Khóa luận tốt nghiệp : Công nghệ cố định enzyme và ứng dụng

~ i ~

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
  
BK
TP HCM



ĐỒ ÁN MÔN HỌC
TRANG BÌA
CÔNG NGHỆ CỐ ĐỊNH ENZYM
VÀ ỨNG DỤNG


SVTH : NGUYỄN BẢO DƢ
MSSV : 60700443
GVHD : TS. TRẦN BÍCH LAM

TRANG BÌA
TP Hồ Chí Minh, 6/2011
Đồ án môn học

~ ii ~

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2011
Chữ ký của giáo viên




Đồ án môn học

~ iii ~

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Trần Bích Lam đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian thực hiện đồ án.
Cảm ơn quý thầy cô bộ môn Công nghệ Thực phẩm, khoa Kỹ thuật Hóa Học, trƣờng
Đại học Bách Khoa TpHCM đã giảng dạy nhiệt tình và truyền đạt những kiến thức quý báu
của mình giúp tôi hoàn thành đồ án.
Xin cảm ơn tất cả bạn bè, những ngƣời đã quan tâm, giúp đỡ tôi hoàn thành đồ án
này.

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 6/2011
Nguyễn Bảo Dƣ















Đồ án môn học

~ iv ~

MỤC LỤC
TRANG BÌA i
NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN ii
LỜI CẢM ƠN iii
MỤC LỤC iv
DANH MỤC HÌNH vi
DANH MỤC BẢNG vi
Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1
1.1. Lịch sử phát triển của enzym cố định 1

1.2. Sơ lƣợc về enzym cố định 2
1.2.1. Định nghĩa 2
1.2.2. Đặc điểm của enzym cố định 2
1.2.3. Ƣu nhƣợc điểm của enzym cố định 3
1.2.4. Các phƣơng pháp cố định enzym 3
1.2.5. Vật liệu cố định 5
1.2.6. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự cố định enzyme 7
Chƣơng 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH 9
2.1. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 9
2.1.1. Enzym β-galactosidase 9
2.1.1.1. Giới thiệu về enzym β-galactosidase 9
2.1.1.2. Nguồn thu nhận enzym β-galactosidase 9
2.1.1.3. Các phƣơng pháp cố định enzym β-galactosidase 10
2.1.1.4. Ứng dụng của enzym β-galactosidase cố định 13
2.1.1.4.1. Thủy phân lactose trong sữa và lactoserum 13
2.1.1.4.2. Tổng hợp Galacto-Oligosaccharides (GOSs) 16
2.1.2. Enzym lipase 17
2.1.2.1. Giới thiệu về enzym lipase 17
2.1.2.2. Nguồn thu nhận enzym lipase 17
2.1.2.3. Các phƣơng pháp cố định enzym lipase 18
2.1.2.4. Ứng dụng enzym lipase cố định trong công nghệ thực phẩm 20
2.1.2.4.1. Ứng dụng lipase cố định tổng hợp các ester có hƣơng trái cây 20
2.1.2.4.2. Ứng dụng enzyme lipase cố định để sản xuất liên tục monoacylglycerol
từ olein dầu cọ 21
2.1.3. Enzym α-galactosidase (raffinase) 23
Đồ án môn học

~ v ~

2.1.3.1. Giới thiệu về enzym α-galactosidase 23

2.1.3.2. Nguồn thu nhận enzym α-galactosidase 23
2.1.3.3. Cách phƣơng pháp cố định enzym α-galactosidase 23
2.1.3.4. Ứng dụng của enzym riffinase cố định 26
2.2. Ứng dụng trong phân tích 27
2.2.1. Tổng quan về cảm biến sinh học (biosensor) 27
2.2.1.1. Giới thiệu về cảm biến sinh học 27
2.2.1.2. Lịch sử phát triển cảm biến sinh học 27
2.2.1.3. Phân loại 28
2.2.1.4. Các yếu tố sinh học 29
2.2.1.4.1. Enzym 29
2.2.1.4.2. Kháng thể 29
2.2.1.4.3. Vi sinh vật 30
2.2.1.5. Bộ chuyển đổi (transducer) 30
2.2.1.5.1. Chuyển đổi điện hóa 30
2.2.1.5.2. Chuyển đổi quang 30
2.2.1.5.3. Chuyển đổi nhiệt 30
2.2.1.5.4. Chuyển đổi bằng tinh thể áp điện (piezoelectric) 30
2.2.2. Cảm biến sinh học sử dụng L-glutamate oxidase và L-glutamate dehydrogenase
cố định dùng để phân tích monosodium glutamate trong thực phẩm 31
2.2.2.1. Giới thiệu 31
2.2.2.2. Phƣơng pháp thí nghiệm 31
2.2.2.2.1. Các hóa chất sử dụng 31
2.2.2.2.2. Sự cố định enzym 31
2.2.2.2.3. Điện cực 32
2.2.2.2.4. Thử nghiệm 32
2.2.2.2.5. Quá trình phản ứng 33
2.2.2.2.6. Cấu hình nhiệt độ và pH 33
2.2.2.2.7. Xác định giá trị K
m
và V

max
34
2.2.2.2.8. Sự ổn định của màng cố định 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

Đồ án môn học

~ vi ~

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Mô hình biosensor 27
Hình 2.2: Mô hình cảm biến sinh học phân tích MSG dùng L-GLOD–L-GLDH cố định 32
Hình 2.3: Đƣờng hiệu chỉnh vận tốc tiêu thụ Oxy theo nồng độ MSG của cặp L-GLOD–L-
GLDH cố định trong cảm biến sinh học 33
Hình 2.4: pH ở nhiệt độ 25 ± 2 ◦C có mặt 2mM NADPH và 10mM ammonium với nồng độ
MSG 1.2mg/L 34
Hình 2.5: Nhiệt độ ở pH 7.0 với nồng độ MSG 12mg/dL 34
Hình 2.6: Hoạt tính của enzym cố định trên cảm biến sinh học trong thời gian 60 ngày: L-
GLOD 25U–L-GLDH 143.2U; L-GLOD 25U–L-GLDH 35U; L-GLOD 25U 35

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Ƣu – Nhƣợc điểm của các phƣơng pháp cố định enzyme 4
Bảng 2.1: Tóm tắt các phƣơng pháp cố định enzym β-galactosidase 13
Bảng 2.2: Thủy phân lactose sử dụng các kỹ thuật cố định khác nhau 15
Bảng 2.3: Nguồn VSV thu nhận enzym lipase và tính chất enzyme lipase 18



Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học

~ 1 ~

Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1. Lịch sử phát triển của enzym cố định [1]
- Năm 1916, Nelson và Griffin quan sát và cho thấy rằng enzym invertase của nấm men
(EC.3.2.1.2.6) khi hấp thụ vào than có khả năng thủy phân đƣờng saccharose. Sau đó trên thế
giới xuất hiện nhiều báo cáo về khả năng cố định enzym bằng liên kết đồng hóa trị trên chất
mang. Trƣớc năm 1953 chƣa có một nghiên cứu nào về enzym không hòa tan đƣợc ứng dụng
vào thực tế.
- Năm 1953, Grubhofer và Schleith đã cố định đƣợc một số enzym nhƣ carboxy
peptidase, diastase, pepsin và ribonuclease trên polyaminostyrene bằng liên kết đồng hóa trị
và các nghiên cứu trên mới bắt đầu thử nghiệm ứng dụng qui mô pilot.
- Năm 1954, Chang đã tạo ra đƣợc các vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzym để chống lại
dị ứng khi đƣa enzym vào cơ thể.
- Năm 1963, Bernfeld và Wan đã thí nghiệm thành công việc nhốt các enzym nhƣ
amylase, trypsin, papain, ribonuclease vào gel polyacrylamide.
- Năm 1964, Quiociio và Richards đã mô tả phƣơng pháp liên kết chéo cố định
carboxy peptidase A với glutaraldehyde. Cũng trong năm này Chang đã triển khai phƣơng
pháp tạo vi nang để nhốt enzym carbonic anhydrase.
- Năm 1969, Wilson đã xây dựng thành công xƣởng thực nghiệm để sản xuất glucose
bằng glucoamylase cố định.
- Năm 1969, Chibata và những ngƣời cộng tác ở công ty Tanabe Seiyaku – Nhật đã là
những ngƣời đầu tiên thực hiện thành công việc áp dụng enzym cố định vào sản xuất công
nghiệp. Theo phƣơng pháp cố định enzym của các tác giả ngƣời Nhật, enzym aminoacylase
của nấm sợi đã đƣợc gắn vào DEAE-sephadex thông qua liên kết ion và sử dụng chúng cho
các quá trình thủy phân.
- Năm 1970, Mosbach đã tiến hành cố định ba loại enzym: -galactosidase, hexokinase,
glucophosphatase bằng liên kết cộng hóa trị với các hạt sephadex.
- Năm 1971, Gregoriadis đã triển khai liposome có chứa amyloglucosidase.
- Năm 1973, Chibata và các cộng tác viên cũng là những ngƣời đầu tiên thành công

