CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN TRONG THỰC PHẨM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ĐHQG TP. HCM
KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC
TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH CÔNG CỤ
CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM
LƯỢNG VITAMIN TRONG THỰC PHẨM

TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 12/2013
Tiểu Luận Môn Học 2
CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM
LƯỢNG VITAMIN TRONG THỰC PHẨM
I. Giới thiệu chung về các họ Vitamin trong thực phẩm
1. Phân loại Vitamin trong thực phẩm – phản ứng sinh hóa của vitamin
Vitamin được ghép bởi hai chữ: “vita” và “amine”. “Vita” gốc Latinh có nghĩa là sự
sống, “amine” là các acid amin. Vitamin là những acid amine cần thiết cho sự sống.
Cơ thể con người cần một lượng nhỏ Vitamin nhưng thiếu chúng cơ thể sẽ mắc bệnh.
Hiện nay người ta đã nghiên cứu và phân lập được trên 30 loại vitamin khác nhau,
đồng thời đã nghiên cứu các thành phần, cấu tạo và tác dụng sinh lý của chúng. Người
ta cũng tổng hợp một số lượng lớn vitamin bằng tổng hợp hoá học ở phòng thí
nghiệm.
Căn cứ vào tính hoà tan của vitamin mà ngày nay người ta chia vitamin ra làm hai
nhóm.
1.1 Các vitamin tan trong nước
Vitamin tan trong nước chủ yếu tham gia và làm nhiệm vụ xúc tác trong quá trình sinh
học gắn liền với sự giải phóng năng lượng ( các phản ứng oxi hoá - khử, sự phân giải
các hợp chất hữu cơ ) nghĩa là chúng hoàn thành chức năng năng lượng như nhóm
các Vitamin B1 (tiamin), Vitamin B2 (riboflavin), Vitamin B3 (axit pantotenic),
Vitamin B5 (nicotinamit), Vitamin B6 (piridoxin), Vitamin B7 (biotin), Vitamin B10
(axit folic), các vitamin B12 (các cianocobalamin), vitamin B15 (axit pangaminic),
vitamin C, vitamin P (citrin), vitamin U (S-metyl-metionin), Vitamin C,…
1.2 Các vitamin tan trong chất béo ( trong dầu và mỡ)
Vitamin hoà tan trong chất béo (trong dầu và mỡ) thì tham gia vào phản ứng tạo nên

các chất, tạo nên các cấu trúc, các cơ quan và các mô của cơ thể, nghĩa là chúng hoàn
thành chức năng tạo hình như nhóm các Vitamin A (A1, A2), D, K, E.
2. Phân bố
Tiểu Luận Môn Học 3
Thực phẩm chứa nhiều loại vitamin, điển hình như
- Vitamin A có nhiều trong gan, cá, sữa
- Tiền tố vitamin A có nhiều trong cà rốt, rau xanh, quả mơ, dưa chột, quả đào có
màu vàng, ngô
- Vitamin D có nhiều trong cá, gan, lòng đỏ trứng, thịt lợn, chất béo của sữa
- Vitamin E có nhiều trong bột mì, quả hạnh nhân
- Vitamin C có nhiều trong cam, chanh, bưởi, rau xanh, cải bắp, cải xoong, xoài,
củ cải, hành tây, ớt ngọt, rau mùi, ổi
- Vitamin B1 có nhiều trong gạo, bột mì, bột đậu xanh, thịt gà, nấm
- Vitamin B6 có nhiều trong gan bê, ruốc thịt, thịt gà, ngô
- Vitamin B9 (hay còn gọi là axit pholic) có nhiều trong măng tây, rau xanh, đậu
rau xanh, gan, thịt gà, trứng.
- Vitamin B12 có nhiều trong pho mát làm từ thịt dê và thịt cừu, cá, quả hạnh
nhân, cải xoong, dưa bắp cải, sữa tươi, sữa bột, sữa chua, sữa đậu nành, nước
khoáng.
3. Cấu tạo, tính chất, trạng thái cảm quan
Vitamin B1 Vitamin B2
Tiểu Luận Môn Học 4
Vitamin B3 Vitamin B5
Vitamin B6 Vitamne B7
Vitamin B9 Vitamin B12
Tiểu Luận Môn Học 5
Vitamin C
Tiểu Luận Môn Học 6
Các vitamin rất khác nhau về tính chất vật lý, tính chất hóa học. Trong tự nhiên, các
vitamin tồn tại ở dạng rắn hoặc dạng keo. Ví dụ

