Ứng dụng kỹ thuật NAT để phát hiện sớm HIV, HBV, HCV ở người cho máu

Bộ y tế
******



Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

ứng dụng kỹ thuật nat để phát hiện
sớm hiv, HBV, hcv ở ngời cho máu

Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Nguyễn Anh Trí
PGS. TS. Bạch Khánh Hòa
Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Huyết học Truyền máu TW









6909
26/6/2008

Hà Nội 2008

Bộ y tế
******

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

ứng dụng kỹ thuật nat để phát hiện
sớm hiv, HBV, hcv ở ngời cho máu





Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Nguyễn Anh Trí
PGS. TS. Bạch Khánh Hòa
Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Huyết học Truyền máu TW
Cấp quản lý: Bộ Y tế

Thời gian thực hiện: từ tháng 10/2005 đến tháng 12/2007
Tổng kinh phí : 350 triệu đồng (ba trăm năm mơi triệu đồng)
Trong đó, kinh phí SNKH: 100%





Hà Nội 2008
Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ
1. Tên đề tài: ứng dụng kỹ thuật nat để phát hiện sớm hiv, HBV, hcv
ở ngời cho máu.
2. Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Nguyễn Anh Trí.
PGS.TS. Bạch Khánh Hòa.

3. Th ký đề tài: Nguyễn Quốc Cờng
Trần Vân Chi
4. Danh sách những ngời thực hiện chính:
TT Họ và tên cán bộ thực
hiện đề tài
Học vị, học
hàm, chức vụ
Cơ quan công tác
1 Nguyễn Chí Tuyển Bác sỹ Viện Huyết học-Truyền
máu TW
2 Nguyễn Quốc Cờng Cử nhân Viện Huyết học-Truyền
máu TW
3 Chử Thị Thu Hờng Bác sỹ Nội trú Đại học Y Hà Nội
4 Nguyễn Minh Phơng Cử nhân Viện Huyết học-Truyền
máu TW
5 Nguyễn Kim Dũng Kỹ thuật viên Viện Huyết học-Truyền
máu TW

5. Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 10/2005 đến tháng 12/2007.
Lời cảm ơn.
Chúng tôi chân thành cảm ơn Vụ Khoa học và Đào tạo - Bộ Y tế, Ban
lãnh đạo Viện Huyết học Truyền máu TW, Khoa Thu gom máu - Viện
Huyết học - Truyền máu TW, Hãng CHIRON giúp đỡ và tạo điều kiện để
chúng tôi hoàn thành tốt đề tài này.

Bản tự đánh giá
Về tình hình thực hiện và những đóng góp mới của đề tài KH&CN cấp Bộ

1. Tình hình thực hiện đề tài so với đề cơng:
1.1/ Về mức độ hoàn thành, khối lợng công việc: đã hoàn thành vợt

mức khối lợng công việc so với đề cơng. Đề cơng đặt ra là 6000 mẫu thực
hiện 9.392 mẫu.
1.2/ Về các yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm
KHCN: đã ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử (NAT) thực hiện trong sàng lọc
máu.
1.3/ Về tiến độ thực hiện : đã hoàn thành đúng tiến độ đề ra.
2. Về những đóng góp mới của đề tài:
Trên cơ sở so sánh với những thông tin đã đợc công bố trên các ấn
phẩm trong và ngoài nớc đến thời điểm kết thúc đề tài, đề tài có những điểm
mới sau đây:
Về giải pháp Khoa học Công nghệ: ứng dụng kỹ thuật mới trong sàng
lọc để thực hiện an toàn truyền máu.
Hà Nội, ngày 26 tháng 1 năm 2008.
Chủ nhiệm đề tài



PGS. TS. Nguyễn Anh Trí


Các chữ viết tắt


A : Adenine
AIDS : Aquired Immune Deficiency Symdrome
(Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải)
Anti HBs : Anti Hepatitis B surface
(Kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B)
Anti HBc : Anti Hepatitis B core
(Kháng thể kháng kháng nguyên lõi virus viêm gan B)

Anti HBe : Anti Hepatitis B e
(Kháng thể kháng kháng nguyên e virus viêm gan B)
Au : Australia
BN : Bệnh nhân
C : Cytosin
DNA : Acid Desoxyribonucleic
ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay
(Kỹ thuật miễn dịch gắn enzym)
EIA : Enzyme Immunoassay
(Kỹ thuật miễn dịch enzym)
FDA : Food and Drug Administration
(Cục quản lý thực và dợc phẩm Hoa Kỳ)
G : Guanin
HBcAg : Hepatitis B core Antigen
(Kháng nguyên lõi virus viêm gan B)
HBsAg : Hepatitis B surface Antigen
(Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B)
HBeAg : Hepatitis B e Antigen (Kháng nguyên e virus viêm gan B)
HBV : Hepatitis B virus (Virus viêm gan B)
HCV : Hepatitis C virus (Virus viêm gan C)
HH-TM TW: Huyết Học Truyền máu Trung Ương
IC : Internal Control (Nội kiểm tra)
KN : Kháng nguyên
KT : Kháng thể
NAT : Nucleic acid testing (Xét nghiệm phát hiện acid nucleic)
NCM : Ngời cho máu
NCMCN : Ngời cho máu chuyên nghiệp
NCMTN : Ngời cho máu tình nguyện
NNCM : Ngời nhà cho máu
PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi)

