Luận Án Tiến Sĩ Nông Nghiệp Nghiên Cứu Bệnh Nhiễm Độc Tố Botulin Của Vi Khuẩn Clostridium Botulinum Trên Vịt Tại Một Số Tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long.pdf

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.19 MB, 157 trang )

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP

NGUYỄN THU TÂM

NGHIÊN CỨU BỆNH NHIỄM ĐỘC TỐ BOTULIN
CỦA VI KHUẨN Clostridium botulinum TRÊN VỊT
TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG
SÔNG CỬU LONG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI

NĂM 2020

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI
MÃ NGÀNH: 62.64.01.02

NGHIÊN CỨU BỆNH NHIỄM ĐỘC TỐ BOTULIN
CỦA VI KHUẨN Clostridium botulinum TRÊN VỊT
TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG
SÔNG CỬU LONG

Cán bộ hướng dẫn khoa học
PGS. TS. NGUYỄN ĐỨC HIỀN

Nghiên cứu sinh thực hiện
Nguyễn Thu Tâm

NĂM 2020

CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG
Luận án đính kèm theo đây, với tên đề tài: “Nghiên cứu bệnh nhiễm
độc tố botulin của vi khuẩn Clostridium botulinum trên vịt tại một số tỉnh
Đồng bằng Sông Cửu Long” do Nghiên cứu sinh Nguyễn Thu Tâm thực hiện
và báo cáo đã được hội đồng chấm luận án thông qua.
Ủy viên

Thư ký

Phản biện 1

Phản biện 2

Cán bộ hướng dẫn 1

Chủ tịch Hội đồng

i

LỜI CẢM TẠ
Trong suốt quá trình học tập và làm luận án tiến sĩ, tôi đã nhận được sự
quan tâm, giúp đỡ từ q thầy cơ, gia đình và bạn bè. Hơm nay, tơi đã hồn
thành luận án, tơi xin chân thành gởi lời cảm ơn.

Trước hết tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban
chủ nhiệm khoa Nông nghiệp, Ban chủ nhiệm Bộ môn Thú Y đã chấp thuận,
tạo điều kiện thuận lợi và có chính sách ưu đãi cho tơi được học tập nâng cao
trình độ chun mơn.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến thầy hướng dẫn – PGS. TS.
Nguyễn Đức Hiền đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho tôi được học tập, nghiên cứu, bổ sung kiến thức và hoàn
thành luận án.
Xin cảm ơn đến quý thầy cô thuộc Bộ môn Thú Y, trường Đại học Cần
Thơ đã nhiệt tình giảng dạy và chia sẻ nhiều kinh nghiệm quý báu cho tơi
trong q trình học tập cũng như làm việc.
Xin gởi lời cảm ơn đến thầy PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải – Trường Đại
học Nơng lâm thành phố Hồ Chí Minh và các nhân viên phịng thí nghiệm
Việt-Hàn – Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình hướng dẫn, hỗ trợ kỹ thuật
chun mơn cho tơi trong q trình nghiên cứu.
Tơi cũng xin đặc biệt cảm ơn đến các anh chị và em là cựu sinh viên của
ngành Chăn nuôi, ngành Thú Y và các anh chị làm công tác thú y tại các tỉnh
An Giang, Hậu Giang, Kiên Giang và thành Phố Cần Thơ đã nhiệt tình giúp
đỡ, hỗ trợ tôi trong việc thu thập mẫu được kịp thời và chính xác. Tơi xin chân
thành cảm ơn các chủ hộ chăn ni vịt đã nhiệt tình giúp đỡ tơi trong việc lấy
mẫu và lấy thông tin liên quan đến đề tài nghiên cứu.
Xin chân thành cảm ơn các cán bộ thuộc Trạm chẩn đoán xét nghiệm và
điều trị bệnh động vật – Chi cục chăn nuôi và Thú Y thành phố Cần Thơ, Ban
lãnh đạo Công ty TNHH Một thành viên chăn nuôi Vemedim đã tạo điều kiện
thuận lợi và giúp đỡ cho tơi hồn thành một số thí nghiệm trong nghiên cứu.
Xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp, bạn bè và gia đình đã động viên,
khích lệ, giúp đỡ và chia sẻ những buồn vui trong học tập, công việc và trong
cuộc sống để tơi có thêm nghị lực, niềm tin và điểm tựa để phấn đấu và hoàn
thành luận án của mình.
Xin chân thành cám ơn!