- Vitamin B: nhóm các vitamin B đều tan tốt trong nước, thường ở dạng tinh thể
- Vitamin B1 là những tinh thể trắng hình kim hay ở dạng vẩy, thường có mùi
đặc trưng. Khi tiếp xúc với không khí, chế phẩm khan nhanh chóng hút ẩm
(khoảng 4% nước).
- Vitamin B1 có tính axit, hoà tan tốt trong môi trường nước, axit acetic, nhưng
- khó tan trong ethanol 96% và methanol, không tan trong ete, benzen hay
cloroform và chịu nhiệt khá nên không bị phân huỷ khi nấu nướng. Vitamin B1
nóng chảy ở 2330C-252
0
C.
- Vitamin B1 bền trong môi trường axit, còn trong môi trường kiềm nó rất dễ bị
phân huỷ khi đun nóng
- Vitamin B2 ở dạng tinh thể màu vàng, có vị đắng, dễ bị phân hủy bởi ánh nắng
mặt trời, nhiệt độ cao và không ổn định với tia cực tím. Trong vùng UV
Vitamin B2 hấp thu tại 2 bước sóng 223,3 và 268,0nm. Vitamin B2 hoà tan
trong nước, ổn định trong môi trường axit, chịu nhiệt, phân huỷ nhanh trong
môi trường kiềm. Nó cũng bền vững khi đông lạnh, ở trạng thái khô Vitamin
B2 bền với nhiệt và axit.
- Vitamin B6 là tinh thể không màu, vị hơi đắng, hòa tan tốt trong nước và trong
rượu, chịu nhiệt, nhạy cảm với ánh sáng, pyridoxin bazơ có nhiệt độ nóng chảy
ở 1600C, pyridoxin hydrochloric nóng chảy ở 204-206 0C, bền vững khi đun
nóng. Bền khi đun sôi trong axit hay kiềm, không bền trong môi trường có tính
oxy hóa. Vitamin B6 nhạy cảm với ánh sáng. Chúng phân hủy nhanh khi chiếu
sáng ở môi trường kiềm hay trung tính, còn trong môi trường axit thì pyridoxin,
pyridoxan và pyridoxamin bền hơn.
- Vitamin C kết tinh không màu hoặc hơi vàng, rất dễ tan trong nước (300g/lít).
Dung dịch nước 5% có pH=3. Có khi dùng dạng muối natri dễ tan trong nước
hơn (900g/lít).
- Vitamin A tồn tại trong tự nhiên gồm 2 dạng:
Tiểu Luận Môn Học 7

• Retinol: dạng hoạt động của vitamin A, nó được đồng hoá trực tiếp bởi cơ
thể.
• Tiền vitamin A: nó chính là một tiền chất của vitamin A được biết đến
nhiều dưới tên bêta-caroten. Tiền chất này được chuyển hoá bởi ruột
thành vitamin A để cơ thể có thể sử dụng.
- Vitamin E: tồn tại trong tự nhiên với 8 dạng khác nhau, là chất dầu lỏng, không
màu, hòa tan rất tốt trong dầu thực vật, rượu etylic có thể kết tinh chậm trong
rượu metylic nếu giữ ở nhiệt đọ thấp tới -35
o
C. Vitamin E khá bền với nhiệt,
nhưng không bền với tia tử ngoại.
4. Tầm quan trọng của Vitamin
Thông thường các vitamin trong cùng một nhóm có tác dụng bổ sung, hoàn thiện, làm
tăng tác dụng của nhau. Các nhóm đại diện cùng tác dụng như thế gồm có:
- Nhóm các vitamin làm tăng khả năng chống lại viêm nhiễm gồm có vitamin A,
B1, B2, C, D, H, P.
- Nhóm các vitamin bảo đảm cho hệ thần kinh hoạt động hoàn hảo gồm vitamin
A, B1, B2, C.
- Nhóm các vitamin khởi động việc tạo máu gồm có vitamin A, B2, B12, axit
folic, C, D.
- Nhóm các vitamin chi phối tới việc tạo mô xương và răng gồm có vitamin A,
B1, C, D.
- Nhóm các vitamin chi phối tới hoạt động sinh dục gồm có A, C, E.
- Nhóm trợ giúp sự tăng trưởng: gồm tất cả các vitamin trừ vitamin H.
5. Việc lạm dụng Vitamin và hậu quả
- Vitamin phần lớn không tổng hợp được trong cơ thể mà phải có trong thức ăn
nguồn gốc động vật và thực vật. Việc thiếu vitamin sẽ gây ra nhiều rối loạn cho
cơ thể.
- Nhiều người cho rằng uống vitamin sẽ giúp tăng cường sức khỏe, nhưng khoa
học đã chỉ ra điều đó không hoàn toàn đúng, nhất là dùng quá liều.

- Các vitamin đều rất thiết yếu với cơ thể con người, nhưng việc dùng vitamin
quá liều có thể gây ra những tác động bất lợi, làm suy giảm hệ miễn dịch của cơ
thể. Nhiều người tiêu dùng “thoải mái” sử dụng các loại vitamin hoặc các thực
Tiểu Luận Môn Học 8
phẩm bổ sung vitamin vì nghĩ rằng “thừa còn hơn thiếu” mà không hề biết đến
tác hại của việc sử dụng vitamin quá liều.
- Các chuyên gia dinh dưỡng nói rằng cách tốt nhất để cơ thể hấp thụ các vitamin
là thông qua một chế độ ăn uống lành mạnh với nhiều trái cây và rau. Mọi
người nên dùng vitamin bổ sung chỉ khi họ không thể bổ sung đủ vitamin qua
thực phẩm hoặc có nhu cầu thêm, và nên tham khảo ý kiến bác sĩ hoặc chuyên
gia dinh dưỡng uy tín về đúng liều để dùng.
II. Các phương pháp phân tích xác định hàm lượng Vitamin trong thực
phẩm
Các vitamin đã được các nhà khoa học phát hiện và nghiên cứu từ rất lâu. Đi kèm với
việc nghiên cứu các vitamin thì các phương pháp phân tich hóa lý, y sinh dùng để xác
định hàm lượng các vitamin từ các nguồn gốc khác nhau cũng đã phát triển khá đầy đủ
và chi tiết. Trong phạm vi bài tiểu luận này, tôi xin liệt kê các phương pháp xác định
hàm lượng vitamin trong thực phẩm theo 2 nhóm vitamin tan trong nước và trong dầu.
Dựa vào cấu trúc hóa học, trạng thái tồn tại của các vitamin, hàm lượng các vitamin có
trong mẫu cần phân tích và các điều kiện thiết bị, hóa chất có trong phòng thí nghiệm,
các vitamin được xác định bằng rất nhiều cách khác nhau từ phương pháp phân tích cổ
điển đến phương pháp phân tích hiện đại.
A. Định lượng các nhóm Vitamin tan trong nước
Như đã nêu ở trên, các Vitamin thuộc nhóm này bao gồm các Vitamin B, Vitamin C…
Đặc điểm chung của nhóm này là có cấu trúc phân cực, tan nhiều trong nước. Các
phương pháp xác định hàm lượng nhóm Vitamin này bao gồm:
1. Phương pháp cực phổ
a) Nguyên lý:
Các Vitamin nhóm B và Vitamin C là những hợp chất phân cực
Vitamin nhóm B như B1, B3, B6, B9, Vitamin C trong thực phẩm được phân tích

