Đề tài : Đánh giá lượng tồn dư thuốc kích thích tăng trọng trong thịt gia súc, gia cầm

Bộ y tế
Viện Dinh Dỡng
________________________________________________________




Báo cáo tổng kết đề tài


đánh giá lợng tồn d thuốc kích thích
tăng trọng trong thịt gia súc, gia cầm


Chủ nhiệm đề tài: trần quang thủy

6488
27/8/2007


Hà Nội - 2007

1
PHẦN A: TÓM TẮT KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI
1. KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI
(a)- Đóng góp mới của đề tài
- Xây dựng quy trình phân tích thuốc kích thước tăng trưởng dạng kháng sinh và hocmon có
độ tin cậy và chính xác cao, áp dụng được tại các phòng phân tích thực phẩm tại Trung ương,
Thành phố và tuyến Tỉnh.
- Nêu được thực trạng tình sử dụng thuốc; các d¹ng vµ lo¹i thức ăn chăn nuôi gia súc gia cầm
có bán trên thị trường Hà nội; và tỉ lệ tồn dư thuốc kháng sinh, hocmon trong thịt gia súc gia
cầm tại các chợ trọng điể
m và một số cơ sở chăn nuôi của Hà Nội.
- Tõ thùc tr¹ng trªn ®ã các nhà quản lý trong ngành Y tế, thú y đưa ra các chính sách quản lý
vĩ mô, vi mô trong việc sử dụng thuốc kích thích tăng trưởng; nghiên cứu đưa ra các tiêu
chuẩn giới hạn tồn dư cho phép các loại thuốc kích thích tăng trưởng gia súc gia cầm chưa
được ban hành trong ngành Nông nghiệp và Y tế; đồng thời thúc đẩy giám sát chặt chẽ hơn
nữa các cơ sở chăn nuôi trong nước, sản xuất th
ịt và sản phẩm gia súc gia cầm đạt tiêu chuẩn
chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm (CLVSATTP).
(b)- Kết quả cụ thể (các sản phẩm cụ thể)
- Quy trình phân tích thuốc kích thích tăng trưởng trong thịt gia súc, gia cầm
- Số lượng và chủng loại thuốc kích thích thích tăng trưởng (dạng kháng sinh và hocmon) và
thức ăn gia súc sử dụng trong chăn nuôi gia súc, gia cầm
- Giúp các nhà quản lý trong ngành Nông nghiệp và Y tế thấy được tình hình sử dụng thuốc

kích thích tăng tr
ưởng trong thịt gia súc gia cầm tại địa bàn Hà Nội để đưa ra chính sách
quản lý, giám sát, kiểm tra hữu hiệu từ khâu nguyên liệu, chăn nuôi, phân phối thịt gia súc
trên địa bàn Hà nội nói riêng và trong cả nước nói chung và nhanh chóng ban hành tiêu
chuẩn lượng cho phép lớn nhất đối với lượng tồn dư thuốc kích thích tăng trưởng trong thịt
gia súc gia cầm và các sản phẩm của chúng
- Đưa ra các tiêu chuẩn hiện hành của JECFA, WHO/FAO, JAPAN về lượng tồn dư cho
phép lớn nhấ
t thuốc kích thích tăng trưởng trong thịt gia súc gia cầm để các ban ngành nước
ta tham khảo
- Đưa ra tài liệu về thức ăn chăn nuôi gia súc gia cầm và vấn đề sử dụng thức ăn chăn nuôi an
toàn cho người tiêu dùng.
(c)- Hiệu quả về đào tạo
- Đào tạo cho các phòng thử nghiệm thực phẩm tuyến Tỉnh kỹ thuật phân tích kháng sinh và
hocmon trong thực phẩm gia súc gia cầm, phù hợp với các điều kiện trang thiết b
ị phân tích
hiện có của phòng thử nghiệm
2
- Hng dn cho cỏc nh qun lý, sn xut a ra th trng cỏc loi thc n chn nuụi ỳng
cụng thc phi trn nguyờn liu v thnh phn thuc, ỳng quy cỏch v quy nh.
- Hng dn ngi chn nuụi s dng thc n chn nuụi gia sỳc gia cm an ton, nhm a
ra th trng sn phm tht sch, m bo V sinh an ton thc phm.
- B sung kin thc cho ngi tiờu dựng bi
t c v tn d thuc kớch trng trong sn
phm tht gia sỳc, gia cm cú bỏn trờn th trng v tỏc hi ca thuc.
(d)- Hiu qu v kinh t
- Hng dn nh sn sut sn xut cỏc loi thc n chn nuụi cú s dng cỏc loi thuc kớch
thớch tng trng cú hiu qu theo tng giai on chn nuụi; nhm tng sn lng tht gia sỳc
gia cm
sạch, tng bc ỏp ng c nhu cn tiờu th ca ngi dõn.

- Chi phớ kim nghim cho ch tiờu thuc kớch thớch tng trng (khỏng sinh v hocmon) ti
cỏc phũng thớ nghim v sinh an ton thc phm ớt tn kộm, vn t chớnh xỏc v tin cy
cao.
(e)- Hiu qa v xó hi
- Nõng cao nhn thc ca cỏc nh qun lý, sn xut v ngi tiờu dựng v vai trũ, tỏc dng,
tỏc hi ca thuc kớch thớch tng trng trong trong chn nuụi v tn d thu
c trong tht v
sn phm ca gia sỳc gia cm trong sn xut v i sng xó hi
- Ngi tiờu dựng thụng thỏi hn, bit chn sn phm tht gia sỳc gia cm m bo v sinh an
ton thc phm, ngn nga c cỏc bnh cú liờn quan n thuc kớch thớch tng trng cú
th dn n cỏc bnh tim n v him nghốo gỏnh nng cho xó hi nh bộo phỡ gi to, bin
i gii tớnh do s dng th
t gia cm gia sỳc cú d lng khỏng sinh v hocmon cao vt
quỏ mc quy nh cho phộp.
(f)- Cỏc hiu qu khỏc
2. áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống x hội
-
Ap dụng Quy trình phân tích đề tài xây dựng để phân tích d lợng thuốc kích thích tăng
trởng trong thực phẩm tại các Phòng Thử nghiệm phân tích Trung ơng, Tỉnh, Thành phố
- Đề tài nêu ra các loại thuốc kháng sinh, hocmon và các dạng công thức thức ăn chăn nuôi
để các nhà quản lý thuốc và sản xuất thức ăn chăn nuôi, ngời chăn nuôi gia súc gia cầm
tham khảo áp dụng trong thực tiễn.
- Giúp cho ngời tiêu dùng thực phẩm có thông tin về các loại thuốc kích thích trởng trong
gia súc gia cầm, thận trong khi mua thực phẩm.
3
3. đánh giá thực tiễn đề tài đối chiếu với đề cơng
nghiên cứu đ đợc phê duyệt
(a) Tiến độ
- Do ảnh hởng của dịch cúm gia cầm, hiện tợng nở mồm long móng ở gia súc gia cầm nên
việc mua mẫu gặp nhiều khó khăn, bị trễ về thời gián tiến độ đề tài nghiên cứu.

