Nghiên cứu sản xuất và chuẩn hoá các sản phẩm huyết tương đạt tiêu chuẩn quốc tế dùng cho điều trị

Bộ khoa học công nghệ

Bộ y tế




Báo cáo tổng kết
Đề tài nghiên cứu khoa học độc lập
cấp nhà nớc
nghiên cứu quy trình sản xuất và chuẩn hoá
các sản phẩm huyết tơng đạt tiêu chuẩn quốc tế
sử dụng cho điều trị


Chủ nhiệm đề tài :
GS.TSKH. đỗ trung phấn
Cơ quan chủ trì : Viện Huyết học - truyền máu tw
viện trởng: pgs.ts. nguyễn anh trí
Cơ quan chủ quản : Bộ y tế

6832
14/5/2008

Hà Nội, 12/ 2007

lời cảm ơn

Thay mặt tập thể nhóm nghiên cứu, chúng tôi xin chân thành cảm ơn:
- Cảm ơn Bộ Khoa học Công nghệ (KHCN), Bộ Y tế đã ủng hộ và tạo điều
kiện để chúng tôi hoàn thành đề tài này. Đây là đề tài cấp nhà nớc thứ 3 do tôi
làm chủ nhiệm cùng tập thể Viện HHTM Trung ơng thực hiện.
- Xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Bệnh viện Bạch Mai và GS.TS. Trần
Quy - Nguyên bệnh viện trởng giai đoạn đầu 2001 - 2003; BGĐ và PGS.TS.
Nguyễn Anh Trí - Viện trởng Viện HHTM Trung ơng đã giúp đỡ và tạo điều
kiện cho chúng tôi hoàn thành nội dung của đề tài tại Viện HHTM Trung ơng
và Bệnh viện Bạch Mai.
- Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Trung tâm Bảo quản mô ghép -
Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện để đề tài thực hiện đông khô các sản phẩm
huyết tơng đạt kết quả.
- Xin chân thành cảm ơn BGĐ Bệnh viện Nhi Trung ơng đã ủng hộ và tạo
điều kiện để Khoa Hoá sinh và Huyết học tham gia nghiên cứu cùng chúng tôi,
với trách nhiệm giám sát chất lợng của sản phẩm.
- Xin chân thành cảm ơn BGĐ và Khoa Truyền nhiễm - Học viện Quân y đã
tạo điều kiện để chúng tôi đánh giá tác dụng hỗ trợ của huyết tơng giàu anti-
HBs điều trị bệnh nhân viêm gan cấp có kết quả.
- Sau cùng xin chân thành cảm ơn toàn thể cán bộ công nhân viên, những

ngời cho máu tình nguyện tại Viện HHTM Trung ơng đã hết sức nhiệt tình,
với trách nhiệm cao đã cùng chúng tôi hoàn thành đề tài có kết quả.
Đề tài đã đem lại cho Viện HHTM một số trang bị, quy trình công nghệ sản
xuất các sản phẩm huyết tơng, kiến thức và tay nghề của 1 số cán bộ - KTV
trực tiếp tham gia thực hiện đề tài. Chúng tôi coi đây là cơ sở vật chất quý giá để
phát triển đề tài trong tơng lai.
Hà Nội, ngày 28/12/2007
Thay mặt tập thể
nhóm nghiên cứu


GS.TSKH.NGND
Đỗ Trung Phấn

Các thành viên tham gia nghiên cứu thuộc đề tài
nghiên cứu sản xuất các sản phẩm huyết tơng
(Giai đoạn 2004 - 2007)

Chủ nhiệm đề tài: GS.TSKH. Đỗ Trung Phấn
Th ký đề tài: ThS. Phạm Tuấn Dơng

1. Các thành phần tham gia nghiên cứu: gồm các nhóm sau đây:
1. Nhóm: Vận động và thu gom máu chất lợng cao
- Ths. Nguyễn Đắc Thuận Viện HHTM TW
- ThS. Trần Ngọc Quế -
- BS. Nguyễn Mạnh Quân -
2. Nhóm: Sàng lọc các bệnh nhiễm trùng
- PGS. TS. Bạch Khánh Hoà Viện HHTM TW
- TS. Bùi Mai An -
- KTV: Trần Thị Ngọc Anh -

3. Nhóm: Sản xuất các sản phẩm huyết tơng
- ThS. Phạm Tuấn Dơng Viện HHTM TW
- CN. Đỗ Thị Hiền -
- CN. Trần Thị Thuỷ -
- CN. Võ Thị Diễm Hà -
4. Nhóm: Đông khô các sản phẩm huyết tơng
- TS. Ngô Duy Thìn Trờng ĐH Y Hà Nội
- TS. Lê Đình Mùi -
- ThS. Lê Thị Hồng Nhung -
- ThS. Nguyễn Thị Thu Thuỷ -
5. Nhóm: Kiểm tra chất lợng sản phẩm
- TS. Hoàng Hạnh Phúc BV Nhi Trung ơng
- TS. Trần Thị Hồng Hà -
- TS. Nguyễn Thị Nữ Viện HHTM TW
- BS. Lê Xuân Hải -

6. Nhóm: Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng
- Nguyễn Anh Trí Viện HHTM TW
- ThS. Bạch Quốc Khánh -
- TS. Phạm Quang Vinh ĐH Y Hà Nội- BV Bạch Mai
- Nguyễn Thị Lan Bệnh viện Bạch Mai
- TS. Hoàng Vũ Hùng Học viện Quân y
2. Các cơ quan tham gia
1. Viện Huyết học Truyền máu Trung ơng
2. Bệnh viện Bạch Mai
3. Trờng Đại học Y Hà Nội (Trung tâm bảo quản Mô - Bộ môn Mô học)
4. Học viện Quân y (Khoa Truyền nhiễm, Quân y viện 103)
5. Bệnh viện Nhi Trung ơng (Khoa Hoá sinh và Huyết học)

Chữ viết tắt

ACD
Acid Citrate dextrose
CD
Cluster of differentiation
CFU
Colony forming unite
CM
Carboxyl methyl
CPD
Citrate - Phosphate dextrose
CPD-A1
Citrate - Phosphate dextrose - Adenine
DIC
Disseminated Intravaseular Coaglulation
DEAE
Dimethylaminoethyl
ELISA
Enzym leankaged sorbant Assay
FDP
Fresh Dried plasma
FFP
Fresh frozen plasma
G-CSF
Granulocyte - colony Stimulating factor
GEMM
Granulocyte - Erythrocyte - Monocyte - Megakaryocyte
HBV
Hepatitis B virus

HCV
Hepatitis C virus
HIV
Human immunodeficiency virus
HHTM
Huyết học - Truyền máu
HLA
Human leukocyte Antigen
HST
Huyết sắc tố
HTTĐL
Huyết tơng tơi đông lạnh
IMIG
Intramuscular Immunoglobulin
IVIG
Intravascular Immunoglobulin
KHCN
Khoa học - Công nghệ
KHKT
Khoa học - Kỹ thuật
LDH
Lactate dehydrogenase
PEG
Polyethaylen - glycol
TM
Tuyền máu
SP
Sản phẩm
WHO
World Health Organization

