CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT CHUYỂN HOÁ THUỘC NHÓM NITROFURAN TRONG THỦY SẢN

RT: 0.00 - 10.00 SM: 5B
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Time (min)
0
20
40
60
80
100
Relative Abundance
0
20
40
60
80
100
Relative Abundance
RT: 5.18
MA: 488579
SN: 812
5.74
7.296.60
8.22 9.318.65
RT: 5.18
MA: 1197952
SN: 6318
RMS
5.88
4.68
7.46 8.72 9.486.64 8.22
NL:

3.80E4
TIC F: + c APCI
SRM ms2

0
[103.500-
104.500] MS
KS5-3
NL:
8.93E4
TIC F: + c APCI
SRM ms2

0
[133.500-
134.500] MS
KS5-3
RT: 0.00 - 10.00 SM: 5B
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Time (min)
0
20
40
60
80
100
Relative Abundance
0
20
40

60
80
100
Relative Abundance
RT: 3.76
MA: 344845
SN: 8227
RMS
4.27
1.010.73 3.212.131.32 2.66
RT: 3.75
MA: 1298932
SN: 197
3.281.36 1.88 2.780.38
NL:
3.50E4
TIC F: + c APCI
SRM ms2

0
[261.500-
262.500] MS
KS5-3
NL:
1.35E5
TIC F: + c APCI
SRM ms2

0
[290.500-

291.500] MS
KS5-3
RT: 0.00 - 10.00 SM: 5B
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Time (min)
0
20
40
60
80
100
Relative Abundance
0
20
40
60
80
100
Relative Abundance
RT: 5.14
MA: 523877
SN: 149
5.57
6.23
9.87
7.39 9.148.78
8.22
RT: 5.14
MA: 494581
SN: 535

4.87
9.47
8.71
6.39
7.06 8.05
NL:
4.74E4
TIC F: + c APCI
SRM ms2

0
[165.500-
166.500] MS
KS5-3
NL:
4.18E4
TIC F: + c APCI
SRM ms2

0
[191.500-
192.500] MS
KS5-3
RT: 0.00 - 10.00 SM: 5B
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Time (min)
0
20
40
60

80
100
Relative Abundance
0
20
40
60
80
100
Relative Abundance
RT: 5.09
MA: 87263
SN: 94
5.68
5.91
6.25
6.84
7.54 8.938.36
9.75
RT: 5.09
MA: 119615
SN: 13519
5.85
6.18
9.268.937.776.75 9.92
NL:
6.24E3
TIC F: + c APCI
SRM ms2

0
[103.500-
104.500] MS
KS5-3
NL:
9.32E3
TIC F: + c APCI
SRM ms2

0
[133.500-
134.500] MS
KS5-3
MỤC LỤC
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 1
PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC
CHẤT CHUYỂN HOÁ THUỘC NHÓM
NITROFURAN TRONG THỦY SẢN
I. NITROFURAN
An toàn vệ sinh thực phẩm là vấn đề đang được cả xã hội quan tâm, đặc biệt là ở
đô thị và các khu công nghiệp, khi ngày càng có nhiều tác nhân độc hại bị phát hiện
trong thực phẩm khiến dư luận lo ngại. Tuy nhiên trong lĩnh vực sản xuất kinh doanh
nói chung và trong chăn nuôi gia súc, gia cầm nói riêng còn nhiều vấn đề đáng lo
ngại, như việc quản lý sử dụng thuốc kháng sinh còn lỏng lẻo, tình trạng sử dụng các
chất bổ trợ trong chăn nuôi khá tùy tiện. Từ đó đã để lại tồn dư các hóa chất, kháng
sinh trong sản phẩm chăn nuôi, gây nguy hại nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu
dùng.
Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợp thường được sử dụng trong thức ăn
gia súc như kích thích tăng trưởng và là phương pháp điều trị dự phòng, điều trị các
bệnh nhiễm trùng đường tiêu hóa gây ra bởi Escherichia và Salmonella trong chăn

