên tác giả, tên VK chứa plasmid viết hoa
-STT chỉ chủng VK
Câu 5: Nêu các phương pháp thường dùng để đưa DNA vào tế bào chủ?
- Có 2 phương pháp thường dùng để đưa DNA vào tế bào chủ là: Phương pháp điện biến nạp,
hóa biến nạp.
 Điện biến nạp:
- Nguyên tắc: sử dụng dòng điện cao thế cục bộ theo xung để tạo lỗ nhỏ trên màng SH của tế bào,
tạo điều kiện cho tế bào hấp thụ DNA tái tổ hợp được dễ dàng.
- Hiệu suất:
Từ 10
9
– 10

10
TB biến nạp cho 1 mg DNA tái tổ hợp, tuy nhiên lượng TB biến nạp bị chết nhiều
có khi lên đến 70%
Hiệu suất của phương pháp này phụ thuộc vào các yếu tố sau:
+Độ mạnh của điện trường tác động khác nhau đối với các loại TB khác nhau.
+ Độ dài của hệ số thời gian (thời gian ngắt xung – ms)
+ Nồng độ tế bào chủ
+ Nồng độ DNA tái tổ hợp
+ Giai đoạn phát triển của TB (TB quá già hoặc quá non đều ko thích hợp)
+ Môi trường dung dịch đệm
+ Cấu trúc màng TB








 Hóa biến nạp:
- Hiện tượng biến nạp là chìa khóa giúp ta hiểu biết cơ sở phân tử của gen, cũng là công cụ để
thực hiện các thao tác tạo tính DT của vật sống
- Theo Menđen và Higa cho thấy rằng: E.coli trở nên rất dễ dàng biến nạp bởi DNA ngoại lai khi
các TB VK được xử lý trong MT có CaCl
2
và trước đó được sốc nhiệt ở 42
o
C
- Hóa biến nạp là phương pháp sử dụng chất hóa học, tạo điều kiện để đưa vector tái tổ hợp vào
TB chủ.

- Qúa trình thực hiện gồm 2 bước:
+ Xử lý TB chủ trong dung dịch CaCl
2
ở nhiệt độ thấp nhằm để thay đổi màng TB và ủ vector
tái tổ hợp với TB chủ đã xử lý
Hiệu suất của phương pháp hóa biến nạp này vào khoảng 10
5
-10
6
tế bào biến nạp trên 1 mg
DNA tái tổ hợp
Các TB phát triển ở pha sớm đến pha giữa dễ đc biến nạp hơn
Việc xử lý TB bằng các ion KL hóa trị 2 như Mg
2+
, Mn
2+
, và Ba
2+
cũng có khả năng biến
nạp lớn
Hiệu suất biến nạp còn phụ thc vào kích thc của plasmid, plasmid càng nhỏ thì hiệu suất biến
nạp càng cao, sd chất hóa học, tạo ĐK để đưa DNA tái tổ hợp vào TB.
Câu 6: Trình bày phương pháp để phân tích gen tách dòng
Có 3 phương pháp :
- Lai phân tử
- Xác định TT gen: phương pháp hóa học của Maxam Gilbert , PP ezym sử dụng các
dideoxionucleotid, PP xác định TT nu bằng máy tự động
- PP PCR
 Lai phân tử: để phân tích genl tách dòng, có thể dùng những PP lai phân tử sau: Southern Blot ,
Northerm blot

+ PP thường dùng nhất là PP Southern blot bao gồm các bước:
-Tách DNA bộ gen của TB
-SD enzym cắt giới hạn để cắt phân tử DNA thành những đoạn nhỏ
-Điện di trên gel Agarose để tách những đoạn có kích thước khác nhau
-Gây biến tính DNA trên gel bằng dd NaOH 0,5M
-Chuyển DNA từ gel lên màng lai
-Tiến hành lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ ở nhiệt độ là 65
o
C, thời gian lai khoảng 3 -8h.
Rửa màng lai để loại bỏ những mẫu dò ko bắt cặp chuyên biệt với DNA cố định trên màng lai
-Chụp và ktra phóng xạ tự ghi
 Phân tích bằng xác định TT nu:
+ PP hóa học của Maxam Gilbert :
- Nguyên tắc : dựa trên PƯHH thủy giải đặc hiệu, các DNA ko tự xoắn lại với nhau, tạo thành tập
hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau.









