Nghiên cứu, xác định hàm lượng vitamin D trong nấm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH
VÕ QUỐC OAI
1.1. NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
VITAMIN D TRONG NẤM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60.44.01.18
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Người hướng dẫn khoa học: TS. Mai Thị Thanh Huyền
2
Vinh, 2014
Lêi c¶m ¬n
Luận văn được thực hiện tại phòng thí nghiệm chuyên đề
Hóa phân tích - Khoa Hóa học - trường Đại học Vinh.
Tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới
Trường Đại học Vinh, phòng đào tạo sau đại học, Trung Tâm
Thực Hành thí nghiệm trường Đại học Vinh, trường THPT
Mai Thúc Loan và các đồng nghiệp, nhóm cộng tác nghiên
cứu - phân tích vitamin D trong nấm.
Đặc biệt tác giả gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới
TS. Mai Thị Thanh Huyền đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ
với những chỉ dẫn khoa học quý giá trong suốt quá trình triển
khai, nghiên cứu và hoàn thành đề tài.
Tác giả rất mong nhận được sự đóng góp, phê bình của
quý thầy cô, các nhà khoa học, đọc giả và các bạn đồng nghiệp.
3
MỤC LỤC
VÕ QUỐC OAI 1
Vinh, 2014 2
Hệ thống các kí hiệu viết tắt 4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 7
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 33
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO 67
4
Hệ thống các kí hiệu viết tắt
25(OH)D : 25-hydroxyl vitamin D
25(OH)D
2
: 25-hydroxyl vitamin D
2
25(OH)D
3
: 25-hydroxyl vitamin D
3
BHT : butylate hydroxytoluen.
BSTFA :N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide
DM : Chất khô (dry matter).
ECLIA : Phân tích miễn dịch quang hóa
(electro chemiluminescence immunoassay )
EtOH : Etanol
FTIR : Phép phân tích Fourier hồng ngoại (Fourier
transform infrared)
HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao
IT : Bẫy ion ( Ion trap)
IS :Chất nội chuẩn (internal standard)
LC : Sắc kí lỏng (Liquid chromatography)
MeOH : Metanol
MS : Phổ khối (Mass spectrometry)

MTBE : Methyl-tert-butyl ether.
PFP : Pentafluorophenyl-propyl
RIA : phân tích miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay)
SPE : chiết pha rắn (Solid Phase Extraction)
UPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao
UV : Tia tử ngoại
DAD : Đầu dò mảng diot
RMSE : Độ lệch khởi động (root mean square error).
5
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài.
Vitamin D hay còn gọi là vitamin mặt trời là một loại vitamin khá đặc biệt
so với những loại khác. Vitamin D có vai trò quan trọng với đời sống của con
người, như nó đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển, hoàn thiện, duy trì sự
ổn định của xương, răng, nó tham gia vào điều hòa chức năng của một số gen,
ngoài ra còn tham gia một số chức năng như: bài tiết của insulin, hormon cận
giáp, hệ miễn dịch, phát triển hệ sinh sản và da ở nữ giới. Một số nghiên cứu
mới cho thấy thiếu vitamin D, thai phụ có thể sinh con nhẹ cân, cùng sự tăng
trưởng chậm của trẻ chào đời đủ tháng [14],[22]. Tình trạng thiếu vitamin D
trên thế giới cũng như các nước nhiệt đới rất nghiêm trọng [24]. Theo một số
nghiên cứu tình hình thiếu vitamin D trên thế giới là 40-50%, ở Thái lan và
Malayxia 50%, Nhật và Hàn Quốc 80-90%, nước bắc Âu và bắc Mỹ khoảng
50-70% và 63% ở phụ nữ châu Á. Ở Việt Nam, theo một số nghiên cứu mới
nhất về tình trạng thiếu dinh dưỡng của học sinh tiểu học thì hơn 50% học sinh
tiểu học thiếu hụt vitamin D.
Để nhận đủ vitamin D thì ngoài việc cho cơ thể tiếp xúc với ánh nắng có
lợi cho cơ thể thường xuyên thì cần thiết phải bổ sung thêm nguồn vitamin D
từ nguồn thực phẩm ăn uống hàng ngày. Nấm là là một trong những nguồn
thực phẩm giàu vitamin D
2

và dinh dưỡng có vai trò quan trọng trong xây dựng
khẩu phần vitamin D
2
hàng ngày. Tuy nhiên nguồn nấm trên thị trường rất đa
dạng về chủng loại và nguồn gốc, nhiều loại nấm không rõ nguồn gốc, không
đảm bảo chất lượng tràn lan trên thị trường. Hơn nữa những đánh giá về giá trị
dinh dưỡng chung cũng như hàm lượng vitamin D của các loại nấm trên địa
bàn Nghệ An, Hà Tĩnh đang còn hạn chế.
6
Vì vậy việc phân tích hàm lượng vitamin D
2
trong nấm là cần thiết, vừa để
xây dựng một quy trình định lượng chúng trong nấm, vừa để góp phần đánh giá
hàm lượng vitamin D
2
có trong nấm góp phần xây dựng bảng thành phần dinh
dưỡng thực phẩm địa phương.
Có nhiều phương pháp, kĩ thuật đánh giá hàm lượng vitamin D trong thực
phẩm, trong đó phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cho phép phân tích với
độ nhạy và độ chọn lọc cao.
Từ những kết quả nghiên cứu về vitamin D nói chung và vitamin D
2
trong
nấm nói riêng cũng như trên điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm, với mong
muốn xây dựng một phương pháp phân tích phù hợp và quy trình xử lý mẫu
hiệu quả trên đối tượng nấm để phân tích vitamin D tôi đã chọn đề tài
“ NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D TRONG NẤM
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO(HPLC)”.
2. Mục đích nghiên cứu.
Xây dựng quy trình phân tích vitamin D