Tác giả luận án

Nguyễn Thu Tâm

ii

TÓM TẮT
Luận án “Nghiên cứu bệnh nhiễm độc tố botulin của vi khuẩn Clostridium
botulinum trên vịt tại một số tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long” được thực hiện từ
năm 2013 đến 2017, tại các tỉnh, thành phố gồm An Giang, Kiên Giang, Hậu Giang
và thành phố Cần Thơ (TPCT) với mục tiêu chung là đánh giá tần suất lưu hành
bệnh botulism trên đàn vịt chạy đồng của Đồng bằng sông Cửu Long; xác định sự
hiện diện vi khuẩn C. botulinum cũng như type độc lực của botulin trên vịt bệnh và
môi trường chăn nuôi; đồng thời đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng C.
botulinum phân lập được tại Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL).
Điều tra 187.505 vịt chạy đồng (VCĐ) được nuôi dưỡng tại tỉnh An Giang,
Kiên Giang, Hậu Giang và thành phố Cần Thơ (TPCT), trong đó có 108.505 con vịt
đẻ và 79.000 con vịt thịt. Kết quả cho thấy, 2.253 con VCĐ được nuôi dưỡng tại
ĐBSCL mắc bệnh botulism chiếm 1,19 %. Tỷ lệ vịt đẻ mắc bệnh 1,52% cao hơn vịt
thịt (0.91%) và khác nhau có ý nghĩa thống kê. Triệu chứng lâm sàng của bệnh
botulism trên VCĐ là liệt cổ, liệt mí mắt - đồng tử dãn và liệt chân xuất hiện ở tần
suất khá cao lần lượt là 87,92%, 90,07%, 79,78%, triệu chứng vịt giảm ăn ủ rũ, xù
lông, kém vận động với tỷ lệ 68,55%; tiêu chảy phân trắng - xanh 70,96% và tiêu
chảy máu là 34,30%. Bệnh tích gan, phổi xuất huyết chiếm tỷ lệ cao lần lượt là
95,48%, 86,19%, bệnh tích ruột trống thức ăn và sinh hơi cũng chiếm tỷ lệ 92,14%.
Phân lập vi khuẩn C. botulinum trên bệnh phẩm của vịt bệnh theo Lindstrom
and Korkeala (2006) và qui trình có cải tiến, kết quả cho thấy tỷ lệ hiện diện vi
khuẩn C. botulinum trên mẫu phân vịt bệnh chiếm tỷ lệ cao hơn trên mẫu gan với tỷ
lệ lần lượt là 50,72% và 43,13%. Xác định độc tố trong 200 mẫu huyết thanh của vịt

bệnh botulism bằng thử nghiệm trên chuột bạch theo tiêu chuẩn CDC - Hoa Kỳ
(1998) với kết quả của huyết thanh không xử lý nhiệt xuất hiện 63% chuột chết và
37% chuột có triệu chứng bất thường. Định type độc tố botulin bằng phản ứng trung
hòa với huyết thanh chuẩn, kết quả thể hiện tỷ lệ mẫu huyết thanh chứa độc tố
botulin type C là khá cao, chiếm 40,48%; kế đến là mẫu huyết thanh chứa độc tố
botulin type E với tỷ lệ 28,57%, thấp nhất là mẫu huyết thanh chứa độc tố botulin
type D với 25,40%; Đặc biệt, kết quả thí nghiệm cịn có sự hiện diện kết hợp giữa
type C + type D là 3,97% và giữa type C + type E là 1,59%.
Xác định các các yếu tố nguy cơ gây bệnh botulism trên VCĐ ở ĐBSCL bằng
cách phân lập vi khuẩn C. botulinum trên đất ruộng, nước trên mặt ruộng, cua và ốc
trên ruộng ni có vịt bệnh theo qui trình ni cấy, phân lập vi khuẩn Clostridium

iii

botulinum của Lindstrom and Korkeala (2006) và qui trình có cải tiến. Kết quả cho
thấy sự hiện diện của vi khuẩn C. botulinum trên đất 17,5%, nước trên mặt ruộng
19,67%; trên cua (8,33%) cao hơn trên ốc (3,00%) và sự sai khác của hai tỷ lệ này
rất có ý nghĩa về mặt thống kê với P<0,01.
Đánh giá tính gây bệnh của vi khuẩn C. botulinum phân lập được bằng cách
xác định LD50 trên vịt được tiêm truyền độc tố botulin vào tĩnh mạch và đường uống.
Sau 7 ngày theo dõi, kết quả cho thấy 23/32 mẫu làm vịt chết, chiếm 71,88% và vịt
có biểu hiện triệu chứng bất thường 28,12%. Vịt xuất hiện các triệu chứng lâm sàng
như ủ rủ, ít đi lại, xù lông, giảm ăn, giảm đẻ chiếm tỷ lệ 100%; triệu chứng liệt cổ
chiếm 92,19%; liệt mí mắt, dãn đồng tử với tỷ lệ 76,19%; liệt chân chiếm 60,94%;
tiêu chảy phân trắng - xanh chiếm 35,94%. Mổ khám bệnh tích cho thấy gan xuất
huyết chiếm 92,19%, bệnh tích ruột trống thức ăn, sinh hơi chiếm 89,06%, phổi tụ
huyết với tỷ lệ 81,25%.
Từ khóa: Botulin, Clostridium botulinum, limberneck, đồng bằng sông Cửu Long.

iv

ABSTRACT
The thesis named “Study on botulin poisonging disease of Clostridium
botulinum on ducks in the Mekong Delta” was conducted from 2013 to 2017 in An
Giang, Hau Giang, Kien Giang and Can Tho to clarify the frequency of the botulism
disease on the free-grazing ducks of the Mekong Delta; the prevalence and botulin
toxin types of C. botulinum isolated from infected ducks and the environment; the
evaluation of pathogenicity of isolated C. botulinum strains in the Mekong Delta.
A total of 187,505 free-grazing ducks were examined in An Giang, Hau Giang,
Kien Giang and Can Tho including 108,505 laying ducks and 79,000 meat ducks.
The results indicated that 2,253 ducks were infected with botulism disease with 1.19
% in a total of ducks. Laying ducks were infected disease (1.52%) higher than meat
ducks were (0.91%) with a significant statistical difference. The clinical symptoms of
botulism infected ducks were neck paralysis, eyelids paralysis – mydriasis, leg
paralysis at high rates of 87.92%, 90.07%, 79.78% respectively; ducks were less
eating, moody, ruffled feathers, less activities 68.55%; greenish diarrhea and blood
diarrhea were 70.96% and 34.30%. The lesions of liver and haemorrhage lung were
also high at 95.48%, 86.19%; and gas in the intestine was 92.14%.
The isolation of C. botulinum from duck specimens was followed the method of
Lindstrom and Korkeala (2006) and had modification. The prevalence of C.
botulinum was in feces (50.72%) higher than that in liver (43.13%). The
determination of botulin toxin with 200 serum samples from infected ducks was
examined on mice following the standard of CDC (1998); the result in without heat
treatment Group showed that mice were died at 63% and abnormal at 37%. By the
neautral reaction, the sera were with botulin type C at a relatively high rate
(40.48%), followed by type E (28.57%), type D (25.40%); especially, there were the
combination types of type C + type D (3.97%) and type C+ type E (1.59%).
The risk factors of the botulism disease in the free-grazing ducks were