bằng phương phấp cực phổ trên thiết bị METROHM 797 VA COMPUTRACE của
hãng METROHM (Thụy Sỹ).
Tiểu Luận Môn Học 9
b) Tiến hành:
Cân 5 – 10(g) mẫu đã đồng nhất vào becher 250ml, thêm vào 100ml HCl 0,1N, đun
sôi cách thủy 40-45 phút, để nguội, chỉnh về pH 4÷4,5 bằng CH
3
COONa 2,5M. Sau
đó đưa lên tới vạch 250ml bằng nước cất, lọc qua giấy lọc, thu dịch mẫu đã qua lọc và
đem xác định bằng máy đo cực phổ.
Nền tối ưu cho phương pháp này là đệm Acetate pH 6,5.
- Chương trình chạy:
- Dựng đường chuẩn.
- Đo mẫu: Hút 10ml đệm Acetate pH 6,5 + 0,5ml mẫu + 0,5ml Triton X-100 vào
cell đo và đem đi xác định trên thiết bị cực phổ METROHM 797 VA
COMPUTRACE
Tiểu Luận Môn Học 10
- Nền đệm axetat, pH=6,5
- Kết luận: Phương pháp cực phổ là một trong những phương pháp phân tích hữu
cơ nhanh và đạt được độ chính xác cao, ngoài ra chi phí cho máy móc thiết bị
và hoá chất phù hợp với điều kiện của các phòng thí nghiệm ở Việt Nam.
2. Phương pháp chuẩn độ Iot xác định Vitamin C
a) Nguyên tắc: được xây dựng trên nguyên tắc phản ứng oxy hóa khử
Iốt tương đối không tan trong nước, nhưng điều này có thể cải thiện bằng cách
pha trộn iốt với iođua và hình thành triiođua:
I
2
+ I
-
< > I

3
-

Triiođua oxy hóa vitamin C tạo acid dehydroascorbic:
C
6
H
8
O
6
+ I
3
-
+ H
2
O > C
6
H
6
O
6
+ 3I
-
+ 2H
+

Vitamin C còn hiện diện trong dung dịch, thì triiotđua được chuyển thành ion
iođua rất nhanh chóng.
Tiểu Luận Môn Học 11
Tuy nhiên, khi tất cả vitamin C đã bị oxy hóa, thì iốt và triiođua sẽ hiện diện trong

dung dịch và phản ứng với tinh bột tạo nên một hỗn hợp màu xanh đen. Màu xanh đen
là điểm dừng cho phản ứng chuẩn độ.
Quy trình chuẩn độ này thích hợp trong việc kiểm tra hàm lượng vitamin C trong viên
thuốc vitamin C, nước ép quả, trái cây tươi, đông lạnh hoặc trái cây đóng gói và
rau quả. Phương pháp chuẩn độ có thể thực hiện chỉ sử dụng dung dịch iốt và
không dùng iodate, nhưng dung dịch iodate ổn định hơn và cho kết quả chính xác hơn
b) Tiến hành:
- Chuẩn bị dung dịch
• Dung dịch chỉ thị 1% tinh bột:
 Cho 0,5 g tinh bột hòa tan vào 50 ml nước cất nóng gần sôi.
 Hòa tan hoàn toàn và để dung dịch nguội trước khi sử dụng.
• Dung dịch iốt:
 Hòa tan 5 g KI và 0,268 g KIO
3
trong 200 ml nước cất.
 Thêm 30 ml acid sunfuric 3 M.
 Cho dung dịch này vào ống đong 500 ml và pha loãng dung dịch bằng nước cất
đến vạch định mức 500 ml. Hòa tan dung dịch hoàn toàn.
 Cho dung dịch vào becher 600 ml.
- Xử lý mẫu (kẹo vitamin C):
Tiểu Luận Môn Học 12
• Hòa tan 0,250 g kẹo vitamin C (acid ascorbic) trong 100 ml nước cất.
• Dùng nước cất pha loãng thành dung dịch 250 ml bằng bình định mức.
• Thêm 25,00 ml dung dịch mẫu xác định vitamin C vào bình erlen 125 ml.
• Thêm 10 giọt dung dịch hồ tinh bột 1 %.
• Rửa sạch buret với một lượng nhỏ dung dịch iốt và sau đó cho dung dịch iốt và
buret. Ghi lại vạch thể tích dung dịch ban đầu trong buret.
• Chuẩn độ dung dịch cho đến điểm dừng phản ứng, thấy dấu hiệu đầu tiên
của màu xanh dương bền trong 20 giây khi lắc đều dung dịch.
• Ghi nhận vạch thể tích dung dịch iốt trên buret. Lượng iốt đã dùngcho ch