2
bằng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao HPLC, từ đó xác định hàm lượng của chúng trong một số mẫu
nấm.
3. Mục tiêu nghiên cứu
+ Thiết lập được phương pháp phân tích đảm bảo độ chính xác, độ hội tụ,
độ nhạy cao, xác định được LOD và LOQ của phương pháp.
+ Áp dụng phương pháp để khảo sát, xác định hàm lượng vitamin D
2
trong
một số loại nấm trước và sau khi chiếu xạ bằng tia UV.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Các mẫu nấm được thu thập ở các chợ trên địa bàn thành phố Vinh, Hà
Tĩnh và một số loại nấm tự nhiên ở vườn quốc gia Pù Mát.
7
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.2. Vitamin D.
1.2.1. Giới thiệu, cấu tạo, phân loại và tên gọi
Vitamin là nhóm chất cần thiết cho hoạt động sống của bất kỳ cơ thể nào
và chúng có khả năng ở nồng độ thấp hoàn thành chức năng xúc tác ở cơ thể
sinh vật. Vitamin D được xếp trong nhóm vitamin hòa tan trong dầu béo cùng
với vitamin A, vitamin E, vitamin K. Vitamin D được phát hiện năm 1922
được phân lập năm 1932 tìm ra cấu trúc năm 1936 đến năm 1959 được tổng
hợp nhân tạo [11].
Thuật ngữ vitamin D dùng để chỉ một nhóm các hợp chất sterol có cấu
trúc tương tự nhau, có hoạt tính phòng ngừa hoặc điều trị còi xương nhờ làm
tăng khả năng hấp thu canxi và photphat ở đường ruột. Các hợp chất đó bao
gồm: vitamin D
2
(ergocalciferol), vitamin D

3
(cholecalciferol), và các vitamin
D
4
, D
5
, D
6
, D
7
. Cấu trúc của các dạng vitamin được trình bày trong hình 1.1.
Đối với người các hợp chất quan trọng nhất trong nhóm vitamin D là
vitamin D
3
và vitamin D
2
được đưa vào cơ thể qua đường tiêu hóa và các biện
pháp y tế khác. Cơ thể cũng có thể tổng hợp vitamin D ở da từ cholesterol, khi
da được tiếp xúc với tia UV (có trong ánh nắng mặt trời) vì thế nó còn được
mệnh danh là "vitamin ánh nắng" [18].
Mặc dù vitamin D thường được gọi là một vitamin, nhưng theo nghĩa hẹp
thì nó không phải là một vitamin thiết yếu trong chế độ ăn, bởi vì hầu hết động
vật có vú trong tự nhiên đều có thể tự tổng hợp đủ cho cơ thể khi tiếp xúc hợp
lý với tia nắng mặt trời.
8
Hình 1.1 Khái quát về cấu trúc và sự chuyển hóa các dạng vitamin D
1.2.2. Vai trò của vitamin D đối với cơ thể
Vitamin D đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của xương. Vitamin
D có vai trò quan trọng với sự hấp thụ canxi ở ruột mà canxi rất cần thiết cho
hoạt động của tim, cơ bắp và thần kinh, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên

xương và răng, đồng thời cũng không thể thiếu để tham gia vào quá trình đông
máu. Trẻ em khi thiếu canxi sẽ chậm lớn, lùn, còi xương, xương biến dạng,
răng không đều, răng dị hình, chất lượng răng kém và bị sâu [15], [21]. Người
lớn thiếu vitamin D có thể dẫn đến bệnh loãng xương [21].
9
Một lượng nhỏ vitamin D mỗi ngày làm giảm nguy cơ mắc bệnh cao
huyết áp, vitamin D giúp làm tăng khả năng miễn dịch, ngừa một số bệnh ung
thư phổ biến, làm chậm quá trình phát triển ung thư đặc biệt là ung thư gan,
ung thư đại trực tràng [10], [12], [19].
Thiếu vitamin D trong thai kì có thể sinh con nhẹ cân, đặc biệt nếu thiếu
vitamin D trong 3 tháng đầu thai kì, con sinh ra bị hạn chế tăng trưởng gấp đôi,
sự thiếu vitamin D trong thai kì gây ra những tổn thương não không thể phục
hồi [30]. Trẻ em nếu không được cung cấp đủ vitamin D sẽ ảnh hưởng đến sự
phát triển của xương, do chất xương và sụn không được vôi hóa đầy đủ, sụn
phát triển không bình thường, làm xương biến dạng [30]. Các triệu chứng cho
biết trẻ thiếu vitamin D: Thần kinh bị kích thích (quấy khóc, ngủ không yên
giấc, hay giật mình, nhất là trẻ dưới 3 tháng), hay đổ mồ hôi trộm cả lúc trời
lạnh, co giật khi sốt cao, có thể có cơn khó thở với tiếng thở rít. Nặng hơn nữa,
trẻ sẽ yếu cơ và có sự biến đổi ở xương đầu, lồng ngực, tay, chân, cơ - dây
chằng và cột sống . Nếu thiếu vitamin D trẻ em sẽ bị còi xương; trẻ bị còi
xương sẽ ảnh hưởng đến phát triển chiều cao và tầm vóc của trẻ sau này [10],
[12], [15], [21].
Vitamin D cũng có ảnh hưởng đến nồng độ serotonin trong não, gây ảnh
hưởng đến tâm trạng con người. Serotonin còn có tên gọi là hoóc môn hạnh
phúc, suy giảm serotonin khiến tâm trạng buồn chán hoặc dễ cáu giận, không
thể kiểm soát được cơn bốc đồng, do đó thiếu vitamin D kéo dài dễ dẫn tới
trầm cảm[40]. Do ít tiếp xúc với ánh nắng mặt trời, chúng ta dễ bị thiếu hụt
vitamin quan trọng này, dù có ăn chế độ lành mạnh và tập thể dục đều đặn
[11] , [12].
10