RNA : Acid Ribonucleic
wTCR : working Target Capture Reagent
(Hóa chất bắt giữ trình tự đích)
T : Tymin
TTUs : Ten tips Unit (Thanh chứa 10 tip đựng mẫu)
TTC : Ten tips Cassette (Thanh có chứa 10 đầu côn để rửa)
XN : Xét nghiệm







Mục lục

đặt vấn đề
1

Chơng I: tổng quan tài liệu
3
1.1. Lịch sử sàng lọc các tác nhân lây bệnh qua đờng truyền
máu
3
1.1.1. Trên thế giới
3
1.1.2. Tại Việt Nam
5
1.2. Đặc điểm sinh học của HIV, HCV, HBV
6

1.2.1. Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngời (HIV)
6
1.2.2. Virus viêm gan C
9
1.2.3. Virus viêm gan B
10
1.3. Các biện pháp bảo đảm an toàn truyền máu, phòng lây
nhiễm HIV, HBV, HCV qua đờng truyền máu
14
1.3.1. Lựa chọn NCM an toàn
14
1.3.2. Các kỹ thuật sàng lọc huyết thanh HIV, HBV, HCV cho NCM
15
1.4. Kỹ thuật sàng lọc NAT
18
1.4.1. Cơ sở sinh học phân tử
18
1.4.2. Nguyên lý kỹ thuật
20
1.4.3. Các giai đoạn kỹ thuật
21
1.5. Tình hình áp dụng quy trình kỹ thuật sàng lọc NAT để phát
hiện sớm NCM nhiễm HIV, HBV, HCV trên thế giới và tại Việt
Nam
23
1.5.1. Trên thế giới
23
1.5.2. Tại Việt Nam
24
Chơng 2: đối tợng và phơng pháp

25
nghiên cứu
2.1 Đối tợng nghiên cứu
25
2.2 Vật liệu nghiên cứu
25
2.3 Phơng pháp nghiên cứu
27
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu
27
2.3.2. Kỹ thuật NAT
29
2.4. Xử lý số liệu
37
Chơng III: Kết quả nghiên cứu
38
3.1. Kết quả nghiên cứu hiệu quả sử dụng kỹ thuật NAT trong
việc nâng cao tính an toàn sinh học của các chế phẩm máu
38
3.1.1. Kết quả xét nghiệm NAT của mẫu trộn 8 để phát hiện đồng
thời cả 3 loại virus HIV, HBV, HCV
38
3.1.2. Kết quả tỉ lệ không có giá trị trong quá trình xét ngiệm
39
3.1.3. Số lần chạy có không có giá trị trong quá trình xét nghiệm
41
3.1.4. Kết quả xác định loại virus bằng Probe đặc hiệu
41
3.1.5. Kết quả xác định ngời cho máu bị nhiễm virus viêm gan C
trong mẫu trộn dơng tính

43
3.1.6. Tỉ lệ nhiễm các virus đợc sàng lọc bằng kỹ thuật NAT trong
nghiên cứu
43
3.1.7. Kết quả RT-PCR của mẫu bị nhiễm virus HCV
43
3.2. Xây dựng labo sinh học phân tử (SHPT) thực hiện đợc các
kỹ thuật SHPT trong đó có NAT phục vụ cho nội dung sàng lọc
máu và đào tạo
44
Chơng IV: Bàn luận
45
4.1 . Kết quả nghiên cứu hiệu quả sử dụng kỹ thuật NAT trong
việc nâng cao tính an toàn sinh học của các chế phẩm máu
45
4.1.1. Kỹ thuật NAT
45
4.1.2. Sử dụng trộn 8
46
4.1.3. Tỉ lệ dơng tính khi phát hiện đồng thời cả 3 loại virus HIV,
HBV, HCV (Procleix Ultrio Assay)
47
4.1.4. Tỉ lệ không có giá trị trong quá trình xét nghiệm
49
4.1.5. Kết quả xác định loại virus bằng Probe đặc hiệu
51
4.1.6. Kết quả xác định ngời cho máu bị nhiễm virus viêm gan C
trong mẫu trộn dơng tính
52
4.1.7. Tỉ lệ nhiễm các virus đợc sàng lọc bằng kỹ thuật NAT trong

nghiên cứu
52
4.1.8. Kết quả RT-PCR và ELISA của mẫu bị nhiễm virus HCV
56
4.2. Xây dựng labo sinh học phân tử (SHPT) thực hiện đợc các
kỹ thuật SHPT trong đó có NAT phục vụ cho nội dung sàng lọc
máu và đào tạo
57
Kết luận
60
Kiến nghị
61
Tài liệu tham khảo

Danh sách mẫu huyết tơng






1
đặt vấn đề

Máu rất quan trọng và cần thiết cho sự sống, nhờ có máu mà nhiều
ngời bệnh đã đợc cứu sống. Máu và chế phẩm máu có tầm quan trọng đặc
biệt trong điều trị các bệnh máu cũng nh cần để cấp cứu các trờng hợp chảy
máu sau đẻ, chảy máu do chấn thơng, tai nạn và thảm họa. Máu quan trọng
nh vậy nhng truyền máu có thể gây tai biến cho ngời bệnh [18].
An toàn truyền máu là nội dung xuyên suốt trong chiến lợc truyền