(b)- Thực hiện mục tiêu nghiên cứu
- Đảm bảo thực hiện đầy đủ các mục tiêu nghiên cứu đề ra của đề tài
(c) Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của bản đề cơng
- Sản phẩm tạo ra của đề tài đáp ứng đủ các dự kiến của đề cơng
(d) Đánh giá việc sử dụng kinh phí
- Khối lợng đề tài lớn, tập trung vào xây dựng quy trình phân tích, và kinh phí cho kiểm
nghiệm chỉ tiêu kháng sinh và hocmon khá cao; nhng vẫn đảm bảo các mục tiêu nghiên cứu
đề ra. Do vậy đạt hiệu quả cao trong việc sử dụng kinh phí đợc cấp.
4. Các ý kiến đề xuất
- Cần có sự phối hợp liên ngành trong quản lý thuốc và các cơ sở sản xuất thức ăn chăn nuôi
có sử dụng thuốc kích thích tăng trởng, thịt và sản phẩm gia súc gia cầm bán trên thị trờng
tiêu thụ nh siêu thị và bán lẻ
- Xây dựng và ban hành tiêu chuẩn các về thuốc kích thích tăng trởng trong thức ăn chăn
nuôi và thịt gia súc gia cầm
- Xây dựng các Phòng thử nghiệm trọng điểm tại tỉnh thành có năng lực cao trong kiểm soát
đợc chất lợng và VSATTP. Từng bớc đa dạng hóa khả năng phân tích các chỉ tiêu chất
lợng và VSATTP của các PTN thuộc ngành Y tế, tỉnh thành đặc biệt đối với hàng hóa thực
phẩm xuất nhập khẩu trong và ngoài nớc.
4
Phần B: Nội dung báo cáo chi tiết kết quả
nghiên cứu đề tài cấp Bộ
1. Đặt vấn đề
1.1. Tóm lợc những nghiên cứu trong và ngoài nớc
liên quan đến đề tài. Tính cấp thiết cần nghiên cứu của
đề tài
Nhờ những tiến bộ vợt bậc của khoa học kỹ thuật mà ngành công nghiệp sản xuất
các sản phẩm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi đã ngày một phong phú và không ngừng phát
triển. Các chủng loại thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm chế biến sẵn trên thị trờng hiện nay
rất đa dạng. Ngoài các thành phần cơ bản cung cấp năng lợng nh protein, lipid, glucid,
ngời ta còn bổ sung chất khoáng, vitamin, kháng sinh và chất tăng trọng giúp cho con vật

vừa lớn nhanh vừa có khả năng chống đỡ bệnh tật. Những lợi ích của thức ăn đóng gói sẵn rất
dễ nhận thấy, ngời chăn nuôi vừa không mất nhiều thời gian tìm nguồn nguyên liệu, chế
biến phù hợp với từng thời kỳ sinh trởng của con vật mà lại cho năng suất rất cao nhng nếu
buông lỏng quản lý chất lợng các loại thức ăn chăn nuôi và chạy theo lợi nhuận sẽ có thể
dẫn tới những sai sót khó lờng trong sản xuất, sử dụng thức ăn chăn nuôi chế biến sẵn, gây
hậu quả nghiêm trọng đến chất lợng vệ sinh an toàn thực phẩm, ảnh hởng lớn tới sức khỏe
ngời tiêu dùng.
Một số nghiên cứu đã đề cập đến những tác dụng ngoài ý muốn của kháng sinh, chất
kích thích tăng trởng trong thức ăn chăn nuôi chế biến sẵn đến chất lợng vệ sinh an toàn
thực phẩm. Ngời tiêu dùng ngày nay đã cảnh giác với những thực phẩm có liên quan đến
công nghệ sinh học, các loại phụ gia thực phẩm và việc lạm dụng kháng sinh trong điều trị
bệnh tật cho ngời và gia cầm, gia súc. Việc lạm dụng các chất kháng sinh và hocmon bổ
sung vào thức ăn chăn nuôi gần đây đã đợc cảnh báo, tuy nhiên lợng tồn d trong thịt gia
cầm, gia súc vẫn cha đợc xác định cụ thể. Do vậy, để cung cấp số liệu có tính khoa học,
Khoa Hóa Thực phẩm và Vệ sinh an toàn thực phẩm-Viện Dinh dỡng đã tiến hành đề tài
nghiên cứu Đánh giá lợng tồn d thuốc kích thích tăng trọng trong thịt gia súc, gia cầm.
Hy vọng kết quả của đề tài sẽ góp phần đề xuất biện pháp tăng cờng công tác quản lý việc
sản xuất và sử dụng một cách có hiệu quả thức ăn chế biến sẵn nhằm thúc đẩy sự phát triển
ngành chăn nuôi, cung cấp đủ nguồn thực phẩm sạch, vệ sinh an toàn, bảo vệ sức khỏe ngời
tiêu dùng.
1.2. Giả thiết nghiên cứu của đề tài
- Tham khảo các tài liệu phân tích thuốc kích thích tăng trọng gia súc gia cầm trong và ngoài
nớc. Khảo nghiệm, lựa chọn quy trình phân tích tối u phù hợp với điều kiện trang thiết hiện
5
có của phòng thử nghiệm; tiến hành thẩm định kỹ thuật đạt; tiêu chuẩn áp dụng thử nghiệm
tại Phòng thử nghiệm.
- áp dụng quy trình phân tích đã xây dựng xác định lợng tồn d thuốc kích thích tăng
trởng trong thịt và phủ tạng gia súc gia cầm tại các chợ trọng điểm và 2 cơ sở chăn nuôi của
Hà Nội.
- Khảo sát, tìm hiểu, ghi chép các loại thuốc kích thích tăng trởng dạng kháng sinh và

hocmon và các loại thức ăn gia súc gia cầm có bán trên thị trờng Hà Nội.
- Tham khảo và nghiên cứu trong và ngoài nớc đa ra tài liệu về thức ăn gia súc của ; vấn đề
an toàn trong sử dụng.
- Xử lý thống kê kết quả phân tích.
1.3. Mục tiêu nghiên cứu
- Phân tích lợng tồn d thuốc kích thích tăng trởng trong mẫu thịt lợn và thịt gà
trên thị trờng Hà Nội.
- Thu thập các loại thuốc kích thích tăng trọng dùng cho gia súc gia cầm trên địa bàn
Hà Nội, danh mục đợc phép theo khuyên cáo của FAO/WHO và bị cấm.
- Khảo sát thị trờng bán thức ăn gia súc có sử dụng thuốc kích thích tăng trởng. Tài
liệu về thức ăn tăng trọng và an toàn trong sử dụng bảo vệ sức khỏe cộng đồng.
Địa điểm, thời gian phân tích mẫu
- Khoa Hóa-Vệ Sinh An Toàn Thực Phẩm và Phòng Hóa Độc Thực phẩm/Trung Tâm
Kiểm Nghiệm VSATTP, Viện Dinh Dỡng.
- Thời gian tiến hành 2004 - 2006

6
2. Tổng quan của đề tài:
2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nớc liên quan tới đề
tài
Tình hình nghiên cứu ngoài nớc đối với thuốc kích thích tăng trởng dạng kháng sinh và
hocmon đối với thực phẩm phát triển mạnh mẽ tại nhiều nớc Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản từ đầu
những năm 1960 về phơng pháp phân tích trên các thiết bị nh Sắc ký lỏng, Sắc ký khí,
Elysa và đến đầu 1970 các kỹ thuật khối phổ ra đời có thể phân tích tồn d thuốc kích thích
tăng trởng dới dạng vết siêu nhỏ. Có nhiều khảo sát tại tại các nớc phát triển cũng nh các
nớc kém phát triển tại Châu Phi và gần đây tại Trung Quốc, cho thấy d lợng thuốc kháng
sinh và hocmon trong thực phẩm và đặc biệt trong thịt gia súc gia cầm khá cao đáng báo động
với tỉ lệ cao. Do vậy việc nghiên cứu tình hình sử dụng thuốc kích thích tăng trởng trong sản
xuât, chăn nuôi và đến sản phẩm thực phẩm, thủy sản xuất nhập khẩu đợc đặc biệt chú trên
thế giới trong thời gian qua.