Thiếu vitamin D là bệnh đặc hữu dành cho người lớn. Một số lượng lớn
các trẻ em và thanh thiếu niên khỏe mạnh cũng thiếu hụt vitamin D [20], [36].
Một nghiên cứu dựa trên dân số của 2.972 phụ nữ độ tuổi sinh đẻ Mỹ tìm thấy
42% phụ nữ Mỹ gốc Phi ở Mỹ có mức 25(OH)D < 15 ng/ml và 12% có mức
<10ng/ml (1 ng/ml tương đương với 2,5 nmol/l) [30].
Theo các nghiên cứu cho thấy hàm lượng lý tưởng 25(OH)D trong máu
cần thiết để ngăn ngừa bệnh còi xương và loãng xương là 15 ng/ml,mức cần
thiết để tối ưu hóa sự hấp thu canxi ở ruột là 34 ng/ml. Gần đây đã phát hiện ra
rằng hàm lượng trung bình 29-38 ng/ml có thể ảnh hưởng đến việc giảm đáng
kể tỷ lệ mắc bệnh ung thư nội tạng và trên 33ng/ml sẽ giảm 50% nguy cơ ung
thư đại tràng và ở mức độ 52 ng/ml làm giảm 50% nguy cơ ung thư vú [11],
[12].
1.2.3. Nguồn cung cấp vitamin D cho cơ thể
Cơ thể người có thể nhận được vitamin D trong 3 cách: qua da, chế độ ăn
uống và bổ sung bằng thuốc.
Có lẽ vì vitamin D mang nghĩa của từ 'vitamin', hầu hết mọi người hiểu
sai về nó cũng giống như các vitamin khác, có nghĩa là, họ có thể có được
lượng đầy đủ bằng cách ăn một chế độ ăn uống tốt. Tuy nhiên, hầu hết chế độ
ăn uống tự nhiên con người có chứa ít vitamin D, trừ khi những chế độ ăn giàu
nguồn gốc hoang dã, cá béo. Một lượng nhỏ vitamin D có trong thực phẩm
tăng cường, bổ sung như sữa, nước cam và các loại ngũ cốc tại Mỹ, và bơ thực
vật ở châu Âu, nhưng các nguồn cung như vậy thường là những nguồn đóng
góp nhỏ cho nguồn vitamin D cơ thể. Theo truyền thống, nguồn vitamin D con
người bắt đầu từ da, không phải bắt nguồn từ miệng [23], [30].
11
Sự tổng hợp vitamin D của da xảy rất nhanh chóng và mạnh mẽ, quá trình
tổng hợp diễn ra dễ dàng chỉ sau một vài phút được tiếp xúc với ánh nắng mặt
trời. Tiếp xúc với ánh nắng mặt trời chứ không phải chế độ ăn uống là nguồn
cung cấp chính vitamin D cho cơ thể cho dự trữ và tuần hoàn, có thể xem đây
là một chức năng của phần bề mặt da hở [24]. Nguồn cung cấp vitamin D qua

da giúp cung cấp 80-85% nhu cầu vitamin D của cơ thể. Dưới tác dụng của tia
cực tím các tiền chất vitamin D có ở tuyến bã và lớp Malpighi của biểu bì sẽ
được chuyển thành vitamin D. Nếu được phơi nắng đầy đủ, sau 3 giờ, 1cm
2
da
có thể sản xuất ra 18UI vitamin D
3
[11], [16], [18], [23], [24].
Ví dụ khi người có làn da được tắm nắng vào mùa hè ( toàn thân, liều tối
thiểu UVB), mỗi cơ thể sản xuất ~ 20.000 IU vitamin D trong <30 phút [25].
Để đạt được điều này tương đương với con người sẽ phải uống 200 ly sữa (100
IU/8 oz thủy tinh) hoặc dùng 50 viên vitamin tổng hợp tiêu chuẩn (400
IU/viên) trong một lần.
Nguồn cung cấp tự nhiên vitamin D khác là qua thức ăn. vitamin D có
trong nguồn thực phẩm từ động vật (D
3
)và thực vật (D
2
), có nhiều trong các
thực phẩm như dầu gan cá thu, dầu dừa, lòng đỏ trứng, sữa động vật [24].
Dữ liệu về thành phần thực phẩm hiện nay cho thấy nấm là một nguồn
cung cấp vitamin D tốt ngoài các nguồn từ động vật như trứng, sữa, thịt, cá
Vitanmin D được bảo toàn tốt trong quá trình nấu ăn [29].
Các báo cáo về nấm của một số nước trên thế giới cho thấy hàm lượng
vitamin D trong nấm tự nhiên ở trong khoảng 2 – 40 µg/100g, có thể đáp ứng
đủ nhu cầu vitamin D trong một ngày của cơ thể người và thay thế nguồn
vitamin D từ các sản phẩm từ động vật, đặc biệt đối với người ăn chay [39].
Khi bổ sung vitamin D cho cơ thể cũng nên phối hợp bổ sung canxi cho
cơ thể để tăng hiệu quả sử dụng với cơ thể [10], [12], [31].
12