nuôi gia súc, gia cầm. Chúng cũng đã được sử dụng để điều trị nhiễm trùng do vi
khuẩn và sinh vật đơn bào trong nuôi trồng thủy sản Tuy nhiên chúng gây tác hại
cho sức khỏe con người, đặc biệt là gây ung thư và đột biến ở người. Năm 2002 –
2003 phát hiện dư lượng chất chuyển hóa của nitrofuran trong số lượng lớn các mẫu
từ gia cầm và nuôi trồng thủy sản các sản phẩm nhập khẩu vào Châu Âu từ một số
khu vực Đông Nam Á và các nước Nam Mỹ. Từ đó đã dẫn đến lệnh cấm sử dụng
trong sản xuất thực phẩm động vật tại nhiều quốc gia bao gồm Mỹ, Canada và EU
Các nước này đã đặt lệnh cấm trên tất cả các loại thực phẩm nhập khẩu có chứa dư
lượng nitrofuran. Tháng 3 năm 2003 EU đã quy định yêu cầu giới hạn nhỏ nhất cần
thực hiện phương pháp (MRPL) đối với các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran là 1
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 2
μg/kg. Năm 2002, ở Việt Nam, Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn đã quyết định
cấm sản xuất, nhập khẩu, lưu thông và sử dụng một số loại kháng sinh hóa chất trong
sản xuất và kinh doanh TACN trong đó có nitrofuran.
1. Tác dụng của các chất kháng sinh nhóm nitrofuran
Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợp có chứa nhóm 5-nitro, thường được
sử dụng làm thức ăn gia súc kích thích sự tăng trưởng, chủ yếu đối với gia súc (như
gia cầm, lợn), nuôi trồng thủy sản (cá, tôm) và nuôi ong để điều trị các vi khuẩn và
sinh vật đơn bào nhiễm trùng như viêm ruột tiêu hóa gây ra bởi Escherichia coli và
Salmonella spp, gia cầm bệnh tả và bênh cầu trùng màu đen đầu.
Các chất nhóm nitrofuran bao gồm Furazolidone, furaltadone, furazolidone,
nitrofurazone, khi đi vào cơ thể sinh vật nó tạo thành các chất chuyển hóa tương ứng
(AOZ, AMOZ, AHD, SEM) liên kết trong các mô tồn tại trong nhiều tuần sau khi sử
dụng.
McCracken và các cộng sự 1995, Nouws và Laurensen 1990 chỉ ra rằng các hợp
chất nhóm nitrofuran sau khi vào cơ thể tạo thành các chất chuyển hóa tương ứng liên
kết trong các mô.
Về mặt cơ chế tác dụng, các chất chuyển hóa từ nitrofuran đã kìm hãm hoặc phá
hủy các hệ thống men điều hòa trao đổi chất ở vi khuẩn. Do đó vi khuẩn không phát
triển và không sinh sản được nữa. Tác dụng tốt với vi khuẩn gram âm và gram

dương. Đồng thời còn tác dụng cả với nguyên sinh động vật, một số chất có tác dụng
tốt trong việc giệt trừ giun đũa.
Với nồng độ thấp, nitrofuran có tác dụng kháng sinh, nồng độ cao có tác dụng diệt
khuẩn.
Theo nhiều báo cáo, nitrofuran tác dụng rất tốt trong việc diệt khuẩn
salmonellosis, colisepticeamia. Nitrofuran còn có tác dụng kích thích dinh dưỡng.
Trộn nitrofuran với thức ăn, theo tỉ lệ thích hợp sẽ giúp cho gà và lợn còn tăng trọng
nhanh.
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 3
Nitrofuran ảnh hưởng đến sức khỏe con người như gây ung thư và đột biến, khi
thực phẩm có tồn dư nitrofuran và các dẫn xuất của nó.
Do đó hầu hết các nước trên thế giới đã cấm sử dụng kháng sinh nhóm nitrofuran
trong chăn nuôi. Ở Việt Nam, bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn đã quyết định
cấm sử dụng nitrofuran cho vào trong thức ăn chăn nuôi. EU đã quy định yêu cầu
giới hạn nhỏ nhất cần thực hiện phương pháp (MRPL) đối với các chất chuyển hóa
nhóm nitrofuran là 1 μg/kg.
2. Dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong thực phẩm
Từ năm 2002 – 2003 nitrofuran thường xuyên được phát hiện thấy trong thịt gia
cầm và các sản phẩm nuôi trồng thủy sản nhập khẩu vào các nước EU từ Thái Lan,
Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Việt Nam, Ecuador và Brazil.
Hơn nữa, dư lượng nitrofuran cũng được tìm thấy trong sản phẩm gia súc và gia
cầm ở Châu Âu như: Bồ Đào Nha, Ý, Hy Lạp, Romania và Bulgari. Sau đó EU đã
kiểm tra và cho thấy nitrofuran ô nhiễm trong các sản phẩm có nguồn gốc từ hơn 9
quốc gia trong năm 2007, tỷ lệ mắc cao nhất là từ Ấn Độ (37%), Trung Quốc (37%),
Bangladesh (10%) và Thái Lan (5%) trong một loạt cá sản phẩm bao gồm tôm, mật
ong và thịt hộp.
Từ tháng 10/2006 đến tháng 5/2007, FDA liên tục phát hiện thủy sản nhập khẩu từ
Trung Quốc có nhiễm nitrofuran. Kết quả lấy trên các sản phẩm tôm, cá trê, cá ba
sa cho thấy, 22/89 mẫu (chiếm 22%) bị phát hiện có chất cấm nitrofuran trong tôm.
Ở Việt Nam theo kết quả khảo sát của TS. Nguyễn Quốc Ân, phó trưởng phòng