determined via the isolation of C. botulinum from soil, water, crabs and snails at the
fields with infected ducks. It was also done by following the modified method of
Lindstrom and Korkeala (2006). The prevalence of C. botulinum was 17.5% in soil,
19.67% in water; especially, C. botulinum was present in crabs (8.33%) higher than
in snails (3.00%) (P<0,01).
The pathogenicity of isolated C. botulinum strains was examined the LD50 on
ducks by injection of toxin suspension via intravenous and oral route. Ater 7

v

observed days, it showed that 23/32 samples made ducks die (71.88%) and abnormal
ducks was 28.12%. Ducks exhibited the clinical symptoms such as moody, less
movement, ruffled fearthers, less eating and laying (100%); neck paralysis (92.19%);
eyelids paralysis and mydriasis (76.19%); leg paralysis (60.94%); greenish diarrhea
(35.94%). The lesions were heamorrhage liver (92.19%), the empty and gas
producing in intestine (89.06%), and haemorrhage lung (81.25%).
Key words: Botulin, Clostridium botulinum, limberneck, Mekong delta.

vi

TRANG CAM KẾT KẾT QUẢ
Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi, các kết quả
nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa
từng dùng để bảo vệ ở bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp
đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thơng tin trích dẫn trong
luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Cán bộ hướng dẫn

Tác giả luận án

PGS. TS. Nguyễn Đức Hiền

Nguyễn Thu Tâm

vii

MỤC LỤC
CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG .................................................................. i
LỜI CẢM TẠ ................................................................................................... ii
TÓM TẮT ........................................................................................................ iii
ABSTRACT ...................................................................................................... v
TRANG CAM KẾT KẾT QUẢ.................................................................... vii
MỤC LỤC ..................................................................................................... viii
DANH SÁCH BẢNG ..................................................................................... xii
DANH SÁCH HÌNH ..................................................................................... xiv
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT .................................................................. xvi
Chương 1: GIỚI THIỆU ................................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài .................................................................... 2
1.3 Những đóng góp mới về khoa học............................................................... 2
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................. 3
2.1 Giới thiệu về bệnh nhiễm độc tố botulin của vi khuẩn Clostridium
botulinum ........................................................................................................... 3
2.2 Tác nhân gây bệnh nhiễm độc tố botulin ..................................................... 4
2.3 Đặc tính sinh học của vi khuẩn C. botulinum .............................................. 4
2.3.1 Phân loại, đặc điểm hình thái .................................................................... 4

2.3.2 Đặc tính ni cấy ...................................................................................... 6
2.3.3 Đặc tính sinh hóa ...................................................................................... 6
2.3.4 Khả năng hình thành bào tử của Clostridium ........................................... 7
2.3.5 Sức đề kháng ............................................................................................. 8
2.3.6 Sự phân bố và ảnh hưởng của vi khuẩn C. botulinum trong tự nhiên ...... 8
2.3.7 Độc tố của vi khuẩn ................................................................................ 10
2.3.7.1 Độc tố botulin ...................................................................................... 10
2.3.7.2 Cơ chế gây bệnh của độc tố botulin ..................................................... 13
2.4 Bệnh do nhiễm độc tố của Clostridum botulinum ..................................... 15
2.4.1 Bệnh ở người .......................................................................................... 15
viii

2.4.2 Bệnh ở động vật hữu nhũ ........................................................................ 17
2.4.3 Bệnh do độc tố của Clostridium botulinum ở loài gia cầm .................... 18
2.4.4 Ảnh hưởng của độc tố botulin trên cá..................................................... 24
2.4.5 Ảnh hưởng của độc tố botulin trên chuột ............................................... 24
2.5 Phương pháp xác định độc tố botulin của vi khuẩn Clostridium botulinum25
2.5.1 Phương pháp tiêm truyền cho chuột bạch (Mouse bioassay) ................. 26
2.5.2 Xác định độc tố botulin bằng sinh học phân tử ...................................... 29
2.5.3 Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Clostridium botulinum ........ 29
2.5.3.1 Phương pháp lấy mẫu .......................................................................... 29
2.5.3.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn C. botulinum ..................... 31
2.6 Những ứng dụng của độc tố botulin của vi khuẩn C. botulinum ............... 31
2.6.1 Trong y học ............................................................................................. 31
2.6.2 Trong thẩm mỹ........................................................................................ 33
2.7 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn C. botulinum trong và ngồi nước ...... 33
2.7.1 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn C. botulinum trên thế giới ................ 33
2.7.2 Tình hình ngộ độc do độc tố của vi khuẩn C. botulinum trên thế giới .. 41
2.7.3 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn C. botulinum ở Việt Nam ................ 43