Lượng vitamin D cơ thể cần mỗi ngày phụ thuộc vào tuổi của mỗi người.
Trung bình lượng khuyến cáo hàng ngày từ tổ chức Food and Nutrition Board
cho các lứa tuổi khác nhau được liệt kê dưới đây đơn vị quốc tế (IU) bảng 1.1.
Bảng 1.1 Nhu cầu vitamin D mỗi ngày của các lứa tuổi [17]
Stt Lứa tuổi Liều lượng (IU)
Khuyến cáo-tối đa
Liều lượng (µg)
Khuyến cáo-tối đa
1 0-6 tháng 200-1000 5-25
2 6-12 tháng 400-1500 10-37,5
3 1-3 năm 600-2500 15-62,5
4 4-8 năm 600-3000 15-75
5 9-13 năm 600-4000 15-100
6 14-18 năm 600-4000 15-100
4 19-70năm 600-4000 15-100
5 Từ 71 tuổi trở đi 800-4000 20-100
6 Phụ nữ mang thai và
cho con bú
600-4000 15-100
13
1.3. Các phương pháp xác định vitamin D
1.3.1. Phương pháp thử nghiệm sinh học [28], [34]
Phương pháp chính thức đầu tiên để xác định vitamin D là phương pháp
thử nghiệm sinh học, trong đó hoạt tính sinh học của vitamin D được xác định
bằng khả năng của nó ngăn ngừa hoặc cải thiện các triệu chứng thiếu hụt
vitamin D trong cơ thể.
Bằng cách đo khả năng hoạt động chống còi xương, ví dụ như thử nghiệm
trên loài chuột (kiểm tra điểm vôi hóa hoặc kiểm tra chữa bệnh còi xương) đã
từ lâu được sử dụng để xác định vitamin D trong thực phẩm hoặc các dược
phẩm.

Chuột còi xương được cho ăn bằng thức ăn có chứa một lượng khác nhau
của vitamin D đã được thiết lập theo các định mức tiêu chuẩn. Sau bảy ngày,
xương của những con chuột được xử lý bằng dung dịch nitrat bạc. Lượng canxi
mới được chuyển vào xương được biểu hiện thành vết tối trên ảnh chụp. Thang
tiêu chuẩn được thiết lập bằng cách xây dựng mối liên hệ giữa các vùng tối trên
xương với lượng vitamin D trong chế độ ăn uống (cho gà con mới sinh thức ăn
bổ sung có chứa hàm lượng khác nhau của vitamin D). Hàm lượng vitamin D
trong mẫu sau đó được xác định bằng cách so sánh với khu vực mờ tối của chất
chuẩn, từ đó xác định tỷ lệ tro xương sau ba tuần với mỗi chế độ ăn uống.
Các thử nghiệm sinh học hấp thu canxi ở ruột khác bao gồm trên cơ thể và
trong ống nghiệm cũng đã được nghiên cứu bằng cách điều tra khả năng của
các hợp chất thử nghiệm để kích thích sự hấp thu canxi ở ruột non. Trong các
thử nghiệm,
45
Ca
2 +
được sử dụng để gián tiếp định lượng hàm lượng vitamin D.
14
Các sinh trắc nghiệm có thể phát hiện vitamin D ở nồng độ rất thấp. Ví
dụ, kiểm tra trên dòng chuột có thể phát hiện hàm lượng thấp tới 12 ng vitamin
D. Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp là không phân biệt giữa các dạng
khác nhau của vitamin D, đòi hỏi thời gian chuẩn bị lâu dài, độ tin cậy thấp so
với các phương pháp khác.
1.3.2. Phương pháp quang phổ.
Phổ hồng ngoại đã được sử dụng để phân tích định lượng của vitamin D.
Trong các pha rắn, vitamin D
2
có thể được phân biệt với vitamin D
3
dựa vào

đỉnh phổ vitamin D
2
tại 907 cm
-1
[34].
Phổ FTIR đặc trưng của tinh thể vitamin D
2
và D
3
cũng đã được mô tả.
Không có phương pháp luận được đưa ra trong quá trình định lượng vitamin D
bằng cách sử dụng phổ dao động. Lý do có thể là do giới hạn phát hiện của
phương pháp này liên quan đến nồng độ vitamin D thường thấp trong thực
phẩm. Vitamin D có thể được định lượng bằng cách đo sự hấp thụ tia cực tím
tối đa ở 264 nm. Hạn chế của phương pháp này là các hợp chất hấp thụ tia cực
tím khác trong mẫu đo sẽ can thiệp vào kết quả định lượng vitamin D [34].
1.3.3. Các phương pháp xét nghiệm miễn dịch
Phương pháp miễn dịch phóng xạ RIA (Radioimunoassay) do Yalow và
Berson (giải Nobel) đề xuất 1960. Phương pháp này có thể phát hiện vật chất
hiện ở nồng độ < 0,001 μg/ml [44].
15
Năm 2013 Wendy L Arneson và công sự đã đề cập đến các phương pháp
hiện tại được dùng rộng rãi để đánh giá hàm lượng vitamin D trong lâm sàng
bằng cách đo lượng 25(OH)D và các dạng chuyển hóa hydroxyl vitamin D
khác trong huyết thanh người [44]. Trong bài báo này tác giả có đánh giá về
các phương pháp thường dùng phổ biến nhất để định lượng vitamin D đó là
phương pháp RIA, phương pháp LC-MS/MS và phương pháp HPLC. Tác giả
đã mô tả khá đầy đủ về quy trình thực hiện phương pháp xét nghiệm miễn dịch
và nêu ra một số phương pháp xét nghiệm miễn dịch để định lượng vitamin D
được FDA chấp thuận hiện có gồm phương pháp xét nghiệm miễn dịch quang