Các phơng pháp phân tích d lợng kháng sinh và hocmon trong thực phẩm

Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu phân tích tồn d kháng sinh và hocmon
trong thịt cũng nh phủ tạng động vật, phần lớn các phơng pháp đều sử dụng thiết bị sắc ký
lỏng hiệu năng cao [7; 8; 9; 10; 11; 12 ; và 18; 19; 20; 21; 22; và 24; 25; 26; 27; 28; 29].
* Phân tích kháng sinh nhóm tetracyclin
Các kháng sinh nhóm tetracyclin là những kháng sinh phổ rộng, có tác dụng trên cả
các vi khuẩn gram âm và gram dơng, đặc biệt có tác dụng trên các vi khuẩn nh
Staphylococcus, Streptococcus, Pneumococcus, Gonococus, Cholera, Dysentery bacillis,
Pertussis, Rickettsia, Chlamydia và Mycoplasma. Việc sử dụng rộng rãi các kháng sinh nhóm
này có thể làm tăng nguy cơ đề kháng kháng sinh, vì vậy cần thiết phải có những phơng
pháp đánh giá chính xác về mức độ tồn d nhằm bảo vệ sức khỏe ngời tiêu dùng. Phơng
pháp phân tích bằng vi sinh vật là một phơng pháp phổ biến để xác định d lợng kháng
sinh. Tuy nhiên phơng pháp này tốn nhiều thời gian, không thể xác định cụ thể từng loại
kháng sinh trong nhóm và độ chính xác là không ổn định. Vì vậy hiện nay các phơng pháp
sắc ký đợc lựa chọn là phơng pháp chính để phân tích d lợng các kháng sinh nhóm
tetracyclin. Ph
ơng pháp sắc ký cổ điển là phơng pháp sắc ký lớp mỏng đợc áp dụng từ
những năm 1960, sử dụng các vật liệu lớp mỏng nh kieselguhr, silica gel và celluloza. Các
mẫu đợc áp dụng chủ yếu là dợc phẩm và một số loại thực phẩm nh sữa, mật ong và thịt,
cá. Phơng pháp điện di mao quản cũng đợc áp dụng và có một số u điểm so với sắc ký
lỏng nh sử dụng rất ít dung môi, thời gian phân tích ngắn, hiệu lực tách cao. Tuy nhiên
phơng pháp này ít đợc áp dụng trong thực tế để phân tích d lợng kháng sinh vì lợng
mẫu bơm nhỏ và do đó độ nhạy thấp. Phơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là phơng pháp
chính đợc áp dụng hiện nay để xác định d lợng rất nhỏ các kháng sinh trong thực phẩm.
Nhiều nghiên cứu đã thực hiện và công bố trên các tạp chí phân tích chuyên ngành. Các
7
tetracyclin đợc chiết và làm sạch bằng chiết pha rắn, sau đó định lợng trên sắc ký lỏng sử
dụng các detector UV hoặc PDA. Đối với các mẫu có d lợng rất nhỏ, ngời ta sử dụng sắc
ký lỏng khối phổ để định lợng [19].

Phân tích olaquindox và cacbadox
Olaquindox và carbadox là hai chất thuộc nhóm quinoxaline 1,4-dioxide, đợc dùng ở
một số nớc để kích thích tăng trởng và điều trị ỉa chảy trên gia súc. Do những nguy cơ về
khả năng gây đột biến gen và gây ung th của các chất này và một số chất chuyển hóa của
chúng, EU đã cấm sử dụng hai loại hóa chất này từ năm 1998. Để giám sát việc sử dụng các
chất olaquindox và carbadox trong chăn nuôi, các phơng pháp phân tích cũng đã đợc phát
triển và áp dụng để phân tích trong thức ăn chăn nuôi và sản phẩm từ gia súc, gia cầm. Các
phơng pháp đợc áp dụng để xác định tồn d olaquindox, carbadox và các chất chuyển hóa
chính là sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ UV hoặc DAD [9, 10].

Phân tích các hocmon steroid
Các hocmon steroid có thể có mặt trong thịt các loại gia súc, gia cầm với hàm lợng
rất thấp vài àg/kg (ppb). Bản thân động vật cũng tự tổng hợp các loại hocmon này trong quá
trình chuyển hóa tự nhiên các protein và chất béo. Vì vậy các hocmon này đợc biết là có thể
ảnh hởng đến sự phát triển và phân bố của các mô mỡ và cơ. Mức độ và tỷ lệ các loại
hocmon, các chất tiền thân và các chất chuyển hóa phụ thuộc vào các điều kiện sinh lý, đặc
tính di truyền và ảnh hởng của môi trờng, trong đó có điều kiện và thức ăn chăn nuôi. Vì
vậy, việc giám sát hàm lợng các hocmon steroid là rất quan trọng để đánh giá chất lợng thịt
gia súc, gia cầm. Tuy nhiên thực tế rất khó có thể phân biệt đợc đâu là hocmon nội sinh và
đâu là lợng hocmon đợc đa vào qua quá tình chăn nuôi. Vì vậy thông thờng ngời ta
phải xác định tỷ lệ giữa các loại hocmon, tỷ lệ các chất tiền thân và các chất chuyển hóa.
Nhiều phơng pháp phân tích đã đợc phát triển để xác định hàm lợng hocmon trong thịt
nh phơng pháp sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao, phơng pháp miễn dịch,
phơng pháp sắc ký khí khối phổ và ph
ơng pháp sắc ký lỏng khối phổ [22, 28]. Để đạt độ
chính xác cao hơn, ngời ta có thể kết hợp nhiều phơng pháp với nhau, chẳng hạn kết hợp
phơng pháp miễn dịch và phơng pháp sắc ký khí khối phổ. Phơng pháp phân tích miễn
dịch đặc biệt phù hợp để phân tích sàng lọc nhiều mẫu với độ nhạy rất cao.
2.2 Tình hình nghiên cứu trong nớc liên quan tới đề
tài