uẩn độ chính là thể tích dung dịch iốt ban đầu trừ đi dung dịch sau chuẩn độ.
• Làm lại thí nghiệm chuẩn độ ít nhất 2 lần. Các kết quả chấp nhận sai
khác 0,1 ml
c) Tính toán kết quả:
Gọi V
iot
: thể tích dung dịch chuẩn Iot dùng chuẩn độ (mlk)
N
iot
: nồng độ đương lượng dung dịch Iot dùng chuẩn độ (N)
V
sample
: thể tích mẫu đem chuẩn độ (ml)
N
sample
: nồng độ đương lượng Vitamin C trong mẫu đem chuẩn độ.
Ta có:
Tiểu Luận Môn Học 13
iot iot
sample
sample
V *N
N
V
=
= M
sample
=>Hàm lượng vitamin C trong mẫu:
Vitamin C (mol/g) =
sample

sample
M * *
dinhmuc phaloang
V f
m
3. Định lượng vitamin B
2
bằng phương pháp huỳnh quang
a) Lý thuyết
Sự phát quang có thể được hiểu là năng lượng được tách ra khi các nguyên tử kích thích
bởi các chùm sáng có bước song tới hạn, tương tự như hiện tượng lân quang. Tuy nhiên
sự khác nhau,giữa hai hiện tượng này là phát huỳnh quang giải phóng ngay lập tức năng
lượng ánh sáng hấp thụ từ một nguyên tử hay phân tử, còn lân quang giải phóng từ năng
lượng hấp thụ. Cả hai đều là sự phát quang.
Rất nhiều hợp chất giàu e, như hợp chấy chứa hai hoặc nhiều nối đôi liên hợp và do có ∏-
electron nên phát huỳnh quang.
Các e của một phân tử tồn tại trong điều kiện năng lượng thấp nhất (mức năng l ượng thấp
nhất của trạng thái cơ bản)vì các e này không ổn định trong bất cứ một bậc năng lượng
nào khác. Trạng thái cơ bản này là trạng thái năng lượng bình thường của một phân tử.
nếu như phân tử này bị chiếu bởi bức xạ tử ngoại và nó hấp thụ một số proton thì phân tử
này sẽ bị kích thíchđén một trạng thái năng lượng cao hơn. Hiện tượng này cũng giống
như hiện tượng đã xảy ra khi một e hoặc các e thu năng lượng và nhảy từ trạng thái năng
lượng cơ bản đến mức năng lượng cao nhất của trạng thái kích thích đầu tiên.
Tiểu Luận Môn Học 14
Theo lí thuyết lượng tử thì mức năng lượng của một phân tử có thể tồn tại chỉ trong một
số trạng thái xác định ,cho nên chỉ có ánh sáng với những tần số tương ứng với năng
lượng cần thiết để nâng phân tử từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích bị hấp thụ.
Bởi vì một trong rất nhiều trạng thái kích thích có thể được hình thành, nên các hợp chất
có thể hấp thụ ánh sáng với các tần ssó khác nhau.
Quá trình hấp thụ xảy ra rất nhanh khoảng 10

-15
giây. Electron se duy trì ở trạng thái kích
thích từ 10
-8
ddeens 10
-4
giây. Sau đó nó sẽ bắt đàu nhảyvề trạng thái cơ bản. quá trình này
có thể xảy ra qua sự va chạm phân tử mà năng lượng tỏa ra dưới dạng nhiêựt hoặc e rơi
xuống mức dao động thấp nhất của trạng thái cơ bản ,đồng thời giải phóng một photon
năng lượng và phát huỳnh quang. Do một lượng năng lượng dã bị mất trước khi e nhảy
xuống trạng thái năng lượng thấp hơn ,nên năng lượng giải phóng dưới dạng photon phải
có ít năng lượng hơn photon kích thích
Các hợp chất phát quang tự nhiên đươc gọi là sự phát huỳnh quang tự phát. Nhiều hợp
chất không phát huỳnh quang có thể được chuyển hóa hóa học thành các chất phát huỳnh
quang hóa học.nếu các e của một hợp chất được tự do hơn (ví dụ bằng cách thay thế O,N
hoặc S vào cấu trúc) khả năng phát huỳnh quang sẽ tăng lên. Tuy nhiên một số nhóm có
thể có xu hướng định xứ các điện tử và do đó làm giảm độ huỳnh quang.từ những điều
trên có thể thấy rằng bước song hấp thụ và bước song phát xạ của mỗi hợp chất sẽ khác
nhau. Có nhiều hợp chất hấp thụ năng lượng vpứi bứơc sóng như nhau,một số chất phát
quang tại cùng một bước sóng .sự kết hợp của hai bước sóngkhá đặc trưng cho một hợp
chất, do đó phép đo huỳnh quang có thể được dùng trong phân tích định tính. Nếu có sự
nghi ngờ về sự có mặt của một hợp chất phát quang, tiếp tục đo bước sóng lân quang, sự
xê dịch bước sóng huỳnh quang bởi PH, hiệu suất lượng tử, thời gian phát quang và dữ
liệu phân cưch hóa sẽ hoàn chỉnh sự nghiên cứu này.
Tính đặc thù của phép đo huỳnh quang là đơn giản hóa và làm tăng độ tin cậy của quá
trình phân tíchvì hợp chất thường được đo trực tiếp mà không phải chiết tách trước.
Tiểu Luận Môn Học 15
không giống như quang phổ hấp thụ mà ở đó các hợp chất khác nhau co khả năng hấp thụ
cùng một bước sóng kích thích khác. Với việc thay đổi bước sóng kích thích cực đại hoặc
thay đổi PH, có thể làm giảm thậm chí đến mức tối thiểu tính chất đó.