quản lý thuốc, cục thú y vào năm 2007 đã phát hiện 5 mẫu thủy sản nuôi lấy tại ao
nuôi nhiễm SEM (3 mẫu tôm, 1 mẫu cá và 1 mẫu cua lột) với hàm lượng từ 0 – 3,55
ng/g. Năm 2008 phát hiện 1 mẫu tôm thẻ chân trắng tại Phú Mỹ – Bình Định nhiễm
AOZ với hàm lượng 12,6 ng/g; 2/754 mẫu cua lột tại Cần Guộc – Long An nhiễm
SEM với hàm lượng từ 2 – 2,2 ng/g.
3. Các phương pháp xác định kháng sinh nhóm nitrofuran
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 4
Hiện nay có nhiều phương pháp để xác định kháng sinh nhóm nitrofuran, bao
gồm: phương pháp sắc ký lỏng với detector UV, phương pháp vi sinh (kỹ thuật Elisa),
phương pháp sắc ký lỏng với detector MS/MS.
II. ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT CHUYỂN HOÁ THUỘC NHÓM
NITROFURAN TRONG THỦY SẢN BẰNG SẮC KÝ LỎNG GHÉP
ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ BA TỨ CỰC (LC/MS/MS)
1. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này qui định phương pháp định lượng kháng sinh nhóm nitrofuran và các
chất chuyển hoá (metabolite) tương ứng trong thủy sản bằng sắc kí lỏng ghép đầu dò
khối phổ ba tứ cực (gọi tắt là LC/MS/MS).
Giới hạn phát hiện của phương pháp cho bốn chất họ Nitrofuran là 1 g/Kg.
2. Công thức
3. Nguyên tắc
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 5
Dư lượng liên kết với mô của các chất chuyển hoá nhóm nitrofuran trong thức ăn
chăn nuôi được thuỷ phân bằng hydrochloric acid loãng để thu được các
metabolite tương ứng. Các metabolite này được dẫn xuất hoá với 2-
nitrobenzaldehyde. Định tính và định lượng các chất dẫn xuất bằng thiết bị LC
/MS/MS.
4. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, chất chuẩn
4.1 Thiết bị
- Hệ thống sắc kí lỏng: Water Alliance 2690 hoặc tương đương gồm bơm và hệ thống
tiêm mẫu;

- Cột bảo vệ pha đảo C18 (Symmetry Sentry Guard hoặc tương đương), kích thước
20 x 3,9mm;
- Cột C18 (Symmetry hoặc tương đương) kích thước150 x 3,0 mm, 5 µm. [Cột sắc ký
Agilent C18 (150mm x 2,1mm x 3,5μm)].
- Ðầu dò khối phổ dạng bốn cực với giao diện ESI (Triple quadrupole Micromass
Quattro Ultima hoặc tương đương).
- Cột chiết pha rắn SPE (Oasis HLB).
- Máy lắc vortex VELP.
- Máy đồng nhất mẫu.
- Máy li tâm MIKRO 22R.
- Cân phân tích (có độ đọc 0,1mg và 0,01mg).
- Cân kĩ thuật (có độ đọc 0,01g).
- Máy thổi khí N2 làm khô có điều nhiệt.
- Bể điều nhiệt
4.2 Dụng cụ
Cốc có mỏ dung tích 50, 100, 200 ml.
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 6
- Ống đong dung tích 10, 100, 200 ml.
- Pipetman, pipet nhựa, pipet pasteur 200 μl; 1000 μl; 5 ml…đầu côn.
- Ống ly tâm 50 ml, màng lọc 0,2 μm.
- Vial loại 1,8 ml.
- Bình định mức loại A dung tích 10, 25, 50, 100 ml.
- Ống nghiệm thủy tinh…
5. Hóa chất, dung dịch
5.1 Hóa chất
- Methanol (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 99,9%)
- Amoni acetate (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 98%)
- 2-NBA (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 99%)
- K2HPO4.3H2O (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 99%)
- NaOH (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 99,9%)