Ơ Việt Nam kháng sinh đợc dùng rộng rãi để chữa bệnh cho ngời và gia súc, ngời
ta đã phát hiện ra rằng nếu đa một lợng nhỏ kháng sinh vào thức ăn gia súc gia cầm thì
không những hạn chế nhiều bệnh truyền nhiễm mà còn làm con vật lớn nhanh, cho nhiều thịt
và nhiều trứng. Sau đó, kháng sinh ngày càng đợc dùng phổ biến trong chăn nuôi. Ngời ta
đã trộn kháng sinh vào thức ăn gia súc với liều lợng thích hợp nhằm kích thích sinh trởng
đối với gia súc còn non và mang lại hiệu quả trong trờng hợp thức ăn kém chất lợng,
chuồng trại ẩm ớt mất vệ sinh và những vùng có dịch bệnh thờng xuyên xẩy ra. ở những
8
con vật mới vào giai đoạn phát triển thì kháng sinh có hiệu quả mạnh hơn con vật trởng
thành. Đối với gia súc tiết sữa nh bò sữa, lợn nái đang tiết sữa, kháng sinh có tác dụng
không rõ ràng, có thể kháng sinh tiết qua sữa gây ảnh hởng đến chất lợng sữa, không nên
bổ sung kháng sinh vào thức ăn nếu không vì mục đích chữa bệnh cho con vật [1, 2].
Bên cạnh những lợi ích dễ nhận thấy của thức ăn chăn nuôi có bổ sung kháng sinh,
những tác dụng không mong muốn của kháng sinh ngày càng thể hiện rõ rệt. Dùng kháng
sinh với liều lợng thấp và liên tục đã làm xuất hiện vi khuẩn kháng lại kháng sinh. Kháng
sinh không những loại bỏ những vi khuẩn có hại mà còn tiêu diệt các vi khuẩn có ích nh vi
khuẩn tạo vitamin nhóm B trong đờng tiêu hoá. Do vậy, đã có những khuyến cáo hạn chế
hoặc không dùng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi, chỉ sử dụng tập trung vào những giai
đoạn gia súc dễ bị khủng hoảng nh cai sữa sớm và tránh các loại kháng sinh thờng dùng để
chữa bệnh cho con ngời.
Một số kháng sinh khi sử dụng với hàm lợng cao gây ra tình trạng kháng kháng sinh,
gây khó khăn cho công tác phòng chống bệnh tật cho gia cầm, gia súc. Lợng tồn d vợt
mức cho phép kháng sinh trong thực phẩm vừa ảnh hởng tới giá trị cảm quan của món ăn lại
vừa có hại tới sức khoẻ ngời tiêu dùng. Tại phiên họp của Hội đồng chuyên gia JECFA của
FAO/WHO đợc tổ chức năm 1999 tại Rome, Italia nhằm đánh gía tồn d một số thuốc thú y
trong thực phẩm đã đa ra giới hạn lợng ăn vào hàng ngày có thể chấp nhận và giới hạn tối
đa cho phép của một số kháng sinh. Với Dihydrostreptomycin/streptomicin lợng ăn vào
hàng ngày có thể chấp nhận là 0-50 ppb theo trọng lợng và giới hạn tồn d tối đa cho phép
trong thịt lợn, thịt gà, thịt bò (thịt bắp) kể cả gan là 600 ppb, còn trong thận là 1000 ppb.
Lợng ăn vào hàng ngày có thể chấp nhận đối với Neomycin là 0-60 ppb theo trọng lợng và

giới hạn tồn d tối đa cho phép trong thịt bò, lợn, gà là 500 ppb, lợng tồn d cho phép trong
gan, thận cao hơn 3-4 lần so với thịt bắp [3, 14, 16].
Gần đây ở Việt Nam, một số nghiên cứu đã đề cập đến vấn đề d lợng kháng sinh
nhóm tetracycline trong thịt và phủ tạng [15]. Kết quả khảo sát cho thấy rằng, khi sử dụng
thức ăn nuôi lợn chứa chlortetracyclin với hàm lợng 110 ppm hoặc 330 ppm trong khoảng
thời gian liên tục 31 và 98 ngày tơng ứng thì d lợng chlortetracyclin trong gan và thận cao
gấp 10 lần d l
ợng trong phần thịt mỡ. Nghiên cứu tơng tự ở gà cũng cho thấy khi cho gà
ăn thức ăn chứa 220 ppm chlortetracyclin, lợng tồn d, sau khi ngừng cho ăn, ở gan và thận
là 0,66 và 0,42 (ppm) tơng ứng, trong khi tồn d ở phần da có dính mỡ chỉ là 0,02 ppm.
Những nghiên cứu này cũng cho thấy sau một ngày ngừng cho ăn thức ăn có chứa
chlortetracyclin, không còn phát hiện thấy tồn d kháng sinh này trong thịt. Do vậy, nếu
trong thức ăn chăn nuôi có chứa chlortetracyclin thì việc cách ly gia cầm với thức ăn đó 1-2
ngày là cần thiết.
Carbadox và olaquindox là 2 loại kháng sinh nhanh chóng phân hủy trong cơ thể động
vật để tạo thành desoxycarbadox ở gan và thận nhng bền ở trứng và phần thịt [2, 5].
Quinoxaline-2-carboxylic acid (QCA) là chất chuyển hóa chính của carbadox. Đối với
olaquindox, các chất chuyển hóa tìm thấy là khác nhau ở các mô khác nhau và cũng khác
9
nhau ở các loại vật nuôi. Chất này đợc hấp thu nhanh chóng ở đờng ruột và thải trừ qua
đờng nớc tiểu. ở lợn, khi bổ sung olaquindox vào thức ăn với hàm lợng 60 ppm, sau 28
ngày tồn d olaquindox còn dới 0,005 ppm ở phần thịt và dới 0,01 ppm trong thận.
Trong nhiều năm qua, một số loại hocmon và các dẫn suất của nó đã đợc bổ sung
vào thức ăn chăn nuôi nhằm kích thích tăng trởng cho gia cầm, gia súc [8,9,10]. Khi trộn
thyroxin vào thức ăn với lợng nhỏ 40-60 (ppm) có tác dụng tăng trởng rõ rệt đối với gia
cầm, gia súc đang ở trong tình trạng thiếu hụt iod hoặc khẩu phần ăn hàng ngày không cân
đối các chất dinh dỡng. Nếu kéo dài thời gian sử dụng thức ăn chăn nuôi có bổ sung
thyroxin và không đủ thời gian cách ly trớc khi giết mổ 10 ngày thì lợng tồn d thyroxin có
thể vợt mức cho phép, vi phạm các quy định về chất lợng vệ sinh an toàn thực phẩm [23].
Một số loại nội tiết tố sinh dục progesteron, testosteron, 17-estradiol cũng đã đợc

dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi với mục đích tăng trọng và nâng cao hiệu quả của
thức ăn. Tuy nhiên, trong những năm 50-60 của thập kỷ trớc do thiếu thận trọng khi đa
hocmon vào thức ăn chăn nuôi nên hàng chục năm sau tại một số nớc phát triển nh Thuỵ
điển, Anh, Pháp, Scotland ngời ta đã nhận thấy hậu quả rõ rệt của nó đến tình trạng vệ sinh
an toàn thực phẩm có liên quan đến sức khoẻ cộng đồng. Hiện tợng đồng tính luyến ái tăng,
giảm mật độ tinh trùng, tinh hoàn lệch, ẩn ở trẻ em trai và tuổi dậy thì ở trẻ em gái sớm hơn.
Đến năm 1989, các nớc này chỉ cho phép sử dụng testosteron, estradiol trong điều trị bệnh.
Đến năm 1999, ngời ta đã thông báo nguy cơ gây ung th của 17- estradiol nên cũng
không dùng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi với mục đích tăng trọng [1,2].
Phơng pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao hiện nay đã đợc áp dụng tại một số
phòng phân tích thực phẩm, để xác định nhiều loại chất kích thích tăng trởng, trong đó có
các hocmon steroid [22, 28]. Để phân tích bằng sắc ký, mẫu sau khi chiết xuất, đợc làm sạch
và làm giàu trớc khi tạo dẫn xuất dễ bay hơi, thông thờng là silyl hóa. Quá trình làm sạch
thờng rất phức tạp, tốn thời gian và dung môi, vì vậy nhiều tác giả đã nghiên cứu để cải tiến
quy trình làm sạch nh
áp dụng các vật liệu chiết pha rắn để giảm thời gian phân tích và
lợng hóa chất sử dụng. Việc phân tích các hocmon trong thịt động vật còn phức tạp hơn
nhiều, vì vậy thờng phải kết hợp phơng pháp chiết xuất lỏng lỏng và chiết xuất pha rắn,
một số tác giả còn kết hợp chiết pha rắn với làm sạch qua sắc ký lỏng trớc khi dẫn xuất và
phân tích.
Qua khảo sát các loại thức ăn trên thị trờng và các điều kiện chăm sóc, đề phòng
dịch bệnh cho gia cầm, gia súc ở nớc ta hiện nay [1,2,5], đề tài đã tập trung phân tích tồn d
các kháng sinh nhóm tetracyclin, olaquindox, carbadox; các hocmon steroid và tổng hợp bao
gồm testosteron, progesteron, oestradiol, trenbolon, dexamethason.
10
3. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu
3.1. Thiết kế nghiên cứu
- Tham khảo các tài liệu phân tích Quốc tế về thuốc thích thích tăng trởng (kháng sinh và
hocmon) trong thực phẩm; áp dụng xây dựng Quy trình kỹ thuật kiểm nghiệm tối u phù hợp
dựa vào điều kiện, trang thiết bị hiện có của Phòng Thử nghiệm Viện Dinh dỡng; và sau khi