2.8 Một số đặc điểm sinh học của vịt đẻ.......................................................... 44
2.8.1 Nguồn gốc, đặc điểm của vịt .................................................................. 44
2.8.2 Đặc điểm tiêu hóa, hấp thu thức ăn của vịt............................................. 45
2.8.3 Ni vịt đẻ .............................................................................................. 47
2.8.4 Những điều lưu ý khi nuôi vịt đẻ ............................................................ 47
Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 49
3.1 Phương tiện nghiên cứu ............................................................................ 49
3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................... 49
3.1.2 Địa điểm nghiên cứu ............................................................................... 49
3.1.2.1 Địa điểm thu thập mẫu ......................................................................... 49
3.1.2.2 Phân tích mẫu và ni chuột thí nghiệm ............................................. 49
3.1.2.3 Thí nghiệm trên thực địa ...................................................................... 49
3.2 Trang thiết bị dụng cụ và hóa chất............................................................. 49
3.3 Nội dung nghiên cứu.................................................................................. 50

ix

3.3.1 Nội dung 1 .............................................................................................. 50
3.3.1.1 Mục tiêu ............................................................................................... 50
3.3.1.2 Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 50
3.3.1.3 Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 51
3.3.1.4 Chỉ tiêu theo dõi................................................................................... 52
3.3.2 Nội dung 2 .............................................................................................. 52
3.3.2.1 Mục tiêu ............................................................................................... 52
3.3.2.2 Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 52
3.3.2.3 Phương pháp tiến hành ........................................................................ 53
3.3.2.4 Chỉ tiêu theo dỏi................................................................................... 60
3.3.3 Nội dung 3 .............................................................................................. 60
3.3.3.1 Mục tiêu ............................................................................................... 60

3.3.3.2 Đối tượng nghiên cứu: môi trường chăn nuôi: đất, nước, cua, ốc ....... 60
3.3.3.3 Phương pháp thực hiện ........................................................................ 60
3.3.3.4 Chỉ tiêu theo dõi................................................................................... 61
3.3.4 Nội dung 4 .............................................................................................. 62
3.3.4.1 Mục tiêu ............................................................................................... 62
3.3.4.2 Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 62
3.3.4.3 Phương pháp tiến hành ........................................................................ 62
3.3.4.4 Chỉ tiêu theo dõi................................................................................... 66
3.4 Xử lý số liệu ............................................................................................... 66
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 67
4.1 Tình hình bệnh botulism trên vịt chạy đồng (VCĐ) Đồng bằng sông Cửu
Long (ĐBSCL) ................................................................................................ 67
4.1.1 Điều kiện tự nhiên của các tỉnh An Giang, Hậu Giang, Kiên Giang và
thành phố Cần Thơ........................................................................................... 67
4.1.2 Tình hình chăn ni vịt chạy đồng ở ĐBSCL ........................................ 70
4.1.3. Tình hình bệnh botulism trên vịt chạy đồng ở (ĐBSCL) ...................... 72
4.1.4 Tình hình vịt bệnh botulism theo mục đích ni .................................... 74
4.1.5 Triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh botulism trên vịt chạy đồng . 75
4.1.6 Bệnh tích đại thể trên vịt bệnh botulism ................................................. 76

x

4.2 Phân lập vi khuẩn C. botulinum và xác định độc tố botulin trên vịt chạy
đồng mắc bệnh botulism .................................................................................. 77
4.2.1 Phân lập vi khuẩn C. botulinum trên bệnh phẩm của vịt bệnh botulism 77
4.2.2 Xác định độc tố trong huyết thanh của vịt bệnh botulism bằng thử
nghiệm trên chuột bạch .................................................................................... 79
4.2.2.1 Kết quả gây độc trên chuột .................................................................. 79
4.2.2.2 Kết quả xác định type độc tố botulin ................................................... 82

4.3 Xác định các các yếu tố nguy cơ gây bệnh botulism trên vịt chạy đồng ở
ĐBSCL có bệnh botulism ................................................................................ 84
4.3.1 Tình hình nhiễm vi khuẩn C. botulinum từ các mẫu đất và nước trên
ruộng ................................................................................................................ 84
4.3.2 Tình hình nhiễm vi khuẩn C. botulinum từ mẫu cua và ốc trên ruộng ... 87
4.4 Tính gây bệnh của vi khuẩn C. botulinum phân lập được trên vịt bệnh và
môi trường........................................................................................................ 88
4.4.1 Kiểm tra độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn C. botulinum ................ 88
4.1.2 Sự đa kháng của vi khuẩn C. botulinum phân lập được với một số loại
kháng sinh ........................................................................................................ 91
4.4.3 Thử nghiệm độc tố botulin trên vịt ......................................................... 93
4.4.4 Những triệu chứng lâm sàng trên vịt thử nghiệm độc tố ........................ 94
4.4.5 Khảo sát bệnh tích đại thể trên vịt thử nghiệm độc tố botulin................ 96
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................ 99
5.1 Kết Luận .................................................................................................... 99
5.2 Đề nghị ..................................................................................................... 100
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 100
PHỤ LỤC MẪU ĐIỀU TRA DỊCH BỆNH TRÊN ĐÀN VỊT ................. 119
KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ CÁC SỐ LIỆU ...................................... 120

xi

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1 Đặc trưng tổng quát hệ gen một số loài Clostridium ......................... 5
Bảng 2.2 Một số phản ứng sinh hóa của các Clostridium ................................. 6
Bảng 2.3 Sự hiện diện của vi khuẩn Clostridium trong một số loại mẫu .......... 9
Bảng 2.4 Quan hệ giữa các nhóm của độc tố botulin và một số ký chủ .......... 13
Bảng 2.5 Phương pháp xác định độc tố botulin bằng sinh học phân tử theo loại
mẫu................................................................................................................... 29