máu của Quốc gia, trong đó sàng lọc các tác nhân lây nhiễm qua đờng truyền
máu đợc xem là một trong những nội dung then chốt [18].
Các tác nhân gây bệnh có thể đợc truyền từ máu và chế phẩm máu của
ngời cho máu (NCM) đã nhiễm bệnh sang ngời thân. Căn nguyên gây các
bệnh nhiễm trùng qua đờng máu có rất nhiều [54], [55], tuy nhiên theo
khuyến cáo của Tổ chức Y tế thế giới thì 3 virus bắt buộc phải đợc sàng lọc
NCM là HIV, HBV, HCV [58], [102].
Trong sàng lọc NCM hiện nay, ngời ta dùng phơng pháp ELISA để
phát hiện các kháng thể (KT) và các kháng nguyên (KN) của virus. Phơng
pháp này có độ tin cậy khá cao, tuy nhiên nhợc điểm của phơng pháp là phụ
thuộc rất nhiều vào đáp ứng miễn dịch của mỗi cá thể, giai đoạn cửa sổ còn
khá dài, nguồn NCM cha thực sự an toàn. Do vậy, ngời ta vẫn gặp những
trờng hợp bệnh nhân (BN) bị lây nhiễm virus do truyền máu nhiễm virus
trong giai đoạn cửa sổ.
Từ năm 1999, kỹ thuật NAT đã phát triển cho phép xác định trực tiếp
HIV-RNA, HBV-DNA, HCV-RNA. Nhờ sử dụng phơng pháp này, ngời ta
có thể loại trừ những mẫu máu có virus mà kỹ thuật huyết thanh học không
phát hiện đợc, do đó làm giảm nguy cơ BN bị lây nhiễm virus do truyền máu
trong giai đoạn cửa sổ. Cụ thể rút ngắn giai đoạn cửa sổ từ 80-90 ngày còn 23

2
ngày cho HCV; 22-30 ngày còn 11 ngày cho HIV; 50-60 ngày xuống còn 34
ngày cho HBV [51].
Hiện nay, một số nớc tiên tiến đã áp dụng thờng quy kỹ thuật NAT
để sàng lọc HIV, HBV, HCV cho NCM nh Mỹ, Nhật, Hà Lan, Thụy Điển,
Đức
Tại Việt Nam, sàng lọc HIV, HBV, HCV cho NCM đã đợc thực hiện
trên phạm vi toàn quốc từ cuối năm 1994. Tuy nhiên do điều kiện kinh phí còn
hạn hẹp nên các biện pháp kỹ thuật sàng lọc NCM còn nhiều hạn chế, vì vậy
giai đoạn cửa sổ huyết thanh còn khá dài nên việc lây nhiễm các bệnh qua

đờng truyền máu là khó tránh khỏi do không phát hiện đợc [19], [20], [30].
Xuất phát từ thực trạng trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này
nhằm mục tiêu:
1. Nghiên cứu hiệu quả sử dụng kỹ thuật NAT trong việc nâng
cao tính an toàn sinh học của các chế phẩm máu.
2. Xây dựng labo sinh học phân tử (SHPT) thực hiện đợc các kỹ
thuật SHPT trong đó có NAT phục vụ cho nội dung sàng lọc máu và đào tạo.













3
Chơng I
Tổng quan
1.1. Lịch sử các tác nhân lây bệnh qua đờng truyền máu
1.1.1. Trên thế giới
Năm 1885, Lurman đã thông báo 191 trờng hợp viêm gan sau khi tiêm
chủng vaccine phòng đậu mùa [82]. Năm 1963 Blumberg bắt đầu nghiên cứu
tìm yếu tố huyết thanh để chẩn đoán bệnh này [18].
Năm 1965 Blumberg và cộng sự lần đầu tiên miêu tả KN Australia và
cho rằng KN này có thể đợc phát hiện trong huyết thanh của nhiều BN

Hemophilia đợc truyền máu nhiều lần [42].
Năm 1967 ông đã thành công trong việc dùng KT miễn dịch khuếch tán
trên gel thạch phát hiện KN viêm gan B, ký hiệu Au [18].
Năm 1970, nhà bác học Dane và cộng sự đã phân lập đợc virus viêm
gan B hoàn chỉnh gọi là Dane [17], [18], [37]. Những năm tiếp theo các dấu
ấn miễn dịch khác của virus viêm gan B nh kháng thể HBs, HBeAg, kháng
thể HBc, kháng thể HBe, HBcAg lần lợt đợc phát hiện [18], [69].
Sàng lọc HBsAg cho NCM đợc bắt đầu từ năm 1971, kỹ thuật ban đầu
đợc sử dụng là kỹ thuật khuếch tán trên gel thạch và kỹ thuật điện di. Năm
1975 sử dụng kỹ thuật phóng xạ miễn dịch (RIA) và kỹ thuật miễn dịch
enzym (EIA) để phát hiện HBsAg [71]. Năm 1980 bắt đầu sử dụng ELISA để
sàng lọc HBsAg ở NCM.
Virus viêm gan C đợc Houghton xác định và phân lập năm 1988, đồng
thời ông cũng là ngời nghiên cứu thành công trong việc sản xuất kít ELISA
thế hệ thứ nhất để chẩn đoán tình trạng nhiễm HCV [18].
Năm 1989, tác nhân gây viêm gan non A- non B đã đợc sáng tỏ [18].
Các nhà khoa học đã phân lập đợc virus viêm gan C và họ đã lai tạo thành
công dòng vô tính của virus từ E.coli chủng C-300-3 và từ kết quả này họ đã