- Kết quả: các PUHH xử lý mạch DNA đc phát hiện bằng điện di trên gel polyacrylamid có thể
xác định đc TT mạch đơn
- Ưu điểm: dễ tiến hành, chi phí thấp
- Nhc điểm: Độ chính xác ko cao, phải thực hiện nhiều lần và loại bỏ các sai sót để kết quả gần
đúng nhất.
Ko đưa đc vào tự động hóa

+ PP enzym SD các dideoxinucleotid của Sanger
- Dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho TT cần XĐ nhờ hoạt động của E DNA polymerase. Với
việc SD thêm các dideoxinucletid (dd NTP) với các deoxinucleoxit (dNTP) thông thường, kết
quả tổng hợp cũng là sự hình thành 1 tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thc khác nhau.
- KQ: PƯ tổng hợp nên các đoạn Olygonucleotid dài ngắn khác nhau 1 nu và đc nhận biết nhờ PP
điện di.
- Ưđ: các bc tiến hành đơn giản có độ chính xác cao, là cơ sở của các máy giải TT gen
- Nhc đ: chỉ đọc đc 1 đoạn TT ngắn, chính xác khoảng 800 nu
+ PP xđ TT nu bằng máy tự động:
- Trong kthuật này ko đánh dấu bằng các đồng vị phóng xạ mà bằng hóa chất tạo màu (các
fluochrome). Mỗi loại dd NTP đc đánh dấu bằng 1 fluochrome có màu khác nhau.
- Tất cả các Olygonucleotid cùng chấm tại 1 loại dd NTP sẽ có cùng 1 mã.
- Sau khi điện di trên gel Polyacramid, KQ sẽ đc xử lý qua 1 hệ thống vi tính.
 KT PCR:
- Nguyên lý hoạt động: PP PCR (PƯ tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase). Do Karl Mullis và
cộng sự phát minh năm 1985. Đây là PP đc SD rộng rãi để nhân gen. Thực chất đây là sự tạo
dòng invitro ko cần sự hiện diện của TB nhằm mục đích thu nhận 1 số lượng lớn bản sao của 1
TT xác định
- PCR đc thực hiện khi có DNA mẫu , các đoạn mồi chuyên biệt, Taq plymerase, 4 loại
deoxiribonucleotid triphotphat (dNTP, dGTP , dTTP, dCTP), dd đệm và ion Mg
2+

- Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp 1 mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần
sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Đó là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ
sung với 1 đầu của mạch khuôn, DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới
- Có thể dùng mồi nhân gen, mồi PUC 18 hoặc M13 có sẵn trên vector tách dòng để ktra sản
phẩm
+ PUC 18 kết thúc gen sau điện di hơn 1100 nu
+ Mỗi PUC hay M13 thiết kế chung cho mọi vector.
Câu 7: Ngân hàng hệ gen là gì? Trình bày các bước thiết lập ngân hang hệ gen và ngân hàng

cDNA?
TRẢ LỜI:
(*) Khái niệm ngân hàng hệ gen là:
àoNgân hàng hệ gen của một sinh vật là tập hợp các trình tự DNA cấu thành bộ gen được gắn vào
vector ,nó chỉ biểu diễn tổng số của gen. Ngân hàng này được tạo ra từ một bộ sưu tập DNA tái tổ hợp
cả các chuỗi mã hóa lẫn các chuỗi k mã hóa. Khác với ngân hàng cDNA, ngân hàng bộ gen có thể được
thiết lập bất kỳ loại tb nào of sv nghiên cứu.