Phép đo huỳnh quang cũng có thể được dùng trong phân tich dịnh lượng vì cường độ
huỳnh quang tỉ lệ thuận với nồng độ của hợp chất phát quang. Tuy nhiên mối liên quan
trực tiếp này chỉ đúng với dung dịch rất loãng vì ánh sáng phát ra từ những chất phát
quang đều phải di qua dung dịch trước khi đến máy đo quang vì thế một lượng ánh sáng
sẽ bị hấp thụ bởi các phân tử khác trong dung dịch. Nồng độ càng cao thì lượng ánh sáng
phát xạ bị hấp thụ càng lớn, cho đến một điểm nhất định khi mà sự tăng tiến tới bão hòa
và cường độ huỳnh quang cũng sẽ bắt đầu giảm dần (vì lí do này mà đường chuẩn như
vậy thường được dùng trong các thí nghiệm đo huỳnh quang ). Do đó một giá trị của
cường độ huỳnh quang có thể sẽ tương ứng với hai giá trị nồng độ của chất phát quang.
Chất tan có ảnh hưởng đến tính chất phát huỳnh quang của một hợp chất. những chất tan
khác nhau có thể làm tăng hoặc giảm cường độ phát quang. Cũng như vậy hằng số điện
môi thể hiện mức độ phát quang tự do của các điện tử л và do đó thể hiện sự thay đổi
bước sóng cực đại huỳnh quang. Dung dịch đệm có xu hướng gây ảnh hưởng dập tắt bước
sóng của một số chất và ảnh hưởng này tăng khi dung dịch đệm tăng lên.
Cường độ phát huỳnh quang của một hợp chất dễ bị ion hóa sẽ thay đổi theo trạng thái ion
hóa mà quá trình ion hóa này lại phụ thuộc độ PH. Nhiều hợp chất sinh học có khả năng
phát huỳnh quang tự nhiên hoặc pháy huỳnh quang hóa học dễ bị ion hóa, cường độ phát
huỳnh quang của những chất này phụ thuộc vào PH. Một số hợp chất bị ion hóa bởi ánh
sáng và do đó phát huỳnh quang.
Cường độ huỳnh quang có xu hướng giảm khi nhiệt độ tăng. Nhiệt độ càng cao thì tốc độ
chuyển động của các phân tử trong dung dịch càng tăng. Do đó năng lượng hấp thụ
chuyển thành nhiệt chứ không phải là huỳnh quang.
Tiểu Luận Môn Học 16
Với một số chất không bền trong dung dịch ,tốc độ phân hủy quang phụ thuộc vào cường
độ ánh sáng. Phần lớn các chất phát huỳnh quang phân hủy thành các chất không phát
huỳnh quang. Tuy nhiên một số phân hủy thành chất có độ huỳnh quang thậm chí còn cao
hơn chất ban đầu.
Phần lớn những máy đo huỳnh quang có một khe đóng mở được ở ghiữa nguồn sáng và
mẫu thí nghiệm, khe này được mở ngay trước khi đo để giảm tối thiểu sự phân hủy quang.
Sự dập tắt xảy ra khi sự phat huỳnh quang của một chất bị giảm bởi một chất khác. Có hai

loại dập tắt: dập tắt ảnh hưởng màng lọc và dập tắt thật. ảnh hưởng màng lọc xảy ra khi
màng lọc hấp thụ ánh sáng kích thích hoặc ánh sáng phát xạ. còn sự dập tắt thật thì xảy ra
khi yếu tố gây tắt làm giảm năng lượng của phát quang.làm cho năng lượng hấp thụ biến
thành dạng năng lượng khác chứ không phải thành dạng năng lượng huỳnh quang.sự dập
tắt xảy ra trong trường hợp chất phát quang chuyển hóa thành chất không phát quang. Có
thể phân tích các yếu tố dập tắt thong qua sự biến mất một hợp chất phát quang trong
dung dịch. Ví dụ như biến mất của phức chất borat-benzoin trong phổ phát quang bởi oxi.
Đóng góp quan trọng nhất của phương pháp đo quang phổ huỳnh quang là tính đặc thù và
độ nhạy. tính đặc thù được miêu tả ở trên ,còn độ nhạy thì thường gấp vài nghìn lần so với
phương pháp quang phổ hấp thụ.
Trong phương pháp đo phổ huỳnh quang ,bước sóng của ánh sáng phát xạ dài hơn bước
sóng của ánh sang kích thích. Vì vậy, một máy đơn sắc dược dung để ngăn phần lopứn
ánh sang kích thích đến máy ghi phổ mà chỉ cho phép ánh sáng huỳnh quang đi qua,cho
nên phép đo huỳnh quang được tiến hành trong điều kiện cường độ ánh sang thấp. trong
các kĩ thuật hấp thụ độ nhạy cảm của mức hấp thụ thấp nhất phụ thuộc vào tính chính xác,
do đó có thể so sánh hai cường độ ánh sáng tương tự nhau.
Có hai ưu điểm trong việc sử dụng đo huỳnh quang so với kĩ thuật hấp thụ là:
Tiểu Luận Môn Học 17
• Chỉ cần đo một lần chứ không cần đo hai lần như trong kĩ thuật hấp thụ
• Kết quả đưa ra từ máy đo huỳnh quang tỉ lệ thuận trực tiếp với nồng độ chứ không
phải là tỉ lệ nghịch với logarit nồng độ.
Dựa vào ưu điểm trên mà người ta dung phương pháp huỳnh quang để xác định hàm
lượng vitamin B
2
.
b) Nguyên tắc:
Trong ngũ cốc riboflavin (latoflavin,vitamin G, vitamin B
2
) là chất có màu vàng-xanh lá
cây được chỉ định bằng phương pháp phân tích huỳnh quang .riboflavin có nhiều trong tế