Bảng 2.6 Bảng hướng dẫn lấy mẫu bệnh phẩm để xác định bệnh botulism.... 30
Bảng 3.1 Phân bố mẫu khảo sát tại 4 địa điểm lấy mẫu .................................. 51
Bảng 3.2 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C. botulinum trong bộ API 20A..... 55
Bảng 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ..................................................................... 56
Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm Định type độc tố botulin ...................................... 57
Bảng 3.5 Phân bố mẫu trên môi trường nuôi ................................................... 60
Bảng 3.6 Tiêu chuẩn đường kính vịng vơ khuẩn của một số loại kháng sinh 62
Bảng 3.7 Bố trí thí nghiệm để xác định liều LD50 của độc tố botulin ............ 64
Bảng 4.1 Số lượng VCĐ nuôi tại tỉnh An Giang, Hậu Giang, Kiên Giang và
thành phố Cần Thơ........................................................................................... 71
Bảng 4.2 Tỷ lệ vịt bệnh botulism tại Đồng bằng sông Cửu Long ................... 72
Bảng 4.3 Tỷ lệ bệnh botulism trên vịt đẻ và vịt thịt ........................................ 74
Bảng 4.4 Tần suất xuất hiện triệu chứng lâm sàng trên vịt bệnh botulism ..... 76
Bảng 4.5 Tần suất xuất hiện bệnh tích đại thể trên vịt bệnh botulism............. 77
Bảng 4.6 Tỷ lệ vi khuẩn C. botulinum hiện diện trên bệnh phẩm của vịt bệnh
botulism ........................................................................................................... 77
Bảng 4.7 Tỷ lệ chuột bị nhiễm độc botulin trong huyết thanh của vịt bệnh
botulism ........................................................................................................... 79
Bảng 4.8 Tần suất xuất hiện các biểu hiện bất thường trên chuột thí nghiệm. 80
Bảng 4.9 Các bệnh tích đại thể trên chuột thí nghiệm ..................................... 81
Bảng 4.10 Xác định type độc tố botulin .......................................................... 83
Bảng 4.11 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. botulinum từ các mẫu đất và nước trên
ruộng ................................................................................................................ 85
Bảng 4.12 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. botulinum từ các mẫu cua và ốc ruộng ... 87
xii

Bảng 4.13 Tỷ lệ độ nhậy của vi khuẩn C. botulinum phân lập được với một số
loại kháng sinh ................................................................................................. 89
Bảng 4.14 Kết quả khảo sát tính đa kháng của vi khuẩn C. botulinum với một

số loại kháng sinh ............................................................................................ 91
Bảng 4.15 Tỷ lệ vịt chết sau 7 ngày thử độc tố botulin ................................... 93
Bảng 4.16 Triệu chứng lâm sàng trên vịt thử nghiệm độc tố botulin .............. 94
Bảng 4.17 Kết quả khảo sát bệnh tích đại thể trên vịt thử nghiệm độc tố
botulin .............................................................................................................. 96

xiii

DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1 Hình dạng vi khuẩn C. botulinum và nha bào .................................... 5
Hình 2.2 Cấu trúc bào tử của vi khuẩn Clostridium spp. .................................. 8
Hình 2.3 Cơ chế tác động của độc tố botulin................................................... 14
Hình 2.4 Triệu chứng ngộ độc ở cáo ............................................................... 18
Hình 2.5. Triệu chứng ngộ độc ở bị ................................................................ 18
Hình 2.6 Chu trình lan truyền botulism ở gia cầm .......................................... 20
Hình 2.7 Liệt mí mắt ở vịt ............................................................................. 22
Hình 2.8 Cổ vịt liệt .......................................................................................... 22
Hình 2.9 Vịt nhiễm độc tố botulin không nâng đầu được khỏi mặt nước ....... 22
Hình 2.10 Vai trị của C. botulinum trong một hệ sinh thái nước ngọt .......... 41
Hình 3.1 Vịt bị liệt mềm cổ ............................................................................. 52
Hình 3.2 Sơ đồ qui trình ni cấy, phân lập vi khuẩn Clostridium botulinum có
cải tiến .............................................................................................................. 53
Hình 3.3 Khuẩn lạc của vi khuẩn C. botulinum trên thạch máu ...................... 54
Hình 3.4 Khuẩn lạc của vi khuẩn C. botulinum trên môi trường SFP ............. 54
Hình 3.5 Hình ảnh nha bào của vi khuẩn C. botulinum dưới KHV ................ 54
Hình 3.6 Đặc tính sinh hóa theo API 20A của vi khuẩn C. botulinum............ 55
Hình 3.7: Kháng độc tố chuẩn ......................................................................... 58
Hình 3.8 Sơ đồ xác định type độc tố botulin trong huyết thanh vịt ................. 59
Hình 3.9 Sơ đồ qui trình ni cấy, phân lập vi khuẩn Clostridium botulinum

trên mơi trường ni có cải tiến ....................................................................... 61
Hình 3.10 Sơ đồ quy trình chuẩn bị canh khuẩn chứa độc tố botulin ............. 63
Hình 4.1 Bản đồ các tỉnh ĐBSCL ................................................................... 68
Hình 4.2 Vịt chạy đồng .................................................................................... 72
Hình 4.3 Vịt chạy đồng bị liệt mềm cổ ............................................................ 74
Hình 4.4 Phổi chuột xuất huyết ....................................................................... 82
Hình 4.5 Gan chuột xuất huyết ........................................................................ 82
Hình 4.6 Mí mắt chuột sung có ghèn ............................................................... 82
Hình 4.7 Dạ dày, ruột chuột trồng thức ăn ...................................................... 82
Hình 4.8 Lơng xù, rụng lơng ........................................................................... 95
xiv