tiến hành thẩm định phơng pháp nếu đạt độ tin cậy và chính xác; áp dụng phân tích 150 mẫu
thịt gia súc gia cầm tại các chợ trong điểm và cơ sở chăn nuôi tại Hà Nội.
- Khảo sát các loại thuốc kích thích tăng trởng và thức ăn gia súc gia cầm có bán trên thị
trờng Hà nội thuộc thuộc Nhà nớc, doanh nghiệp, thị trờng tự do và tham khảo tham chiếu
tiêu chuẩn về hàm lợng cho phép lơn nhất tồn d thuốc trong thịt và sản phẩm thịt của gia
súc gia cầm theo tiêu chuẩn Quốc tế, tiến tới từng bớc xây dựng tiêu chuẩn của Việt nam.
- Dựa vào các tài liệu trớc đây và hiện có trong và ngoài nớc, đa ra tài liệu về thức ăn chăn
nuôi và an toàn cho ngời sử dụng thịt gia súc gia cầm về Vệ sinh an toàn thực phẩm.
- T vấn về quản lý, kiểm soát chất lợng và VSATP đối với thức ăn chăn nuôi và thịt gia súc
gia cầm.
3.2. Chọn mẫu, cỡ mẫu và đối tợng nghiên cứu
*Đối tợng nghiên cứu
Mua mẫu thịt và phủ tạng gia súc gia cầm tơi sống ngay sau giết mổ tại các chợ
trọng điểm phân phối thực phẩm lớn (Chợ Hàng Bè, chợ Hôm, chợ Mơ, chợ Trơng Định,
chợ Thanh Xuân) và tại các cơ sở chăn nuôi (Sóc Sơn, Từ Liêm).
*Cỡ mẫu
- 20 mẫu gia súc, gia cầm x 05 chợ = 100 mẫu
- 25 mẫu gia súc, gia cầm x 02 cơ sở chăn nuôi = 50 mẫu
Cỡ mẫu đợc tính theo công thức sau
:
Z
2
x p x (1- p)
n =


e
2
Trong đó :
n: tổng số mẫu cần thu thập

Z: 1,96 với khoảng tin cậy 95%
e: sai số cho phép, thờng là 5%
p: tỷ lệ mẫu nhiễm, ớc tính theo các kết quả nghiên cứu trên thế giới là 10%.
11
Thay các số đã biết vào công thức trên ta tính đợc cỡ mẫu là:
1,96)
2
x 0,1 x (1- 0,1)
n =

= 138
(0,05)
2
Đề phòng sơ suất làm hỏng mẫu 8-10% là 12 mẫu, vậy cỡ mẫu phải thu thập là: n =
138 mẫu + 12 mẫu = 150 mẫu
* Chn mu v kỹ thuật lấy mẫu theo (TCVN 4833-1:2002)
Mẫu thịt, gan của gà và lợn đợc thu thập đại diện ở các chợ nội thành gian từ 8-10
giờ sáng và 2 cơ sở chăn nuôi tại Sóc sơn và Từ liêm, Hà Nội trong ngày. Mỗi mẫu thịt gà
(thịt đùi và thịt lờn), mẫu thịt lợn (thịt vai và thịt lạc) đợc lấy tối thiểu là 500g, mẫu gan tối
thiểu là 300g, đựng vào túi polyetylen sạch, bảo quản lạnh trong hộp xốp, đa ngay về phòng
thí nghiệm trong thời gian không quá 3 giờ. Tại phòng thí nghiệm, mẫu đợc tiến hành xử lý
sơ bộ và cân lấy lợng mẫu phân tích ngay trong ngày, mẫu còn lại đợc lu giữ trong hộp
nhựa kín có lắp và đợc bảo quản ở nhiệt độ -20
0
C tủ lạnh đông [3].
3.3. Phơng pháp nghiên cứu
3.3.1. Chỉ tiêu nghiên cứu
- Xây dựng quy trình phân tích chỉ tiêu hàm lợng thuốc kháng sinh, hocmon
- Đánh giá thực trạng tồn d thuốc trong thịt gia súc gia cầm trên địa bàn Hà Nội.
- Xác định danh mục thuốc kích thích tăng trởng và các loại thức ăn gia súc gia cầm

(nguyên liệu, thuốc phối trộn, phụ gia).
- Quản lý sử dụng thuốc trong chăn nuôi và an toàn cho ngời tiêu dùng
3.3.2. Phơng pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu
Tham chiếu các tài liệu phân tích trong và ngoài nớc, để xây dựng quy trình phân
tích thuốc kích thích tăng trởng với điều kiện hiện tại của Phòng kiểm nghiệm thực phẩm-
Viện Dinh dỡng có đánh giá các thông số thẩm định của phơng pháp. Sau đó áp dụng Quy
trình phân tích lợng tồn d thuốc kháng sinh và hocmon trong thịt gia súc, gia cầm
3.3.2.1. Phơng pháp phân tích tetracyclin, oxytetracyclin và
chlortetracyclin
a) Nguyên lý
Mẫu đợc chiết với đệm McIlvaine và TCA và làm sạch bằng chiết pha rắn RP-C18-
Supelco. Xác định tetracyclin trong gia súc gia cầm bằng Hệ thống sắc ký lỏng với detectơ
PDA ở bớc sóng 365nm. Pha động 0,01M axít oxalic-axetonitri-metanol (80:13:7,v:v:v), cột
sắc ký lỏng pha ngợc RP-C18 (250 x 4,6mm x 5àm).
12
b) Phạm vi áp dụng
Quy trình này áp dụng cho các loại thực phẩm tơi có nguồn gốc động vật.
c) Tài liệu tham chiếu
A.L. Cinquina, F. Longo, G. Anastasi, L. Giannetti, R. Cozzani (2003). Validation of a high-
performance liquid chromatography method for the determination of oxytetracycline,
tetracycline, chlortetracycline and doxycycline in bovine milk and meat. Journal of
Chromatography A, 987: 227-233[11].
d) Dụng cụ, thiết bị
Hệ thống sắc ký lỏng Breeze/Water với các detecto UV 2487 và bơm 1525
Hệ thống sắc ký lỏng Empower bơm mẫu tự động, với detecto PDA 2996 và detecto huỳnh
quang 2487.
Cột Symmetry C18 (Waters -Mỹ), 5
à
m x 4,6mm x 150mm, kèm bảo vệ cột Symmetry
Guard C18.

d). Hóa chất, dung môi, dung dịch đệm
Các hóa chất và dung môi thuộc loại tinh khiết phân tích:
Etanol (Prolabo - Pháp)
Metanol, axetonitril (J.T. Baker - Mỹ)
n-hexan và axít clohydric (Merck - Đức).
Chất chuẩn tetracyclin C
22
H
24
N
2
0
8
/444,43; oxytetracyclin C
22
H
24
N
2
0
9
/460,44; và
chlortetracyclin C
22
H
23
ClN
2
0
8