trong việc cố định tế bào vi sinh vật để sản xuất L-aspartate từ ammonium fumarate bằng gel
acrylamid. Tế bào E.coli chứa trong gel có hoạt tính aspartate rất cao.
Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học

~ 2 ~

- Đến năm 1987, bằng công nghệ ứng dụng enzym glucoisomerase cố định, đã tiến
hành sản xuất siro fructose từ glucose theo qui mô công nghiệp. Cho đến nay có khoảng 4,5
triệu tấn siro fructose đƣợc sản xuất theo phƣơng pháp enzym cố định.
- Ngoài sản phẩm trên, enzym cố định còn đƣợc ứng dụng nhiều trong công nghệ lên
men, chống ô nhiễm môi trƣờng và cả trong y học.
1.2. Sơ lƣợc về enzym cố định
1.2.1. Định nghĩa [1]
Enzym cố định có thể hiểu theo 2 nghĩa:
- Nghĩa hẹp: enzym không hòa tan là enzym đƣợc đƣa vào những pha riêng rẽ, pha này
có thể tách riêng với môi trƣờng dung dịch phản ứng. Pha enzym không hòa tan trong nƣớc
và đƣợc gắn với các polymer ƣa nƣớc có trọng lƣợng phân tử lớn.
- Nghĩa rộng: các chất xúc tác cố định là các enzym, tế bào, cơ thể sống ở trạng thái
cho phép sử dụng lại. Nhƣ vậy, theo nghĩa rộng, enzym không hòa tan bao gồm cả enzym
đƣợc cố định vào một chất mang, cả enzym có trong tế bào sống, chúng đƣợc cố định trong
các bình phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần.
- Enzym không hòa tan hay enzym cố định thƣờng là những enzym hòa tan đƣợc gắn
vào một chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Nhờ quá trình gắn này mà enzym từ trạng
thái hòa tan chuyển sang không hòa tan.
1.2.2. Đặc điểm của enzym cố định [1]
Enzym cố định có đặc điểm nhƣ sau:
- Hoạt tính của enzym cố định thƣờng nhỏ hơn hoạt tính của enzym tự do cùng loại. Sở
dĩ có sự thay đổi hoạt tính riêng của enzym cố định là do những nguyên nhân sau:
 Do ảnh hƣởng điện tích của chất mang: khi điện tích của chất mang có sự khác
biệt với điện tích của enzym thì khi gắn enzym vào chất mang, cấu trúc không gian của

enzym có sự thay đổi ở mức độ nhất định. Chính vì sự thay đổi cấu trúc này mà sự kết hợp
giữa enzym và cơ chất sẽ kém đi, dẫn đến hoạt tính của chúng cùng giảm.
 Do enzym bị nhốt vào mạng lƣới hoặc bị liên kết bởi chất mang khiến cho sự tiếp
xúc giữa enzym và cơ chất bị kém đi.
- Enzym cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis – Menten nhƣng có một số sai
khác nhất định:
 Có thể xảy ra sự cạnh tranh cơ chất với enzym và chất mang.
Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học

~ 3 ~

 Xảy ra hiện tƣợng cản trở khuếch tán của cơ chất và sản phẩm làm giảm tốc độ
phản ứng.
- Enzym cố định thƣờng có tính bền nhiệt hơn enzym tự do nhờ có tác dụng che chở
của chất mang.
- Enzym cố định thƣờng có pH tối ƣu không trùng với enzym tự do cùng loại.
- Enzym cố định do có chất mang che chắn nên đƣợc bảo vệ tốt hơn enzym tự do.
- Enzym cố định có thể tái sử dụng nhiều lần và dễ dàng tách ra khỏi cơ chất một cách
dễ dàng sau phản ứng và độ bền của enzym cố định cao hơn enzym tự do.
1.2.3. Ƣu nhƣợc điểm của enzym cố định [1]
Ưu điểm:
- Enzym cố định có thể tái sử dụng nhiều lần trong thời gian dài.
- Enzym cố định không lẫn vào trong sản phẩm cuối của phản ứng enzym, do đó nó
không gây ảnh hƣởng xấu đến chất lƣợng sản phẩm, hay nói cách khác chúng ta không tốn
chi phí cho việc tách enzym ra khỏi sản phẩm.
- Có thể ngừng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách hệ chất mang – enzym ra khỏi
dung dịch cơ chất.
- Enzym cố định tƣơng đối bền với các tác nhân vật lý và hóa học hơn enzym tự do.
- Dễ dàng tiến hành quá trình sản xuất theo phƣơng pháp liên tục.
Nhược điểm:

- Sự có mặt của chất mang có thể làm giảm hoạt tính của enzym.
- Trong đa số trƣờng hợp, enzym có thể bị giảm hoạt mất hoạt tính sau quá trình cố
định.
- Tuy nhiên, những hạn chế trên là không đáng kể so với những lợi ích mà enzym cố
định mang lại. Do vậy, ngày càng có nhiều nghiên cứu về cố định enzym cũng nhƣ ứng dụng
enzym cố định vào sản xuất công nghiệp.
1.2.4. Các phƣơng pháp cố định enzym [1]
Các phƣơng pháp cố định enzym đƣợc chia thành 2 nhóm: hóa học và vật lý.





Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học

~ 4 ~

Bảng 1.1: Ưu – Nhược điểm của các phương pháp cố định enzyme [1]
Phƣơng pháp hóa học
Phƣơng pháp
Ƣu điểm
Nhƣợc điểm
Phƣơng pháp gắn enzym
lên chất mang bằng liên
kết cộng hóa trị
Liên kết giữa enzym và chất
mang là liên kết bền, do đó hạn
chế tối đa sự mất mát enzym
trong quá trình phản ứng.
Hoạt tính enzym có thể bị

giảm do những biến đổi về
cấu trúc của enzym trong quá
trình cố định.
Phƣơng pháp gắn các
phân tử enzym lại với
nhau bằng liên kết cộng
hóa trị
Tạo đƣợc liên kết rất bền trƣớc
các tác nhân pH, nhiệt độ…
Thƣờng đƣợc dùng phối hợp với
các phƣơng pháp khác.
Chi phí cao, thao tác thực
hiên tƣơng đối phức tạp.
Hoạt tính enzym có thể bị
giảm do những biến đổi về
cấu trúc của enzym trong quá
trình cố định.
Phƣơng pháp vật lý
Phƣơng pháp
Ƣu điểm
Nhƣợc điểm
Phƣơng pháp gắn enzym
lên chất mang bằng tác
nhân vật lý
Thao tác thực hiện đơn giản.
Điều kiện tiến hành cố định
enzym ôn hòa nên không làm
mất hoạt tính của enzym trong
quá trình cố định.
Có khả năng tái sử dụng chất

mang.
Do lực tƣơng tác giữa enzym
và chất mang yếu nên dễ xảy
ra hiện tƣợng nhả hấp phụ
trong quá trình sử dụng
enzym cố định do khuấy trộn
hay do thay đổi nhiệt độ, pH
của môi trƣờng.
Phƣơng pháp nhốt enzym
Thao tác đơn giản.
Không đòi hỏi phải có các nhóm
tạo liên kết nên phù hợp với
nhiều loại enzym.
Hiệu quả cố định enzym cao.
Có thể cố định đồng thời nhiều
enzym.
Chỉ thích hợp cho phản ứng
với cơ chất có khối lƣợng
phân tử nhỏ.
Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học

~ 5 ~

Phương pháp hóa học:
- Gắn enzym lên chất mang bằng liên kết cộng hóa trị.
- Gắn các phân tử enzym lại với nhau bằng liên kết cộng hóa trị.
Phương pháp vật lý:
- Hấp phụ enzym lên chất mang bằng liên kết vật lý nhƣ sau: lực mao quản, liên kết
ion, lực Van der Walls….
- Phƣơng pháp nhốt enzym trong khuôn gel hoặc màng bao vi thể.