Hình 4.9 Liệt mi mắt ........................................................................................ 95
Hình 4.10 Phân chảy trắng- xanh .................................................................... 95
Hình 4.11 Liệt mềm cổ .................................................................................... 95
Hình 4.12 Phổi vịt tụ huyết .............................................................................. 98
Hình 4.13 Gan vịt xuát huyết ........................................................................... 98
Hình 4.14 Ruột vịt trống thức ăn ..................................................................... 98
Hình 4.15 Ruột vịt sinh hơi ............................................................................. 98

xv

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tăt

Từ viết nguyên văn

Ý nghĩa

VCĐ

Vịt chạy đồng

ARN

Acid ribonucleotid

API

Analytical Profile Index

BoNTs

Botulinum neurotoxins

Độc tố thần kinh

CDC

Control of Disease Center

Trung tâm kiểm soat bệnh tật

C. bifermentans

Clostridium bifermentans

C. botulinum

Clostridium botulinum

C. butyticum

Clostridium butyticum

C. carnis

Clostridium carnis

C. chauvoei

Clostridium chauvoei

C. colinum

Clostridium colinum

C. difficile

Clostridium difficile

C. fallax

Clostridium fallax

C. histolyticum

Clostridium histolyticum

C. novji

Clostridium novji

C. perfringens

Clostridium perfringens

C. septicum

Clostridium septicum

C. sordellii

Clostridium sordellii

C. spiroforme

Clostridium spiroforme

C. sporogenes

Clostridium sporogenes

C. tetani

Clostridium tetani

DPA-Ca

Acid dipicolinic- calcium

ĐBSCL

Đồng bằng sông Cửu Long

ELISA

Enzyme-linked
Immunosorbent assay

FDA

LD

Food and Drug

Cục Quản lý Thực phẩm và

Administration

Dược phẩm

Lethal dose

Liều gây chết

xvi

MLD

Minimum Lethal Dose

Liều gây chết tối thiểu

PCR

Polemerase Chain Reaction

phản ứng chuỗi polymerase

SNAREs

Soluble N-ethyl maleimide

Protein SNARE

(NEM)-sensitive factor
attachment protein receptor
protein family
SNAP

Synaptosomal-associated
protein

xvii

Chương 1: GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) với hệ thống sơng ngịi chằng chịt
và khí hậu nóng ẩm, diện tích trồng lúa lớn, và nguồn động thực vật thủy sinh
phong phú; đây là những điều kiện thuận lợi để có thể chăn ni vịt quanh
năm, đặc biệt là nuôi vịt chạy đồng. Số lượng vịt nuôi theo phương thức chạy
đồng ở ĐBSCL khoảng 31,5 triệu con, chiếm hơn 70% đàn vịt trong vùng và
chiếm 40% trong tổng đàn vịt cả nước (Niên giám thống kê, 2019). Phương
thức chăn ni này có ưu điểm là tận dụng được thức ăn tự nhiên có sẵn của
vùng sơng nước, lúa rơi vãi sau thu hoạch của nông dân nhằm giảm đáng kể
chi phí trong chăn ni. Nhưng điều này cũng là một mối đe dọa lớn cho
ngành thú y vì khơng thể kiểm sốt được mơi trường chăn thả dẫn đến nguy cơ
xảy ra dịch bệnh rất cao. Một trong những bệnh phổ biến trên đàn vịt chạy
đồng ở Đồng bằng Sông Cửu Long hiện nay là bệnh “limberneck” hay bệnh
“cúm cần” theo cách đặt tên của địa phương. Bệnh cúm cần là bệnh trên thủy
cầm do ngoại độc tố botulin của vi khuẩn Clostridium botulinum gây ra; thế
nên, bệnh còn được gọi là bệnh botulism.
Vi khuẩn Clostridium botulinum là vi khuẩn kị khí tuyệt đối, sinh bào tử
hình oval và có nha bào, thường tồn tại trong đất, nhất là các vùng bùn lắng
trầm tích, trong xác các loài nhuyễn thể, trong ruột các loài động vật trên cạn và
dưới nước, sinh độc tố thần kinh botulinum neurotoxin rất mạnh, phá huỷ hoàn
toàn thần kinh trung ương (Todar, 2009). Vịt ăn phải độc tố này sẽ xuất hiện các
triệu chứng là liệt mềm cổ, liệt mí mắt, liệt cánh, liệt chân và tử số cao, gây thiệt
hại kinh tế nặng nề cho người chăn nuôi (Rocke and Friend, 1998).
Hiện nay, những trong nhân y và thú y trên thế giới đã và đang nghiên
cứu bệnh botulism trên con người và trên các loại gia cầm. Tuy nhiên, những
nghiên cứu và thơng tin về tình hình về bệnh botulism, yếu tố nguy cơ cũng
như đặc điểm sinh học của vi khuẩn Clostridium botulinum tại Việt Nam nói
chung, Đồng bằng sơng Cửu Long nói riêng cịn khá hạn chế. Với mong muốn
thông qua nghiên cứu này sẽ cung cấp thơng tin khá tồn diện về vi khuẩn