(*) Các bước thiết lập ngân hàng hệ gen là:
- Tách và làm sạch DNA of sv
- Cắt DNA thành những đoạn có kích thước xác định = enzyme RE loại II- thông thường, người ta sử
dụng EcoRI
- Vector dk chọn để tạo dòng gen thường là cosmid hoặc phage λ cũng dk xử lý bởi EcoRI
- Tạo vector tái tổ hợp và đóng gói trong vỏ phage
- Đưa vector tái hợp và tế bào chủ và tạo dòng
- Xác định đặc tính và biểu hiện của dòng vi khuẩn vừa lập
- Tiến hành sang lọc, nghĩa là phải tách những vector nào có đoạn DNA ưa chuộng, từ đó xây dựng
ngân hàng bộ gen
(*) Ngân hàng cDNA
- Thiết kế ngân hàng cDNA: Ngân hàng cDNA là tập hợp các bản sao cDNA từ tất cả các mRNA của
một tế bào . Như vậy, ngân hàng dk thiết lập từ một loại tb xác định (tb biệt hóa), vì thế cDNA mang

tính tế bào rất cao.
Quá trình chuẩn bị ngân hàng cDNA bao gồm các bước:
+ Tách RNA tổng số, ta phải chọn những tb chứa nhiều mRNA cần thiết và sau đó làm sạch mRNA
Tách mRNA = cách tách trên 1 celulose oligo dT
+ Tổng hợp cDNA sợi lép từ mRNA dưới tác dunhj của enzyme phiên mã ngược nhờ kỹ thuật nuclease
S1 or kỹ thuật Gubler- Hoffman
+ Methyl hóa các vùng hạn chế (có trong đoạn cDNA sợi đôi)dk nhận biết bởi enzyme EcoRI để bảo
vệ vùng này k bị cắt khi thao tác với EcoRI
+ Tạo đầu dính bằng cách sử dụng đoạn nối linker có chứa trình tự nhận biết bởi EcoRI. Trong trường
hợp này, chỉ có đoạn nối bị cắt còn cDNA vẫn còn nguyên vẹn (do dk methyl hóa). Đưa cDNA vào
vector tạo DNA tái tổ hợp
+ Ghép cDNA đầu dính vào vector thích hợp đã được mở bởi EcoRI & đã khử nhóm photphat.
+ Hàn kín mạch nhờ enzyme phosphoryl hóa và enzyme ligara để tạo vector tái tổ hợp
+ Đưa vector tái tổ hợp vào tb chủ và nuôi cấy trong điều kiện thích hợp để tạo dòng
+ Xác định dòng cần tìm và thành lập ngân hàng cDNA

Câu 8:Trình bày phương pháp tách dòng từ mARN
Phương pháp tách dòng từ mARN gồn có 3 bước
Bước 1: Tổng hợp cDNA
- Sử dụng enzyme phiên mã ngược nhờ kỹ thuật nuclease S1
- Sử dụng kỹ thuật Gubler-Hoffman
Bước 2: Gắn cDNA vào vector
- Ghép nối đầu bằng
- Dùng linker hoặc adapter
- Tạo đuôi homopolymer
Bước 3: Đưa vector tái tổ hợp vào tb vật chủ
- Các tế bào vật chủ
- Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tb

CÁC TẾ BÀO VẬT CHỦ
- Vật chủ nhân sơ: thường sử dụng là vi khuẩn E.coli
Ưu điểm của E.coli: Sinh sản nhanh, dễ nuôi cấy và nhân giống, dễ chấp nhận nhiều loại vector.
Ngoài ra còn sử dụng một số loại vk như: Bạillus, Pseudomonas, Streptomyes
- VẬt chủ nhân chuẩn: Gồm các tb nấm men , động vật, thực vật : tảo
Ưu điểm của nấm men : dễ nhân giống, có rất nhiều loại tb đột biến
PHƯƠNG PHÁO BIẾN NẠP VECTOR TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO VẬT CHỦ
a. Điện biến nạp
Nguyên tắc: sd dòng điện cao thế cục bộ theo xung để tạo lỗ nhỏ trên màng sinh học of tb, tạo dk cho
tb hấp thụ DNA tái tổ hợp dk dễ dàng.
Hiệu suất: Từ 10
9
đến 10
10
tb biến nạp cho 1mg DNA tái tổ hợp, tuy nhiên, lượng tb biến nạp
bị chết nhiều có khi lên tới 70%. Hiệu suất của phương pháp này phụ thuộc vào các yếu tố sau:
- Độ mạnh của điện trường tác động khác nhau đối vs các loại tb khác mhau
- Độ dài của hằng số thời gian (thời gian ngắt xung – ms) . Theo nhiều nghiên cứu, hầu hết đối vs các
loại tb sv, hiệu quả biến nạp cao khi hằng số thời gian đạt dk khoảng 6ms
- Nồng độ tb chủ
- Giai đoạn phát triển của tb (tb quá già hoặc quá non đều k thích hợp)
- Môi trường dung dịch đệm
- Cấu trúc màng tb
b. Hóa biến nạp
Hiện tg biến nạp là chìa khóa giúp ta hiểu biết cs phân tử of gen, cũng là công cu để thực hiện
các thao tác tạo tính di truyền của vật sống, Theo Mandel và Higa chho thấy rằng, E.coli trở nên rất dễ