1.2.5. Vật liệu cố định [1]
Vật liệu và phƣơng pháp cố định là hai yếu tố có tính chất quyết định đến hiệu quả của
quá trình cố định enzym. Trong đó, không có đặc điểm, tính chất của vật liệu cố định nào
thích hợp cho tất cả các loại enzym và cũng không có enzym nào thích hợp với tất cả các loại
vật liệu cố định.
Vật liệu cố định enzym và tế bào có thể chia làm hai loại: vật liệu vô cơ và vật liệu hữu
cơ.
Vật liệu vô cơ:
- Đặc điểm: chất mang vô cơ bền với các tác động bên ngoài, không bị vi sinh vật ăn
mòn, phân hủy, nhƣng việc gắn với enzym thƣờng khó khăn hơn.
- Một số chất mang vô cơ thông dụng nhƣ: thủy tinh xốp, các oxid kim loại nhƣ oxid
nhôm, oxid mangan, oxid magie, silicagel…
Vật liệu hữu cơ:
- Đặc điểm: chất mang hữu cơ thƣờng có các nhóm hoạt động hóa học nhƣ: -NH
2
, -
COOH, -OH, -SH,… nên dễ kết gắn với enzym nhƣng độ bền với tác động của môi trƣờng
không cao, đặc biệt các polymer sinh học rất dễ bị vi sinh vật xâm nhập và tấn công.
 Các polymer tự nhiên:
- Tinh bột là vật liệu phong phú rẻ tiền. Tinh bột dùng để đóng mạch, diethanolamin
tinh bột đã đƣợc dùng làm chất mang cố định enzym nhƣ lipase, glucoisomerase, trypsin,
amylase. Nhƣợc điểm của tinh bột là độ trƣơng kém, thiếu các nhóm chức năng nên khả năng
cố định và hoạt tính enzym còn thấp. Tinh bột thƣờng đƣợc ghép copolymer với các vinyl
monomer ƣa nƣớc nhƣ acrylamide, acrylic acid để cải thiện tính chất cơ lý, độ trƣơng nở và
tạo các nhóm chức năng trên bề mặt.
Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học

~ 6 ~

- Cellulose và dẫn xuất của cellulose là CM-cellulose, DEAE-cellulose,

nitrocellulose… là những vật liệu rẻ hơn so với agarose nhƣng lại không đồng nhất, thƣờng
chỉ sử dụng ở dạng sợi, và dạng tinh thể (microcrystalline). Cellulose là vật liệu đƣợc nghiên
cứu cố định enzym đầu tiên, các quy trình cố định trên vật liệu này đƣợc nghiên cứu khá hoàn
chỉnh. Cellulose thƣờng đƣợc dùng để hấp thụ, liên kết ion, liên kết cộng hóa trị với enzym
hoặc nhốt trong gel.
- Chitin là hợp chất đƣợc Braconnot phân lập từ năm 1811 và Odier đặt tên là chitin từ
năm 1823. Chitin là một polymer sinh học có nhiều triển vọng trong nghiên cứu và ứng dụng
làm vật liệu cố định enzym và tế bào. Chitin là một polymer sinh học rất phổ biến trong tự
nhiên, chỉ đứng sau cellulose.
- Chitin có cấu trúc tƣơng tự cellulose, là một polymer của các gốc 2-acetoamide-2-
deoxy-β-D-glucoza, liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4-glycoside. Chitin có trong thành phần
cấu trúc vỏ của côn trùng, vỏ tôm cua, sò, vách tế bào sinh vật,…Chitin là một vật liệu có
chứa nhóm chức –OH và cho liên kết với enzym, có cấu trúc siêu lỗ, có khả năng hấp thụ tốt,
dễ tạo màng. Chitin có cấu trúc mạng tinh thể chặt chẽ, không chỉ có các liên kết hydro hình
thành trong chuỗi mà còn có giữa các lớp với nhau trong mạng tinh thể. Chitin là một
polymer kỵ nƣớc, độ trƣơng thấp, diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ và bền về mặt hóa học. Gần
đây có rất nhiều nghiên cứu cố định enzym trên chitin, chủ yếu bằng phƣơng pháp hấp thụ và
liên kết công hóa trị qua cầu nối glutaraldehyde. Chitin đƣợc tìm thấy trong thành tế bào của
nấm sợi. Nó là chất hữu cơ chiếm lƣợng lớn để hình thành nên lớp vỏ ngoài của động vật
không xƣơng sống (côn trùng, giáp xác…). Về mặt cấu trúc, chitin có cấu trúc tƣơng tự nhƣ
cellulose, điểm khác biệt hóa học duy nhất là nhóm acetamido ở vị trí số 2 trên khung carbon
của chitin đƣợc thay thế cho nhóm hydroxyl (-OH) ở cellulose.
- Chitosan là dẫn xuất của chitin khi đƣợc deacetyl hóa trong kiềm mạnh. Chitosan dễ
tạo màng, tạo hạt, có cấu trúc siêu lỗ, có nhóm - NH
2
. Chitosan có thể cố định enzym bằng
phƣơng pháp hấp phụ, phƣơng pháp cộng hóa trị, hoặc nhốt enzym trong gel chitosan.
Chitosan không tan trong nƣớc, tan trong dung môi hữu cơ nhƣ acid formic, acid dipic, acid
acetic. Chitosan là một polymer sinh học có trọng lƣợng phân tử cao, có các nhóm amin hoạt
động, các nhóm hydroxyl có thể tham gia phản ứng hóa học.

- Anginate, carrageenan, cả hai vật liệu này tạo gel trong dung dịch CaCl
2
dùng để nhốt
tế bào, enzym.
- Chất mang protein thƣờng là gelatin, keratin, albumin,… thƣờng có khả năng dễ tạo
màng, tạo hạt, nhốt enzym trong khuôn gel với tác nhân đóng mạch là glutaraldehyde; nhƣợc
điểm của nhóm này là thƣờng kém bền, dễ bị nhiễm khuẩn.
Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học