4
sử dụng KN C-300-3 để phát hiện KT chống HCV trong huyết thanh của BN
viêm gan [65].
Năm 1990 tại Mỹ đã sử dụng kỹ thuật EIA thế hệ 1 (HCV 1.0 EIA) để
phát hiện KT đặc hiệu với KN Protein c100-3 của HCV [73].
Năm 1992 kỹ thuật EIA thế hệ 2 phát triển (HCV 2.0 EIA) có độ nhạy
hơn thế hệ 1 trong việc phát hiện nhiễm trùng HCV cấp và mạn. KN đợc sử
dụng trong kỹ thuật này bao gồm 2 thành phần protein: 1 cấu trúc (c22-3) và 1
không cấu trúc (c33c). Những KT chống lại protein này xuất hiện sớm hơn
c100-3 do đó giai đoạn cửa sổ huyết thanh học đợc rút ngắn so với thế hệ 1 là
10-20 ngày [73].

Năm 1996 kỹ thuật EIA thế hệ 3 (HCV 3.0 EIA) đã phát triển, kỹ thuật
này khác với những thế hệ trớc là bỏ đi phức hợp Protein c100 và thêm phức
hợp Protein NS-5. Do đó giai đoạn cửa sổ huyết thanh học đợc rút ngắn 10
ngày so với thế hệ 2 [41], [50].
Năm 1981, tại Los Angeles (Mỹ) nhà khoa học P. Carini đã phát hiện
một số trờng hợp đồng tính luyến ái nam bị viêm phổi rất nặng [27], [55].
Tháng 6/1981 bác sỹ Michael Goleb đã mô tả bệnh nhân đầu tiên bị hội chứng
suy giảm miễn dịch mắc phải ở ngời [36]. Năm 1983 nhà bác học Luc
Montagnier (Pháp) và Gallo (Mỹ) đã phát hiện và chứng minh HIV chính là
căn nguyên gây hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở ngời [55], [80].
Ngày 02/03/1985, Cục quản lý thực và dợc phẩm Hoa Kỳ, viết tắt là
FDA (Food and Drug Administration) cho phép sử dụng kỹ thuật EIA đầu tiên
để phát hiện kháng thể HIV-1 [39], [44]. Năm 1987 tại Mỹ bắt đầu sử dụng kỹ
thuật thấm miễn dịch (Western Blot - WB) để phát hiện kháng thể HIV. Năm
1996 FDA bắt đầu sử dụng kỹ thuật phát hiện KN p24 của virus HIV-1 để
sàng lọc NCM.
Từ năm 1999 FDA đã cho phép sử dụng kỹ thuật NAT để phát hiện trực
tiếp RNA của virus HCV và HIV-1 tại Mỹ [45], [68]. Phơng pháp này làm

5
tăng cờng độ an toàn của máu, có thể phát hiện đợc nhiễm trùng virus cấp
tính trong giai đoạn cửa sổ mà tại thời điểm đó phơng pháp huyết thanh học
không phát hiện đợc. Hiện nay, nhiều nớc trên thế giới đã áp dụng kỹ thuật
NAT để sàng lọc các virus ở NCM làm giảm tối đa sự lan truyền virus qua
đờng truyền máu, nhờ đó tỉ lệ lây nhiễm virus đã giảm đi rất nhiều.
1.1.2. Tại Việt Nam
Năm 1970 KN Australia gọi là KN viêm gan B xuất hiện trên 1 BN nữ
thiếu máu tan máu tự miễn đợc truyền máu nhiều lần. Từ năm 1970 Khoa
Huyết học-Truyền máu BV Bạch Mai và một số nơi trên Việt Nam bắt đầu
tiến hành kiểm tra kháng nguyên Au trên NCM nhng cũng mới chỉ sử dụng

kỹ thuật khuếch tán trên gel thạch.
Năm 1984 chúng ta bắt đầu sử dụng kỹ thuật ELISA để sàng lọc NCM
ở một số trung tâm truyền máu lớn.
Phơng pháp và kỹ thuật phát hiện KN Au có rất nhiều [18], KN đợc
phát hiện có thể chính là virus hoặc là những thành phần liên quan chặt chẽ
với virus viêm gan, đơn giản nhất là kỹ thuật miễn dịch khuếch tán trên gel
thạch. Huyết thanh cần xác định và kháng thể Australia đợc đặt đối diện
trong 2 ô. Nếu huyết thanh BN có chứa KN thì sẽ hình thành 1 cung tủa nơi
gặp nhau của 2 huyết thanh.
Ngoài ra còn có kỹ thuật kết hợp bổ thể, ngng kết bị động ngợc, miễn
dịch phóng xạ, thờng dùng là điện di miễn dịch khuếch tán.
Kỹ thuật chủ yếu dùng ở Việt Nam thời đó là kỹ thuật khuếch tán miễn
dịch Ouchterlony và miễn dịch khuếch tán điện di của Repars cải tiến. Kỹ
thuật sử dụng sàng lọc NCM là kỹ thuật điện di khuếch tán vì có u điểm là
thời gian nhanh và sàng lọc đợc nhiều, tuy nhiên độ nhạy cha cao vì thế bỏ
sót những KN yếu.
Giáo s Bạch Quốc Tuyên và cộng sự [31] đã chỉnh lý kỹ thuật kết hợp
bổ thể, kỹ thuật ngng kết bị động ngợc để tăng độ nhạy của sàng lọc nhng