bị biến nạp bởi DNA ngoại lai khi các tb vk đc xử lí trong mtrg có CaCl
2
và trước đo đc sốc nhiệt ở
42
0
C
Hóa biến nạp là pp sd chất hóa học, tạo dk để đưa vector tái tổ hợp vào tb vật chủ. Quá trình
được thực hiện theo 2 bước: Xử lí tb vật chủ trong dd CaCl
2
ở nhiệt độ thấp nhằm để thay đổi màng tb
và ủ vector tái tổ hợp vs tb chủ đã xử lí
Hiệu suất của pp hóa biến nạp này vào khoảng 10
5
đến 10
6
tb biến nạp trên 1mg DNA tái tổ
hợp. Qua các kết quả thực nghiệm, ng ta thấy rằng, các tb phát triển ở pha sớm đến pha giữa dễ dk
biến nạp hơn. Những nghiên cứu sau này cho thấy việc xử lí tb = các ion kim loại hóa trị 2 như Mg
2+
,
Mn
2+
và Ba
2+ cũng
có kn biến nạp lớn. Noni ra, hiệu suất biến nạp còn phụ thuộc vào kích thước của
plasmid, plasmid càng nhỏ thì hiệu suất biến nạp càng cao. Sử dụng chất hóa học, tạo dk để đưa DNA
tái tổ hợp vào tb
Câu 9: TB các PP chọn lọc các dòng DNA tái tổ hợp
- CL là chọn ra dòng tái tổ hợp mong muốn duy nhất ở trong rất nhiều các dòng khác.
- CL là khi có 1 nhân tố CL nào đó đc SD trong quá trình sinh trưởng của các TB chủ có chứa

DNA tái tổ hợp.
1. SD các cơ chất sinh màu
- SD cơ chất ko màu dùng cho β- galactosidase là X- gal.











- Cơ chế:
+ SD vector mang 1 phần gen lacZ, gen này mã hóa cho β- galactosidase
+ Trong MT có lactose (hoặc IPTG) thì enzym này sẽ đc tổng hợp bởi các TB E.coli
+ Nếu β- galactosidase đc tổng hợp sẽ chuyển X-gal thành màu xanh
+ Nếu DNA lạ xen vào gen lacZ thì β- galactosidase ko đc tổng hợp nên X-gal sẽ ko bị phân
giải, tạo khuẩn lạc có màu trắng.
- Khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp sẽ là những khuẩn lạc có màu trắng. Hệ thống phát hiện X-gal
có thể diễn ra theo 2 cách:
+ 1 gen β- galactosidase nguyên gốc (lacZ) có thể có mặt trong vector
+ Dùng 1 hệ thống bổ trợ mà ở đó 1 phần của gen lacZ có mặt trong vector và phần còn lại thì
có mặt trong TB chủ.
2. Bất hoạt bằng đoạn xen
- KN: Sự có mặt của các đoạn DNA đã tách dòng có thể phát hiện đc nếu đoạn xen xen vào TT
mã hóa của gen
- 3 KT sd PP này:
+ Gắn đoạn DNA cần nhân lên vào giữa 1 trong 2 gen kháng kháng sinh