~ 7 ~

 Các polymer tổng hợp:
- Các polymer tổng hợp đƣợc sử dụng làm chất mang cố định enzym nhƣ
polyacrylamide, polyester, polyvinylalcohol, polyvinylacetate, polyacrylic,
polyhydroxyethylacrylate, polystyrene,…
- Ƣu điểm chung của các polymer tổng hợp này là bền, tính chất cơ lý tốt, hoàn toàn trơ
với sự tấn công của vi khuẩn, độ trƣơng tốt, một số polymer có thể điều chỉnh kích thƣớc siêu
lỗ.
- Nhƣợc điểm là một số polymer có giá thành cao, khả năng tƣơng hợp sinh học kém,
không thể phân hủy trong môi trƣờng tự nhiên nên gây ô nhiễm môi trƣờng.
1.2.6. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự cố định enzyme [1]
Ảnh hưởng của chất mang
- Các tính chất lý học của chất mang nhƣ tính hòa tan, tính bền cơ hóa, diện tích, tính
háo nƣớc và kỵ nƣớc,…đều có ảnh hƣởng nhất định đến lƣợng enzym đƣợc liên kết, đến tính
bền và hoạt tính sinh học của các chất dẫn xuất enzym không tan.
- Bản chất hóa học của chất mang cũng ảnh hƣởng đến khả năng tạo thành dẫn xuất
enzym và tới khả năng chất mang hấp phụ không đặc trƣng các chất từ môi trƣờng phản ứng.
- Sự định vị enzym giúp cho dẫn xuất enzym không tan có tính bền nhiệt cao hơn
enzym tan.
- Chất mang có tác dụng hạn chế sự biến tính của enzym trong các dung môi, làm đứt

nối liên kết hydro và liên kết kỵ nƣớc
Ảnh hưởng của pH
- Khi lực ion thấp thì nồng độ H
+
gần chất mang tích điện âm cao hơn, còn gần chất
mang tích điện dƣơng cao hơn trong dung dịch. Kết quả là pH tối ƣu của enzym liên kết đồng
hóa trị với chất mang tích điện âm sẽ chuyển dịch sang pH kiềm so với enzym hòa tan, trái
lại nếu enzym liên kết đồng hóa trị với chất mang tích điện dƣơng thì pH tối ƣu sẽ chuyển
dịch sang phía pH acid.
- Khi lực ion lớn thì điện tích của chất mang đƣợc trung hòa bởi các ion trái dấu và pH
tối ƣu của enzym cố định gần giống enzym hòa tan.
Ảnh hưởng của enzyme
- Theo Poltorak, một trong những nguyên nhân làm giảm hoạt độ của enzym cố định là
sự tƣơng tác protein-protein giữa các phân tử enzym đã đƣợc liên kết.
- Trong mọi trƣờng hợp đều thấy hoạt độ riêng của chế phẩm bị giảm đi cùng với sự
tăng lƣợng enzym đƣợc kết hợp trên một đơn vị diện tích chất mang.
Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học

~ 8 ~

Ảnh hưởng của phương pháp cố định
- Khi cố định bằng phƣơng pháp hấp phụ vật lí, các enzym ít bị thay đổi cấu trúc không
gian do đó ít ảnh hƣởng đến hoạt tính. Nhƣng do phƣơng pháp này sử dụng các liên kết yếu
nhƣ liên kết kị nƣớc, liên kết hydro,… nên enzym dễ bị giải hấp phụ.
- Khi cố định bằng phƣơng pháp liên kết cộng hóa trị sẽ có độ ổn định cao khi sử dụng
dƣới các điều kiện nhƣ nhiệt độ, pH, có khả năng chống chịu cao đối với sự ảnh hƣởng của
các dung môi hữu cơ và các tác nhân vật lí khác. Tuy nhiên, liên kết cộng hóa trị sẽ làm thay
đổi mạnh mẽ cấu trúc không gian của enzym nên hoạt tính của enzym cố định thƣờng bị giảm
đi đáng kể.
- Khi cố định bằng phƣơng pháp bao gói, quá trình hoạt động của enzym phụ thuộc vào

hai yếu tố chính là kích thƣớc chất mang polyme và trọng lƣợng của phân tử cơ chất. Hai yếu
tố này sẽ làm giảm tốc độ khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất khác. Hơn nữa, cùng
với hoạt tính xúc tác cao của enzym sẽ làm xuất hiện gradient nồng độ của cơ chất và sản
phẩm của dung dịch và chất mang chứa enzym cố định. Điều này làm cho các thông số công
nghệ thay đổi, đó là điều cần để ý khi thiết lập quy mô của quá trình.









Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học

~ 9 ~

Chƣơng 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH
2.1. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm
2.1.1. Enzym β-galactosidase
2.1.1.1. Giới thiệu về enzym β-galactosidase [2]
Enzym β-galactosidase (EC.3.2.1.23) là một lactase thủy phân đƣờng lactose thành
các monomer là glucose và galactose. Việc sử dụng β-galactosidase để thủy phân lactose
trong sữa và whey là một trong những ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp chế biến thực
phẩm và các sản phẩm từ sữa. Enzym này có thể đƣợc sử dụng dƣới dạng hòa tan hoặc dạng
cố định nhƣng dạng hòa tan chỉ có thể sử dụng trong qui trình sản xuất gián đoạn, còn dạng
cố định có lợi thế hơn là có thể sử dụng tốt cho cả hai qui trình sản xuất gián đoạn và liên tục.
Mặc dù hầu hết các ngành công nghiệp vẫn thủy phân lactose với enzym tự do, nhƣng
việc sử dụng enzym β-galactosidase cố định là một lĩnh vực đáng quan tâm vì những tiềm

năng của nó.
2.1.1.2. Nguồn thu nhận enzym β-galactosidase [2]
Enzym β-galactosidase có thể đƣợc thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau nhƣ vi sinh
vật, thực vật, và động vật. Tuy nhiên, tính chất của enzym đƣợc thu nhận từ các nguồn khác
nhau có sự khác nhau rõ rệt. Enzym thu nhận từ nguồn thực vật và động vật có giá trị kinh tế
thấp, nhƣng thu nhận từ nguồn vi sinh vật lại có nhiều ƣu thế nhƣ dễ dàng xử lí thu nhận, tốc
độ nhân giống vi sinh vật cao, năng suất thu nhận sản phẩm cao. Một số vi sinh vật đƣợc xem
là nguồn thu nhận tiềm năng của loại enzym này.
Bacteria: Alicyclobacillus acidocaldarius subsp, Rittmannii Arthrobacter sp, Bacillus
acidocaldarius, B. circulans, B. coagulans, B. subtilis, B. megaterum, B. stearothermophilus,
Bacteriodes polypragmatus, Bifidobacterium bifidum, B.infantis, Clostridium acetobutylicum,
C.thermosulfurogens, Corynebacterium murisepticum, Enterobacter agglomerans,E.
cloaceae, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus,L.
helviticus, L. kefiranofaciens, L. lactis, L. sporogenes, L. themophilus, L. delbrueckii,
Leuconostoc citrovorum, Pediococcus acidilacti, P. pento, Propioionibacterium shermanii,
Pseudomonas fluorescens, Pseudoalteromonas haloplanktis
Streptococcus cremoris, S. lactis, S. thermophius, Sulfolobus solfatarius,
Thermoanaerobacter sp.,Thermus rubus, T. aquaticus, Trichoderma reesei, Vibrio cholera,
Xanthomonas campestris.
Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học

~ 10 ~

Fungi: Alternaria alternate, A. palmi, Aspergillus foelidis, A. fonsecaeus, A.
fonsecaeus, A. Carbonarius, A. Oryzae, Auerobasidium pullulans, Curvularia inaequalis,
Fusarium monilliforme, F. oxysporum, Mucor meihei, M. pusillus, Neurospora crassa,
Penicillum canescens, P. chrysogenum, P. expansum, Saccharopolyspora rectivergula,
Scopulariapsis sp, Streptomyces violaceus.
Yeast: Bullera singularis, Candida pseudotropicalis, Saccharomyces anamensis, S.
lactis, S. fragilis, Kluyveromyces bulgaricus, K. fragilis, K. lactis, K.marxianus.