6
các kỹ thuật đó chỉ dùng vào một số trờng hợp nghiên cứu vì tốn kém kháng
thể nhiều và không thuận lợi khi xét nghiệm hàng loạt.
Tại Việt Nam, việc sàng lọc cả ba loại virus này mới đợc thực hiện từ
đầu những năm 90 của thế kỷ trớc và cho đến nay vẫn tỏ ra hữu hiệu trong
việc ngăn chặn sự lan truyền bệnh dịch. Từ năm 1996 trở về đây đã có thống
kê bớc đầu về tình hình lây nhiễm các virus qua đờng truyền máu [18].
Hiện nay phần lớn các trung tâm truyền máu nớc ta đã sử dụng kỹ
thuật ELISA với thế hệ kít thứ 3 (phát hiện đợc cả hai loại kháng thể HIV
loại IgG và IgM ) và thế hệ thứ 4 (phát hiện cả KN HIV p24, hai loại kháng
thể HIV IgG, IgM). Do vậy có thể phát hiện đợc NCM bị nhiễm HIV trong

vòng từ 14 đến 38 ngày.
Năm 1997 các tác giả nớc ngoài đã nghiên cứu áp dụng kỹ thuật PCR
phát hiện HIV-RNA, HCV-RNA, HBV-DNA để sàng lọc NCM [18]. Tuy
nhiên, kỹ thuật này đòi hỏi phải có trình độ chuyên môn cao, giá trang thiết bị
đắt tiền, điều kiện XN ngặt nghèo và giá thành cho một XN còn khá cao, thời
gian XN đòi hỏi lâu, do vậy việc tiến hành kỹ thuật PCR sàng lọc NCM ở Việt
Nam vẫn cha đợc ứng dụng để sàng lọc HIV, HCV, HBV.
1.2. Đặc điểm sinh học của HIV, HCV, HBV
1.2.1. Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngời (HIV)
1.2.1.1 Cấu trúc HIV
HIV thuộc nhóm Retroviridae, thuộc họ Lentivirus, có kích thớc từ
100-200 nm. Dới kính hiển vi điện tử cấu trúc HIV gồm 3 phần: [18], [55],
[101]
- Lớp vỏ (envelop): Đợc cấu tạo bởi lớp lipid kép và các glycoprotein
màng gồm gp 110, gp 120, gp 40, gp 41.
- Phần nhân: Bao gồm các Protein là p24, p17, p18, p51, p56. Các
protein này tạo nên khung cấu trúc của virus.
- Các enzym:

7
+ Reverse trancriptaza (RT): làm nhiệm vụ xúc tác quá trình sao chép
ngợc từ RNA của virus thành sợi DNA, nhờ đó sợi DNA này có khả năng
gắn vào sợi DNA của tế bào vật chủ.
+ Proteaza: làm nhiệm vụ xúc tác quá trình cắt những protein mới đợc
tổng hợp quá dài để tạo ra những protein có kích cỡ thích hợp hơn.
+ Integraza: làm nhiệm vụ gắn liên kết DNA của virus vào DNA của tế
bào vật chủ.
- Genome của HIV: là sợi đơn RNA gồm 10.000 nucleotid và có 9 gen,
trong đó có 3 gen chủ yếu là:
+ Gag: Mã hóa cho việc tổng hợp protein nhân là p17 và p24.

+ Env: Mã hoá cho việc tổng hợp protein màng là gp 120, gp 41,
+ Pol: Mã hoá cho việc tổng hợp 3 enzym: RT, proteaza, integraza.
00
Hình 1-1: Cấu trúc HIV [18]
Hiện nay, ngời ta đã phát hiện đợc cả hai loại HIV-1 và HIV-2. HIV-
1 gặp ở trên khắp thế giới, đợc phát hiện năm 1983. HIV-2 gặp chủ yếu ở
Tây và Đông Phi, Tây ấn Độ, đợc phát hiện năm 1986. Cả HIV-1 và HIV-2
đều là căn nguyên gây bệnh AIDS, tuy nhiên HIV-2 thờng khó đợc lan
p
roteaza
p
reteaza
reverse transci
p
taza
inte
g
raza

8
truyền hơn và khoảng thời gian từ lúc nhiễm đến lúc phát bệnh là lâu hơn
đáng kể so với HIV-1 [25], [27], [35].
1.2.1.2. Chuyển đổi huyết thanh của ngời nhiễm HIV/AIDS
- Giai đoạn I: Nhiễm trùng khởi phát có thể chia thành 2 giai đoạn nhỏ.
Giai đoạn đầu, ngời nhiễm HIV chỉ có những biểu hiện lâm sàng giống nh
các virus khác: sốt, đau mình mẩy, phát ban, sng hạch và trong huyết thanh
cha tìm thấy KN và KT, giai đoạn này kéo dài từ 1-2 tuần kể từ khi nhiễm
trùng. Giai đoạn tiếp theo trong huyết thanh xuất hiện kháng nguyên HIV
thờng phát hiện thấy KN p24. Tiếp theo có thể phát hiện thấy kháng thể
chống HIV type IgM. Thời gian này kéo dài 3-6 tuần.

Hình 1-2: Diễn biến huyết thanh của ngời nhiễm HIV [18].
- Giai đoạn II: Thời kỳ nhiễm trùng tiềm tàng. Trong huyết thanh xuất
hiện kháng thể chống HIV type IgM, KN và KT type IgM mất dần và không
phát hiện đợc. Tiếp đó là sự hình thành KT chống HIV type IgG. Thời kỳ này
kéo dài 3 tháng, 1 năm, 3 năm, 10 năm, thậm chí dài hơn nữa [18], [55] [49].