/470,84 (Sigma-Mỹ).
Dung dịch đệm :

Đệm McIlvaine pH 4

0.05: Cân 28,4 g Na
2
HPO
4
cho vào bình định mức 1l và hoà tan
bằng nớc cất rồi định mức tới vạch, lắc đều hỗn hợp. Cân 21,0 g axít xitric monohydrat vào
bình định mức 1l khác, hoà tan bằng nớc cất và định mức tới vạch, lắc kỹ. Lấy 1l axít xitric
ở trên trộn với 625 ml Na
2
HPO
4
trong bình 2l. Điều chỉnh pH tới 4

0,05 bằng cách thêm từng
giọt HCl 0,1M (8,3ml HCl đặc/l) hoặc NaOH 0,1M (4g/l). Dung dịch này sử dụng đợc trong
1 tuần.
Dung dịch đệm McIlvaineEDTA: thêm 6,05 g Na
2
EDTA.2H
2
O vào 1,625 L đệm
McIlvaine và trộn hỗn hợp tới khi tan hết. Dung dịch này sử dụng đợc trong 1 tuần.

Axít oxalic trong metanol: hoà tan 1,26 g axít oxalic ( loại sắc ký) trong bình định mức
1l, pha loãng dung dịch tới vạch mức bằng metanol và trộn đều hỗn hợp. Dung dịch đợc sử

dụng trong 1 ngày.
e) Pha dung dịch chuẩn
- Dung dịch chuẩn kháng sinh nhóm tetracyclin: pha dung dịch chuẩn ở điều kiện
13
tránh ánh sáng trực tiếp và bảo quản trong bình màu nâu.
Dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm: cân 100 0,1mg các chất chuẩn tetracyclin,
oxytetracyclin và chlortetracyclin vào từng cốc 50ml, hoà tan và chuyển vào bình định mức
100ml, định mức bằng MeOH ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ. Các dung dịch chuẩn gốc bảo quản ở
4
0
C có thể sử dụng đợc trong 3 tháng.
Hỗn hợp dung dịch chuẩn gốc 100 ppm: lấy 10ml mỗi dung dịch chuẩn gốc 1000
ppm ở trên cho vào 1 bình định mức 100ml, pha loãng tới vạch mức bằng metanol ở nhiệt độ
phòng và lắc kỹ hỗn hợp. Bảo quản ở 4
0
C.
Dung dịch chuẩn làm việc các kháng sinh nhóm tetracyclin 25 ppm: lấy 2,5ml dung
dịch chuẩn hỗn hợp gốc hàm lợng 100 ppm vào trong bình định mức 10ml, định mức tới
vạch bằng MeOH ở nhiệt độ phòng, lắc đều hỗn hợp. Bảo quản ở 4
0
C, pha mới dung dịch này
hàng tuần.
Dung dịch chuẩn các kháng sinh nhóm tetracyclin chạy sắc ký 0,05; 0,1; 0,25; 0,5
và 1,0 (ppm): lấy 20; 40; 100; 200 và 400 (
à
l) chuẩn hỗn hợp tetracycline làm việc cho vào
các bình định mức 10ml. Thêm 6ml axít oxalic trong metanol vào mỗi bình. Định mức tới
vạch bằng nớc cất ở nhiệt độ phòng và lắc kỹ hỗn hợp. Bảo quản ở 4
0
C, pha mới hàng ngày.

f) Xây dựng đờng chuẩn
Đờng chuẩn các kháng sinh tetracyclin, oxytetracyclin và chlortetracyclin đợc xây
dựng bằng cách phân tích dãy chuẩn kháng sinh có nồng độ từ 0,05 đến 1 (ppm). Đờng
chuẩn và phơng trình hồi quy tuyến tính đối với từng loại kháng sinh đợc xác định ở các
hình dới đây.
Đờng chuẩn oxytetracycline
y = 83716x + 121.76
R
2
= 0.9998
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
ppm
Diện tích

Đờng chuẩn tetracycline
y = 83881x + 755.19
R
2
= 0.9997
0

10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
ppm
Diện tích

Đờng chuẩn chlortetracycline
y = 31515x + 29.08
R
2
= 0.9981
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
ppm
Diện tích

g) Các bớc tiến hành
14
Chiết và làm sạch mẫu:
Cân 5,00 0,05g mẫu vào bình nón có nút mài 50ml, thêm 20ml dung dịch đệm
McIlvaine EDTAvà siêu âm lạnh trong 30 phút (hoặc lắc mạnh bằng máy lắc ngang trong 30
phút). Gạn lấy dịch trong vào bình nón khác, bã đợc chiết 2 lần nh trên mỗi lần bằng 5ml
dung dịch đệm McIlvaine-EDTA, gộp dịch trong vào bình nón, thêm 3ml axít tricloaxetic
0,5g/ml vừa cho vừa lắc nhẹ trong khoảng 1 phút. Để bình nón vào nớc đá 15 phút, lọc thu
lấy dịch trong vào bình nón 30ml. Dịch lọc sau đó đợc cho qua cột SPE-C18 (hoạt hoá bằng
6ml MeOH, 6ml nớc cất: 2 lần). Rửa cột SPE bằng 10ml nớc cất, hút chân không đến khô.
Rửa giải bằng 2ml MeOH. Dịch rửa giải đợc bơm vào cột tách sắc ký lỏng để xác định
tetracyclin, oxytetracyclin và chlortetracyclin. Quy trình phân tích đợc tóm tắt nh sau:











6ml MeOH
6ml nớc cất

hoạt hoá
Rửa bã 5ml đệm McIlvaine x 2 lần và
Lặp lại chiết nh trên
Siêu âm trong 30 phút (hoặc lắc mạnh bằng máy lắc ngang)
Gộp dịch lọc qua phễu lọc vào bình nón hoặc ly tâm lạnh 4000v/p, 4
o
C trong 15p
3ml axít tricloaxetic 0,5g/ml và lắc nhẹ
trong 1 phút; để lạnh 15 phút và lọc
Lọc dịch mẫu qua phễu lọc vào bình nón 30ml hoặc ly tâm lạnh 4000v/p, 4
o
C trong 15p
Làm sạch qua cột SPE-C18
Rửa giải bằng 2 ml axít oxalic trong etanol, cho vào lọ/vial 2 ml
Bơm 50
à
l dịch cuối vào HPLC
Cho 5 g mẫu vào bình nón
20ml đệm McIlvaine
3ml dịch lọc mẫu
Rửa tạp: 3ml H
2
O cất x 3 lần, sau đó hút
chân khôn
g
đến khô
15
Điều kiện sắc ký:
- Dung môi pha động: 0,01M axít oxalic/ACN/ MeOH ( 80/13/7, v/v/v)
- Nhiệt độ cột 30

0
C
- Detecto UV 350nm
- Thể tích bơm 50àl.
- Tốc độ dòng 1ml/phút
h) Tính kết quả
D lợng các kháng sinh trong mẫu thực đợc tính toán dựa vào đờng hồi quy tuyến
tính đợc xác định ở trên hoặc theo công thức sau đây:

md
xc
c
A
V
CC
A
m
=ì ì

Trong đó: C
x
: Hàm lợng mẫu phân tích (ppm)
C
c
: nồng độ mẫu chuẩn (ppm)
A
m
: Diện tích pic mẫu
A
c