2.1.1.3. Các phƣơng pháp cố định enzym β-galactosidase [2]
Phương pháp hấp phụ vật lý
Các chất vô cơ nhƣ nhôm, silic, thủy tinh xốp, đất sét, bentonite,… chất hữu cơ nhƣ
cellulose, tinh bột, than hoạt tính, nhựa trao đổi ion,… đƣợc sử dụng làm chất mang hấp phụ
trong cố định enzym. Hơn nữa có thể xử lí thêm với glutaraldehyde để tăng sự ổn định.
Enzym β-galactosidase từ K. fragilis và K. lactis đƣợc cố định trên chitosan có hoạt
độ riêng 0.9–2.2 U/mg trọng lƣợng khô của tế bào. Hoạt tính của enzym đƣợc cố định từ K.
fragilis thì cao hơn nhƣng độ ổn định của enzym cố định từ A. oryzae thì cao hơn 5-14 lần tùy
thuộc vào phƣơng pháp cố định. Khi dùng phƣơng pháp hấp phụ ngƣời ta nhận thấy hoạt tính
cao nhất thu đƣợc khi dùng enzym từ nấm men với chất mang là Ostsorb-DEAE. Hơn nữa, sự
cố định tối đa đạt đƣợc ở pH 5.5 và kết quả tối ƣu thu đƣợc khi có mặt dung dịch đệm
citrate/phosphate trong suốt quá trình cố định β-galactosidase từ E. coli bằng phƣơng pháp
hấp phụ vật lí trên chromosorb-W. Một thiết bị phản ứng mới chứa β-galactosidase từ B.
circulans đƣợc cố định trên màng có gờ làm từ PVC và silica đƣợc sử dụng để thủy phân
lactose trong sữa gầy. Việc cố định β-galactosidase từ Bullera singularis trên hạt Chitopearl
BCW 3510 (970 GU/g nhựa) bằng phƣơng pháp hấp phụ đơn giản cũng đƣợc thực hiện.
Các nghiên cứu về động học của enzym β-galactosidase từ Kluyveromces marxianus
(Saccharomyces) lactis đƣợc cố định trên những chất mang khác nhau nhƣ nhôm và silica đã
cho thấy rằng hoạt tính của enzym cố định phụ vào bản chất hóa học tự nhiên và cấu trúc vật
lí của chất mang. Khi kích thƣớc lỗ của các hạt chất mang tăng thì hoạt tính của enzym giảm
mạnh. Sự cố định β- galactosidase từ Thermus sp. diễn ra rất nhanh trên PEI-Sepabeads và
DEAE-Agarose. Tuy nhiên, độ mạnh hấp phụ thì cao hơn trong trƣờng hợp của PEI-
Sepabeads.
Enzym β-galactosidase từ B. stearothermophilus chịu nhiệt đƣợc cố định trên chitosan
sử dụng Tris (hydroxymethyl) phosphine (THP) và glutaraldehyde dùng để thủy phân đƣờng
lactose trong sữa. Khả năng chịu nhiệt và hoạt tính của enzym β-galactosidase đƣợc cố định
Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học

~ 11 ~

trên THP thì vƣợt trội hơn so với enzym tự do và enzym đƣợc cố định bằng glutaraldehyde.
Enzym β-galactosidase đƣợc cố định trên THP cho thấy hoạt tính cao hơn enzym tự do khi có
mặt ion Ca
2+
và ổn định trong suốt thời gian bảo quản ở 4
o
C trong 6 tuần, trong khi enzym tự
do bị mất 31% hoạt tính trong cùng điều kiện. Hai phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm là
phƣơng pháp “Response surfacemethodology” (RSM) và “Centre composite design” (CCD)
đƣợc dùng để tối ƣu sự cố định enzym β-galactosidase từ Pisum sativum trên hai vật liệu
khung mạng: Sephadex G-75 và hạt chitosan. Hiệu suất cố định đạt đƣợc 75.66% và 75.19%
tƣơng ứng với Sephadex G-75 và chitosan.
Enzym β-galactosidase từ A. oryzae đƣợc cố định trên một chất mang rẻ tiền
concanavalin A-cellulose. Chế phẩm β-galactosidase đƣợc hấp phụ và liên kết chéo bằng
Concanavalin A-cellulose, giúp giữ lại 78% hoạt tính ban đầu. Nhiệt độ tối ƣu của enzym cố
định tăng từ 50
o
C lên 60
o
C. Enzym cố định bằng phƣơng pháp hấp phụ và liên kết chéo giữ
đƣợc 93% hoạt tính sau 1 tháng bảo quản trong khi enzym tự nhiên chỉ giữ đƣợc 63% hoạt
tính.
Phương pháp bao gói
Khung mạng sử dụng để cố định thƣờng đƣợc làm từ các nguyên liệu nhƣ Ca-alginate,
agar, k-carragenin, polyacrylamide và collagen. Tuy nhiên, một vài khung mạng rắn nhƣ than
hoạt tính, ceramic,… cũng có thể dùng để cố định. Các loại màng dùng để nhốt enzym đƣợc
sử dụng phổ biến là nylon, cellulose, polysulfone, và polyacrylmide.
Enzym β-galactosidase từ nấm sợi đƣợc cố định trong gel polyvinyl alcohol có tính
chịu nhiệt cao hơn enzym tự do, giữ đƣợc 70% hoạt tính sau 24h ở 50
o

C. Các tế bào K.
bulgaricus có chứa enzym β-galactosidase đƣợc xử lí với glutaraldehyde đƣợc nhốt trong
alginate sử dụng dung dịch BaCl
2
. Các hạt alginate thu đƣợc sau khi xử lí tiếp theo với
polyethyleneimine thì đạt đƣợc độ ổn định cao. Enzym β-galactosidase của E. coli cũng đƣợc
cố định trong gel polyacrylamide thông qua việc chuẩn bị các dẫn xuất liên kết chéo của
enzym với bisimidoesters.
Tế bào K. marxianus có chứa lactase hoạt động đƣợc nhốt trong gel calcium pectate
(CPG) và trong gel calcium alginate (CAG) đƣợc làm cứng bằng polyethyleneimine và
glutaraldehyde. Các tế bào đƣợc cố định trong CPG đã thủy phân hơn 80% lactose trong quá
trình liên tục và bán liên tục.
So sánh các phƣơng pháp cố định enzym β-galactosidase từ Thermus aquaticus cho
thấy rằng việc cố định bằng liên kết chéo sau đó nhốt enzym trong hạt agarose có thể cho
hiệu suất hoạt động tốt hơn. Việc nhốt enzym β-galactosidase từ A. oryzae trong gel
polyvinyl alcohol lạnh xốp sẽ tăng cƣờng độ ổn định với nhiệt độ, pH, lực ion hơn so với
Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học

~ 12 ~

enzym tự do. Khung dạng sợi đƣợc làm từ alginate và gelatin đƣợc bổ sung chất làm cứng là
glutaraldehyde có thể giữ đƣợc 56% hoạt tính của enzym trong 35 ngày mà không có bất kì
sự giảm hoạt tính.
Ngƣời ta nhận thấy rằng chế phẩm β-galactosidase đƣợc liên kết chéo bằng canavalin
A có thể thủy phân lactose vƣợt trội trong hàng loạt quá trình so với các chế phẩm khác vì
chúng vẫn giữ đƣợc hoạt tính cao, cụ thể là giữ đƣợc 95% hoạt tính sau 7 lần sử dụng, và giữ
đƣợc 93% hoạt tính sau 2 ngày bảo quản ở 4
o
C.
Phương pháp liên kết cộng hóa trị

Các phân tử enzym liên kết với chất mang thông qua các nhóm chức năng không nằm
trong trung tâm hoạt động của enzym nhƣ amino, carboxyl, hydroxyl, và sulfydryl. Các nhóm
chức năng trên chất mang thƣờng đƣợc hoạt hóa bằng cách sử dụng các chất hóa học nhƣ
cyanogen bromide, carbodimide, và glutaraldehyde.
Enzym từ A. oryzae đƣợc cố định trên bột nylon-6 và zeolite. Zeolite thì không lý
tƣởng vì lƣợng liên kết tạo thành ít trong khi đó nylon-6 tạo ra đƣợc khung mạng ổn định.
Các dẫn xuất thu đƣợc hoạt hóa bằng diazo hoặc bằng carbodiimide cho thấy hoạt tính cao
nhất trong suốt quá trình cố định enzym trên thủy tinh xốp có phủ lớp glycophase.
Enzym β-galactosidase từ E. coli đƣợc cố định trên gelatin sử dụng chất hoạt hóa là
chromium (III) acetate và glutaraldehyde vẫn giữ đƣợc tƣơng ứng 25% và 22% hoạt tính.
Enzym đƣợc cố định trên silica-alumina ổn định hơn enzym tự do ở pH acid.
Các dẫn xuất β-galactosidase cố định cho thấy nhiều sự cải thiện nhƣng hoạt tính khác
nhau sau khi đƣợc tạo điều kiện cho liên kết cộng hóa trị đa điểm bằng cách ủ trong dung
dịch kiềm một thời gian dài, enzym đƣợc cố định trên Sepabeads-epoxy-boronic đƣợc xem là
ổn định nhất. Dẫn xuất tốt nhất rất hoạt động trong việc thủy phân lactose thậm chí ở 70
o
C.
Gần đây sự liên kết ngang của β-galactosidase trên các hạt từ tính có nguồn gốc khác
nhau đƣợc thực hiện với sự có mặt của glutaraldehyde. Kết quả là hoạt tính của enzym cố
định đƣợc tăng lên.
Khi cố định β-galactosidase chịu nhiệt trên Sepabeads để thủy phân lactose ngƣời ta
nhận thấy sự ức chế enzym do sản phẩm tạo ra giảm, điều này hữu dụng trong việc cải thiện
hiệu suất hoạt động của enzym trong công nghiệp.





Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học

~ 13 ~

Bảng 2.1: Tóm tắt các phương pháp cố định enzym β-galactosidase
Phƣơng pháp cố định
Nguồn β-galactosidase
Tác nhân cố định
Hấp phụ vật lý
K. fragilis and K. lactis
A. oryzae
E. coli
B. circulans
B. stearothermophilus
A. niger
K. fragilis
K. lactis
Chitosan
Phenol-formaldehyde resin
Chromosorb-W
Polyvinyl chloride, Silica gel
Chitosan
Porous ceramic monolith
Chitosan beads
CPC-silica, agarose
Bao gói
K. bulgaricus
E. coli
A. oryzae
Thermus aquaticus YT-1
Penicillium expansum F3
K. lactis

Alginate using BaCl
3
Polyacrylamide gel
Nylon-6 and zeolite
Agarose bead
Calcium alginate
Poly(vinylalcohol) hydrogel
Liên kết cộng hóa trị
L. bulgaricus
S. anamensis
E. coli
K. latis
A. niger

A. oryzae
Egg shells
Calcium alginate
Hen egg white
Cotton fabric
Magnetic polysiloxane-
polyvinyl alcohol
Silica

2.1.1.4. Ứng dụng của enzym β-galactosidase cố định
2.1.1.4.1. Thủy phân lactose trong sữa và lactoserum [2]
Sữa đƣợc thủy phân lactose đƣợc sử dụng cho việc chế biến hƣơng liệu sữa, phô
mai, và sữa chua. Sự thủy phân lactose trong sữa và dùng sữa chế biến thực phẩm cũng ngăn
ngừa sự kết tinh lactose khi đông lạnh sữa và sản phẩm sữa cô đặc. Hơn nữa việc sử dụng sữa
đã thủy phân trong sản xuất sữa chua và pho mát sẽ làm tăng quá trình acid hóa, bởi vì thủy
phân lactose thƣờng là bƣớc làm chậm tốc độ của quá trình, làm giảm thời gian đông đặc của

sữa chua và tăng tốc độ phát triển cấu trúc và hƣơng vị cho phó mat. Chất lƣợng của sữa
đông lạnh và kem làm từ sữa cũng đƣợc cải thiện đáng kể khi thêm enzym lactase. Nó chống
Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học

~ 14 ~

lại sự kết tinh đƣờng lactose bằng cách thủy phân thành glucose và galactose và làm giảm
cấu trúc cát sạn.
Thủy phân lactose trong whey là một ứng dụng quan trọng khác của β-galactosidase
trong ngành công nghiệp chế biến sữa. Whey thủy phân và cô đặc hay whey thu đƣợc qua lọc
màng có thể đƣợc sử dụng nhƣ chất tạo ngọt trong sản xuất siro rau quả đóng hợp và nƣớc
giải khát.
β-galactosidase từ nấm (Miles Chemie) đƣợc cố định trong gel polyvinyl alcohol
đƣợc nhận thấy là bền nhiệt hơn so với enzym tự do, giữ đƣợc 70% hoạt tính sau 24h ở 50
o
C
và 5% hoạt tính ở 60
o
C. Thủy phân đƣợc 75% lactose trong 5-6h và mức độ chuyển đổi giảm
50% sau 30 lần sử dụng. Các nghiên cứu về thủy phân lactose sử dụng enzym cố định β-
galactosidase (Aspergillus niger) trên nhựa phenol formaldehyde cho thấy nhiệt độ tối ƣu phụ
thuộc vào thời gian thực hiện quá trình nhƣng không phụ thuộc vào nồng độ và sự chuyển đổi
lactose. Enzym β-galactosidase từ A. niger thủy phân đƣợc 70% lactose trong sữa gầy ở 40
o
C
trong 10 phút. Enzym β-galactosidase có nguồn gốc từ nấm cố định trên hydrogel đƣợc dùng
để thủy phân whey, sau 7h thủy phân đƣợc 70-75% whey. Sự cố định enzym β-galactosidase
từ A. niger trên silica gel đã đƣợc kích hoạt, kết quả là hầu hết các chế phẩm enzym cố định
sử dụng silica gel đƣợc kích hoạt bằng TiCl
3

và FeCl
3
sẽ thủy phân đƣợc 81% đến 84% trong
dung dịch chứa 4% lactose.
Enzym β-galactosidase từ K. lactis đƣợc cố định trên CPC-silica (đã đƣợc silan hóa
và kích hoạt với glutaraldehyde) và agarose (đƣợc kích hoạt bằng tác nhân cyanua) chuyển
đổi đƣợc 90% lactose trong thiết bị phản ứng “packed bed minireactor”. β-galactosidase đƣợc
nhốt trong gel đồng polymer hóa N-isopropylacrylamide và acrylamide có hiệu quả trong quá
trình thủy phân lactose ở 5
o
C cho quá trình sản xuất sửa nghèo lactose. Mô hình động học sử
dụng cho enzym β-galactosidase từ K. lactis cũng đƣợc khảo sát. Enzym cố định có thể hoạt
động ở nhiệt độ thấp và áp dụng đƣợc cho sản xuất các sản phẩm sữa đông lạnh, ngăn chặn
sự kết tinh của lactose, tăng khả năng tiêu hóa và tạo hƣơng vi cho sản phẩm sữa. Enzym β-
galactosidase từ K. lactis cố định trên vải cotton sử dụng glutaraldehyde làm tác nhân liên kết
chéo đƣợc dùng để thủy phân lactose trong sữa nguyên kem và chuyển đổi đƣợc 95% lactose
trong 2h trong thiết bị phản ứng gián đoạn, và khi đƣợc cố định bằng liên kết cộng hóa trị với
polysiloxane-polyvinyl alcohol, sử dụng glutaraldehyde nhƣ là tác nhân liên kết chéo cho
thấy độ hoạt động cao hơn và độ ổn định nhiệt cao hơn so với enzym hòa tan. Vì thế enzym
này đƣợc sử dụng có hiệu quả trong thủy phân lactose từ sữa. β-galactosidases từ K. lactis
cũng đƣợc cố định trên viên nang LentiKats polyvinylalcohol hydrogel dạng thấu kính đƣợc
Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học