bào động vật và thực vật. nó bền trong muối khoáng và phần lớn các tác nhân oxi
hóa,nhưng lại không bền trong dung dịch kiềm.nó rất nhạy cảm với tia khả kiến và tia tử
ngoại nên các thao tác được thực hiện trong ánh sáng dịu hoặc trong các dụng cụ thí
nghiệm thủy tinh có độ quang hóa thấp
Trong các tế bào sống, riboflavin thường kết hợp với axit photphoric hoặc cả với axit
adenylic (FMN hoặc FAD). Cả 2 đều có thể kết hợp một số protein đặc thù để hình thành
các enzyme oxi hóa. Trong một số sản phẩm ( sữa), riboflavin tồn tại dưới dạng tự do có
thể thẩm tách cũng như dạng coenzyme.
Trong phần lớn các quy trình riboflavin, cần thiết phải xử lý các sản phẩm tự nhiên với
axit hoặc enzyme để thu được giá trị tối đa. Bước xử lý này giải phóng riboflavin khỏi
phức chất protein và giúp cho việc tách chiết dễ dàng hơn.
Riboflavin được tách chiết từ ngũ cốc và phân tích bằng máy quang phổ quét tự vi. Dùng
máy quang phổ huỳnh quang quét có điều khiển để điều chỉnh sự phát huỳnh quang của
riboflavin khi có mặt những chất gây cản trở, những chất này theo lý thuyết có ảnh hưởng
đến các chất chuẩn và mẫu thí nghiệm. Do đó cường độ của sự phát huỳnh quang tỷ lệ với
Tiểu Luận Môn Học 18
nồng độ của riboflavin trong dung dịch loãng và nồng độ này được đo dựa vào sự chênh
lệch độ huỳnh quang trước và sau sự khử Natritiosunfit (Na
2
S
2
O
4
).
c) Tiến hành
- Quy trình tách chiết
 Cân 6.0 g thực phẩm (dự tính là chứa 5 đến 10 microgam riboflavin), nghiền bằng
cối sứ.
 Đổ vào bình nón 100 ml và them 50 ml dung dịch HCl 0.01M. lức bình để tẩm ươt
hết ngũ cốc. sau đó đậy nắp bình bằng giấy nhôm (tốt nhất là giấy bạc) để tránh

riboflavin bị phân hủy bởi ánh sáng. Đặt trong nồi cách thủy đang đun sôi khoảng
1 giờ, cứ 5 phút lại lắc một lần. kiểm tra mức nước mỗi lần lắc bình, không để
nước cạn.
 Làm nguội bình đến nhiệt độ phòng và cho vào cốc 100 ml.dùng máy đo PH chỉnh
đến 6.0 (bằng dung dịch NaOH 0.5M)
Chú ý: Cho NaOH từ từ dể tránh những chổ có PH cao sẽ dẫn đến mât riboflavin.
 Ngay lập tức thêm HCl 1M để giảm PH đến 4.5.Li tâm bằng ống li tâm thủy tinh
100 ml ở 2000 v/phút (rpm) trong 10 phút.
 Pha loãng dịch lọc đến 250 ml với nước cất trong bình định mức.
- Quá trình axit hóa và oxi hóa của dịch chiết
 Lấy 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 10ml dịch chiết và 1 ml nước.trộn đều bằng
máy trộn.
Tiểu Luận Môn Học 19
 Lấy 2 ống nghiệm khác, cho vào mỗi óng 10 ml dịch chiết và 1ml dung dịch chuẩn
riboflavin (0.5 microgam/ml) và trộn đều.
 Cho 1 ml axit axetic đặc vào cả 4 ống nghiệm và để 2 phút.
 Cho thêm 0.5 ml dung dịch KMnO
4
3%vào mỗi ống, trộn đều và để 2 phút.
 Cho 0.5 ml H
2
O
2
3% vào mỗi ống và trộn đều. màu đỏ sẽ biến mất trong vong 10
giây.
- Đo độ huỳnh quang của dịch chiết
 Để đo độ huỳnh quang của riboflavin, bước song phát xạ và bước sóng kích thích
phải được xác định bằng máy đo quang phổ quét (scanning spectrophotometer).
 Xác định cực đại của bước sóng phát xạ và bước sóng kích thích của dung dịch
chuẩn riboflavin (nồng độ 1 microgam/ml riboflavin) giá trị cực đại cho kích thích

nên có giá trị là 450 nm. Giá trị cực đại cho phát xạ là 530nm.
F =2.303.Ф.p
0.
έ.b.c
Trong đó: Ф –hiệu suất lượng tử
P
0
–cường độ tối
έ – độ hấp thụ phân tử
b –độ dài đường dẫn
c – nồng độ
Phương trình này chỉ đúng với những dung dịch có nồng độ thấp. ở phương trình
trên,cường độ huỳnh quang tỉ lệ thuận với cường độ tối p
0
và nồng độ c. độ huỳnh quang
Tiểu Luận Môn Học 20
sẽ tăng khi p
0
tăng (hoặc công suất của nguồn tăng), độ huỳnh quang cũng tăng khi nồng
độ của chất phát quang tăng.
Để thành lập mối liên quan theo định luật Lambert-Beer, có một đường chuẩn độ cho
riboflavin chứa 0.5 – 1.0 – 2.0 và 4.0 microgam/ml.
Chú ý: Trong khi đo huỳnh quang, phải để cẩn thận tránh không cho dung dịch tiếp xúc
với tia tử ngoại quá lâu nếu không sẽ làm riboflavin bị phân hủy rất nhanh.
 Đo độ huỳnh quang của dịch chiết không chứa riboflavin (kết quả A). dung 3ml
dung dịch trong cuvett.
 Cho vào cuvett đã chứa 3 ml dịch chiết này khoảng 5mg Na
2
S
2