Mục lục

Trang
1. Đặt vấn đề - mục tiêu - nội dung nghiên cứu 1
2. Tổng quan 3
2.1. Lịch sử phát triển truyền máu và sản xuất các sản phẩm máu 3
2.2. Máu và các thành phần của máu 3
2.3. Các thành phần huyết tơng 7
2.4. Các phơng pháp chiết tách các thành phần huyết tơng 15
2.5. Bảo quản huyết tơng và các sản phẩm huyết tơng 23
2.6. Giám sát và quản lý chất lợng các sản phẩm huyết tơng 24
2.7. Một số sản phẩm huyết tơng có giá trị cao trong điều trị 25
2.8. Tình hình sử dụng các sản phẩm huyết tơng trên thế giới 28
2.9. Khả năng sản xuất và sử dụng các sản phẩm huyết tơng tại Việt Nam 30
2.10. Một số vấn đề mới về protein huyết tơng: proteome - proteomics 31
2.11. Hớng phát triển trong tơng lai 33
3. Đối tợng và phơng pháp 35
3.1. Đối tợng 35
3.1.1. Ngời cho máu 35
3.1.2. Động vật thực nghiệm 35
3.2. Chất liệu nghiên cứu và trang thiết bị, hoá chất cần thiết 35
3.2.1. Chất liệu nghiên cứu: Huyết tơng 35
3.2.2. Trang bị, hoá chất 35
3.3. Phơng pháp 36
3.3.1. Tuyển chọn huyết tơng chất lợng cao và an toàn 36
3.3.2 Sản xuất các sản phẩm huyết tơng: sản phẩm và quy trình sản xuất 39
3.3.2.1. Huyết tơng tơi đông khô 39
3.3.2.2. Sản xuất yếu tố VIII cô đặc 40

3.3.2.3. Sản xuất - globulin 40
3.3.2.4. Sản xuất Albumin chất lợng cao 41
3.3.2.5. Sản xuất - globulin giàu anti - HBs 42
3.3.3. Đông khô và bảo quản các sản phẩm huyết tơng 43
3.3.4. Chỉ tiêu chất lợng các sản phẩm 46
3.3.5. Kiểm tra chất lợng sản phẩm 49
3.3.6. Xây dựng các quy trình công nghệ 49
3.3.7. Xử lý kết quả 49
3.3.8. Sơ đồ tóm tắt quy trình nghiên cứu chung 49

4. Kết quả 56
4.1. Các sản phẩm huyết tơng thu đợc 56
4.1.1. Huyết tơng tơi chất lợng cao 56
4.1.2. Huyết tơng tơi đông khô 58
4.1.3. Yếu tố VIII cô đặc từ huyết tơng ngời 61
4.1.4. - globulin từ huyết tơng nghèo F-VIII 64
4.1.5. Albumin từ huyết tơng nghèo F-VIII 70
4.1.6. - globulin giàu anti-HBs 75
4.2. Các quy trình công nghệ đã hoàn thiện 79
4.3. Kết quả về đào tạo và báo khoa học 102
4.4. Đánh giá mức độ hoàn thành các chỉ tiêu nghiên cứu 103
5. Bàn luận 104
5.1. Chất lợng huyết tơng tơi (FFP) 104
5.2. Chất lợng huyết tơng đông khô 105
5.3. Kết quả sản xuất yếu tố VIII cô đặc 107
5.4. Chất lợng của - globulin sản xuất từ huyết tơng nghèo F-VIII 109
5.5. Chất lợng albumin sản xuất từ huyết tơng nghèo F-VIII 111
5.6. Vấn đề sản xuất -globulin giàu anti-HBs từ huyết tơng ngời 113
5.7. Đông khô và bảo quản các sản phẩm huyết tơng 114
5.8. Phơng pháp chiết tách các sản phẩm huyết tơng 115

6. Kết luận 117
1. Các sản phẩm huyết tơng đã thu đợc 117
2. Hiệu quả của phơng pháp đông khô các sản phẩm huyết tơng 117
3. Các quy trình công nghệ đã hoàn thiện 118
4. Các bài báo khoa học đã công bố 118
5. Kết quả đào tạo 118
7. ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 119
8. Kiến nghị 120
9. Tài liệu tham khảo 121



1
1. Đặt vấn đề
mục tiêu - nội dung nghiên cứu
Viện HHTM đã hoàn thành 2 đề tài độc lập cấp nhà nớc:
1. Nghiên cứu lây truyền mẹ con của virus viêm gan B và các virus truyền
qua đờng truyền máu, KY01/15 nghiệm thu 06/ 1996.
2. Nghiên cứu sản xuất và chuẩn hoá các sản phẩm máu sử dụng cho điều
trị bệnh, KHCN 11/ DA5 nghiệm thu 03/ 2004. (10)
Hai đề tài trên đã thiết thực góp phần nâng cao chất lợng máu và an toàn
TM, trực tiếp phát triển truyền máu từng phần vừa có hiệu quả kinh tế cao, tiết
kiệm vừa nâng cao hiệu quả điều trị, làm thay đổi tập quán TM toàn phần trong
nhiều thập kỷ từ 1954 của các BS lâm sàng.
Trong các sản phẩm máu, chúng ta mới sản xuất, chuẩn hoá và sử dụng các
sản phẩm tế bào máu bao gồm HC, tiểu cầu, bạch cầu hạt, tế bào gốc (CD
34
), còn
các sản phẩm huyết tơng - nguồn nguyên liệu lớn, và rất quí bởi có nhiều thành
phần có thể tách ra riêng biệt sử dụng cho điều trị, tới nay ta vẫn cha làm đợc,

trong khi ở nhiều nớc trên thế giới kể cả các nớc trong khu vực nh Thái Lan,
Indonesia việc sản xuất albumin, globulin miễn dịch đợc quan tâm đặc biệt
trong các ngân hàng máu. Vì vậy, với nớc ta đây là yêu cầu thực tiễn và cấp bách.
Sản xuất các sản phẩm huyết tơng đợc bắt đầu từ 1950 sau khi Cohn đa
ra phơng pháp tách các protein huyết tơng bằng ethanol có kết quả. Trên 50
năm qua, phơng pháp này đã phát triển ở nhiều nớc, theo thời gian phơng
pháp đầu tiên của Cohn (27) đã đợc bổ sung và hoàn thiện. Bằng phơng pháp
này, đã tách đợc albumin, globulin miễn dịch, yếu tố VIII, fibrinogen, và một
số yếu tố đông máu khác (31,59). Tuy nhiên, tồn tại của phơng pháp này là sản
phẩm cha đợc hoàn toàn tinh khiết, nh albumin châu Âu đạt trên 90%
(53,55) hoặc ở Mỹ đạt trên 95% (59). Nhng đây là phơng pháp đơn giản, trang
bị ít lại thực hiện đợc một lợng lớn huyết tơng, ethanol có tác dụng khử trùng
kể cả HIV, sản phẩm tạo ra an toàn sau khi loại ethanol.
Trong nớc, tới nay cha có tài liệu nào thông báo về sản xuất các sản
phẩm huyết tơng nội địa.
Xuất phát từ tình hình trên, đề tài này nghiên cứu sản xuất một số sản phẩm
huyết tơng sử dụng cho điều trị bệnh.