+ Đưa hỗn hợp đó vào TB vật chủ
+ Nuôi hỗn hợp trong MT chọn lọc và chứa chất kháng sinh ko bị xen.
+ Từ đó CL dòng VK tái tổ hợp và chứa vector tự đóng vòng.
- CL dòng VK tái tổ hợp lại nuôi trên MT mà TB vật chủ chứa vector tái tổ hợp ko có khả năng
kháng
- SD cơ chất X-gal
Phương pháp này sd vector thế hệ 3 hoặc các vector khác mang gen lacZ
+ Gắn đoạn DNA vào giữa gen lacZ
+ Đưa hỗn hợp đó vào TB vật chủ
+ Nuôi hỗn hợp đó trên MT chọn lọc có CKS và 1 cơ chất hoạt hóa cho lacZ hoạt động X –gal.
- SD hình thái vết tan
+ Xen vào gen cI có trong phage, chủ yếu ở phage . Gen cI mã hóa chất ức chế cI là chất quy
định sự hình thành lysogen.
+ Nếu xen đoạn DNA cần tạo dòng vào bên trong gen cI thì gen cI sẽ bất hoạt do đó vết tan của
phage sẽ trong suốt, nếu vết tan màu đục là các dạng ko tái tổ hợp.
3. Phép thử bổ trợ với các đột biến xác định
- Phương pháp này dc SD khi các TB mang ĐB đặc thù, DNA tách dòng cung cấp 1 chức năng
mà thể ĐB ko có.
- Yêu cầu của PP:
+ Phải có nòi ĐB khuyết chức năng tại 1 gen cụ thể
+ Phải có MT chọn lọc thích hợp để thể tái tổ hợp có thể mọc đc
+ Đoạn xenn nghiên cứu phải biểu hiện trong TB vật chủ cho sản phẩm hoạt động chức năng bổ
trợ với ĐB.
+ PP này chủ yếu SD để chọn lọc các gen quy định enzym.

Câu 10: Trình bày PP tách dòng từ DNA




- B1: Chuẩn bị gen tách dòng và vector tách dòng, nhân gen bằng PCR – tách chiết DNA bộ gen,
nhân gen bằng PCR, SD enzym giới hạn cắt thành các đoạn nhỏ DNA, điện di trên gel agarose
(hoặc gel polyacrylamid) với thang DNA chuẩn.
+ Từ KQ điện di, dựa vào kích thước của gen cần tách dòng để lựa chọn đc DNA cần tách dòng
+ Vector tách dòng: SD plasmid, phage hoặc NST nhân tạo… tùy thuộc vào kích thước của gen
cần tách dòng và mục đích tách dòng.
- B2: Gắn DNA vào vector tạo vector tái tổ hợp
+ SD enzym giới hạn thích hợp cắt các gen cần tách dòng và vector tách dòng ở những vị trí đặc
hiệu giống nhau
+ Có 3 cách:
@ Ghép nối đầu bằng : SD các enzym nối DNA ligase : hiệu quả ko cao.
@ Dùng linker hoặc adapter : gắn thêm các linker hoặc adapter có TT nhận biết của cùng 1
enzym giới hạn vào các đoạn DNA cần tách dòng để tạo ra đầu dinh, có bổ sung thêm ligase
DNA
@ Tạo đuôi homopolymer: dùng enzym terminal tranferase để gắn cùng 1 loại nu vào đoạn
DNA cần tách dòng.
 Nếu có các đầu dính sẵn : khi bổ sung DNA cần tách dòng vào vector thì chúng tự nối lại
với nhau nhờ các TT bổ sung.