9
- Giai đoạn III: Nhiễm trùng cấp, ngời nhiễm HIV có các biểu hiện
của hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải. Giai đoạn này trong huyết thanh
BN cùng một lúc có thể phát hiện thấy KN gp 41 và KT chống p18, p24 [18].
1.2.2. Virus viêm gan C
1.2.2.1. Cấu trúc của HCV
HCV là virus thuộc nhóm có nhân RNA, họ Flaviviridae, có đờng kính
từ 55-60 nm. Cấu trúc HCV gồm các thành phần cơ bản sau:[18]
- Phần vỏ: gồm lớp Lipid và các Protein xuyên màng, các protein màng
này giúp cho virus tiếp cận với tế bào đích.
- Phần nhân: gồm các protein đã đợc phosphoryl hoá, đó là các protein
làm nhiệm vụ điều hoà sao chép gen.
- Genome của HCV: là sợi đơn RNA, đợc cấu trúc bởi khoảng 9.400
axit amin và các gen mã hoá (gen C, E
1
, E
2
/NS1), giúp mã hoá các protein
hạt virus: gen E
1
mã hoá glycoprotein 33 (gp33), gen E
2
/NS1 mã hoá gp70,

gen C mã hoá protein của nucleocapsid p22, gắn với RNA virus, gen NS3 mã
hoá enzym protease, gen NS5A mã hoá enzym polymerase, gen NS5B mã hoá
enzym replicase. Hai enzym này cần thiết cho sự sao chép của HCV.

Hình 1-3: Cấu trúc HCV [18]
Protein
xuyên màng
RNA virus
Protein nucleocapside
Vỏ
Cấu trúc của
genome
Lớ
p
vỏ
Genome
RNA

10
1.2.2.2. Chuyển đổi huyết thanh của ngời nhiễm viêm gan C

Ag
Core
0
80
150
S ngy sau tiờm
HCV Ab
Ca s 70 ngy
?

?
70
Ca s
2005
HCV Ag+Ab
RNA

Hình 1-4: Diễn biến huyết thanh của ngời nhiễm HCV [74].
Sau khi bị nhiễm HCV, 95% BN không có biểu hiện lâm sàng, thời gian
ủ bệnh rất khó xác định, tuy nhiên do có sự huỷ hoại tế bào gan nên enzyme
Alanin aminotranferase (ALT) thờng có những biến đổi sớm [49].
Thời gian cửa sổ của nhiễm HCV là khá dài, kháng thể HCV chỉ đợc
phát hiện sau nhiễm HCV từ 80-90 ngày bằng kỹ thuật ELISA [51], thời gian
phát hiện kháng thể HCV tuỳ vào đáp ứng miễn dịch của từng BN và từng thế
hệ kít chẩn đoán [18], [64].
1.2.3. Virus viêm gan B
1.2.3.1. Cấu trúc của HBV
Virus viêm gan B (tiểu thể Dane) có đờng kính từ 40-42 nm, là virus
thuộc nhóm có nhân DNA, họ Hepanaviridae. Cấu trúc của virus gồm các
thành phần sau [17], [70]:

11


Hình 1- 5: Cấu trúc HBV [18]
- Lớp vỏ bọc: dày khoảng 7 nm gồm 2 lớp lipoprotein, 3 loại protein:
+ Protein nhỏ: gồm 226 acid amin, đợc mã hoá bởi gen S. Protein này
mang tính quyết định kháng nguyên bề mặt viêm gan B (HBsAg).
+ Protein trung bình: gồm 280 acid amin, đợc mã hoá bởi các gen S
2

-S.
Protein này có tính miễn dịch cao, cảm thụ đặc biệt với albumin, có thể đó là
thụ thể để virus tiếp cận và xâm nhập vào tế bào gan.
+ Protein lớn: bao gồm 380-400 acid amin, đợc mã hoá bởi các tiền
gen S
1
+S
2
, 1S. Protein này mang tính quyết định KN bề mặt viêm gan B và
đóng vai trò quan trọng trong việc liên kết, xâm nhập của virus vào tế bào gan.

Hình 1-6: Hình thái và cấu trúc màng của HBV [18]
HBeA
g
DNA
Polymerase
DNA
HBcA
g

HBsA
g

12
- Lớp Capsit: dày khoảng 28nm đợc mã hoá bởi các gen C (core=lõi)
gồm 183 axit amin, mang đặc trng của kháng nguyên HBc (HBcAg). Ngoài
ra còn có KN lõi đợc mã hoá bởi gen C+C, đó là HBe (HBeAg). KN này liên
quan đến khả năng nhân lên của virus.
- Lớp trong cùng:
+ Genome của virus: Là sợi kép HBV-DNA.