2
Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

A. Mục tiêu:
1. Nâng cao chất lợng sàng lọc an toàn máu để thu đợc nguyên liệu huyết
tơng chất lợng cao và an toàn.
2. Nghiên cứu quy trình điều chế ở quy mô phòng thí nghiệm và xây dựng
tiêu chuẩn chất lợng các chế phẩm huyết tơng bao gồm: huyết tơng khô, khối
yếu tố VIII cô đặc, -globulin, albumin.
3. Nghiên cứu điều kiện thích hợp bảo quản các chế phẩm nói trên.
4. Bớc đầu nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng các sản phẩm máu nhằm đánh
giá hiệu quả điều trị.

B. Nội dung:
1. Nâng cao chất lợng thu gom huyết tơng: Ngời cho máu an toàn, sàng
lọc bệnh nhiễm trùng.
2. Nghiên cứu điều chế huyết tơng đông khô: Thể tích 200ml/ chai, nồng
độ protein > 5g/ l, pH 6-7, nớc tồn d < 2%, thời gian bảo quản > 1 năm.
3. Nghiên cứu qui trình điều chế khối cô đặc yếu tố VIII; độ sạch đạt > 85%,
thể tích 10 - 20ml/lọ, nồng độ F-VIII từ 6 - 15 đơn vị, lợng yếu tố VIII trong 1 đv/
lọ: >70 UI; sau đông khô chất lợng ổn định. Thời gian bảo quản > 1 năm.
4. Nghiên cứu qui trình chiết tách và chuẩn hoá -globulin (phơng pháp
Cohn bằng ethanol): Độ tinh khiết đạt > 95%, thể tích 5 - 10 ml/lọ, nồng độ -
globulin 5g/l, pH 5 - 6; loại dùng tiêm bắp (IMIG); thời gian bảo quản > 1 năm.
5. Nghiên cứu qui trình chiết tách và chuẩn hoá albumin (phơng pháp
Cohn bằng ethanol): độ tinh khiết đạt > 80%, thể tích 5 - 10 ml/lọ, nồng độ
albumin 5 - 10 g/l; pH 5 - 6, thời gian bảo quản > 1 năm.
6. Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng nhằm đánh giá hiệu quả điều trị của
các sản phẩm.


3
2. Tổng quan


2.1. Lịch sử phát triển truyền máu và sản xuất các sản phẩm máu
Lịch sử truyền máu có thể tóm tắt trong các sự kiện sau đây: (Xem phụ lục 1)
1. Đầu thế kỷ XVII xuất phát từ lời kêu cứu của các bệnh nhân thiếu máu,
lời thỉnh cầu của họ đã làm thức tỉnh thầy thuốc lu ý đến nghiên cứu về truyền
máu. Đồng thời, W. Harvey phát minh hệ tuần hoàn, ông cho rằng máu chạy
trong các mạch máu. Nh vậy có thể lấy máu ra và truyền trả lại.
2. Trên cơ sở này Richard Lower (1662) đã lấy máu động vật truyền cho
ngời, nhng không có kết quả bệnh nhân tử vong. Do đó nghiên cứu TM bị cấm

150 năm (từ giữa thế kỷ XVII đến hết thế kỷ XVIII).
3. Đầu thế kỷ XIX Bundell làm sống lại nghiên cứu về TM. Ông lấy trực
tiếp máu ngời truyền cho ngời kết quả khoảng 50% sống và 50% chết. Thành
công này đã hé mở một tia hi vọng mới cho TM. Tuy nhiên tử vong do TM vẫn
là điều bí ẩn.
4. Sang đầu thế kỷ XX: Landsteiner tìm ra hệ nhóm máu ABO, kết quả của
ông đã giải thích nguyên nhân chết do TM ở thế kỷ trớc bởi Blundell và cộng
tác và mở ra luồng ánh sáng mới cho phát triển của TM, với phát minh này đã
cứu sống hàng vạn - vạn ngời trên toàn thế giới.
5. Từ 1950 kết quả nghiên cứu về chất chống đông và túi chất dẻo đã mở ra
chiến lợc tách các thành phần máu và TM từng thành phần vừa có hiệu quả, vừa
an toàn và tiết kiệm.
6. 1960 - 1970 J. Daussett phát minh hệ kháng nguyên bạch cầu ngời
(HLA) từ đó mở ra trang mới ghép cơ quan và truyền máu an toàn hơn.
7. Từ 1980 vấn đề bệnh nhiễm trùng nhất là HIV trong TM đã nổi lên thành
vấn đề toàn cầu về an toàn TM.
Tới nay vấn đề TM hiện đại đã và đang phát triển mạnh ở các nớc, đó là
TM từng thành phần, sàng lọc các bệnh nhiễm trùng, loại bạch cầu trớc khi bảo
quản, truyền tế bào gốc trong điều trị bệnh (Xem phụ lục 1).
2.2. Máu và các thành phần của máu (Tóm tắt) (11)
- Máu là một thể lỏng chiếm 1/13 trọng lợng cơ thể, hoặc 1,3 -1,8 lít/m
2
diện
tích cơ thể, hoặc 60-70ml/kg cân nặng. Máu tập trung nhiều ở cơ (khoảng 40%).

4
- Độ nhớt của máu tăng 4-5 lần so với nớc ở 38
0
C.
- Tỷ trọng: 1,055 - 1,063.

- Tốc độ lắng: 35 mm sau 2 giờ.
- Khối tế bào (Hct): 0,40 - 0,50 l/lít hoặc 40 - 50%.
- pH = 7,33 - 7,73, các chất đệm duy trì pH là bicarbonate 23-27mmol/lít,
đệm phorphate, đệm protein, đệm Hb (chiếm 82%).
- áp lực keo do protein tạo nên bình thờng 28mmHg.
- áp lực thẩm thấu do các cation, amion tạo nên bình thờng là 7,2-8,1atm
(trực tiếp) hoặc đo bằng độ hạ băng điểm là 292-308 mmol/lít huyết tơng.
Máu có nhiều chức năng cần thiết cho sự sống của cơ thể:
- Dinh dỡng : vận chuyển các chất dinh dỡng
- Bài tiết : các chất cặn bã
- Hô hấp : ôxy và CO
2
- Bảo vệ : bạch cầu, kháng thể, bổ thể
- Cầm máu bằng cơ chế đông máu.
- Điều hoà:
+ Điều hoà các chức phận nhờ các hormone.
+ Duy trì tuần hoàn (huyết áp).
+ Điều hoà thân nhiệt.
Máu gồm 2 phần chính: tế bào và huyết tơng.
2.2.1. Phần tế bào máu: gồm có hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, tế bào gốc (9).
2.2.1.1. Hồng cầu
Có nguồn gốc từ tế bào gốc định hớng tuỷ (CFU - GEMM) phát triển và
biệt hoá thành HC ra máu ngoại vi.
- HC chứa HST vận chuyển O
2
, chức năng này do màng hồng cầu đảm nhiệm.
- Cấu tạo màng hồng cầu:
+ Lớp ngoài cùng: carbohydrat kỵ nớc liên kết với protein tạo thành glycoprotein.
+ Lớp lipid màng: gồm 2 lớp lipid kép.
+ Protein màng: protein xuyên màng, màng hồng cầu đợc cấu trúc bởi 3

thành phần: protein 52%; lipid 40%; carbohydrat 8%, bề mặt hồng có các kháng
nguyên hệ ABH, Rh, Lewis, Duffy có vai trò trong an toàn truyền máu.