- B3: Đưa vector tái tổ hợp vào TB chủ
+ Chọn TB phù hợp: E.coli, nấm men, tảo.
+ PP biến nạp: hóa biến nạp, điện biến nạp.
Câu 11: Plasmid là gì? Vì sao ng ta chọn plasmid làm vector tách dòng.nêu ưu điểm của vector
plasmid thế hệ thứ 3
TRẢ LỜI
*) Plasmid là : Các plasmid là những DNA nhỏ, ngắn (2-5kb), dạng vòng (khép kín), sợi đôi nằm ngoài
NST, đc tìm thấy đầu tiên trong tb một số vk, nhỏ so với NST của tb vật chủ
. Chúng sao chép đc là nhờ một số enzyme có mặt trong tb vk và k phụ thuộc vào sự sao chép của vk.
Một số plasmid chỉ có 1 bản sao duy nhất vì chúng tự tái bản chỉ một lần trong mỗi lần phân bào. Một
số khác có số bản sao lớn vì chúng tái bản đc nhiều lần trong mỗi lần phân bào. Những plasmid có từ
10 đến 100 bản sao trong tế bào chủ đc coi như plasmid có banr sao cao. Plasmid khác có từ 1 đến 4
bản sao trong tb chủ, đc xếp vào nhóm có bản sao thấp.
Mỗi plasmid đều có 1 chuỗi mã di truyền mang chức năng tự tái bản DNA. Nếu k có vị trí khởi
đầu phiên mã này, DNA k thể tự tái lập trong tb chủ. Với tính chất tự tái bản, plasmid là một vector tạo
dòng DNA cần thiết. Do kích thước nhỏ nên plasmid chỉ chứa ít gen chọn lọc, thường đặc tính chọn lọc
là kháng sinh. Từ khi đc phát hiện đến nay, các plasmid k ngừng đc cải tiến và ngày càng đc có them
nhiều đặc tính quý cho việc tạo dòng.
Trong phòng thí nghiệm, ng ta sd các plasmid nhân tạo mà đc tạo ra từ các plasmid tự nhiên và
cài them một số chuỗi DNA
*) Nguyên nhân người ta thường sử dụng plasmid lm vector tách dòng và ưu điểm của nó là:
+ Với tính chất tự tái bản, plasmid là 1 vector tách dòng DNA cần thiết
+ Do kích thc nhỏ nên plasmid chỉ chứa rất ít gen chọn lọc, thg đặc tính chọn lọc là kháng kháng sinh
+ Tiện SD cho nhiều loại RE khác nhau với hàng chục TT nhận biết
-
Plasmid thế hệ thứ 3:

-Là các plasmid mạnh và đa năng, tiện SD cho nhiều loại RE khác nhau với hàng chục TT nhận
biết của chúng nối tiếp nhau tạo thành các đoạn dài gọi là polylinker

-Ưu điểm của vector plasmid thế hệ thứ 3 là: phên mã AND thành nhiều ARN:
+ Có kích thc nhỏ, sao chép nhanh trong TB VK
+ Tạo số lượng bản sao lớn
+ Có đặc điểm Origin
+ Có đặc điểm nhận biết RE MSC (Multi cloning sits), vị trí đa tách dòng (polylinker) bằng gen
quy định lên dấu chuẩn chọn lọc.
-
Dấu chuẩn chọn lọc là gen mã hóa enzym β – galactoside. Có chức năng phân hủy X-gal tạo ra
khuẩn lạc màu xanh. Nếu TB vật chủ ko có loại enzym này thì khuẩn lạc màu trắng.

-
Vector plasmid thế hệ 3 còn có 1 gen kháng kháng sinh, có mục đích


Câu 12: TB các PP sàng lọc các dòng DNA tái tổ hợp
- Sàng lọc (Screening): là KT đc dùng khi 1 QT các TB sồng đc phân tích để XĐ các TT mong
muốn. Vì chỉ có 1 phần nhỏ trong số lớn các khuẩn lạc của VK hay các vết tan của phage đem
sàng lọc có mang các đoạn DNA quan tâm nên việc sàng lọc phải có những PP đặc hiệu và độ
nhạy cao.
a) Sàng lọc bằng cách lai axit nu:
- Mẫu dò acid nu : mẫu dò là 1 TT DNA bắt cặp bổ sung với 1 TT DNA đích.Tuy nhiên cũng có
TH sd mẫu dò từ SV thứ 2 để xđ DNA của SV thứ nhất.
- Có 3 loại mẫu dò: cDNA, DNA hệ gen, các Olygonucleotid
 Mẫu dò cDNA: Có thể tạo ra QT và đem sd, ko cần tách dòng các cDNA. KT này thường được SD
dưới tên gọi là PP sàng lọc “cộng/trừ”
+ Nếu dòng ta quan tâm có chứa 1 đoạn chỉ biểu hiện trong những điều kiện xđ thì các mẫu dò có
thể tạo ra từ các QT mRNA của TB biểu hiện gen này và từ các TB ko biểu hiện gen này.

