Nghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng hy thiêm và vối việt nam
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (26.93 MB, 474 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
VIỆN KIỂM NGHI ỆM THUỐC TRUNG ƯƠNG
NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO
NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP MỘT SỐ
CHẤT CHUẨN ĐƯỢC CHIẾT XUẤT
TỪ DƯỢC LIỆU ĐỂ GÓP PHẦN HOÀN
THIỆN TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG
HY THIÊM VÀ VỐI VIỆT NAM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
HÀ NỘI, NĂM 2023
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘYTẾ
VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TRUNG ƯƠNG
NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO
NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP MỘT SỐ
CHẤT CHUẨN ĐƯỢC CHIẾT XUẤT
TỪ DƯỢC LIỆU ĐỂ GĨP PHẦN
HỒN THIỆN TIÊU CHUẨN CHẤT
LƯỢNG HY THIÊM VÀ VỐI VIỆT NAM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGHÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 9720210
Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS. Phương Thiện Thương
TS. Nguyễn Thị Liên
HÀ NỘI, NĂM 2023
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan
Luận án “Nghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ
dược liệu để góp phần hồn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt
Nam” là cơng trình nghiên cứu của tôi với sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS.
Phương Thiện Thương và TS. Nguyễn Thị Liên.
Các kết quả được trình bày trong luận án là trung thực và được công bố
một phần trong các bài báo khoa học của nhóm nghiên cứu. Luận án chưa từng
được công bố, không trùng lặp với luận văn, luận án hoặc các cơng trình
nghiên cứu khoa học của các tác giả khác.
Nghiên cứu sinh
Nguyễn Thị Phương Thảo
LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành luận án, tơi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình và có hiệu
quả của nhiều tập thể và cá nhân, của các thầy, cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè và
gia đình. Cho phép tơi bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới:
PGS.TS. Phương Thiện Thương – Phó Viện trưởng Viện Khoa học và
Cơng nghệ Việt Nam – Hàn Quốc, TS. Nguyễn Thị Liên – Viện Kiểm nghiệm
thuốc Trung ương, những người thầy đã định hướng, hướng dẫn tơi trong q
trình thực hiện luận án.
Ban Lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, các Khoa/Phòng
trong Viện đã tạo điều kiện về môi trường nghiên cứu, cơ sở vật chất, trang
thiết bị, chia sẻ những kinh nghiệm q báu để tơi hồn thành luận án.
Bộ Khoa học và Cơng nghệ đã cấp kinh phí cho Nhiệm vụ Khoa học và
Công nghệ cấp Bộ, mã số 01.2020M001, đồng nghiệp tại Viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam – Hàn Quốc đã phối hợp và hỗ trợ tôi trong q trình thực
hiện nghiên cứu.
Cơng trình nghiên cứu này được hoàn thành với sự nỗ lực của bản thân
và sự ủng hộ của gia đình, bạn bè, xin cảm ơn mọi người đã luôn sát cánh bên
tôi, động viên khích lệ tơi hồn thành nghiên cứu này.