~ 15 ~

dụng để sản xuất D-galactose từ lactose (200 g. L
−1
) trong một quá trình gián đoạn vừa đƣờng
hóa vừa lên men đồng thời.
β-galactosidase từ A. oryzae cố định trên chất mang concanavalin A-cellulose đƣợc

sử dụng để thủy phân liên tục lactose từ whey và sữa. Ngƣời ta nhận thấy rằng pH tối ƣu của
enzym hòa tan và enzym cố định là 4.8 nhƣng nhiệt độ tối ƣu tăng từ 50
o
C lên 60
o
C đối với
enzym cố định. Enzym cố định có sự ổn định nhiệt cao hơn ở 60
o
C. Gần đây thiết bị phản
ứng packed bed cùng với tế bào có tính thấm đƣợc nhốt trong alginate đƣợc sử dụng để thủy
phân lactose trong sữa trong hệ thống liên tục, đạt hiệu suất 87.2%. β- galactosidase từ A.
oryzae đƣợc cố định bằng 3 kĩ thuật khác nhau: hấp phụ trên celite, liên kết cộng hóa trị với
chitosan, hoặc kết hợp lại với nhau bằng liên kết chéo. Các chế phẩm enzym cũng đƣợc so
sánh với nhau về hiệu suất cố định, đặc tính của enzym, độ ổn định, và hiệu quả tổng hợp
oligosaccharide. Các enzym β-galactosidase đƣợc kết hợp lại với nhau bằng liên kết chéo
đƣợc cho là có hiệu quả trong việc thủy phân lactose, đạt hiệu suất 78% trong 12h. β-
galactosidase từ A. oryzae đƣợc cố định trên silica, hoạt tính cũng nhƣ độ ổn định của enzym
đã đƣợc thẩm định, và kết quả cố định tốt nhất thu đƣợc bằng cách sử dụng glutaraldehyde
nhƣ chất hỗ trợ hoạt hóa và ổn định cho enzym. Trong các phƣơng pháp xử lí whey khác
nhau (vi lọc, siêu lọc, xử lí nhiệt), siêu lọc đƣợc xem là phƣơng pháp tốt nhất đối với dung
dịch cơ chất để cho vào thiết bị phản ứng.
Bảng 2.2: Thủy phân lactose sử dụng các kỹ thuật cố định khác nhau
Nguồn VSV
Tác nhân cố định
Hiệu suất
thủy phân
Thời gian thủy
phân
Fungal galactosidase
E. coli

K. lactis
K. fragilis
K. lactis
Fungal β-galactosidase
K. marxianus
A. oryzae


Bacillus stearothermophilus
Polyvinyl-alcohol
Polyacrylamide gel
Thiosulfinate/thiosulfonae
Cellulose beads
Cotton fabric
Hydrogels
Calcium alginate
Concanavalin A layered
calcium alginate-starch
hybrid
Chitosan
75%
47%
85%–90%
>90%
95%
70%–75%
84.8%
89%

>80%
5-6 h
6 h
2.5 h
5 h
2 h
7 h
2.5 h
3 h


2 h

Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học

~ 16 ~

2.1.1.4.2. Tổng hợp Galacto-Oligosaccharides (GOSs) [2]
Bên cạnh hoạt động thủy phân, enzym β-galactosidase còn có tác dụng chuyển nhóm
bằng cách thủy phân và sản xuất ra nhiều oligosaccharide, các oligosaccharide tác dụng có lợi
cho các vi sinh vật có ít trong đƣờng ruột. Hơn nữa, phản ứng chuyển nhóm có thể đƣợc dùng
để gắn galactose vào hợp chất hóa học khác, kết quả tạo thành galacto-oligosaccharide. Do đó
cho thấy tiềm năng trong việc sản xuất các thành phần thực phẩm, dƣợc phẩm, và các hợp
chất có hoạt tính sinh học khác. Các điều kiện của phản ứng chuyển nhóm galactose nên có
nồng độ lactose cao, nâng nhiệt độ và giảm hoạt độ nƣớc trong môi trƣờng phản ứng. Nhiệt
độ, nồng độ cơ chất và nguồn gốc enzym đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp
oligosaccharide. Tuy nhiên ảnh hƣởng của nồng độ lactose ban đầu thì lớn hơn. Nói chung
với nồng độ lactose ban đầu càng cao thì càng nhiều galacto-oligosaccharide đƣợc tổng hợp.
Nhiệt độ cao cũng có thể làm tăng hiệu suất tổng hợp oligosaccharide. Hiệu suất cao hơn ở
nhiệt độ cao hơn là một lợi thế bổ sung khi tiến hành phản ứng ở nồng độ lactose ban đầu

cao. Do đó, enzym β-galactosidase nên đƣợc ổn định ở nhiệt độ cao hàm lƣợng nƣớc thấp để
làm cho hoạt động chuyển nhóm galactose tăng lên.
Việc tổng hợp galacto-oligosaccharide bằng β-galactosidase từ A. oryzae đƣợc tối ƣu
hóa bởi nồng độ lactose, enzym, tỉ lệ cơ chất. Trong quá trình sản xuất gián đoạn liên tiếp
galacto-oligosaccharide, hiệu quả xúc tác tăng lên 190% đối với enzym tự do trong dung
dịch, và 8500g galacto-oligosaccharide trên 1g enzym đƣợc sản xuất trong 10 đợt. Enzym β-
galactosidase từ A. oryzae đƣợc cố định trên Fe
3
O
4
–chitosan cho kết quả hiệu suất tổng hợp
galacto-oligosaccharide cao nhất là 15,5%. Việc tổng hợp galacto-oligosaccharide sử dụng β-
galactosidase từ A. oryzae cố định trên polysiloxane-polyvinyl alcohol (mPOS-PVA) đã đƣợc
thực hiện. Lƣợng galacto-oligosaccharide đạt đƣợc khoảng 26% (w/v) so với lƣợng đƣờng
tổng, có khoảng 55% lactose đƣợc chuyển đổi từ dung dịch có nồng độ lactose là 50% (w/v)
ở pH 4,5 và nhiệt độ 40
o
C. Trisaccharides chiếm hơn 81% tổng lƣợng GOS đƣợc sản xuất.
Việc hình thành GOS không bị ảnh hƣởng đáng kể bởi nhiệt độ và pH.
Hệ thống enzym cố định dùng polyethyleneimine, glutaraldehyde, và cotton đƣợc
nghiên cứu và so sánh sự sản xuất galacto-oligosaccharide trong hệ thống siêu lọc enzym tự
do và hệ thống sử dụng enzym cố định. Trong quá trinh cố định sử dụng kết hợp PEI và GA,
ngƣời ta nhận thấy khoảng 50% đến 90% enzym bị hoạt hóa. Hệ thống enzym tự do và
enzym cố định tƣơng đƣơng cho thấy quá trình sản xuất GOS rất giống nhau, xấp xỉ 22%
(w/v) và 20% (w/v) trong thời gian khoảng 15 – 17 phút, và chuyển đổi đƣợc 50% lactose.
β-galactosidase tinh khiết từ Bullera singularis ATCC 24193 đƣợc cố định trên hạt
Chitopearl BCW 3510 đƣợc sử dụng cho phản ứng tổng hợp galacto-oligosaccharide (GOSs)
Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học