+ Các enzyme:
- DNA polymerase có khả năng sao chép ngợc;
- Proteinkinase có khả năng phospho hoá protein nhân: HBeAg
và HBcAg.
1.2.3.2. Chuyển đổi huyết thanh của nhiễm virus viêm gan B
Thời kỳ ủ bệnh của nhiễm HBV thay đổi tuỳ thuộc vào từng bệnh nhân,
phụ thuộc vào số lợng virus xâm nhập, cách lây truyền và các yếu tố của vật
chủ. Trong giai đoạn ủ bệnh, ngời bệnh không có bất cứ triệu chứng lâm
sàng nào, các triệu chứng nh mẩn ngứa, sốt, vàng da thờng chỉ gặp trong
viêm gan cấp, thời kỳ này thờng kéo dài từ hai đến ba tháng, một số trờng
hợp có enzyme ALT tăng [12], [13], [14].
Để chẩn đoán nhiễm HBV ngời ta dựa chủ yếu vào các dấu ấn miễn
dich đợc phát hiện trong huyết thanh của bệnh nhân, thờng phải sau nhiễm
HBV 50-60 ngày [18], [70].
* Các dấu ấn miễn dịch của nhiễm HBV bao gồm:
- HBsAg (Hepatitis B surface Antigen): Là KN bề mặt viêm gan B, xuất
hiện sớm nhất trong huyết thanh trớc khi transamin đạt đỉnh cao nhất và
trớc khi vàng da từ một vài tuần đến một vài tháng. HBsAg mất đi sau 2-3
tháng nhng cũng có thể tồn tại đến 6 tháng hay suốt đời. Nếu một ngời có
HBsAg dơng tính trên 6 tháng thì đó là ngời mang HBV mạn tính [7], [77].
HBsAg có một thành phần quyết định KN chung đợc ký hiệu là a bao gồm
a1, a2, a3, phả hệ của HBsAg từ a sẽ đợc phân thành các dới nhóm ad, ay.

13
Rồi từ ad, ay lại đợc phân nhóm tiếp thành adw, adr, ayw, ayr. Các vùng
khác nhau có các phân loại HBsAg khác nhau nh châu Mỹ, châu Âu thờng
gặp phân tip adw, vùng Địa Trung Hải và châu á gặp phân type ayw. Trong
viêm gan cấp thờng gặp phân tip adw và ayw.
- Anti HBs (Anti Hepatitis B surface): Là kháng thể chống lại KN bề
mặt của virus viêm gan B, xuất hiện rất muộn sau 1-3 tháng kể từ khi HBV

xâm nhập vào cơ thể, lúc đó HBsAg thờng hết trong huyết thanh. Anti HBs
có vai trò bảo vệ cơ thể chống tái nhiễm HBV do đó có giá trị đánh giá khả
năng bảo vệ của cơ thể, đồng thời Anti HBs cũng có giá trị đánh giá hiệu quả
của vaccin [72].
- HBeAg (Hepatitis B e Antigen): Là một KN nhân của virus HBV, xuất
hiện sau HBsAg, nồng độ của HBeAg tồn tại cùng với nồng độ HBsAg trong
huyết thanh, giảm sau khoảng thời gian 10 tuần nhiễm bệnh và thờng mất
sớm hơn HBsAg. Khi HBeAg tồn tại trong máu có nghĩa là virus đang đợc
nhân lên rất mạnh, lây nhiễm ở thời kỳ này là khá cao.

Hình 1-7: Diễn biến huyết thanh của ngời nhiễm HBV [18].

14
- Anti HBe (Anti Hepatitis e): là kháng thể chống lại HBeAg, kháng thể
này thờng xuất hiện ngay sau khi HBeAg mất đi. Khi có mặt Anti HBe là dấu
hiệu tốt của đáp ứng miễn dịch, khả năng lây truyền ở thời kỳ này rất thấp,
virus đang trong thời kỳ nghỉ ngơi không sinh sản.
- HBcAg (Hepatitis B core Antigen): là KN lõi xuất hiện trong nhân tế
bào gan, không xuất hiện trong huyết thanh hoặc có xuất hiện trong huyết
thanh của những ngời có virus đang phát triển và nhân lên nhng cha có thử
nghiệm thơng mại hoá để phát hiện. HBcAg rất có giá trị chẩn đoán nhiễm
HBV vì HBcAg dơng tính thì luôn luôn có HBsAg dơng tính.
- Anti HBc (Anti Hepatitis B core): là kháng thể chống lại HBcAg, là
dấu ấn miễn dịch xuất hiện thứ ba sau khi nhiễm HBV. Kháng thể HBc gồm
hai loại: kháng thể HBc loại IgM thờng tồn tại trong giai đoạn nhiễm cấp và
mất dần trong giai đoạn hồi phục, kháng thể HBc IgG tồn tại nhiều năm trong
huyết thanh của bệnh nhân đã bị nhiễm HBV. Anti HBc có tác dụng nh một
chỉ điểm chứng tỏ sự có mặt của HBcAg.
Hiện nay, bằng kỹ thuật PCR phát hiện HBV-DNA đã rút ngắn đợc
thời kỳ cửa sổ của HBV chỉ còn 20-30 ngày [48].