5
- Chức năng của màng hồng cầu:
Ngăn cản protein và các chất hoà tan trong nớc đi qua nh: albumin, Na
+
,
K
+
, nhng lại cho các chất hoà tan trong mỡ đi qua (O
2
, HCO
3
-
). Do vậy màng hồng
cầu đóng vai trò quan trọng trong vận chuyển O
2
và CO
2
cùng huyết tơng đào thải
qua phổi.
Duy trì áp lực thẩm thấu trong và ngoài hồng cầu, hoạt động này nhờ
bơm natri".
Màng hồng cầu có tính mềm dẻo, tạo điều kiện cho hồng cầu chuyển qua
hệ thống vi mạch.
Hoạt động của màng hồng cầu cần nănglợng, nhất là năng lợng cho vận
chuyển oxy của hemoglobin.
2.2.1.2. Bạch cầu: có hai loại:
a) Bạch cầu tuỷ:

- Bắt nguồn từ tế bào gốc định hớng tuỷ (CFU - GEMM) phát triển thành
bạch cầu trởng thành làm nhiệm vụ ở máu ngoại vi.
- Bạch cầu tuỷ làm nhiệm vụ bảo vệ cơ thể bằng cơ chế thực bào (không đặc
hiệu) tiêu huỷ vi trùng và các tế bào thoái hoá của cơ thể.
- Bạch cầu tuỷ có 2 loại: bạch cầu hạt và bạch cầu mono, chúng đều có chức năng
thực bào. Bạch cầu mono - đại thực bào còn làm nhiệm vụ trình diện kháng nguyên.
- Bạch cầu tuỷ: có nhiều men sử dụng tiêu huỷ các đối tợng thực bào.
- Bạch cầu Mastocyte, bạch cầu ái kiềm có nhiều chất trung gian gây dị ứng
nh: histamin, serotonin, prostaglandin, thromboxan gây sốt, gây đau.
- Bạch cầu sản xuất các cytokin khi đợc hoạt hoá.
- Bạch cầu có kháng nguyên HLA gây miễn dịch đồng loài.
b) Bạch cầu lympho:
Bắt nguồn từ tế bào CD
34
trở thành tế bào gốc dòng lympho. Từ tế bào này
phát triển thành 3 dòng tế bào: T lympho, B lympho và tế bào NK. T và B lympho
cùng với đại thực bào trực tiếp tham gia tạo kháng thể đặc hiệu, sản xuất các cytokin.
2.2.1.3. Tiểu cầu
- Mẫu tiểu cầu sinh ra từ tế bào gốc định hớng tuỷ (GEMM) phát triển
thành tiểu cầu.

6
- Tiểu cầu có nhiệm vụ chống chảy máu giai đoạn đầu nhờ chức năng dính
và ngng tập.
- Tiểu cầu có hệ thống kháng nguyên HPA (human platelet antigen) và
HLA-A, B, C; không có HLA lớp II.
- Có nhiều chất gây dị ứng, gây viêm trong các hạt đặc, hạt , khi ly giải
gây rối loạn đông máu.
2.2.1.4. Tế bào gốc sinh máu (hemopoietic stem cells):
ở máu ngoại vi có một lợng rất nhỏ tế bào gốc sinh máu có dấu ấn CD

34
+
(khoảng 1/10.000). Nhng khi huy động bằng G-CSF số lợng này có thể tăng gấp
100-1000 lần. Hiện tợng này hiện nay đang đợc sử dụng để thu hoạch tế bào
nguồn từ máu ngoại vi cho ghép tuỷ đồng loài, ghép tuỷ tự thân.
Tế bào gốc có thể thu hoạch từ các nguồn (source) sau đây (7)
- Từ tuỷ xơng: bằng cách chọc hút dịch tuỷ từ xơng chậu, liều tế bào tuỷ cho
ghép tuỷ đợc tính nh sau: 3-5x10
8
tế bào có nhân cho 1 kg trọng lợng cơ thể,
hoặc 3-5x10
6
tế bào CD
34
+ cho 1 kg trọng lợng cơ thể hoặc 3-5x10
5
tế bào tạo cụm
(colony forming unit) với G-CSF cho 1 kg trọng lợng cơ thể.
Thờng dùng 2 cách tính hoặc tế bào có nhân, hoặc tế bào có CD
34
+.
- Từ máu ngoại vi: từ máu ngoại vi có thể thu hoạch tế bào gốc có dấu ấn CD
34
+
,
CD
33
+

bằng cách huy động tế bào tuỷ với G-CSF. Có 2 cách thu hoạch tế bào này.

Cho ghép tuỷ tự thân: thờng dùng liều hoá chất cyclophosphamid rồi kích
thích huy động bằng G-CSF. Phơng pháp này có hiệu quả cho phép tự thân, hoá
chất (cyclophophoneid) có tác dụng loại tế bào ung th còn lại (MRD = minitmal
residual disease).
Cách thứ hai, không dùng hoá chất mà trực tiếp kích thích bằng G-CSF liên
tục trong 5 ngày, thu hoạch vào ngày thứ 5, cách này không gây tác dụng của hoá
chất cho ngời cho, ngời cho hoàn toàn an toàn. Cách này dùng cho ghép tuỷ đồng
loài, ngời cho là ngời bình thờng khoẻ mạnh.
- Từ máu cuống rốn ngời: máu cuống rốn có lợng đáng kể tế bào gốc CD
34
,
tế bào gốc ở đây có khả năng sinh sản và biệt hoá lớn. Vì vậy máu cuốn rốn đợc
coi là một nguồn vô tận cung cấp tế bào gốc sử dụng cho điều trị.
Cho tới nay Viện HHTMTW có thể tách cả 4 thành phần tế bào máu nói trên
sử dụng cho điều trị. Nhờ kết quả này chúng ta đã phát triển truyền máu từng thành
phần vừa có hiệu quả cao, an toàn và tiết kiệm.