- HCl 37% (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 99,9%)
- HCl 0,2M: Hút 17 ml HCl 37% vào bình định mức 1000 ml, định mức đến vạch
bằng nước cất.
- 2-NBA 1000 mg/l: cân 100 mg 2-NBA hòa tan và định mức vào bình 10 ml bằng
methanol.
Dung dịch chuẩn bị hằng ngày.
- K2HPO4 0,2 M: cân 45,7 mg K2HPO4.3H2O hòa tan và định mức vào bình 1000
ml bằng nước cất 2 lần.
- Nước cất 2 lần khử ion
- Dimethyl sulfoxide (DMSO)
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 7
- NaOH 2 M: cân 8 g NaOH hòa tan và định mức vào bình định mức 1000 ml bằng
nước cất 2 lần.
- CH3COONH4 10 mM: cân 0,077 g CH3COONH4 hòa tan và định mức vào bình
định mức 1000 ml bằng nước cất 2 lần.
5.2 Chất chuẩn
5.2.1 Chất chuẩn gốc
- Furazolidone VETRANAL, 99,9%
Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH D-30918 Seelze
CAS-No: [67-45-8]
- Furaltadone VETRANAL, 99,9%
Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH D-30918 Seelze
CAS-No: [139-91-31]
- 3-amino-2-oxazolidinone (AOZ) VETRANAL, 99,4%
Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH D-30918 Seelze
CAS-No: [80-65-9]
- 5-methylmorpholino-3-amino-2-oxazolidinone (AMOZ) VETRANAL, 99,9%
Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH D-30918 Seelze
CAS-No: [43056-63-9]
- Nitrofurazone 100 ng/µL trong acetonitrile VETRANAL

Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH D-30918 Seelze
- Nitrofurantoin VETRANAL, 99,9%
Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH D-30918 Seelze
CAS-No: [67-20-9]
5.2.2 Pha chế chất chuẩn
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 8
- Chuẩn AHD 1000 mg/l: cân 13,2 mg ± 0,1 mg chuẩn AHD.HCl hòa tan và
định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử dụng
được trong 6 tháng.
- Chuẩn AHD 10 mg/l: hút 100 μl chuẩn AHD 1000 mg/l định mức bằng
methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử dụng được trong 6
tháng.
- - Chuẩn SEM 1000 mg/l: cân 14,9 mg ± 0,1 mg chuẩn SEM.HCl hòa tan và
định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml.
- - Chuẩn SEM 10 mg/l: hút 100 μl chuẩn SEM 1000 mg/l định mức bằng
methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử dụng được trong 6
tháng.
- - Hỗn hợp chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) 1 mg/l: hút lần lượt 1 ml
chuẩn AOZ 10 mg/l, AMOZ 10 mg/l, AHD 10 mg/l, SEM 10 mg/l định mức
bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử dụng được
trong 3 tháng.
- - Hỗn hợp chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) 20 μg/l: hút 200 μl hỗn
hợp chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) định mức bằng methanol vào
bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử dụng được trong 1 tháng.
- - d4-AOZ 1000 mg/l: Cân 10 mg ± 0,1 mg d4-AOZ định mức bằng methanol
vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử dụng được trong 6 tháng.
- - d4-AOZ 10 mg/l: hút 100 μl d4-AOZ 1000 mg/l định mức bằng methanol vào
bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử dụng được trong 6 tháng.
- - d5-AMOZ 1000 mg/l : Cân 10 mg ± 0,1 mg d5-AMOZ định mức bằng
methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử dụng được trong 6