+ Nếu dòng cDNA đã đc xđ thì cDNA có thể sd để sàng lọc thư viện hệ gen và tách chính đoạn TT
gen.
 Mẫu dò DNA hệ gen: Là các đoạn của TT đã tách dòng đc SD như các mẫu dò dị tương đồng hoặc
để XĐ các dòng khác có chứa các phần bổ sung của gen nghiên cứu.
+ Một phần quan trọng của KT này là NST đi và NST nhảy, nó giúp cho việc XĐ các đoạn TT
chìm nhau và sau đó, nếu nối các mẫu lại ta có các mạch DNA đã đc XĐ.
 Mẫu dò Olygonucleotid:
+ Olygonucleotid đc taoj ra bằng cách dùng mã DT để XĐ TT gen tương ứng.
+ Đc sd khi biết TT của 1 số amino acid trong phân tử protein đc mã hóa bởi gen đích.
+ Ưu điểm: Các gen chưa tách dòng vẫn có thể đc xđ TT. Có thể xđ đc các TT tương ứng.
- Sàng lọc các ngân hàng gen dòng:
+ 1 dòng chứa các chuỗi DNA quan tâm đb có thể đc XĐ bởi lai khuẩn lạc hoặc vết tan.
+ Các vector có nguồn gốc virus (bacterio phage) sẽ sinh tan TB bị chúng xâm nhiễm và SX ra
các vết tan.
+ DNA đc tạo dòng trong các vetor có nguồn gốc plasmid hoặc các vector NST nhân tạo
(BAC, YAC) sẽ sản xuất ra các khuẩn lạc.
+ Nguyên lý: SD mẫu dò đã biết TT để sàng lọc nhận biết thể tái tổ hợp mong muốn.
+ PP tiến hành:
-Từ ngân hàng dòng tách chiết bản sao tái tổ hợp của dòng
-Biến tính DNA kép thành dạng đơn tròng dd kiềm
-Chuyển DNA đơn lên màng lai
-BS mẫu dò để tạo phân tử lai
-Lai ở 65 – 68
o
C trong 6 – 12h
-Rửa mang lai bằng dd SSG
-Thấm khô từ 2 – 3 lần
-Chụp phóng xạ tự ghi.
b) Sàng lọc bằng các KT miễn dịch học đối với các gen biểu hiện
- KT này đòi hỏi protein phải biểu hiện ở dạng tái tổ hợp

- SD kháng thể đặc hiệu để sàng lọc.
- Coi protein là 1 kháng nguyên
- PP:
+ Tách protein tái tổ hợp từ TB vật chủ
+ Điện di protein
+ SD kháng thể thứ nhất liên kết với protein tái tổ hợp.
+ SD kháng thể thứ hai liên kết với kháng thể thứ nhất
+ Loại bỏ các TP ko liên kết với protein tái tổ hợp.
+ Quan sát dựa vào sự xuất hiện của KT thứ 2.










c)PP sàng lọc bằng PCR
- Các vector đc thiết kế ở 2 đầu cài vào TT gắn với pUC
- Khi PCR với mồi pUC thì kích thc của băng ddienj di sau khi tách dòng sẽ lớn hơn khoảng
200bp so với DNA đã chèn vào.
- Ưu điểm: -Tốn ít thời gian hơn
-Khảo sát chính xác hơn đặc điểm của các dòng từ thư viện cDNA và genomic DNA.

Cau 13: Nêu các PP gắn đoạn cDNA vào vector
- PP nối đầu bằng:
+ Xử lý, tạo vetor có đầu bằng
+ Nối vào cDNA nhờ enzym ligase

+ Biến nạp vào TB chủ và kiểm tra
- PP nối đầu dính
+ Gắn mồi OligodT có đặc điểm TT nhận biết của enzym giới hạn
+ Đầu 5’ phân tử mRNA đc gắn đặc điểm nhận biết của enzym giới hạn nhờ homopolimer
chứa đặc điểm nhận biết của enzym giới hạn.
+ Xử lý enzym giới hạn đồng thời của cDNA vào vector
+ Nối với cDNA bằng enzym ligase
+ Biến nạp vào TB chủ và kiểm tra
- PP sd linker (Adapter)
+ Linker: - 1 đoạn TT DNA có đặc điểm nhận biết enzym giới hạn gắn linker vào cDNA
-SD đoạn cDNA với vector cùng bởi 1 enzym giới hạn
-Nối các linker với các cDNA nhờ enzym ligase
- PP nối bằng đuôi homopolymer
+ SD enzym terminal transferse để tạo ra đuôi polyG gắn vào vector và tạo đuôi polyC gắn vào
cDNA
+ Gắn cDNA vào vector: - Gắn tạo đầu bằng
-SD enzym giới hạn
-SD đuôi homopolime