: Diện tích pic chuẩn
V
d
: Thể tích dịch cuối (ml)
m: khối lợng mẫu phân tích (kg)
* Quy trình phân tích nhóm tetracyclin có độ đúng và độ chính xác:
- Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,9997
- Hệ số thu hồi: đối với oxytetracyclin ở nồng độ 25 ((ppm)) là 84%; tetracyclin 87%;
chlortetracyclin 92%.
- Giới hạn phất hiện (LOD): đối với oxytetracyclin 0,027 ppm; với tetracyclin 0,036
ppm, chlortetracyclin 0,055ppm.
- Giới hạn định lợng (LOQ): đối với oxytetracyclin 0,09 ppm; tetracyclin 0,12 ppm;
với trenbolone, chlortetracyclin 0,18 ppm
đợc minh hoạ ở phần thẩm định (phụ lục 1)

16
3.3.2.2. Phơng pháp phân tích cacbadox
a) Nguyên lý
Cacbadox đợc chiết từ mẫu thịt bằng etanol, sau đó loại tạp bằng cách chiết lỏng -
lỏng với dung dịch đệm và n-hexan, làm sạch qua cột oxýt nhôm và phân tích bằng sắc ký
lỏng hiệu năng cao với detectơ UV ở bớc sóng 350nm.
b) Phạm vi áp dụng
Quy trình này áp dụng cho các loại thực phẩm có nguồn gốc động vật.
c) Tài liệu tham chiếu
MacIntosh AI, Neville GA. (1984). Liquid chromatographic determination of
carbadox, desoxycarbadox, and nitrofurazones in pork tissues. J Assoc Off Anal Chem. Sep-
Oct; 67(5):958-62 [23].
d) Dụng cụ, thiết bị
Hệ thống sắc ký lỏng Breeze với các detectơ UV 2487 và bơm 1525
Hệ thống sắc ký lỏng Empower bơm mẫu tự động, với detectơ PDA 2996 và detecto

huỳnh quang 2487.
Cột Symmetry/Water - C18, (150mm x 4,6mm x 5àm), cột bảo vệ Symmetry Guard.
e) Hóa chất, dung môi
Các hóa chất và dung môi thuộc loại tinh khiết phân tích:
Etanol, etyl axetat (Prolabo-Pháp)
Metanol, axetonitri (Merck)
n-hexan và axít clohydric, bột oxýt nhôm-Al
2
0
3
, celit (Merck-Đức).
Chuẩn carbadox C
11
H
10
N
4
0
4
/263,25 (Sigma-Mỹ)
Axít metaphotphoric 3.6%, amoni axetat (Prolabo-Pháp)
Đệm kali dihydrogen photphat (KH
2
PO
4
) 0.2 M, pH = 3.5
f) Pha dung dịch chuẩn
Dung dịch chuẩn gốc cacbadox: 100 ppm pha trong metanol. Bảo quản tránh ánh sáng
và ở 4
o

C.
Dung dịch chuẩn làm việc: Pha loãng từ chuẩn gốc thành các dung dịch chuẩn có
nồng độ 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; và 1,0 (ppm) bằng metanol. Bảo quản ở 4
0
C. Pha mới hàng ngày.
g) Xây dựng đờng chuẩn
17
Đờng chuẩn cacbadox đợc xây dựng bằng cách phân tích dãy chuẩn có nồng độ từ
0,05 đến 0,5 (ppm). Đờng chuẩn và phơng trình hồi quy tuyến tính đối carbadox đợc thể
hiện ở hình dới đây.

Đờng chuẩn carbadox
y = 79984x + 2741.7
R
2
= 0.9987
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
ppm
Diện tích

h) Các bớc tiến hành: Quy trình phân tích cacbadox:

18

Điều kiện chạy sắc ký:

- Pha động: axetonitril : amoni axetat 0,01M : etanol (25:70:5), pH 6,8
- Tốc độ dòng: 1ml/phút
- Nhiệt độ cột: 30
o
C
Cân 10 g mẫu đã đồng nhất
100 ml etanol
Chiết bằng máy xay trong 10 phút

Lọc qua một lớp Celit 545, thu lấy dịch lọc

Thêm vào dịch lọc 25 ml axít metaphotphoric 3,6%

Lắc đều, cô quay chân không đến khoảng 25 ml

Thêm 5 ml hexan, lắc đều, ly tâm

Thêm 10 ml KH
2
PO
4
0,2 M

Trộn đều, thêm nớc đến 100ml, chuyển sang bình gạn

Chiết 3 lần, mỗi lần bằng 50 ml etyl axetat
Gộp dịch chiết hữu cơ, loại nớc bằng Na
2
SO
4


Cô quay chân không đến khô ở 50
o
C

Hòa tan bằng 3 ml etyl axetat

Làm sạch qua cột Al
2
0
3

Cô quay dịch lọc đến khô ở 45
o
C và hòa tan cặn bằng 500 àl pha động
bột nhão: 1g bột nhôm
20 ml etyl axetat
rửa giải: 20ml EtOH:MeOH:EtAC (10:10:80)
19
- Detectơ UV: bớc sóng 350 nm
i) Tính kết quả
md
xc
c

A
V
CC
A
m
=ì ì

Trong đó: C
x
: Hàm lợng mẫu phân tích (ppm)
C
c
: nồng độ mẫu chuẩn (ppm)
A
m
: Diện tích pic mẫu
A
c
: Diện tích pic chuẩn
V
d
: Thể tích dịch cuối (ml)
m: khối lợng mẫu phân tích (kg)
*
Quy trình phân tích cacbadox có độ đúng và độ chính xác:

- Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,9987
- Hệ số thu hồi: với mẫu nạp chuẩn nồng độ 0,1 (ppm) là 68%.
- Hệ số biến thiên (C. V): 0,005
- Giới hạn phất hiện (LOD): 0,015 (ppm)

- Giới hạn định lợng (LOQ): 0,051 (ppm)
đợc minh hoạ ở phần thẩm định (phụ lục 2).
20
3.3.2.3. Phơng pháp phân tích olaquindox
a) Nguyên lý
Mẫu đã đồng nhất kỹ đợc chiết bằng nớc cất, sau đó đợc làm sạch qua cột SPE-
phenyl. Dịch cuối đợc phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ UV ở bớc sóng
260 nm.
b) Phạm vi áp dụng
Quy trình này áp dụng cho các loại thực phẩm có nguồn gốc động vật.
c) Tài liệu tham chiếu
Spierenburg, T.J., H. Van Lenthe, G. DeGraff, and L.P. Jagen (1988). Liquid
chromatographic determination of olaquindox in medicated feeds and in contents of porcine
gastrointestinal tract. J Assoc Off Anal Chem Nov-Dec; 71(6):1106-9 [29].
d) Dụng cụ, thiết bị
Hệ thống sắc ký lỏng Breeze với các detecto UV 2487 và bơm 1525
Hệ thống sắc ký lỏng Empower bơm mẫu tự động, với detecto PDA 2996 và detecto
huỳnh quang 2487.
Cột Symmetry C18 (Waters-Mỹ), 150mm x 5àm x 4,6; cột bảo vệ Symmetry Guard.
Cột chiết pha rắn loại phenyl (100mg, 1.5ml), Alltech, Mỹ
e) Hóa chất, dung môi
Các hóa chất và dung môi thuộc loại tinh khiết phân tích:
Etanol (Prolabo - Pháp)
Metanol, axetonitril (J.T. Baker - Mỹ)
n-hexan, amoni axetat (Merck - Đức).
Chuẩn olaquindox C
10
H
10
N