hóa học (ECLIA), phương pháp RIA. Quy trình thực hiện như sau: Bước thứ
nhất, 25(OH)D được tách ra từ dạng liên kết với protein và gắn vào kháng thể
pha rắn đặc biệt, sau đó thêm vitamin D-isoluminol đánh dấu, thành phần
không liên kết được lấy ra bằng cách rửa sau đó thêm thuốc thử để xảy ra phản
ứng quang hóa. Tín hiệu ánh sáng được phát hiện có sự tỉ lệ nghịch với nồng
độ 25(OH)D.
Phòng thí nghiệm Abbott cung cấp một cách hoàn thiện phương pháp trên
nền tảng phân tích miễn dịch tự động xác định hàm lượng 25(OH)D – phương
pháp miễn dịch quang hoá học vi phân tử (CMIA). Phương pháp này được
FDA chấp thuận năm 2011.
Công ty Immuno Diagnostics cung cấp một phương pháp tự động phân
tích miễn dịch CMIA, IDS-ISYS, để định lượng hàm lượng tổng 25(OH)D và
dạng hydroxyl chuyển hóa khác của vitamin D trong huyết thanh hoặc huyết
tương người. Báo cáo cho thấy có mối quan hệ đặc biệt giữa 25(OH)D
3
và D
2
và độ nhạy của phương pháp là 5,5 ng/ml.
16
Phương pháp quang hóa (ECL) được cấp bằng sáng chế bởi F. Hoffman-
La Roche AG (Basel, Switzerland) được chào hàng thương mại phân tích
vitamin D. Test có sẵn để sử dụng cho tất cả các nền tảng phân tích mô đun
Roche cobas, nó đã được hiệu đính bởi FDA trong tháng 7/2012.
Phương pháp miễn dịch enzyme cũng được sử dụng để phân tích vitamin
D. Vitamin D cho liên kết với protein đồng nhất, từ đó đo lường hàm lượng
thực tổng cộng 25(OH)D. Các tổ hợp liên kết protein - vitamin D có thể nhận
diện vitamin D
2
và D
3

và cũng xác nhận hàm lượng tổng cộng 25-hydroxy D
một cách chính xác.
Một phương pháp xét nghiệm miễn dịch có sẵn trên nền tảng ADVIA
Centaur phát triển bởi nhà khoa học người Đức Siemens A.G Trong phương
pháp này, tổng số Vitamin D được phân tích bằng một phân tích miễn dịch
cạnh tranh đồng nhất, trong đó các đơn vị bức xạ được phát hiện bằng một thiết
bị đầu cuối.
17
Một công trình nghiên cứu của Lena Jafri và nhóm cộng sự [45] đã đánh
giá hiệu suất của các phương pháp miễn dịch phóng xạ (RIA) với HPLC và
phương pháp miễn dịch quang hóa học (ECLIA) cho việc định lượng 25(OH)D
trên đối tượng huyết thanh người. Trong nghiên cứu này, đối với phương pháp
RIA: sử dụng một ống đếp phóng xạ gama đa năng Genesys được sử dụng để
ghi lại sự phát xạ của các phân tử, phân tích 25(OH)D được thực hiện bằng
cách sử dụng kit thương mại 25(OH)D
125
I RIA . Giới hạn phát hiện dưới của
thử nghiệm là 1,5 ng/ml, giới hạn phát hiện trên là 100 ng/mL và C
V
của
phương pháp là 11%. Đối với phương pháp HPLC sử dụng hệ thống HPLC
Perkin Elmer series 200 để phân tích các 25(OH)D huyết thanh, với cột 5 μm
C-18 (4,6 ×150 mm, Supelco) và một đầu dò mảng diode. 0,5 ml mẫu huyết
thanh được thêm vào 25 μl etanol sau khi votex và ủ trong vòng mười phút ở
nhiệt độ phòng thì thêm tiếp 500 μL metanol, isopropanol (90:10, v/v) và tiếp
tục votex mười lăm giây. Dịch thu được sau đó bổ sung 1,5 mL n-hexane và
tiếp tục votex trong sáu mươi giây và ly tâm trong ba phút. Lớp hexane được
cho bay hơi đến khô dưới dòng khí nitơ. Các mẫu được pha trong 100 ml
metanol. và đem phân tích sử dụng cột C-18 (4,6 ×150 mm, supelco) tại tốc độ
dòng chảy 1,75 ml/phút với pha động Metanol-nước (85:15, v/v) bằng đầu dò