7
2.2.2. Phần huyết tơng
- Máu toàn phần đợc chống đông rồi ly tâm khoảng 5000 g/ 5 phút ta thu
đợc huyết tơng. Đó là một dịch lỏng gồm nhiều chất dạng hoà tan, là kho chứa
các tế bào máu từ tuỷ xơng tạo ra trớc khi vào tổ chức. Khác với huyết thanh,
huyết tơng có chất chống đông máu, là chất ức chế phản ứng đông máu nh
citrate, acid - citrate dextrose, citrate - phosphate - dextrose, các chất chống đông
làm tăng thể tích huyết tơng, nhng không ảnh hởng đến tác dụng của các yếu
tố đông máu.
- Huyết tơng có tỷ trọng 1,055 - 1,063g/ml, chiếm 45% trọng lợng toàn
cơ thể (1,3 - 1,8lít/m
2
da, 40-50ml/kg), nớc của huyết tơng chiếm 68% lợng

nớc toàn cơ thể (ngời trởng thành), trong đó 15-20% nớc ngoại bào.
- pH của máu (huyết tơng) 7,33 - 7,43, pH liên quan chặt chẽ với các hệ
thống đệm, trong đó hệ đệm bicarbonat là rất quan trọng, có lợng dự trữ đáng kể
(23-27 mmol/ lít), sau đó là hệ đệm protein, phosphate, suffate và hemoglobin (Hb).
- Huyết tơng có các chức năng sau:
Cung cấp, vận chuyển các chất cần thiết cho cấu tạo và phát triển cơ thể.
Huyết tơng giúp duy trì huyết áp, duy trì hoạt động của hệ tuần hoàn, hệ bài tiết.
Huyết tơng đóng vai trò quan trọng duy trì áp lực thẩm thấu, áp lực keo.
Huyết tơng giúp duy trì hệ thống đông máu bao gồm hệ gây đông và hệ
kháng đông.
Huyết tơng có các thành phần kháng thể giúp bảo vệ cơ thể chống nhiễm
trùng. Vì vậy thiếu huyết tơng, hoặc giảm từng thành phần của huyết tơng đều
gây trạng thái bệnh lý, các trạng thái bệnh lý này sẽ đợc giải quyết nếu sản xuất
các thành phần huyết tơng và sử dụng chúng theo cách "bù đắp" một cách hợp
lý sẽ đem lại hiệu quả điều trị và kinh tế cao.
2.3. Các thành phần huyết tơng
Huyết tơng có nhiều thành phần quan trọng cho sự sống nh: nớc, chất khí,
muối khoáng, sinh tố, nội tiết tố, các cytokin, yếu tố đông máu, kháng thể, bổ thể,
albumin.v.v. Các thành phần đó có thể xếp thành các nhóm lớn sau đây (24):
2.3.1. Nớc
Thành phần quan trọng của cơ thể giúp cho hoạt động tuần hoàn và chuyển
hoá các chất, đào thải cặn bã qua mồ hôi, hơi thở và nớc tiểu. ở ngời trởng
thành nớc chiếm 91% khối lợng huyết tơng, còn 9% là chất khô.

8
2.3.2. Thành phần khí
Huyết tơng có thành phần khí, khoảng 18 - 20ml ôxy/ 100ml huyết tơng,
trong đó có 0,3 ml dạng hoà tan, số còn lại kết hợp với hemoglobin hồng cầu. Có
40 - 45ml CO
2

, 75% CO
2
nằm trong huyết tơng, 25% trong HC. CO
2
tồn tại cả
3 dạng hoà tan trong huyết tơng, dạng HCO
3
-
và dạng kết hợp với HST.
2.3.3. Các vi chất và sinh tố
- Các cation bao gồm: Na
+
, K
+
, Ca
2+
, Mg
2+

- Các anion: Cl
-
, HCO
3
-
, HPO
4
2-
, SO
4
2-

- Các chất hoà tan không tích điện: glucose, cholesterol, triglycerit, urea
- Các yếu tố vi lợng (trace elements): sắt, kẽm, silicon.
- Các siêu vi lợng: selênium, mangan, nickel, chromium
- Các vitamin: -tocophenol, retinol, ascorbate, folate, cobalamin
Khi nghiên cứu các thành phần vô cơ cần lu ý các điểm sau đây:
- Hoạt động của các chất vô cơ không phụ thuộc vào nồng độ theo khối
lợng, mà phụ thuộc vào mili dơng lợng (mEq). Một mEq chất này tơng
quan với 1 mEq chất khác, vì vậy sử dụng mEq thì chính xác hơn khi ta quan
tâm đến cân bằng điện giải (11, 12).
- Trên cơ sở biểu thị nồng độ bằng mEq ta có đợc sự cân bằng điện giải
trong và ngoài tế bào - gọi là cân bằng Donnan nghĩa là anion trong tế bào/ anion
ngoài tế bào bằng (=) cation ngoài tế bào/ cation trong tế bào.
- Khi tính áp lực thẩm thấu ngời ta dùng mili phân tử (mosmol/ l) (trong
đó 1 mosmol có chứa 6,02x10
23
tiểu phân). áp lực thẩm thấu của huyết tơng do
các chất điện giải quyết định. Máu toàn phần có áp lực thẩm thấu là 305
mosmol/ l - trong đó, natri: 142 mosmol, clo: 103 mosmol, kali: 5 mosmol,
calci: 10 mosmol, glucose: 5,5 (1 g/ lít), ure 5 (0,3 g/ lít).
2.3.4. Protein
Các protein huyết tơng đợc tổng hợp chủ yếu ở gan gồm albumin,
globulin, fibrinogen, nucleoprotein, lipoprotein, glucoprotein, các yếu tố đông
máu, bổ thể Trị số bình thờng khoảng 60-80 g/l, khối lợng phân tử là 50.000
dalton, tích điện âm, thuộc nhóm anion. Nếu điện di trên giấy, protein huyết
thanh chia 5 thành phần, chạy nhanh nhất là albumin, tiếp đến là
1
,
2
, và

chậm nhất là globulin. Nếu điện di trên gen tinh bột hoặc polyacryamid có thể
tách đợc 18 - 21 thành phần (12, 24).

9
Ngày nay ngời ta biết huyết tơng có khoảng trên 120 protein khác nhau
có thể phân lập đợc, các protein này có thể xếp loại theo nhiều cách khác nhau:
theo khả năng hoà tan, khả năng điện di, hoặc theo chức năng của chúng.
Theo chức năng, Carlson (1996) đã phân thành 7 nhóm bao gồm: nhóm
globulin miễn dịch, nhóm các thành phần bổ thể, các yếu tố đông máu, các chất
ức chế enzym, các protein liên kết với lipid, các protein vận chuyển (trong đó có
albumin), và một số protein khác cha xác định đợc chức năng.
Phân loại các protein theo chức năng: (24)
a) Các globulin miễn dịch: IgG, IgA, IgM, IgD và IgE (phụ lục 1)
b) Các thành phần bổ thể: C1
q
, C1
r
, C
1s
, C
2
, C
3
, C
4
, C
5
, C
6
, C

7
, C
8
, C
9
,
propertin (phụ lục 2)
c) Các yếu tố đông máu
- Fibrinogen, prothrombin, các yếu tố: V, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII
- Kininogen khối lợng phân tử cao, prekallikrein, plasminogen
- Protein C, protein S, Antithrombin III (chất kháng đông sinh lý).
d) Các yếu tố ức chế enzym (enzym Inhibitors):
1
antitrypsin,
2
macroglobulin,
antithrombin III, -chymotrypsin,
2
-antiplasmin, heparin, cofactor II
e) Protein liên kết với lipid (vận chuyển lipid): apoprotein AI, AII, CI, CII,
CIII,
2
glycoprotein
f) Các protein vận chuyển (transport protein)
- Albumin, prealbumin: chiếm khối lợng lớn.
- Transferrin, thyroxin, haptoglobin, transcobalamin.
- Protein mang hormon, transcortin, hemopexin
g) Một số protein cha rõ chức năng
-
1

glycoprotein,
1
, glycoprotein.
-
1
microglobulin
- Histedin giàu glycoprotein, serum amyloid
Các thành phần protein nói trên đều có thể thay đổi trong bệnh lý, nh quá
trình viêm, hoạt tính của bổ thể C
1
, fibrinogen, ceruloplasmin, haptoglobin
tăng lên nhiều lần, trong khi đó albumin lại giảm một cách đáng kể, tác dụng
này chịu ảnh hởng của các cytokin nh IL-2; IL-6; TNF (24, 31).
Bằng phơng pháp điện di và điện di MD, sử dụng kháng huyết thanh đa
giá đặc hiệu với các protein huyết tơng ngời, ta có thể tách ra đợc nhiều
thành phần protein khác nhau (H.1.1).