tháng.
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 9
- - d5-AMOZ 10 mg/l: Hút 100 μl d5-AMOZ 1000 mg/l định mức bằng
methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử dụng được trong 6
tháng.
- - Hỗn hợp nội chuẩn (d4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl,13C15N2-SEM.HCl)
1 mg/l: hút lần lượt 1 ml chuẩn d4-AOZ 10 mg/l, d5-AMOZ 10 mg/l, d2-
AHD.HCl 10 mg/l và 13C15N2-SEM.HCl 10 mg/l định mức bằng methanol
vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử dụng được trong 3 tháng.
- - Hỗn hợp nội chuẩn (d4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl,13C15N2-SEM.HCl)
20 μg/l: hút lần lượt 200 μl hỗn hợp nội chuẩn (d4-AOZ, d5-AMOZ, d2-
AHD.HCl, 13C15N2-SEM.HCl) 1 mg/l vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở
- 200C sử dụng được trong 1 tháng.
6. Tiến hành phân tích
6.1 Mẫu thử nghiệm
Nếu lượng mẫu dưới 500g: Đem tất cả đi xay nhuyễn để đồng nhất mẫu.
Sau đó chia lượng mẫu đã xay thành 2 phần bằng nhau. Một phần đem phân tích,
phần còn lại đem lưu mẫu.
Nếu lượng mẫu trên 500g: Trải mẫu đều trên khay hình chữ nhật. Chia mẫu
theo nguyên tắc đường chéo, lấy 2 phần mẫu đối diện, thực hiện như vậy đến khi
phần mẫu mang xay còn khoảng 200g÷500g mẫu. Sau đó, đem xay nhuyễn để đồng
nhất mẫu Phần mẫu còn lại đem lưu mẫu.
Cân khoảng 2-3g mẫu đã được đồng nhất cho vào ống ly tâm 50 mL.
Lưu ý: Mẫu kiểm soát dương tính có thể được bổ sung một hoặc hai hoặc cả bốn
chất trong họ Nitrofuran, (chuẩn bổ sung phải nằm trong khoảng tuyến tính của
đường chuẩn, để yên 30 phút. Sau đó, tiến hành xử lý mẫu như quy trình )
6.2 Xử lý mẫu
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 10
Vì các chất dẫn xuất nitrofuran rất nhạy với ánh sáng nên toàn bộ quy trình xử lý
mẫu phải được tiến hành dưới ánh sáng yếu.

6.3 Thuỷ phân và dẫn xuất hoá
Thêm 10 mL hydrochloric acid 0,125 M và 400 mL dung dịch 2-NBA trong
DMSO vào các ống nghiệm chứa mẫu. Đậy nắp ống và vortex khoảng 1 phút. U
mẫu qua đêm (từ 14 đến 16 giờ) ở nhiệt độ 37 ± 2
o
C.
6.4 Trung hoà
Sau khi làm nguội, thêm 1 mL dung dịch K
2
HPO
4
0, 1M. Lắc đều. Điều chỉnh
pH về (7,2÷7,4) bằng NaOH 1 M (kiểm tra bằng máy đo pH). Lắc và để yên trong
5 phút. Kiểm tra lại pH và điều chỉnh thêm nếu cần thiết. Ly tâm mẫu trong 10
phút ở tốc độ 5000 vòng/phút, lấy phần trong (dung dịch A).
6.5 Chiết
- Chuẩn bị cột SPE : Nối cột vào bộ chiết SPE, thêm lần lượt 3 mL ethyl acetate, 3
mL methanol và 5 mL nước cất vào cột. Loại bỏ dung dịch chảy qua cột.
- Làm sạch dịch chiết: Cho dung dịch A vào cột đã được chuẩn bị.
- Rửa cột: Khi mẫu vừa qua hết, thêm 5 mL nước vào cột. Loại bỏ dịch chảy ra
khỏi cột. Sau đó, cột được làm khô bằng hút chân không khoảng 20 phút.
- Giải hấp: bằng cách cho 2 x 2 mL ethyl acetate chảy qua cột với tốc độ 1.5
mL/phút. Dung dịch chảy ra khỏi cột được thu vào ống nghiệm 10 mL và thổi khô
bằng dòng khí nitơ.
6.6 Chuẩn bị mẫu phân tích
Hòa tan cặn khô bằng chính xác 1 mL dung dịch pha động, vortex 20 giây. Lọc
dịch đục qua màng lọc 13 mm, 0.45µm và thu dịch lọc vào lọ vial cho HPLC.
7. Phân tích trên LC /MS/MS
7.1 Điều kiện máy LC
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 11