UV ở 265 nm. Giới hạn phát hiện là 3 ng/ml trong khi khoảng tuyến tính tiêu
chuẩn là 25-100 ng/ml. Thời gian lưu cho 25(OH)D là 4,1 phút. Với phương
pháp ECLIA sử dụng máy phân tích xét nghiệm miễn dịch Roche (Roche
Modular E170), bộ kit thương mại dựa trên phương pháp ECLIA từ Roche .
Giới hạn phát hiện dưới của thử nghiệm là 4,0 ng/ml, giới hạn phát hiện trên là
100 ng/mL và độ chính xác của thử nghiệm là CV = 9,9% . Hàm lượng trung
bình 25(OH)D với HPLC so với RIA là 50,1 nmol/L ( khoảng tuyến tính là
17,7-199,4 nmol/L) và 51,1nmol/L (12,5-187,2nmol/L), trong khi nồng độ
25(OH)D trung bình với RIA so với ECLIA là 32,4 nmol/L (9,98-199,7
18
nmol/L) và 29,9 nmol/L (4,9-214,6 nmol/L). Dữ liệu so sánh cho HPLC so với
RIA cho thấy RIA = -1,13 +1,01 (HPLC) (RMSE = 11,2 nmol/L) và cho RIA
so với ECLIA tiết lộ, ECLIA = 3,21 +0,9 (RIA) (RMSE = 9.6 nmol/L). Kết quả
cho thấy có mối tương quan có thể chấp nhận được giữa HPLC và RIA cũng
như RIA và ECLIA trong định lượng 25(OH)D [45].
1.3.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã được sử dụng rộng rãi
để xác định các vitamin tan trong chất béo từ giữa những năm 1970 và đã được
thông qua như là phương pháp chính thức nhờ khả năng phát hiện, tính chọn
lọc cao [16].Thiết bị sử dụng để phân tích vitamin D trong thực phẩm là máy
sắc ký lỏng cao áp sử dung hệ thống tách sắc ký ghép nối các đầu dò UV, đầu
dò mảng đi ốt (DAD) và đầu dò khối phổ (MS).
Hiệp hội hóa học phân tích tiêu chuẩn (AOAC) đã xác nhận các phương
pháp hóa học sau để phân tích vitamin D trong thực phẩm.
Phương pháp AOAC 980.26: vitamin D trong các chế phẩm vitamin tổng
hợp.
Phương pháp AOAC 981.17: vitamin D trong sữa tăng cường và sữa bột.
Phương pháp AOAC 982.29: vitamin D trong thực phẩm, các loại bột hỗn
hợp và thức ăn chăn nuôi.
Phương pháp AOAC 992.26: vitamin D

3
trong sữa công thức pha sẵn
dành cho trẻ em.
19
Phương pháp AOAC 995.05: vitamin D trong sữa công thức cho trẻ sơ
sinh và các sản phẩm đường ruột (cho ăn bằng ống).
Phương pháp AOAC 2002.05: Cholecalciferol (vitamin D
3
) trong thực
phẩm được lựa chọn (sữa tăng cường, sữa công thức cho trẻ sơ sinh, cháo, bơ
thực vật, dầu ăn và dầu cá).
Các phương pháp trên về nguyên tắc đều tương tự nhau, mỗi phương pháp
đều thông qua 4 giai đoạn chính:
+ Xà phòng hóa mẫu.
+ Chiết mẫu để tách các vitamin D ra khỏi các nền mẫu thực phẩm.
+ Làm sạch, tách các vitamin D khỏi các thành phần khác trong thực
phẩm.
+ Định lượng bằng HPLC với đầu dò UV.
Các phương pháp trên khác nhau bởi việc lựa chọn chất nội chuẩn, dung
môi chiết ( heptan, hexane, pentane hoặc ether dầu hỏa ), các phương pháp
làm sạch (các cột nhôm, cyano, cột pha đảo hoặc silica, pha rắn ), sự lựa chọn
của cột phân tích (Partisil, pha đảo hoặc silic) và bước sóng UV để phát hiện
(254 hoặc 265 nm.).
Phương pháp HPLC đầu tiên được giới thiệu để xác định vitamin D là
phương pháp ngoại chuẩn [42], sau đó được giới thiệu phương pháp nội chuẩn
[26]. Tuy nhiên những nghiên cứu này chỉ xác định được vitamin D
3
và vitamin
D
2

mà không bao gồm dạng chuyển hóa 25(OH)D. Một phương pháp HPLC
để xác định 25(OH)D trong thịt được mô tả bởi Koshy and VanDerSlik (1977),
tuy nhiên, không đồng thời xác định D
3
[33]. Một phương pháp HPLC hai
chiều đã được sử dụng để xác định đồng thời vitamin D
3
và 25(OH)D
3
[27].
Tuy nhiên phương pháp cho thấy giới hạn phát hiện khá cao, khoảng 0,2-1,0
mg/100g.
20
Tác giả Anders Staffas và cộng sự đã nghiên cứu xác định vitamin D
3
trong sữa bột, sữa công thức, dầu ăn, margarine và dầu cá bằng phương pháp
HPLC [13]. Phương pháp phân tích dựa trên phương pháp đề xuất của AOAC
2002.05. Mẫu phân tích được thêm chất nội chuẩn là vitamin D
2
sau đó xà
phòng hóa bằng KOH, etanol có bổ sung thêm chất chống oxi hóa butylated
hydroxytoluene (BHT) chiết mẫu thu được bằng cyclohexan và n-heptan (1:1)
và làm sạch bằng cột silica. Dịch chiết được đem đo mẫu ở máy HPLC đầu dò
UV ở bước sóng 265 nm, cột cho phân tích định lượng LC-C18, 250x 4,6 mm,
d
p
= 5μm (Vydac 201 TP 54, hoặc tương đương) với cột bảo vệ C18, 4.0x 4,0
mm, d
p
= 5 μm (LiChroCART 4-4, hoặc tương đương). Pha động 1: 0.5%