O
4
(pha trong nước)
trộn đều và đo ngay lập tức (kết quả C)
 Đo độ huỳnh quang của dịch chiết có chứa riboflavin thêm vào (kết quả B).
4. Định lượng vitamin B1 bằng phương pháp huỳnh quang
a) Nguyên tắc
Khi oxi hóa vitamin B1(thiamin) bằng kali feroxianua trong môi trường kiềm sẽ tạo thành
hợp chất thiochom,chất này có màu huỳnh quang xanh dưới ánh sáng tử ngoại.Cứ một
phân tử thiamin sẽ tạo thành một phân tử thiocrom.
Để xác định hàm lượng thiamin, người ta dùng dung dịch chuẩn thiamin tinh khiết so
sánh với dung dịch nghên cứu. trước khi tiến hành các phản ứng, thiamin phải được giải
phóng ra khỏi mẫu bằng chế phẩm enzim photphataza , papayolin ,hoặc takađiataza.
b) Hóa chất
- Dung dịch H
2
SO
4
0.1N.
Tiểu Luận Môn Học 21
- Dung dịch CH
3
COOH 30%.
- Dung dịch NaOH 15%.
- Dung dịch kaliferoxianua [K
3
Fe(CN)
6
] 1%chẩn bị để dùng trong ngày và giữ trong
lo mầu.

- Rượu butylic (C
4
H
9
OH) hoặc isoamylic [(CH
3
)
2
CH(CH
2
)
2
OH]: các rượu này không
được phát huỳnh quang. Nếu phát huỳnh quang phải khử bằng than hoạt tính(15 g
than cho vào 1 ml rượu): rượu trộ với than lắc 30 phút trên máy lắc ,lọc làm khan
bằng CaCl
2
và cất ở nhiệt độ thích hợp.
- Chế phẩm photphataza của khuẩn ti penicillium: khẩn này được sấy khô ở nhiệt độ
40
0
c. lấy 10 mg khuẩn này nghiền với 1ml dung dịch natri axetat 30%, chuyển vào
bình định mức, thêm natri axetat đến PH=5.
- Dung dịch vitamin B
1
chuẩn
• Dung dịch gốc(a): 10mg thiamim tinh thể hòa tan vào 10ml HCl 0.01N.Chuyển
dung dịch vào bình định mức dung tích 100ml.Thêm cất đến vạch,lắc kỹ.Đựng
trong chai màu nâu,để ở chổ mát có thể dữ được một tháng.Cứ 1ml dung dịch này
chứ 100γ –thiamim.Lấy 1ml dung dịch này cho vào bình dịnh mức dung tích

100ml,thêm nước cất đến bình định mức,lắc kỹ,1ml dung dịch này chứa 1 γ
thiamim.
• Dãy dung dịch thiamin chuẩn(b):từ dung dịch trên cho vào các ống nghiệm lần
lượt 0.5;1.0;1.5;2ml(chứa 0.5;1.0;1.5;2 γ thiamim ),thêm vào các ông nghiệp lần
lượt 4.5;4.0;3.5;3.0ml nước cất và 1ml dung dịch K
3
Fe(CN)
6
1% (mới pha).Cuối
cùng cho vào mỗi ống 3ml dung dịch NaOH 1%.Lắc nhanh,mỗi ống lại cho thêm
10ml rượu butylic,lắc.Để yên 10 phút ,dung dịch sẽ tách thành 2 lớp.Li tâm ,tách
Tiểu Luận Môn Học 22
bơ lớp dưới,cho vào 1g Na
2
SO
4
khan.Dung dịch rượu khan chứa thiỏcom được cho
vào dãy ống nghiệp khác.Ta được dãy màu tiêu chuẩn bền trong 2-3 ngày.
c) Tiến hành:
- Cân 5-10g mẫu, nghiền trong cối sứ với 10-15ml H
2
SO
4
0.1N.Chuyển vào bình
định mức cỡ 100ml,thêm H
2
SO
4
đến 75ml.
- Đặt bình vào nồi cách thủy sôi trong 45 phút ,lắc điều, để nguội vào thêm chế

phẩm photphataza vào( cứ 1g mãu cần 0.03g khuẩn ti khô)bằng cách:cân khuẩn
ti,đem nghiền trong cối với 2-3ml natri axetat 30% rồi chuyển vào bình định mức,
thêm natri axetat đến pH=5.
- Đặt bình vào máy ổn nhiệt ở 40
o
C trong 12 giờ.Sau đó lấy bình ra,thêm nước cất
đến bình định mức,lắc kỹ,lọc.
- Hút lấy 5ml nước lọc cho vào phiễu chiết,thêm 10ml rượu butylic,lắc mạnh 1-2
phút,chiết tách bỏ lớp rượu .Thêm vào 1ml dung dịch K
3
Fe(CN)
6
1% và 3ml
NaOH 15% ,lắc nhanh và thêm 10ml rượu butylic.Lắc,tách bỏ lớp nước.Lọc lớp
rượu qua giấy lọc chứa NaOH khan.Chuyển dung dịch vào ống nghiệm.
- Đo cường độ huỳnh quang của mẫu thí nghiệm so với dãy dung dịch thiamim
chuẩn trên máy quang phổ dưới ánh sáng tử ngoại của đèn thạch anh,thủy ngân
TIK-4,kính lọc màu đen(kích thước là 432ml nm,sự phát xạ là 545nm).
d) Tính kết quả:
Hàm lượng vitamim B
1
(mg%)được tính theo công thứ sau:
Tiểu Luận Môn Học 23
Trong đó:
a-Lượng vitamim có trong ống nghiệm chuẩn có màu huỳnh quang trùng với mẫu ống
nghiệm (γ).
V-dung tích bình định mức(ml).
V
1
- thể tích dung dịch thí nghiệm lấy để oxi hóa(ml).