Clostridium botulinum và bệnh do vi khuẩn gây ra trên vịt chạy đồng ở Đồng
bằng sơng Cửu Long. Từ đó, đề tài “Nghiên cứu bệnh nhiễm độc tố botulin
1

của vi khuẩn Clostridium botulinum trên vịt tại một số tỉnh Đồng bằng
sông Cửu Long” được tiến hành.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
- Tình hình bệnh botulism trên vịt chạy đồng (VCĐ) ở Đồng bằng sông
Cửu Long.
- Xác định sự hiện diện vi khuẩn C. botulinum và xác định type độc lực
của botulin trên vịt mắc bệnh botulsim.
- Đánh giá sự lưu hành của vi khuẩn C. botulinum trên môi trường chăn
nuôi VCĐ ở ĐBSCL.
- Xác định khả năng gây bệnh của các chủng C. botulinum phân lập được.
1.3 Những đóng góp mới về khoa học
- Đã đưa ra những bằng chứng khoa học xác thực đầu tiên về bệnh liệt
mềm cổ trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.
- Khẳng định sự hiện diện của bệnh nhiễm độc tố botulin trên vịt chạy
đồng ở Đồng bằng sông Cửu Long.
- Xác định được các type độc tố của vi khuẩn Clostridium botulinum gây
bệnh liệt cổ trên vịt.
- Kỹ thuật mouse bioassay lần đầu tiên được áp dụng để xác định bệnh
nhiễm độc tố vi khuẩn Clostridium botulinum trên vịt ở Việt Nam.
1.4 Ý nghĩa khoa học của luận án
Đây là cơng trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách cơ bản có hệ
thống về bệnh botulism trên vịt chạy đồng ở Đồng bằng sơng Cửu Long. Từ
đó xây dựng được quy trình khoa học trong chẩn đoán xác định bệnh, đồng
thời là cơ sở khoa học trong việc xây dựng qui trình phịng trị bệnh botulism
trên vịt chạy đồng ở Đồng bằng sông Cửu Long nói riêng, cả nước nói chung.

2

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về bệnh nhiễm độc tố botulin của vi khuẩn Clostridium
botulinum
Botulism được báo cáo lần đầu ở gà năm 1917 (Dickson, 1917) còn ở vịt
được phát hiện lần đầu ở Hoa Kỳ vào những năm 1900 và sau đó vào năm
1923, bệnh được phát hiện ở gà khi ăn giòi (ấu trùng ruồi xanh) và đây là lần
đầu tiên C. botulinum type C được phân lập từ loài thân mềm này (Bengtson,
1922). Đến năm 1930, nhiều tác giả như Giltner and Couch, Gunderson and
Hobmairer đã phân lập được C. botulinum type C từ thủy cầm hoang dã bị
bệnh tại Hoa Kỳ (Shaw and Simpson, 1936).
Ở gia cầm, bệnh còn được gọi là bệnh liệt cổ (limberneck) và bệnh vịt
phương Tây (Western duck sickness). Hầu hết gia cầm bị nhiễm C.
botulinum type C và trong ổ dịch thì vịt là lồi cảm nhiễm nhất (Rosen,
1971). Bệnh xảy ra nhiều vào những tháng thời tiết nóng hơn là những tháng
lạnh (Rocke and Bollinger, 2007). Người khơng bị ảnh hưởng bởi type C, tuy
nhiên thí nghiệm cho thấy khỉ chết sau khi cho ăn gà nhiễm độc tố type C
(Giltner and Couch, 1930).
Đối với gia cầm, C. botulinum type E và C được xem là tác nhân chính
gây ra bệnh mặc dù một số type khác cũng có khả năng gây bệnh cho gia cầm
(Dohms, 1987). Bình thường vi khuẩn sống cộng sinh trong đường ruột gia
cầm và không gây bệnh nhưng khi con vật chết thì vi khuẩn sẽ phát triển và
sản sinh độc tố. Khi xác động vật phân hủy, ruồi đẻ trứng vào nở ra những ấu
trùng (giịi) mang độc tố. Trên mơ xác gia cầm chết đã xác định được lượng
độc tố type C lớn hơn 2000 liều gây chết tối thiểu (MLD) và trong con giòi
chứa lượng độc tố lên đến 104 – 105 liều MLD. Do đó khi gà, chim, vịt ăn giòi
hoặc xác động vật chết sẽ dễ dàng bộc phát bệnh.

Trong môi trường nước, các động vật giáp xác nhỏ và ấu trùng cơn trùng
có thể chứa Clostridium botulinum trong ruột. Khi các loài động vật này chết
xác động vật phân hủy sẽ cung cấp một nguồn protein thúc đẩy việc sản xuất
các loại độc tố botulin type C trong thịt, trầm tích hoặc vùng đất ngập nước
(Bell et al., 1955 ; Soos & Wobeser, 2006). Botulism gây ra bởi type A và E ở