isopropanol và 2% methyl-tert-butyl ether (MTBE) trong cyclohexane:n-
heptan; trộn 5ml isopropanol và 20 mL MTBE với 1L cyclohexane:n-heptan (1
+1); pha động 2 : isopropanol+n-heptan (20+80). Pha loãng 200 ml isopropanol
thành 1 lít với n-heptan; Pha động 3: Metanol+axetonitril (20 + 80). Pha loãng
200ml metanol thành 1 lít với acetonitrile. Hàm lượng vitamin D
3
trong các
mẫu nghiên cứu từ 0,4 – 12 µg/100g. Độ thu hồi từ các mẫu thêm chuẩn
vitamin D
3
thay đổi 93-102%. Giá trị độ lặp lại độ lệch chuẩn tương đối (RSD)
cho kết quả chấp nhận thay đổi từ 2,2% (dầu cá) và 7,4% (dầu ăn), trong khi tái
lặp độ lệch chuẩn tương đối (RSD) giá trị thay đổi từ 6,8% (bơ thực vật) và
24% (dầu ăn)[13].
21
Jette Jakobsen và cộng sự đã xác định hàm lượng tổng vitamin D trong
thịt bao gồm vitamin D
3
và 25-hydroxyvitamin D
3
, được định lượng bằng
phương pháp HPLC sau khi thủy phân bằng kiềm, chiết pha rắn và bán chuẩn
bị HPLC [28]. Một hệ thống bán chuẩn bị HPLC gồm bộ điều khiển 600 và
bơm, một máy làm lạnh 717PLUS tự động, và một detector hấp thụ 2487.
Detector DAD được sử dụng ở khoảng 220-320 nm và việc định lượng được
hiện ở bước sóng 265 nm. Vitamin D
2
được sử dụng giống như chất nội chuẩn
đối với vitamin D
3

cũng như là đối với 25(OH)D
3.
Nghiên cứu này là một
phương pháp phân tích có thể được sử dụng cho việc đánh giá các loại vitamin
D khác nhau, đóng góp thông tin mới vào bảng thành phần thực phẩm.
Markus Herrmann và cộng sự đã phát triển một phương pháp phân tích
sắc ký lỏng khối phổ song song (LC-MS) [37]. Thiết bị gồm hệ thống khối phổ
API 5000 kết hợp với một nguồn bức xạ ion hóa, tách sắc ký sử dụng cột sắc
ký pha đảo Supelco C8 (Supelcosil LC-8, 3.3cm x 3mm, kích thước hạt 3 μ m)
cột bảo vệ C8 (4 ×2,0 mm) để định lượng 25(OH)D
2
và 25(OH) D
3
trong huyết
thanh [37]. Phương pháp mới này được đánh giá kết quả cùng với hai phương
pháp sử dụng rộng rãi để xét nghiệm miễn dịch RIAvà ECLIA. Kết quả cho
thấy phương pháp LC-MS định lượng chính xác 25(OH)D phù hợp với phép
phân tích bằng RIA còn đối với phương pháp ECLIA thì cho thấy có sự sai
lệch.
22
Một phương pháp định lượng đơn giản vitamin D được Lone Hymoller và
cộng sự công bố năm 2011 [35]. Mẫu huyết tương hoặc huyết sau khi xà phòng
hóa và chiết xuất được tách bằng cột sắc ký lỏng pha đảo C30 (250mm × 4.6
mm ID) với cỡ hạt 5,0 μm và cột bảo vệ C30 (10 mm × 4.0 mm ID) với cỡ hạt
5,0 μm. Nhiệt độ cho cả hai cột là 50
0
C, thể tích tiêm mẫu là 50 μL.Chương
trình gradient rửa giải được thực hiện tại tốc độ dòng chảy 1,0 ml/phút với
MeOH (85%) và EtOH trong 55 phút. Trong 12 phút đầu tiên 5% EtOH được
bơm qua cột và sau đó là tỉ lệ EtOH được tăng lên đến 40% trong ba phút.

Mười bảy phút sau đó số lượng EtOH được tăng lên đến 90% trong thời gian 3
phút và được duy trì liên tục trong 10 phút để làm sạch các cột. Gradient được
đưa trở lại thiết lập ban đầu trong 5 phút và 5 phút sau đó các mẫu tiếp theo có
thể được tiêm. Peak thu được nằm trong khoảng 25 phút đầu tiên. Giới hạn
phát hiện gấp ba lần so với tín hiệu nhiễu nền đã được xác định đến 0,14
ng/mL huyết tương và giới hạn định lượng gấp mười lần tín hiệu nhiễu nền đến
0,45 ng/mL huyết tương. Phương pháp này được sử dụng để xác định thành
phần vitamin D và chất chuyển hóa của nó trong huyết tương của sáu loài khác
nhau với: bò, lợn, gia cầm, chồn, ngựa, và con người. Ở gia súc hiệu suất thu
hôi đạt 86,6 và 101,0%, sai khác trong ngày từ 0,9 đến 5,9%, và sai khác giữa
các ngày là 0,2 đến 1,7%. Tuy nhiên, tùy thuộc vào loại và số lượng mẫu mà
phần tỉ lệ sai số là khác nhau.
1.4. Tổng quan nghiên cứu xác định vitamin D trong nấm
Phần lớn các nghiên cứu trên thế giới trong thời gian về phân tích xác định
hàm lượng vitamin D trong nấm sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng hàm lượng vitamin D cao có trong nấm
được hình thành nhờ bức xạ mặt trời. Chính vì vậy các hàm lượng trong nấm
nuôi trồng thường thấp bởi đặc điểm của phương pháp nuôi cấy thường trong
môi trường thiếu ánh sáng.
23
Viraj J. Jasinghe và cộng sự đã đưa ra kết luận từ việc phơi nắng cho nấm
để tăng hàm lượng vitamin D [46]. Nấm đông cô (Lentinula edodes), nấm Sò
(Pleurotus ostreatus), nấm Mỡ (nấm nút) (Agaricus bisporus), và nấm Bào ngư
(Pleurotus cystidus) được chiếu xạ 1 giờ với tia cực tím A (UVA; bước sóng
315-400 nm), tia cực tím B (UVB; bước sóng 290-315 nm), và tia cực tím-C
(UVC; bước sóng 190-290 nm). Mẫu bột nấm khô đông lạnh (0,5g) được cân
chính xác vào bình đáy tròn 250 ml và trộn với 4ml dung dịch natri ascorbate
(17,5 g natri ascorbate trong 100 ml dung dịch NaOH 1M), 50 ml etanol (95%),
và 10 ml dung dịch kali hydroxit 50%. Mẫu được xà phòng hóa trong điều kiện
đun hồi lưu ở 80 °C trong 1 giờ, sau đó nó đã nhanh chóng làm lạnh đến nhiệt