w- khối lượng mẫu(g).
1000-chuyển từ γ ra mg.
5. Định lượng vitamin nhóm B và vitamin C trong thực phẩm bằng sắc ký
lỏng ghép đầu dò UV
a) Nguyên tắc:
Vitamine B và C được chiết ra khỏi nền mẫu bằng hỗn hợp Acetonitril : H
3
PO
4
0.05%
(80:20) và định lượng bằng sắc ký lỏng kết nối với đầu dò UV.
Chuẩn làm việc:
- Chuẩn gốc dạng bột rắn , độ tinh khiết 99.2%, Dr. Ehrenstorfer hay tương đương
- Dung dịch chuẩn gốc (1000 mg/l)
Cân 10,0 mg chuẩn rắn định mức 10 ml bằng Acetonitril: H
3
PO
4
0.05% (80:20)
- Dung dịch chuẩn thứ cấp :
Dung dịch chuẩn thứ cấp 1 (500 mg/l) : hút 5 ml dung dịch chuẩn gốc định mức 10ml
bằng Acetonitril: H
3
PO
4
0.05% (80:20) .
Tiểu Luận Môn Học 24
Dung dịch chuẩn thứ cấp 2 (200 mg/l) : hút 2 ml dung dịch chuẩn gốc định mức 10ml
bằng Acetonitril: H
3

PO
4
0.05% (80:20) .
Dung dịch chuẩn thứ cấp 3 (100 mg/l) : hút 1 ml dung dịch chuẩn gốc định mức 10ml
bằng Acetonitril: H
3
PO
4
0.05% (80:20) .
- Dãy chuẩn làm việc có nồng độ 1.0; 2.0; 5.0; 10; 20; 50 mg/L.
Hút lần lượt 0.1; 0.2; 0.5; 1.0; 2; 5 ml dung dịch chuẩn thứ cấp 3 (100mg/L) cho vào
bình định mức 10ml, định mức đến vạch bằng Acetonitril: H
3
PO
4
0.05% (80:20) ta
được dãy chuẩn có nồng độ 1; 2; 5; 10; 20; 50 mg/L.
Nồng độ dãy chuẩn có thể thay đổi cho phù hợp với hàm lượng chất phân tích có trong
mẫu
b) Tiến Hành Phân Tích
- Chuẩn bị mẫu:
Mẫu phân tích sẽ được tiến hành đồng nhất trước khi phân tích:
 Nếu mẫu phân tích có khối lượng là 200 – 500 g, thì tiến hành đồng nhất
toàn bộ mẫu bằng các phương pháp thích hợp ( mẫu lỏng tiến hành lắc và
trộn đều, mẫu rắn, sệt…tiến hành xay nhuyễn) . Mẫu sau khi đồng nhất thì
được phân làm 02 phần (phần 1 chuyển cho phòng thí nghiệm, phần 2 được
lưu trữ tại khu vực lưu trữ mẫu ).
 Nếu mẫu phân tích có khối lượng > 500 g, thì tiến hành phân chia mẫu bằng
phương pháp thích hợp cho từng đơn vị mẫu : lấy ½ đơn vị mẫu rồi trộn đều
( mẫu chai lọ lấy ½ số chai đem đồng nhất, mẫu dạng viên lấy ½ khối lượng

đem xay nhuyễn…). Toàn bộ mẫu sau khi đồng nhất sẽ được chuyển xuống
phòng thí nghiệm.
- Tiến hành phân tích mẫu:
 Mẫu kiểm soát:
Tiểu Luận Môn Học 25
- Cân khoảng 2 gam (hút 2 ml) mẫu cần phân tích vào óng nhựa 15 ml, tiến hành
thêm chuẩn ở nồng độ thích hợp (kết quả sau phân tích phải nằm trong khoảng
nồng độ của dãy chuẩn làm việc) vào trong nền mẫu phân tích, vortex mẫu, để yên
trong vòng 15 phút.
 Mẫu phân tích:
- Cân khoảng 2 gam (hút 2 ml) mẫu đã được đồng nhất vào ống 15mL.
Tiền hành phân tích tương tự các bước phía dưới cho cả hai mẫu kiểm soát và mẫu
phân tích.
- Thêm vào 10 ml hỗn hợp Acetonitril : H
3
PO
4
0.05% (80:20).
- Vortex cho đều mẫu, đánh siêu âm 5 phút ở nhiệt độ phòng.
- Ly tâm 5 phút, 5000 vòng/phút.
- Sau khi ly tâm mẫu xong ta tiến hành chuyển phần dung dịch trong vào bình định
mứt 25ml.
- Tiến hành chiết mẫu thêm 1 lần, tương tự các bước B.3, B.4, B.5 và B.6
- Gợp toàn bộ dung dịch trong sao khi chiết vào bình định mứt 25 ml và định mứt
đến vạch. Pha loãng mẫu nếu cần thiết.
- Sau đó lọc mẫu qua màng lọc 13mm, 0.45µm.
- Thu dịch lọc cho vào vial.
- Tiến hành đo trên máy HPLC/UV
- Tiến hành đo trên máy HPLC/UV
 Điều kiện phân tích

Cột sắc ký: Cột sắc ký lỏng pha thuận Phenomenex Luna 5µ NH
2
100A (250 x 4.6
mm x 5µm) và cột bảo vệ hay tương đương.