Cột sắc ký: cột C
18
150-4mm (hoặc tương đương)
Nhiệt độ lò cột: 45
0
C
Thể tích tiêm: 25 l
Pha động: gradient như sau:
Thời gian
lưu, phút
MeOH
(0.1%HCOOH)
H2O
(0.1%HCOOH)
Tốc độ dòng
(l/phút)
0 50 50 500
2 50 50 500
3 100 0 500
3.5 100 0 600
9.5 100 0 600
10 100 0 500
11 50 50 500
21 50 50 500
Lưu ý: Với các cột sắc ký lỏng C18 khác nhau (chiều dài, đường kính cột, kích cỡ
hạt ), tỉ lệ thành phần pha động hay tốc độ dòng có thể thay đổi.
7.2 Điều kiện MS
- Kiểu ion hoá: APCI (+) sử dụng tuning offset
- Discharge current: 4 A
- Vaporizer temperature: 4000C

- Sheath gas pressure: 30
- Ion sweep gas pressure: 1,0
- Aux gas pressure: 5
- Capillary temperature: 250
- Capillary offset: 35
- Q2 gas pressure: 1,5
7.3 Điều kiện phân ly MS/MS:
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 12
Các tiền ion thuộc nhóm Nitrofuran bị phân ly thành các ion con liên quan đến
cấu trúc:
Chất phân
tích
Chất đo đạc Ion bị
phân
mảnh, m/z
Ion được
tạo thành,
m/z
Q1, Q3
PW, amu
Tube lens
Furazolidone
hay AOZ
2_NB_AOZ 236 134 (11)
104 (22)
0,7 95
Furaltadon
hay AMOZ
2_NB_AMOZ 335 291 (11)
262 (17)

0,7 94
Nitrofurazone
hay SEM
2_NB_SEM 209 166 (8)
192 (11)
0,7 88
Nitrofurantoi
n hay AHD
2_NB_AHD 249 134 (11)
104 (20)
0,7 96
Chú thích: các ion được tạo thành có cường độ cao nhất được gạch chân và được
dùng để định lượng
8. Trình tự tiêm mẫu
Các mẫu sẽ được phân tích theo trình tự sau:
a. Dung môi trắng;
b. Mẫu kiểm soát âm tính;
c. Mẫu kiểm soát dương tính theo thứ tự nồng độ chất chuẩn bổ sung từ
thấp đến cao;
d. Dung môi trắng;
e. Mẫu cần kiểm nghiệm;
Chú ý: Khi phân tích mẫu hàng loạt, tiêm xen kẽ một mẫu kiểm soát dương tính sau
khi phân tích chuỗi 5 mẫu và kết thúc là mẫu kiểm soát dương tính.
9. TÍNH KẾT QUẢ
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 13
Xây dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic ion định lượng
với nồng độ chuẩn (đã quy đổi về độ tinh khiết) của các chất nitrofuran tương ứng
(bảng 1).
Lượng chất cần phân tích có mặt trong mẫu kiểm được tính theo công thức sau:
Hàm lượng nitrofuran:

m
C
X
Nitrofuran
1
0
×
=
Hàm lượng các metabolite tương ứng:
1
2
M
M
XX
NitrofuranMetabolite
×=
Trong đó: - X: lượng chất cần phân tích có trong mẫu kiểm, µg/kg
- C
o
: nồng độ chất cần phân tích tính từ đường chuẩn, µg/L
- 1: Thể tích định mức 1 mL, mL
- m: khối lượng mẫu phân tích, g
- M
1
: phân tử khối của nitrofuran
- M
2
: phân tử khối của metabolite tương ứng
Bảng 1. Ion định lương và ion xác nhận của các chất họ nitrofuran
Chất cần phân tích Chất đo đạc

Ion bị phân
mảnh
Ion định
lượng
Ion xác
nhận
Furazolidone hay
AOZ
2_NB_AOZ 236 134 104
Furaltadone hay
AMOZ
2_NB_AMOZ 335 291 261.9
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 14
Nitrofurazone hay
SEM
2_NB_SEM 209 166 192.2
Nitrofurantoin hay
AHD
2_NB_AHD 249 134 104
Bảng 2. Phân tử khối các chất họ nitrofuran
Nitrofuran M
1
Metabolite M
2
Furazolidone 225.16 AOZ 102.9
Furaltadon 324.29 AMOZ 201.22
Nitrofurazone 198 SEM 75
Nitrofurantoin238 AHD 115
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 15
III. BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP

1. Các thông số cần đánh giá:
Mục này được thực hiện nhằm đánh giá độ độ lặp lại của thiết bị, vùng tuyến tính,
hiệu suất thu hồi và giới hạn phát hiện của phương pháp - được thực hiện lần đầu tiên
bởi người phát triển phương pháp. Trong quá trình kiểm nghiệm, phân tích, người có
nhiệm vụ phân tích không phải thực hiện mục này
1.1 Yêu cầu:
- Hiệu suất thu hồi trên các nền mẫu khác nhau phải thỏa điều kiện sau (theo
2002/657/EC)
Khoảng nồng độ Hiệu suất thu hồi,
%
≤ 1 ppb
50 – 120
> 1 ppb đến 10 ppb 70 – 110
≥ 10 ppb
80 – 110
- Độ lệch chuẩn (RSD) tương ứng của 03 lần thực hiện riêng biệt trên cùng một
nồng độ phải nhỏ hơn 10%.
1.2 Đánh giá khoảng tuyến tính:
Do đặc tính của đầu dò khối phố 3 tứ cực (cho độ nhạy cao) và hàm lượng
nitrofuran trên nền mẫu thực tế (có hàm lượng thấp, mức ppb) nên phần đánh giá
khoảng tuyến tính chỉ khảo sát với khoảng nồng độ ≤ 5 µg/L. Với các mẫu có
nồng độ C
o
(nồng độ cuối khi tiêm vào máy) vượt quá 5 µg/L, cần giảm lượng
mẫu cân hoặc pha loãng mẫu trước khi tiến hành phân tích.
Đường chuẩn xây dựng dựa trên mẫu kiểm soát phải có độ tuyến tính tốt, hệ số
tương quan hồi qui tuyến tính (R
2
) phải lớn hơn hoặc bằng 0.99.
1.3 Xác định giới hạn phát hiện của phương pháp:

Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 16
Giới hạn phát hiện của phương pháp được xác định thông qua:
- Mẫu trắng được bổ sung Furazolidone, Furaltadone, Nitrofurazone và
Nitrofurantoin tại nồng độ nhỏ nhất mà máy có thể phát hiện (tỉ lệ tín hiệu/nhiễu -
S/N phải thỏa điều kiện : 3 ≤ S/N ≤ 10).
- Khối lượng mẫu phân tích là 2 g.
2. Yêu cầu về độ tin cậy của phương pháp:
- Độ ổn định của thiết bị: %RSD < 5%
- Khoảng làm việc của phương pháp:
- Độ tuyến tính của đường chuẩn phải có hệ số tương quan hồi quy R
2
≥ 0.999
- Hiệu suất thu hồi: từ 80% đến 110% (theo quy định 2002/657/EC)
- Độ lặp lại của phương pháp: %RSD < ½*2(1-0.5logC) (theo quy định
2002/657/EC)
- Giới hạn phát hiện: LOD = 1 µg/kg
3. Thực hiện
Mẫu trắng: mẫu không phát hiện Furazolidone, Furaltadone, Nitrofurazone,
Nitrofurantoin và các metabolite tương ứng
Mẫu kiểm soát dương tính: mẫu trắng (khoảng 1 gram) được bổ sung
Furazolidone, Furaltadone, Nitrofurazone và Nitrofurantoin với 05 nồng độ khác
nhau (mỗi nồng độ thực hiện 03 lần), để yên 1 giờ. Sau đó, tiếp tục thuỷ phân và dẫn
xuất hoá theo qui định tại E.3 (KTSK 81)
Mẫu đánh giá hiệu suất thu hồi: Các mẫu thức ăn chăn nuôi không phát hiện
Furazolidone, Furaltadone, Nitrofurazone, Nitrofurantoin và các metabolite tương
ứng sẽ được bổ sung Furazolidone, Furaltadone, Nitrofurazone và Nitrofurantoin với
nồng độ ≤ 1 ppb (thực hiện 02 lần), để yên 1 giờ. Sau đó, tiếp tục thuỷ phân và dẫn
xuất hoá theo qui định tại E.3 (KTSK 81).
4. Kết quả
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 17

4.1. So sánh quá trình dẫn xuất hóa của nitrofuran và metabolite với 2-NB
a. Furazolidone
Bảng 1. Đường chuẩn Furazolidone
C
oFurazolidone
, µg/L
Diện tích mũi sắc
ký (Area)
0,477 93654
0,795 152725
1,59 329523
3,18 650242
6,36 1295423
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 18
b. AOZ
Bảng 2. Đường chuẩn AOZ và so sánh
C
oAOZ
µg/L
C
oFur tđương
µg/L
Diện
tích
(Area)
C
oFur theo Bảng 1
µg/L
Sai lệch
µg/L