3
0
4
(JAPAN)
f) Pha dung dịch chuẩn
Dung dịch chuẩn gốc olaquindox: 100 ppm pha trong metanol. Bảo quản tránh ánh
sáng và ở 4
o
C.
Dung dịch chuẩn làm việc: Pha loãng từ chuẩn gốc thành các dung dịch chuẩn có
nồng độ 0,05; 0,1; 0,2; 0,4 và 1,0 (ppm) bằng metanol.
g) Xây dựng đờng chuẩn
Đờng chuẩn olaquindox đợc xây dựng bằng cách phân tích dãy chuẩn có nồng độ
từ 0,05 đến 1 (ppm). Đờng chuẩn và phơng trình hồi quy tuyến tính đối olaquindox đợc
thể hiện ở hình dới đây.
21

Đờng chuẩn olaquindox
y = 86044x + 2286.8
R
2
= 0.9975
0
20000
40000
60000
80000
100000
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
ppm

Diện tích

h) Các bớc tiến hành quy trình phân tích olaquindox:
5 g mẫu đồng nhất

Thêm 20 ml nớc cất

Lắc ngang 2 giờ

Ly tâm 15 phút, tốc độ 4500 vòng/ phút

Thu lấy dịch chiết

Làm sạch qua SPE, loại phenyl (5ml)



Điều kiện chạy sắc ký

- Pha động: axetonitril : amoni axetat 0,01M : etanol (25:70:5; v/v/v),
pH= 6,8
- Tốc độ dòng: 1ml/phút
- Nhiệt độ cột: 30
o
C
- Detecto: UV bớc sóng 260nm
hoạt hoá:
6 ml metanol,
3 ml nớc cất
Rửa cột: 2 lần x 2ml nớc cất.

Làm khô trong 4 phút
Rửa giải:
5 ml ACN: H
2
O (7,5: 92,5)
Tiến hành sắc ký
22
h) Tính kết quả
md
xc
c
A
V
CC
A
m
=ì ì

Trong đó: C
x
: Hàm lợng mẫu phân tích (ppm)
C
c
: nồng độ mẫu chuẩn (ppm)
A
m
: Diện tích pic mẫu
A
c
: Diện tích pic chuẩn

V
d
: Thể tích dịch cuối (ml)
m: khối lợng mẫu phân tích(kg)

* Quy trình phân tích olaquindox có độ đúng và độ chính xác:
- Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,9975
- Hệ số thu hồi: 74%.
- Hệ số biến thiên (C. V): 0,018
- Giới hạn phát hiện (LOD): 0,054 ppm
- Giới hạn định lợng (LOQ): 0,18 ppm
đợc minh hoạ ở phần thẩm định (phụ lục 2)

23
3.3.2.4 Phơng pháp phân tích testosteron, progesteron, 17-estradiol,
trenbolon, dexamethason
a) Nguyên lý
Mẫu thịt, gan đợc chiết bằng đệm axetate (0,2M; pH 5,2) và dung môi MeOH.
Dịch lọc sau ly tâm đợc làm sạch chất béo qua cột SPE-C18, rửa giải bằng MeOH đem cô
quay, hoà tan cặn bằng hỗn hợp dung môi n-hexan/diclometan (60/40; v/v). Dịch mẫu tiếp
tục đợc làm sạch qua cột SPE-Si và rửa giải bằng hỗn hợp dung môi n-hexan/etyl axetat
(25/75; v/v), cô quay chân không hoà cặn bằng axetonitril và tiến hành chạy sắc ký bằng Sắc
ký lỏng với detectơ PDA ở bớc sóng 242 và 260nm.
b) Phạm vi áp dụng
Quy trình này áp dụng cho các loại thực phẩm có nguồn gốc động vật.
c) Tài liệu tham chiếu
1. Jungju Seo, Hye-Young Kim, Bong Chul Chung, Jongki Hong (2005).
Simultaneous determination of anabolic steroids and synthetic hocmones in meat by
freezing-lipid filtration, solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.
Journal of Chromatography A

,
1067: 303-309 [22].
2. Tomoyuki Miyazaki, Takeo Sasamoto, Tsuneo Hashomoto and Yataro Kokubo.
Determination of Anabolic Agents in beef and milk by HPLC with Photodiode Array
Detector. Vol.36, No. 6 (1995) [28].
d) Dụng cụ, thiết bị
- Hệ thống HPLC Shimadzu; cột Lichrospher pha ngợc RP-18 (250mm x 4,6mm x
5àm)
- Máy đồng nhất Ultra Turrax T25
- Máy ly tâm Mikro 22R-Hettich
- Máy siêu âm đuổi khí Ultrasonic LC30
- Cột làm sạch chiết pha rắn SPE-Si và cột SPE-C18 loại 3ml/Supelco.
e) Hoá chất, dung môi, tinh khiết phân tích sắc ký
- Hoá chất, dung môi (Merck)
Axetonitril, diclometan, metanol, n-hexan,
- Đệm axetat (0,2M; pH 5,2): hoà tan 27,126g natri axetat trihydrat trong bình
định mức 1l, pha loãng dung dịch tới vạch mức bằng nớc cất 2 lần và trộn đều hỗn hợp.
Dung dịch đợc sử dụng trong 1

ngày.
- Thuốc thử độ tinh khiết 98 - 99%
24
17-estradiol/C
18
H
24
O
2
/272,4-khối lợng phân tử (Hanvet)
Progesteron/C

21
H
30
O
2
/314,5 (SIGMA)
Testosteron/C
19
H
28
O
2
/288,4 (Acros organics)
Dexamethason/C
22
H
30
FO
5
/392,5 (SIGMA)
Trenbolon/C
18
H
22
0
2
/270,4 (SIGMA)
f) Pha dung dịch chuẩn hỗn hợp
Pha dung dịch chuẩn ở điều kiện tránh ánh sáng trực tiếp và bảo quản trong bình
màu nâu:

Dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm: cân 100

0,1mg các chất chuẩn testosteron,
progesteron, 17

-estradiol, trenbolon, dexamethason vào từng cốc 50ml, hoà tan và chuyển
vào bình định mức 100 ml, định mức bằng axetonitrill ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ. Các dung
dịch chuẩn gốc bảo quản ở 4
0
C có thể sử dụng đợc trong 3 tháng.
Hỗn hợp dung dịch chuẩn gốc 100 ppm: lấy 10ml mỗi dung dịch chuẩn gốc 1000
àg/ml ở trên cho vào 1 bình định mức 100ml, pha loãng tới vạch mức bằng axetonitrill, lắc kỹ
hỗn hợp. Bảo quản 4
o
C.
Dung dịch chuẩn làm việc các hocmon 25 ppm: lấy 2,5ml dung dịch chuẩn hỗn hợp
gốc hàm lợng 100àg/ml vào trong bình định mức 10ml, định mức tới vạch bằng axetonitril ở
nhiệt độ phòng, lắc đều hỗn hợp. Bảo quản ở 4
o
C. Pha mới dung dịch này hàng tuần.
Dung dịch chuẩn các hocmon chạy sắc ký 0,0025; 0,005; 0,05; 0,5; 1,0; 2,5 (ppm):
hút 1,0; 2,0; 20,0; 200; 400; 1000 (àl) chuẩn hỗn hợp hocmon 25ppm làm việc cho vào các
bình định mức 10ml. Định mức tới vạch bằng axetonitril ở nhiệt độ phòng và lắc kỹ hỗn hợp.
Bảo quản ở 4
o
C, sử dụng đợc trong 1 tuần.
g) Xây dựng đờng chuẩn
Tiến hành phân tích dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau bằng HPLC thu đợc các
pic có diện tích khác nhau. Dựa trên nồng độ các dung dịch chuẩn và diện tích các pic thu

đợc xác định đờng chuẩn cho từng loại hocmon.