10
Khán
g
hu
y
ết thanh đa
g
iá
đặc hiệu hu
y
ết t ơn
g
n

g
ời
uu
Prealbumin
ALBUMIN

1
1
1
1
1
- FETOPROTEIN
- Lipoprotein
- Acid Glycoprotein
- ANTITRYPSIN
- Antichymotrypsin




Inter- trypsin inhibitor

Ceruloplasmin
-Macroglobulin
HAPTOGLOBIN

2
Hình 1:
Các thành phần protein huyết t ơng trên điện di miễn dịch
với kháng huyết thanh đa giá đặc hiệu protein huyết t ơng ng ờiu

u
u

2

1
Albumin



2


H
.1.1.

11

2.3.5. Một số protein và chất phi protid huyết tơng đặc biệt
- Albumin: là một trong nhiều protein đợc tổng hợp tại gan, trọng lợng
phân tử 65 kd, có 17 cầu nối disulfure (SH-). Huyết tơng ở ngời trởng thành
khoẻ mạnh albumin chiếm 35 - 50 g/lít, chiếm 56% tổng protein huyết tơng,
luôn đổi mới thời gian bán huỷ là 20 ngày. Albumin có lợng nhỏ các protein
tối cần thiết mà cơ thể không tổng hợp đợc nh tryptophan, methiomin,
isoleucin. Hàng ngày cơ thể có khả năng tổng hợp đợc 140-200mg albumin/kg
cân nặng cơ thể. Số này phân bổ ở các khu vực nh sau: 1/3 trong lòng mạch, số
còn lại nằm ngoài lòng mạch, cơ và đờng tiêu hoá (11, 44).
Điều hoà cân bằng albumin giữa sản xuất và tiêu huỷ là do cơ chế ức chế
ngợc (Feed Back) và cơ chế tiêu huỷ nội bào bởi các protease trong hệ enzym
lysosom nội bào. Albumin đóng vai trò duy trì áp lực keo và khối lợng tuần

hoàn, vận chuyển các chất nội sinh (nội tiết tố, bilirubin, acid béo ), và các chất
ngoại sinh nh (thuốc, các vi chất nh kẽm, Ca
2+
, sinh tố v.v ). Vì vậy albumin
là một sản phẩm có giá trị cao trong điều trị bệnh (55, 57, 66).
- Globulin: đây là nhóm protein phức tạp nhất gồm 4 nhóm lớn:
1
,
2
,
và . Theo tài liệu điều tra chỉ số sinh học năm 2001 (5). Tỷ lệ các thành phần
của albumin và globulin huyết tơng nh sau:
+ Phần globulin có:
1
chiếm 2,5% protein huyết tơng,
2
chiếm 8,8%,
chiếm 11,6%, chiếm 20,6%.
+ Phần albumin = 56,6%
Trong -globulin có các globulin miễn dịch: IgA, IgG, IgM, IgE và IgD. Trong
đó, IgG chiếm khoảng 80% (1,5) (phụ lục 2).
- Glucoprotein: khi điện di trên giấy chúng xuất hiện ở vùng
1
và
2
-
globulin. Các glucoprotein đều có hoạt tính sinh học. Glucoprotein tăng trong các
bệnh lao, viêm phế quản, viêm phổi, thấp khớp cấp, viêm cầu thận cấp, thận h, v.v.
- Haptoglobin: gồm 2 chuỗi polypeptid ( và ) là thành phần của
2

-
globulin, trọng lợng phân tử là 85.000 làm nhiệm vụ vận chuyển hemoglobin về
gan để tiếp tục chuyển hoá và không để hemoglobin tự do lọt qua cầu thận.
- Transferrin (Siderophilin) là protein thuộc phần -globulin, trọng lợng
phân tử là 90.000. Nồng độ transferrin trong huyết tơng khoảng 2,9g/l,
transferrin làm nhiệm vụ vận chuyển sắt, cùng với ferritin và haptoglobin,
transferrin làm nhiệm vụ điều hoà cân bằng sắt trong cơ thể.

12
- Seruloplasmin: là protid có màu xanh và vận chuyển đồng (Cu), cứ một
mol seruloplasmin mang 8 nguyên tử đồng, trọng lợng phân tử là 160.000, do
gan tổng hợp.
- Fibrinogen: là một glucoprotein gồm 3 chuỗi polypeptid khác nhau liên
kết với nhau bằng các cầu disulfur (SH-) phần liên kết với glucid qua asparagin
và N-acetyl, glucosamin, fibrinogen có trọng lợng phân tử là 330.000 -
340.000, di chuyển điện di giữa và globulin. Nó đợc tổng hợp ở gan và nồng
độ trong máu trung bình là 2 - 4 g/l (chiếm 4-5% lợng protid huyết thanh).
- Lipid: lipid toàn phần trong huyết thanh bình thờng là từ 4-7 g/l gồm
triglycerid, phospholipid, steroid Khi điện di nó tách cho ta 2 vùng bằng nhau, -
lipoprotein (hình thoi) và -lipoprotein (hình cầu) trọng lợng phân tử 1.300.000,
chứa 60% lipid và 1-2% glucid.
- Cholesterol: cholesterol máu tồn tại dới hai dạng cholesterol tự do và
cholesterol este hoá, chúng đều đợc tổ hợp trong các hạt lipoprotein, nồng độ
cholesterol toàn phần trong huyết thanh 1,5 - 2,0 g/ l hay 4 - 6,5 mmol/l (tự do
1,10 - 1,60 g/l; este hoá 0,35 - 0,9 g/l).
- Glucid: glucid trong máu là glucose, nồng độ bình thờng của glucose là
80 - 120 mg% và 5,55 mol/ lít, đợc điều hoà bởi hệ thống hormon và gan.
- Các Nitơ-phi-protid: các chất chứa nitơ phi protid là sản phẩm thoái hoá
của protid và acid amin, gồm có:
Urê: là sản phẩm thoái hoá quan trọng nhất của protid. Nó không độc

nhng đợc coi nh là đại diện cho toàn bộ các chất cặn bã của chuyển hoá
protid. Urê đợc tổng hợp ở gan và đào thải qua thận. Nồng độ urê máu bình
thờng 20-30 mg% hay 3,537 mmol/l chiếm khoảng 50% tổng số các chất nitơ
phi protid, nồng độ urê thay đổi theo chế độ ăn và bệnh lý thận.
Acid uric: là sản phẩm thoái hoá của nhân purin. Bình thờng nồng độ acid
uric máu là 3 - 7 mg% hay 190 - 420 àmol/ l, nồng độ này gần bão hoà, cho nên nếu
tăng nữa sẽ gây lắng đọng muối urat thành các cục nh trong bệnh Goutte.
Bilirubin: là sản phẩm thoái hoá của hemoglobin. Trong máu bilirubin chủ yếu
ở dạng tự do với nồng độ 2 - 8 mg/ l (bilirubin toàn phần 10 mg/l hay 5 - 17 mol/ l).