-Phương pháp ghép nối đầu bằng:
-Dùng linker (Adapter)








-Tạo đuôi hômpolymer

Câu 14: Nêu các loại tế bào chủ thường dùng trong kĩ thuật di truyền? Vì sao lại chọn chúng làm
tế bào chủ? Các bước cơ bản cơ bản của phương pháp tách dòng?
a) Các tế bào chủ thường dùng là vật chủ nhân sơ và vật chủ nhân chuẩn:
-Vật chủ nhân sơ : thường dùng là VK E.coli
+Chọn chúng làm tế bào chủ do chúng có ưu điểm như : sinh sản nhanh, dễ nuôi cấy và nhân giống,
dễ chấp nhận nhiều loại vector
+Ngoài ra còn sử dụng 1 số VK: Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces.
-Vật chủ nhân chuẩn: Gồm các tế bào nấm men, động vật, thực vật, tảo.
+Ưu điểm: để nhân giống, có rất nhiều loại tế bào đột biến, vì nó là nhân chuẩn nên dễ dàng biểu
hiện đầy đủ các protein của SV nhân chuẩn.
b) Các bước cơ bản của phương pháp tách dòng:
B1: Phân lập các DNA lạ cần tạo dòng:
- Chọn và cắt DNA lạ của TB cho bằng 1 enzym cắt hạn chế (RE), phân lập DNA phù hợp với
vector và mục đích cần tạo dòng.
- Trong trường hợp đặc biệt để tạo dòng 1 gen chưa biết, có thể tổng hợp hóa học đoạn DNA cần
tạo dòng khi dự đoán cấu trúc protein do gen chỉ huy tổng hợp hoặc tổng hợp cDNA từ mRNA.
- Tạo đầu dính khi cần thiết.
B2: Chọn và xử lý vector

Chọn vector cần phải chú ý đến những yêu cầu sau:
- Độ lớn của gen lạ (đoạn cài)
- Loại tế bào chủ tiếp nhận vector và phương pháp ứng dụng
- Xử lý vector: cắt vector bằng RE cùng với loại enzym đã cắt DNA nói trên.
- Khử nhóm photphat bằng enzym alkanline photphatase để tránh 2 đầu vector đóng kín trở lại.
B3: Tạo DNA tái tổ hợp
- Tạo bằng cách ghép DNA lạ vào vector đã được cắt cùng 1 enzym cắt hạn chế loại II. Khi đó
chúng sẽ ghép đôi những đầu dính lại với nhau nhờ bắt cặp bổ sung.
- Một phanr ứng ghép nối xảy ra với sự có mặt của enzym DNA ligase của E.coli hoặc phage T4
hoàn chỉnh phân tử lai.
B4: Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ bằng phương pháp biến nạp hoặc tải nạp
- Mục đích : Sử dụng bệ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp thành 1 số lượng lớn
hơn bản sao, vận chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào VK tức là làm cho VK trở thành khả biến.
- Phụ thuộc vào loại plasmid sử dụng làm vector và sự định vị của vùng cài lắp chứa bên trong
vector mà người nghiên cứu sẽ chọn phương pháp biến nạp hay tải nạp.
- Biến nạp là hiện tượng chuyển VCDT trực tiếp từ tế bào cho D(Doner) sang tế bào nhận
R(Raception), không cần sự tiếp xúc giữa 2 tế bào hoặc nhân tố trung gian là phage và virus.
- Được thực hiện với các vector chuyển gen có nguồn gốc là virus như phage, cosmid.
B5: Phát hiện dòng cần tìm:
- Tiến hành thí nghiệm trong hỗn hợp không đồng nhất nên các dòng VK có thể mọc lên theo 3
khả năng:
+ TB VK ko nhận plasmid tái tổ hợp
+TB nhận plasmid nhưng ko có gen lạ
+ TB nhận được plasmid tái tổ hợp
 Tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà người ta có các phương pháp khác nhau để xác định
dòng cần tìm. Nếu mục đích là nghiên cứu đoạn gen chưa biết, người ta thường dùng đầu dò.
Nếu đoạn DNA đã biết (cDNA), công việc sẽ đơn giản và nhanh chóng.