1.3. Các biện pháp bảo đảm an toàn truyền máu, phòng lây nhiễm HIV,
HBV, HCV qua đờng truyền máu
1.3.1 Lựa chọn NCM an toàn
Để đảm bảo an toàn truyền máu, một trong những chiến lợc quan trọng
nhất của Tổ chức Y tế thế giới là lựa chọn ngời cho máu an toàn. Những
NCM an toàn chính là những NCM có nguy cơ thấp lây truyền các bệnh
nhiễm trùng qua đờng máu. Đó là những NCM thờng xuyên, hoàn toàn tự
nguyện không vì lợi ích kinh tế, họ có nhận thức cao về việc hiến máu tự
nguyện, hiến máu theo sự hớng dẫn của bác sỹ và tự sàng lọc các hành vi
nguy cơ của chính mình. Do đó lấy máu ở những NCM này sẽ hạn chế tối đa
những trờng hợp lây nhiễm HIV, HBV, HCV trong giai đoạn cửa sổ [32],

15
[91], [97], [100]. Hiện nay tại Nhật, Mỹ, Canada, Pháp, Hồng Kông và các
nớc đã phát triển 100% NCM là NCMTN an toàn. Trong khi đó tại các nớc
đang phát triển thì nguồn NCMCN là chủ yếu chiếm từ 80-100%, vì mục đích
của NCMCN là cho máu để lấy tiền nên họ thờng giấu diếm bệnh tật, họ
thờng là những NCM có nguy cơ lây nhiễm các bệnh nhiễm trùng truyền qua
đờng máu cao hơn những NCMTN [18], [21], [32]. Tại Việt Nam, trớc năm
1994 NCMCN chiếm tỷ lệ 100%, trong những năm qua do hiểu rõ đợc tầm
quan trọng của công tác an toàn truyền máu, ngành HHTM dới sự chỉ đạo
của Bộ Y Tế đã phối hợp với Hội liên hiệp thanh niên, Hội sinh viên, Hội chữ
thập đỏ đã đẩy mạnh cuộc vận động hiến máu nhân đạo, nhờ vậy tỷ lệ
NCMTN đã tăng lên > 50% (toàn quốc) và trên 60% (Viện HHTM). Cùng
với việc tuyên truyền vận động để tăng nguồn NCMTN, Viện HHTM bớc
đầu cũng đã tuyên truyền, giáo dục sức khoẻ cho NCM, vận động NCMTN đã
cho máu an toàn tiếp tục cho máu nhắc lại, trớc khi cho máu NCM còn đợc
khám tuyển lâm sàng kỹ càng, NCM đợc yêu cầu phải trả lời một bộ câu hỏi
để tìm hiểu về tình trạng sức khoẻ và các hành vi liên quan đến các yếu tố
nguy cơ [18], [21], [22], [23], [24].

1.3.2. Các kỹ thuật sàng lọc huyết thanh HIV, HBV, HCV cho NCM
Sàng lọc huyết thanh cho NCM là một biện pháp rất quan trọng để đảm
bảo an toàn truyền máu, trong những năm qua nhờ thực hiện tốt biện pháp này
mà tỷ lệ nhiễm HIV, HCV, HBV ở NCM đã đợc giảm đi một cách rõ rệt [7],
[18], [40].
* Nguyên tắc: (Theo quy định của Tổ chức Y Tế thế giới) [34], [35],
[101].
- Phải đảm bảo 100% đơn vị máu trớc khi truyền đợc sàng lọc cả
HIV, HBV, HCV. Các túi máu có kết quả kháng thể HIV, kháng thể HCV,
HBsAg dơng tính đều phải loại bỏ.

16
- Lựa chọn các kỹ thuật có độ nhạy, độ đặc hiệu cao và đặc thù cho
từng vùng để sàng lọc HIV, HBV, HCV cho NCM một cách hiệu quả nhất.
* Sàng lọc kháng thể HIV, kháng thể HCV, HBsAg cho NCM:
Để phát hiện sự có mặt của virus, ngời ta sử dụng phơng pháp tìm
KN virus hoặc KT chống virus trong huyết thanh. Có 3 loại kỹ thuật chính
hiện đang đợc sử dụng là [9]:
- Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme (EIA/ELISA)
- Kỹ thuật ngng kết (PA)
- Kỹ thuật nhanh (Quick test)
1.3.2.1. EIA/ELISA
* Sàng lọc HBsAg cho NCM là xét nghiệm thờng quy đợc thực hiện ở
tất cả các ngân hàng máu trên toàn thế giới để đảm bảo an toàn truyền máu.
Các nớc đã phát triển hiện nay sử dụng kỹ thuật ELISA thế hệ kít thứ ba (sử
dụng ba loại KT đơn dòng khác nhau để phát hiện các dới nhóm khác nhau
của HBV) sàng lọc HBsAg cho NCM [33], [100]. HBsAg là một dấu ấn quan
trọng nhất để chẩn đoán viêm gan B. Sàng lọc HBsAg dựa theo nguyên lý EIA
kẹp giữa và sử dụng KT (thờng là KT đơn dòng) để phát hiện các dới nhóm
của HBsAg đợc gắn trên bề mặt giếng. Độ đặc hiệu là trên 99%. Có thể có

kết quả dơng tính giả ở những mẫu bị nhiễm heparin hoặc do sự ảnh hởng
của hemoglobin hoặc bilirubin. Tỷ lệ dơng tính giả thờng cao hơn trong thời
kỳ mang thai đặc biệt là nhiễm trùng cấp và mạn tính hoặc bệnh tự miễn, hoặc
bệnh gan mãn tính [103], [104]. Độ nhạy của XN liên tục đợc cải tiến và giới
hạn phát hiện cho phép là dới 0.5 ng/ml. Kết quả âm tính giả và kết quả
không điển hình xảy ra trong các trờng hợp sau [105]:
- Giai đoạn cửa sổ ở cuối thời kỳ ủ bệnh trớc khi sự tổng hợp HBsAg
đủ lớn để có thể phát hiện đợc bằng phơng pháp miễn dịch.
- Ngời mang nồng độ HBsAg thấp.
- Những thể đột biến và những biến thể của gen S.