0,15
8
0,34 73542 0,37 0,03
0,31
5
0,69 136521 0,68 -0,01
0,78
8
1,72 365241 1,80 0,08
1,57
5
3,45 684211 3,36 -0,09
3,15
0
6,89
138251
1
6,77 -0,12
Kết quả cho thấy quá trình dẫn xuất hóa của furazolidone và AOZ với 2-NB là
như nhau. Do đó, có thể sử dụng đường chuẩn nitrofuran để định lượng cho cả
nitrofuran và metabolite.
4.2. Đánh giá độ đúng và độ lặp lại của phương pháp:
4.2.1. Độ lặp lại của phương pháp
a. Furazolidone:
Bảng 3, Độ lặp lại của phương pháp
Mẫu C
FURAZOLIDONE_mẫu
(*)
Co
FURAZOLIDONE

, Co
AOZ
Diện tích Area
TB
RSD
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 19
ppb
µg/L µg/L
(m/z
134)
%
Blank 0 0 0 0 0 -
KS
1_1
0,2385 0,477 0,218
89535
86909 2,9KS
1_2
86642
KS
1_3
84548
KS
2_1
0,3975 0,795 0,363
146927
145465 1,0KS
2_2
145473
KS

2_3
143996
KS
3_1
0,795 1,59 0,727
286541
284936 0,7KS
3_2
285545
KS
3_3
282721
KS
4_1
1,59 3,18 1,453
634067
632584 0,3KS
4_2
630283
KS
4_3
633401
KS
5_1
3,18 6,36 2,907
1196921
119850
6
0,2KS
5_2

1200645
KS
5_3
1197952
Mw
FURAZOLIDONE
= 225,16
Mw
AOZ
= 102,9 (g/mol)
(*)
Nồng độ tính trên lượng mẫu cân là 2 g

Bảng 4, Đường chuẩn
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 20
AOZ
C
oAOZ
,
µg/L
Diện
tích
TB
0,218 86909
0,363 145465
0,727 284936
1,453 632584
2,907 1198506
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 21
[103.999-

104.001]
[133.999-
134.001]
MA: 76927
MA: 146927
KS2-1
KS2-1
b. Furaltadone
Bảng 5: Độ lặp lại của phương pháp
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 22
Mẫu
C
FURALTADONE_mẫu
(*)
,
ppb
Co
FURALTADONE
,
µg/L
Co
AMOZ
,
µg/L
Diện tích
(m/z
291)
Area
TB
RSD

%
Blank 0 0 0 0 0 -
KS
1_1
0,2735 0,547 0,339
81386
85564 8,1KS
1_2
93539
KS
1_3
81767
KS
2_1
0,547 1,094 0,679
186471
190415 3,5KS
2_2
186747
KS
2_3
198027
KS
3_1
0,8205 1,641 1,018
285874
295442 3,4KS
3_2
294576
KS

3_3
305875
KS
4_1
1,3675 2,735 1,697
567201
572464 0,8KS
4_2
575776
KS
4_3
574416
KS
5_1
2,735 5,47 3,394
1295547
1297477 0,1KS
5_2
1297951
KS
5_3
1298932
Mw
FURALTADONE
= 324,29
Mw
AMOZ
= 201,22 (g/mol)
(*)
Nồng độ tính trên lượng mẫu cân là 2 g

Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 23
Bảng 6, Đường chuẩn AMOZ
Co
AMOZ
, µg/L
Area
TB
0,339 85564
0,679 190115
1,018 295442
1,697 572464
3,394 1297477
[261.900-
261.902]
[290.079-
291.081]
MA: 50212
MA: 186471
KS2-1
KS2-1
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 24
c. Nitrofurazone
Bảng 7, Độ lặp lại của phương pháp
Mẫu
C
NITROFURAZONE_mẫu
(*
)
ppb
Co

NITROFURAZONE
µg/L
Co
SEM
µg/L
Diện tích píc
(A)
(m/z 166)
Area
TB
RSD
%
Blank 0 0 0 0 0 -
KS
1_1
0,125 0,25 0,095
58975
58464 2,4KS
1_2
56871
KS
1_3
59545
KS
2_1
0,25 0,5 0,189
114930
114530 2,2KS
2_2
111860

KS
2_3
116799
KS
3_1
0,5 1 0,379
215781
219431 1,8KS
3_2
218923
KS
3_3
223588
KS
4_1
0,75 1,5 0,568 309950 0,9
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 25