~ 17 ~

từ lactose trong thiết bị phản ứng packed bed, kết quả tổng hợp đƣợc 55% GOS với năng suất
4.4 g/(L-h) hoạt động trong 15 ngày. Năng suất GOS đạt cao nhất khi nồng độ lactose ban
đầu là 27% (w/w), 50% lactose đƣợc chuyển đổi với nồng độ ban đầu là 500 g/L.
Trisaccharides là một sản phẩm đƣợc tạo ra nhiều nhất, chiếm hơn 70% tổng lƣợng GOS
đƣợc tạo ra. β-galactosidase từ A. oryzae đƣợc cố định trên hạt chitosan tạo ra lƣợng
trisaccharides cao nhất (17,3% trong tổng lƣợng đƣờng), sử dụng 20% (w/v) lactose trong
vong 2h so với đối với enzym tự do và 4,6 % đối với tập hợp enzym có liên kết chéo.
2.1.2. Enzym lipase
2.1.2.1. Giới thiệu về enzym lipase
Lipase (EC 3.1.1.3) là một họ các enzym mà trong môi trƣờng tự nhiên chúng xúc tác
cho các phản ứng thủy phân chất béo. Tuy nhiên, trong các điều kiện phản ứng phù hợp
lipase còn cho thấy khả năng xúc tác các phản ứng ester hóa, chuyển ester và phản ứng
alcoholysis [4].
Sự phát triển nhanh chóng của công nghệ enzym đã mang lại sự quan tâm đáng kể đến
việc ứng dụng enzym lipase trong ngành công nghiệp dầu béo. Các phản ứng sử dụng enzym
lipase mang lại nhiều lợi thế hơn các phản ứng hóa học thông thƣờng. Lipase có thể sử dụng
một cách có hiệu quả và kinh tế trong điều kiện ôn hòa. Đây là đặc điểm quan trọng bởi vì
điều kiện khắc nghiệt sẽ gây ra các phản ứng trùng hợp chất béo và sinh ra nhiều sản phẩm
phụ. Do đó, việc sử dụng lipase sẽ làm giảm nhu cầu loại bỏ các hợp chất màu và các sản
phẩm phụ bằng cách phƣơng pháp tốn kém năng lƣợng [3].
Tuy nhiên, việc ứng dụng enzym lipase vẫn còn nhiều trở ngại do chi phí cao. Vấn đề
này có thể đƣợc khắc phục bằng cách sử dụng enzym cố định, khi đó enzym lipase có thể
đƣợc tái sử dụng dễ dàng và qui trình sản xuất có thể đƣợc vận hành liên tục [3].
2.1.2.2. Nguồn thu nhận enzym lipase
Enzym lipase thƣơng mại thƣờng đƣợc thu nhận từ động vật (tuyến tụy hoặc dạ dày
của động vật nhai lại) hoặc từ nấm sợi nhƣ (Penicillium spp., Aspergillus spp., Rhizopus spp.,
Rhizomucor spp., Mucor spp. or Candida spp…). Enzym lipase từ động vật có tính đặc hiệu
cao trong việc giải phóng các acid béo ở vị trí số 1 và số 3 trong phân tử triglyceride, trong
khi đó các lipase từ nguồn vi sinh vật có khả năng hoạt động và tính đặc hiệu rộng hơn [5].

Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học

~ 18 ~

Bảng 2.3: Nguồn VSV thu nhận enzym lipase và tính chất enzyme lipase [6]
Nguồn VSV
Tính chất enzym
Nhiệt độ tối ƣu
pH tối ƣu
Bacillus acidocaldarius
70
-
Bacillus sp.
50
8.0-9.0
Bacillus strin
60
8.0
Bacillus stearothermophilus
68
-
Bacillus thermocatenletus
60-70
8.0-9.0
Bacillus thermoleovorans
70-75

7.5
Geobacillus sp.
70
9.0
Pseudomonas sp.
65
9.6
Pseudomonas sp.
90
11.0
Pyrobaculum calidifontis
90
-
Pyrococcus furiosus
100
-
Pyrococcus horikoshii
97
5.6
Pyrococcus horikoshii
95
7.0

2.1.2.3. Các phƣơng pháp cố định enzym lipase
Phương pháp hấp phụ vật lí
Đây là phƣơng pháp đơn giản nhất liên quan đến sự tƣơng tác bề mặt thuận nghịch
giữa enzym và chất mang. Lực liên kết chủ yếu là các tƣơng tác kỵ nƣớc. Phƣơng pháp này
có ƣu điểm là chi phí thấp, quá trình thực hiện đơn giản và nhanh chóng; không có sự biến
đổi về mặt hóa học enzym cũng nhƣ chất mang, đây là sự cố đinh thuận nghịch. Nhƣợc điểm
của phƣơng pháp này là sự giải hấp enzym ra khỏi chất mang, sự cản trở về mặt không gian

của chất mang và sự hình thành các liên kết không đặc hiệu. Các vật liệu vô cơ nhƣ than hoạt
tính, silica,… và vật liệu hữu cơ nhƣ các polymer tự nhiên hoạt tổng hợp có thể đƣợc dùng
làm chất mang cố định enzym lipase [7].
Lipase đƣợc hấp phụ trên chất mang kỵ nƣớc rất ổn định đối với nhiệt độ và sự vô
hoạt của dung môi hữu cơ. Dẫn xuất enzym lipase từ C. antarctica B cố định trên Octadecyl–
Sepabead giữ đƣợc 100% hoạt tính sau khi ủ trong 200h ở 50
o
C và pH 7.0. Ngoài ra, dẫn xuất
này còn giữ đƣợc hoạt tính đầy đủ trong thời gian dài (200h) trong dung dịch 50% dioxane ở
nhiệt độ 25
o
C ở pH 7.0. Mặc dù đƣợc cố định bằng phƣơng pháp hấp phụ vật lí đơn giản
Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học

~ 19 ~

nhƣng các dẫn xuất enzym lipase này có tính ổn định nhiệt hơn các dẫn xuất đƣợc cố định
bằng liên kết cộng hóa trị và các enzym tự do trong dung dịch [8].
Phương pháp liên kết cộng hóa trị
Phƣơng pháp này dựa trên liên kết công hóa trị giữa chất mang và một vài nhóm chức
năng của amino acid trên bề mặt của enzym. Chất mang thƣờng đƣợc hoạt hóa trƣớc bằng các
hợp chất đặc biệt làm cho các nhóm chức năng trở nên ái điện tử mạnh, các nhóm này sau đó
phản ứng với các nhóm ái nhân mạnh của enzym. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là tạo đƣợc
các liên kết bền vững và sự cố định đạt đƣợc sự ổn định cao. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp
này là chi phí cao và hiệu suất cố định thấp. Bên cạnh đó, cấu trúc và hoạt tính của enzym bị
ảnh hƣởng mạnh bởi các liên kết cộng hóa trị [7].
Lipase đã đƣợc cố định thành công trên nhiều chất mang khác nhau nhƣ chitosan,
agarose, và các polypeptide kỵ nƣớc sử dụng carbodiimide làm tác nhân hoạt hóa nhóm
carboxyl của chất mang khi cố định enzym lipase từ C. rugosa. Ƣu điểm của carbodiimide là
có khả năng hoạt hóa cao và độc tính thấp đối với enzym [9].

Nhóm carboxyl của -PGA (Poly(-glutamic acid)) đƣợc hoạt hóa bằng cách phản ứng
với carbodiimide (N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC). -
PGA sau khi đƣợc hoạt hóa sẽ đƣợc cho vào dung dịch đệm có chứa lipase tự do. Việc cố
định enzym lipase từ C. rugosa đƣợc thực hiện ở các thời gian và nhiệt độ khác nhau. Sau
giai đoạn này enzym lipase cố định đƣợc làm lạnh khô trong máy sấy thăng hoa sau đó rửa lại
vài lần bằng n-hexan. Điều kiện cố định tối ƣu đạt đƣợc ở nhiệt độ 13,3
o
C trong thời gian
2,3h và hoạt tính cao nhất đạt đƣợc là 1196 U/g-chất mang [9].
Lipase từ Candida Antarctica cũng đƣợc cố định trên agarose và chitosan, sử dụng
các chất hoạt hóa glycidol, glutaraldehyde và epichlorohydrin. Khi dùng chất mang là
agarose với chất hoạt hóa glycidol đạt đƣợc hoạt tính cao nhất là 845U/g gel trong sau 72h cố
định. Khi sử dung chất mang là agarose và chitosan với chất hoạt hóa là glutaraldehyde thì
hoạt tính cao nhất đạt đƣợc tƣơng ứng là 1209U/g gel và 2716U/g gel sau 5h cố định. Sự ổn
định nhiệt tăng đáng kể khi so sánh với enzym hòa tan, gấp 20 lần khi sử dụng agarose-
glyoxyl và gấp 18 lần khi sử dụng chitosan-glutaraldehyde và gấp 21 lần khi sử dụng
agarose-glutaraldehyde. Dẫn xuất tốt nhất có độ ổn định gấp 58 lần so với enzym tự do, thu
đƣợc khi cố định trên chitosan đƣợc hoạt hóa qua 2 bƣớc, sử dụng glycidol và
glutaraldehyde, thời gian cố định là 72h. Mức độ ổn định của dẫn xuất cố định tăng lên theo
thời gian cố định, điều này cho thấy liên kết cộng hóa trị đa điểm giữa chất mang và enzym
đã thực sự xảy ra [10].