độ phòng và chuyển vào phễu tách. Hỗn hợp này lần đầu tiên được chiết xuất
với 15ml nước de-ion, sau đó là 15 ml etanol và sau đó chiết ba lần với n-
pentan có thể tích lần lượt là 50, 50 và 20 ml. Toàn bộ phần hữu cơ được rửa
ba lần với 50 ml dung dịch KOH 3% trong etanol 5% và sau đó rửa lần cuối
với nước de-ion cho đến khi trung hòa. Các phần dịch chiết hữu cơ được
chuyển vào bình đáy tròn, cô quay ở 40°C, và ngay lập tức tái hòa tan trong 5
ml etanol. Sau đó mẫu được đi qua một bộ lọc 0,45 μm. 20 μl của mẫu lọc
được tiêm vào hệ thống HPLC đầu dò UV và tách rửa nhờ cột C18 pha đảo với
pha động là ACN:MeOH (5:25) và tốc độ dòng chảy 2,3 ml/phút. Quá trình
chuyển đổi của ergosterol thành vitamin D
2
dưới UVA, UVB và UVC đã có
sự khác biệt đáng kể. Hàm lượng vitamin D
2
cao nhất (184 ± 5.71 μg/g DM)
được quan sát thấy trong nấm Sò chiếu tia UVB ở nhiệt độ 35
0
C và độ ẩm
khoảng 80%. Mặt khác, theo cùng điều kiện chiếu xạ, nồng độ vitamin D
2
thấp
nhất (22,9 ± 2,68 μg/g DM) đã được quan sát thấy trong nấm Mỡ. Ngoài ra
cường độ của bức xạ tia cực tím và liều chiếu xạ được áp dụng, cũng góp phần
vào sự chuyển đổi của ergosterol trong nấm thành vitamin D
2
. Ngay cả trong
điều kiện bình thường, 5 g nấm đông cô tươi được chiếu trong 15 phút với tia
24
UVA, hoặc UVB là thừa đủ để có được các liều cung cấp được đề nghị của
vitamin D cho người lớn (10 μg/ngày) [46].

Năm 2010 Sundar Rao Koyyalamudi và cộng sự đã công bố một công
trình khoa học về nồng độ vitamin D
2
trong nấm mỡ (Agaricus bisporus) sau
khi tiếp xúc với tia cực tím bằng hệ thống HPLC-MS sử dụng cột Gemini 5μm
C18 với pha động methanol:acetonitrile (25:75, v/v), tốc độ dòng 0.2 mL/min
[41]. Hàm lượng vitamin D
2
trong nấm tăng tương ứng với số lượng các xung
ánh sáng tia cực tím. Không có sự khác biệt thành phần vitamin D
2
trong nấm
từ các giỏ 200 g và 500 g theo các xung ánh sáng. Nấm lớp trên cùng có hàm
lượng vitamin D
2
cao hơn so với lớp dưới cùng của một giỏ, còn nấm thái lát
(dày khoảng 5 mm) sau khi chiếu xạ có hàm lượng vitamin D
2
cao hơn nấm
thái lát thông thường. Như vậy, sử dụng các xung cực tím cung cấp một
phương pháp có hiệu quả cao để tăng nồng độ vitamin D
2
trong nấm mỡ A.
Bisporus [41].
25
Katherine M. Phillips và cộng sự đã xác định được vitamin D
4
trong quá
trình phân tích vitamin D
2

trong sắc ký đồ HPLC-UV của nấm ăn [32]. Các
sterol được xác định bằng sắc ký khí, phát hiện bằng phương pháp ion hóa
ngọn lửa sau khi xà phòng hóa để thực hiện chiết lipid tổng, dùng sắc ký khí
khối phổ (GC-MS) để kiểm tra định tính lại thành phần. vitamin D
4
đã được
định lượng bằng HPLC với đầu dò UV sử dụng vitamin D
3
làm chất nội chuẩn.
Nấm portabella, nấm nút màu trắng, nấm crimini, nấm kim châm (Enoki), nấm
Đông cô, nấm maitake, nấm hàu, nấm morel, nấm mào gà (Chanterelle), được
chiếu xạ UV và phân tích. Phân tích 4 thành phần vitamin D của mỗi mẫu trong
tổng số 71 mẫu từ các nhà cung cấp bán lẻ và nhà sản xuất của Mỹ cho thấy
vitamin D
4
có mặt (>0.1 μg/100 g) trong tổng số 18 mẫu tổng hợp và trong ít
nhất một mẫu của từng loại nấm trừ nấm nút màu trắng. Mức cao nhất trong
các mẫu sau khi tiếp xúc với tia UV là nấm portabella, nấm maitake (0,2-7,0
và 22,5-35,4 mg/100 g). Trong một mẫu nấm sò hàm lượng vitamin D4 đạt
hơn gấp đôi so với D
2
(6,29 so với 2,59 mg/100 g). vitamin D
4
vượt quá 2
mg/100 g trong nấm morel và nấm mào gà, mẫu có chứa D
4
nhưng không phát
hiện được trong hai mẫu nấm morel. Tiền vitamin D
4
là 22,23-

dihydroergosterol đã được tìm thấy trong tất cả các mẫu (4,49-16,5 mg/100 g)
[32].