13
Creatinin và creatin: có giá trị giống urê. Bình thờng nồng độ creatin từ
1 đến 1,5 mg/l và creatinin 6 - 12 mg/l (tổng lợng từ 5-11,5 mg/l hay 44 - 100
àmol/ l). Creatinin tăng trong các bệnh về thận.
NH
3
bình thờng NH
3
rất ít 15%, NH
3
tăng trong bệnh gan giai đoạn
cuối, tiền hôn mê và hôn mê gan, bỏng nặng và xuất huyết tiêu hoá ở ngời xơ gan.
- Các enzym huyết thanh: các enzym trong huyết thanh gồm 3 nhóm:
Các enzym huyết thanh có chức năng là các enzym đợc bài tiết vào máu và
thực hiện các chức năng xúc tác của chúng trong máu. Đại diện cho các enzym này
là các enzym gây đông máu, pseudo-cholinesterase, lipase Nói chung nồng độ
các enzym này tơng đối cao trong huyết thanh so với các mô khác.
Các enzym huyết thanh không có chức năng là các enzym đợc bài tiết vào
máu nhng không hoạt động vì chúng không có cơ chất trong huyết thanh. Nồng
độ các enzym này thấp hơn nhiều (hàng triệu lần) so với nồng độ của chúng

trong các mô.
Các enzym có nguồn gốc tế bào gồm: các enzym khu trú ở bào tơng nh
LDH, aldolase, các enzym vừa có ở bào tơng vừa có ở ty thể là AST, các enzym có
nguồn gốc ty thể GLDH, OCT, enzym có nguồn gốc lysosom là phosphatase
acid, glucuronidase Các enzym này đợc quan tâm nhiều hơn vì khi tăng
hoạt tính của chúng trong huyết thanh phản ánh trạng thái chức năng và bệnh lý
của các cơ quan tơng ứng.
2.3.6. Một số đặc điểm lý hoá của protein huyết tơng liên quan đến
các kỹ thuật chiết tách các thành phần protein huyết tơng:
Để tách đợc các thành phần protein, ngời ta chú ý đến các đặc điểm lý
hoá của huyết tơng (5, 24, 61).
- Điểm đẳng điện của protein: mỗi protid huyết tơng đều có điểm đẳng
điện (isoelectric) tơng ứng với pH. Khi đó protein trở nên trung tính về điện
tích, không sinh ra và cũng không cố định H
+
.
- Tính hoà tan của protein: tính hoà tan này chịu ảnh hởng của nhiều yếu tố:
Tính hoà tan trong dung dịch muối, độ hoà tan muối thấp thì độ hoà tan
protein giảm và ngợc lại;
ảnh hởng của nhiệt độ: độ hoà tan tăng khi nhiệt độ tăng - ngợc lại
nhiệt độ thấp độ hoà tan giảm.

14
- Tính bền vững và biến tính của protein: khi cấu trúc protein thay đổi độ
hoà tan thay đổi, tính chất sinh học cũng mất đi. Các yếu tố ảnh hởng đến biến
tính của protein huyết tơng:
Nhiệt độ: Nhiệt độ tăng có thể phá vỡ liên kết của phân tử protein.
Độ acid hoặc kiềm.
Do các tác nhân vật lý nh tia cực tím làm đứt gãy các liên kết peptid,
sóng siêu âm gây ôxy hoá.

- Biến tính bề mặt: tạo các màng mỏng protein không hoà tan, dới màng là
các nhóm a nớc chìm trong dung dịch.
Một số cơ chất, enzym có thể làm tăng tính ổn định của protein, làm cho
protein bền vững hơn, làm khó khăn cho kỹ thuật tinh chế.
- Trong lịch sử phát triển của các sản phẩm huyết tơng, phải kể đến phát
minh ra túi chất dẻo từ plastic và các chất chống đông máu. Túi này có độ dẻo
tốt tiện cho ly tâm tốc độ cao và bảo quản ở nhiệt độ -20
0
C. Do đó ngay sau khi
phát minh túi chất dẻo và chất chống đông máu ngời ta đã thành công tách
hồng cầu và huyết tơng giàu tiểu cầu, tiếp theo ly tâm bớc 2 tạo ra sản phẩm
huyết tơng sạch. Vào khoảng 1947 Cohn và cộng sự đã thành công tách đợc 3 sản
phẩm đầu tiên từ huyết tơng đó là tủa lạnh yếu tố VIII, albumin và -globulin. Từ
đây truyền máu từng thành phần huyết tơng đã đợc mở ra ở lâm sàng và cũng
là lần đầu tiên bệnh nhân hemophilia A đã đợc chăm sóc (27, 31).
- Các chất chống đông là khâu cực kỳ quan trọng của truyền máu và tách
các thành phần máu. Ngời đầu tiên Braxton-Hicks (1869) đa ra dung dịch
phosphate, sau thay bằng citrate, tới thế chiến thứ hai do nhu cầu cung cấp
máu lớn, dung dịch citrate đã thay bằng dung dịch acid - citrate- dextrose
(ACD) bảo quản máu dài ngày hơn, sau đó dung dịch ACD thay bằng dung
dịch citrate-phosphate-dextrose (CPD). Và ngày nay là dung dịch CPD- A1
(Adenin), dung dịch này giúp bảo quản máu dài ngày hơn nữa (42 ngày với
khối hồng cầu). Các cải tiến về dung dịch chống đông và bảo quản máu vẫn
đang đợc tiếp tục nghiên cứu (52, phụ lục 1)
Có thể nói từ năm 1950, sau phát minh của Cohn, việc nghiên cứu sản xuất
các sản phẩm máu và truyền máu từng thành phần đã phát triển khá nhanh ở các

15
nớc tiên tiến, tới nay một số nớc đã tách đợc trên 20 sản phẩm, tập trung vào
các nhóm sản phẩm có hiệu quả cao cho điều trị nh albumin, globulin miễn