3

gia cầm hiếm xảy ra và nó thường liên quan với việc sử dụng thức ăn hư hỏng
của người để nuôi gà nhà.
Do đặc điểm trên, bệnh thường xảy ra ở những vùng ngập nước vừa rút
cạn, nơi có điều kiện ấm áp, mơi trường có nhiều xác động vật chết và phân
hủy. Các nghiên cứu cho thấy bệnh là nguyên nhân gây chết chủ yếu đối với
các loài chim di cư trên toàn thế giới (Wobeser, 1997).
2.2 Tác nhân gây bệnh nhiễm độc tố botulin
Năm 1895, Emile Van Ermengem là người đầu tiên phát hiện người ngộ
độc và chết do ăn dăm bông, gọi là bệnh ngộ độc thịt và năm 1896 tác giả đã
xác định được nguyên nhân là Clostridium botulinum, một loại vi khuẩn kỵ
khí, có nha bào, rất khó bị tiêu diệt. Sau này, các nhà khoa học khác còn thấy
chúng trong đất, ruột cá, đồ hộp thịt cá, phân người. Năm 1928, Tessmer
Snipe & Hermann Sommer chiết tách được độc tố từ C.botulinum. Năm 1949,
Arnold Burgen phát hiện độc tố của C. botulinum làm tổn thương hệ thần kinh
trung ương (đặc biệt là đến các tín hiệu từ não đến cơ bắp), gây liệt cơ rõ nhất
là liệt cơ mắt (khơng có phản ứng với ánh sáng, song thị), liệt cơ vòm miệng,
lưỡi hầu, gây nên biến dạng mặt, nguy hiểm nhất là gây liệt trung tâm hô hấp,
tim dẫn đến tử vong cao. Năm 1960, Alan Scott & Edward Schantz sử dụng
độc tố botulin cho các mục đích điều trị (Dressler, 2006)
2.3 Đặc tính sinh học của vi khuẩn C. botulinum
2.3.1 Phân loại, đặc điểm hình thái

Vi khuẩn Clostridium botulinum thuộc chi Clostridium, họ Clostridiaceae,
bộ Clostridiales, lớp Clostridia, ngành Firmicutes.
Clostridium botulinum cũng được gọi với nhiều tên là Botulobacillus
botulinus, Ermengemillus botulinus, Bacillus botulinus, Bacillus putrificus,
Pacinia putrifica, Clostridium putrificum, Bacillus putrificus, Pacinia putrifica,
Clostridium putrificum, Botulobacillus botulinus, Ermengemillus botulinus.
Clostridium botulinum có thể phân biệt với các Clostridium khác dựa vào
các đặc trưng cấu trúc phân tử theo bảng 2.1.

4

Bảng 2.1 Đặc trưng tổng quát hệ gen một số lồi Clostridium
Các lồi Clostridium

Đặc điểm
botulinum
Kích thước(bp)

difficile acetobutylicum

perfringens

tetani

3.886.916

4.290.252

3.940.880

3.031.430

2.799.250

G+C (%)

28,24

29,06

30,93

28,60

28,75

Chuỗi mã hố

3650

3774

3740

2660

2368

Mật độ mã hố

0,93

0,87

0,93

0,87

0,85

875

943

920

946

1011

r ARN

9

11

11

10

6

t ARN

80

87

73

96

54

Kích thước gen
trung bình (bp)

(Mohammed Sebaihial et al., 2007)

Vi khuẩn C. botulinum là một trực khuẩn thẳng hai đầu trịn, dài từ 4–6
µm, rộng từ 0,9–1.2 µm, có thể đứng riêng lẻ hay tập trung thành song trực
khuẩn, có khi thành chuỗi ngắn. Trong canh khuẩn có đường glucose vi khuẩn
có dạng sợi dài, vi khuẩn có nha bào.
Nha bào có tính đề kháng cao nhưng bị tiêu diệt ở nhiệt độ 1200C trong
15 phút trong khi độc tố bị phá hủy ở nhiệt độ 1000C trong 20 phút. Nha bào
có hình trứng nằm ở một đầu vi khuẩn. Vi khuẩn có 4 – 8 lơng quanh thân,
nhưng di động khơng mạnh (Quinn et al, 1994).

Hình 2.1 Hình dạng vi khuẩn C. botulinum và nha bào (mũi tên)

(Nguồn: Yeh et al., 2014)

5

2.3.2 Đặc tính ni cấy
C. botulinum là loại vi khuẩn yếm khí tuyệt đối. Nhiệt độ ni cấy thích
hợp 28–30oC, độ pH 8,2–8,5. Trong nước thịt yếm khí có đường glucose: canh
khuẩn mọc đều, sản sinh nhiều hơi, có cặn lắng dưới đáy, sau đó canh khuẩn
trở nên trong và có mùi butyric. Thạch Vaillon hình thành những khuẩn lạc
trong suốt, dần dần trở nên đục, màu nâu nhạt, vi khuẩn sản sinh nhiều hơi làm
nứt thạch hoặc vỡ thạch, mơi trường có mùi butyric. Mơi trường Gelatin có
glucose: cấy chích sâu vi khuẩn mọc tốt theo đường cấy, sản sinh nhiều hơi và
làm tan chảy chậm. Nước thịt yếm khí có óc: làm đen óc. Thạch máu: dung
huyết sau khi ni cấy 3–4 ngày.
2.3.3 Đặc tính sinh hóa
Vi khuẩn lên men có sinh hơi glucose, mantose, levulose, dextrin. Lên
men không đều galactose, saccarose, lactose, raffinose, xylose, dunxit,
maltose, arabinose, salixin. Trực khuẩn hóa lỏng nhanh gelatin. Khơng sinh
indole nhưng sinh H2S (Nguyễn Như Thanh et al., 2001)
Bảng 2.2 Một số phản ứng sinh hóa của các Clostridium (Quinn et al., 1994)

Lipase

Lecithinase

Tiêu hóa Casein

Sản sinh Indol