dịch (Igs), các yếu tố đông máu và một số chất kháng đông bao gồm cả các yếu
tố ức chế men nh antithrombin III,
1
-proteinase (40, 53).
2.4. Các phơng pháp chiết tách các thành phần huyết tơng
Sản xuất các thành phần huyết tơng dựa trên 3 điều kiện cơ bản:
- Huyết tơi có chất lợng tốt: > 60g protein, huyết sắc tố > 120g/l
- Độ an toàn cao: sàng lọc HIV, HBV, HCV, giang mai bằng phơng pháp
miễn dịch (ELISA) và phơng pháp sinh học phân tử nh phản ứng chuỗi
polymerase (polymerase chain reaction: PCR).
- Điều kiện sản xuất: phòng lạnh, vô trùng, trang bị tốt.
Các phơng pháp thờng dùng: tủa lạnh bằng ethanol, sắc ký (chromatography),
miễn dịch hấp thụ (immunoaffinity), tái tổ hợp (recombinant), chuyển gene ở động vật
(transgenic animal) và gần đây là proteomics.
2.4.1. Phơng pháp tủa lạnh bằng ethanol
2.4.1.1. Phơng pháp đợc Cohn nghiên cứu và thực hiện thành công tại
Mỹ từ 1947 nhờ thành công về nghiên cứu và sản xuất túi chất dẻo của Murphy
và Gibson, túi này có độ mềm dẻo có thể ly tâm tốc độ lớn mà không bị vỡ, bảo
quản lạnh sâu không h hỏng, Cohn đã ứng dụng túi chất dẻo để tách các thành
phần huyết tơng bằng ethanol. Bằng phơng pháp này khoảng 1949 - 1950 Cohn
đã thành công tách đợc 3 thành phần huyết tơng: albumin, immunoglobulin
(IgG) và ít tủa sợi huyết (fibrinogen), F-VIII. Tới 1964 tác giả đã thành công
nghiên cứu tan đông (thawing) của huyết tơng toàn phần ở nhiệt độ 2-4
0
C thu
đợc sản phẩm yếu tố VIII, sợi huyết, Von - Willebvand. Tác giả nhận thấy bớc
này không liên quan đến bớc sản xuất albumin và IgG cũng bằng ethanol (31).
* Về u điểm:
- Phơng pháp này có khả năng xử lý đợc một lợng lớn huyết tơng trong
bể có điều nhiệt (thermostatic tanks).

- ít độc
- ổn định
- Giá thành thấp

16
- Ethanol có tác dụng diệt khuẩn (bactericidal).
- Ethanol ở pH thấp có thể tham gia diệt virus, kể cả HIV.
Tuy nhiên, phơng pháp này còn có hạn chế đó là tính đặc hiệu thấp, độ
tinh khiết của các sản phẩm cha cao, nhất là các sản phẩm đông máu (31).
Qua nhiều năm áp dụng và hoàn thiện quy trình chiết tách albumin, IgG
bằng phơng pháp Cohn, tới nay nhiều nớc Châu Âu đã sản xuất và đạt hiệu
quả cao nh Đức, Pháp. Theo thông báo của Schmitt H (1992), hiệu suất albumin
thu đợc là 27g từ 1 lít huyết tơng và hàng năm có khả năng sản xuất đợc từ
300-378 kg Albumin cho 1 triệu dân. Từ số lợng này đã sử dụng truyền cho
bệnh nhân khoảng 45% (55).
Để sản xuất một lợng lớn Albumin, -globulin miễn dịch (IgG) nhiều cơ
sở vẫn sử dụng phơng pháp Cohn mô tả 1950 có bổ sung rõ hơn về các điều
kiện pH, nhiệt độ, lực ion, nồng độ ethanol của môi trờng tủa cho phù hợp với
từng thành phần của huyết tơng. Thí dụ phơng pháp Cohn S-6 đợc mô tả bởi
Van Aken, 1996 (59).
Quy trình này dùng 5 thay đổi khác nhau bao gồm:
- Nồng độ ethanol : 8-40%
- pH : 4,5 - 7,4
- Nhiệt độ : 0 -6
0
C
- Lực ion : 0,14 - 0,01
- Nồng độ protein : 5,1% khi bắt đầu
: 0,8% khi kết thúc
Quy trình này đợc gọi là quy trình tách "tủa protein" đã biết ra khỏi các

protein cha biết trong huyết tơng (61).
Bớc 1: Sử dụng nồng độ ethanol 8%, pH 7,2, lực Ion 0,14 sẽ thu đợc F-
VIII, V.Willebrand, fibrinogen.
Bớc 2: Xử lý nớc mặt của bớc 1 bằng ethanol 25%, pH 6,9; lực ion 0,09
thu đợc tủa II, III đó là yếu tố: F-II, V, VII, IX, X và các Ig: IgG; IgA, ít IgM
Bớc 3: Xử lý nớc mặt bớc hai bằng ethanol 18%, pH 5,2 thu đợc tủa
IV-1 và nớc mặt IV-1 trong đó có antithrombin III, bổ thể, IgM, protease inhibitor.
Bớc 4: Xử lý nớc mặt bớc 3 (IV-1) bằng ethanol 40%, pH 5,8 thu
đợc tủa IV-4 và nớc mặt IV-4. Trong tủa IV- 4 có haptoglobin transferrin,
-globulin.

17
Bớc 5: Xử lý nớc mặt bớc 4 (IV-4) bằng ethanol 40%, pH 4,8 thu
đợc tủa V có chứa albumin và -globulin; nớc mặt V đợc tủa bằng ethanol
40%, pH 5,2 thu đợc albumin sạch (H.2.1) (59).
Qui trình này cho 5 nhóm sản phẩm (Fraction I; II + III; IV-1; IV-4; V)
trong đó, mỗi nhóm lại có thể chiết tách các sản phẩm tinh khiết hơn. Tuy nhiên,
trong điều kiện cha đủ phơng tiện thì tập trung vào sản phẩm I (F-I), sản phẩm
II+III (F-II, III). Sản phẩm V (F-V) (bảng 2.1). F-I cho yếu tố VIII, F-II cho IgG,
F-V cho albumin, đó là các thành phần quan trọng, chiếm lợng lớn của huyết
tơng toàn phần.
Bảng 2.1: Các nhóm sản phẩm của protein huyết tơng thu đợc bằng
phơng pháp tủa ethanol của Cohn


Các phân đoạn
(Fraction)
Ethanol (%) pH Protein nhận đợc
I 8 - 10 7,2
- Fibrrinogen

- F.VII
- C
1
II + III 25 6,9
- F II,III, V, VII, IX
- IgG, A
- Plasminogen
IV - 1 18 5,2
- AT III
-
1
- Proteinase Inhibitor
- Các C'
- IgM
IV-4 40 5,8
- Haptoglobin
- Transferrin
- - globulin
- lipoprotein
V 40 4,8
- Albumin
- và globulin
(Van Aken, 1996)

18

Huyết tơng tơi
Tủa I
Dịch nổi I
Ethanol 25%
pH 6,9; I = 0,09
Ethanol 8%

pH 7,2; I = 0,14
F-VIII, Fibrino
g
en
C'1
Bớc 1
Bớc 2
Dịch nổi II+III
Ethanol 18%
pH 5,2; I = 0,09
Tủa II và III
- I
g
G, A, M
- FII, VII, IX, X
Dịch nổi IV-1
Ethanol 40%
pH 5,8; I = 0,09
Tủa IV-1
- AT III
- C, IgM
- Proteinase Inhibitor
Dịch nổi IV-4
Ethanol 40%
pH 4,8; I = 0,11
Tủa IV-4
-He
p
to
g

lobin
- -globulin

Dịch nổi V
Tủa V
- Albumin
- -globulin

- Ethanol 40%
- pH 4,5; I = 01
Dịch nổi
Loại
Dịch nổi loại bỏ
Albumin
sạch
- Ethanol 40%
- pH 5,2
- I = 0,01
Bớc 3
Bớc 4
Bớc 5
H.2.1. Sơ đồ tách các thành phần huyết tơng bằng phơng pháp Cohn
có cải tiến (theo Van Aken W.G. 1996) (59)