Hà Nội, ngày 01 tháng 12 năm 2022
NCS. Nguyễn Thị Phương Thảo
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ..............................................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN...............................................................................................................3
1.1. VAI TRÒ CỦA CHẤT ĐỐI CHIẾU TRONG KIỂM NGHIỆM DƯỢC
LIỆU...................................................................................................................................................................3
1.1.1. Sự cần thiết phải có chất đối chiếu trong kiểm nghiệm dược liệu..................3
1.1.2. Hướng dẫn của Tổ chức Y tế thế giới về lựa chọn chất đánh dấu trong dược
liệu.......................................................................................................................................................................4
1.2. TỔNG QUAN VỀ CÁC ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU..........................................5
1.2.1. Hy thiêm.............................................................................................................................................5
1.2.1.1. Vị trí phân loại...........................................................................................................................5
1.2.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố..........................................................................................6
1.2.1.3. Thành phần hóa học................................................................................................................6
1.2.1.4. Tác dụng sinh học.................................................................................................................10
1.2.1.5. Tiêu chuẩn hóa dược liệu Hy thiêm...........................................................................11
1.2.1.6. Hợp chất darutosid................................................................................................................12
1.2.2. Vối......................................................................................................................................................13
1.2.2.1. Vị trí phân loại........................................................................................................................13
1.2.2.2. Đặc điểm thực vật và phân bố.......................................................................................13
1.2.2.3. Thành phần hóa học.............................................................................................................14
1.2.2.4. Tác dụng sinh học.................................................................................................................18
1.2.2.5. Tiêu chuẩn hóa dược liệu Vối........................................................................................19
1.2.2.6. Hợp chất 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5' –dimethylchalcon (CO1) .. 20
1.3. TỔNG QUAN VỀ THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN HÓA HỌC...........................22
1.3.1. Định nghĩa, phân loại chất chuẩn hóa học..................................................................22
1.3.2. Thiết lập chất chuẩn hóa học..............................................................................................23
1.3.2.1. Yêu cầu về hàm lượng với chất đánh dấu trong dược liệu...........................23
1.3.2.2. Thiết lập chất chuẩn hóa học gốc................................................................................24
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32
2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU...............................................32
2.1.1. Dược liệu Hy thiêm..................................................................................................................32
2.1.2. Dược liệu nụ Vối và lá Vối..................................................................................................32
2.2. HĨA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ...............................................................................33
2.2.1. Vật tư, hóa chất...........................................................................................................................33
2.2.2. Thiết bị.............................................................................................................................................34
2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................34
2.3.1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc các hợp chất.................36
2.3.2. Tiêu chuẩn chất lượng và phương pháp kiểm nghiệm nguyên liệu để thiết
lập chuẩn.......................................................................................................................................................36
2.3.2.1. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng....................................................................................37
2.3.2.2. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định tạp chất liên quan bằng
HPLC/DAD.................................................................................................................................................37
2.3.2.3. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu thiết lập chuẩn gốc...........38
2.3.3. Thiết lập chất chuẩn gốc........................................................................................................39
2.3.3.1. Đóng lọ........................................................................................................................................39
2.3.3.2. Kiểm tra độ đồng nhất của q trình đóng gói....................................................40
2.3.3.3.Xác định giá trị ấn định công bố trên chứng chỉ với chuẩn gốc định
lượng................................................................................................................................................................40
2.3.3.4. Xác định độ không đảm bảo đo....................................................................................43
2.3.3.5. Dán nhãn và bảo quản ống chuẩn................................................................................44
2.3.3.6. Theo dõi độ ổn định của chất chuẩn đã thiết lập................................................44
2.3.4. Xây dựng quy trình định tính, định lượng đồng thời kirenol, darutosid bằng
HPLC..............................................................................................................................................................45
2.3.4.1. Khảo sát phương pháp chuẩn bị mẫu........................................................................45
2.3.4.2. Xây dựng và thẩm định quy trình định tính, định lượng bằng HPLC .. 45
2.3.5. Xây dựng quy trình định tính, định lượng CO1 trong lá Vối và nụ Vối bằng
HPLC..............................................................................................................................................................46
2.3.5.1. Khảo sát phương pháp chuẩn bị mẫu........................................................................46
2.3.5.2. Xây dựng và thẩm định quy trình định tính, định lượng bằng HPLC .. 46
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.................................................................................47
3.1. CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ VÀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC........................47
3.1.1. Chiết xuất, tinh chế và xác định cấu trúc darutosid..............................................47
3.1.1.1. Chiết xuất, tinh chế...............................................................................................................47
3.1.1.2. Xác định cấu trúc, nhận dạng chất đã tinh chế....................................................49
3.1.2. Chiết xuất, tinh chế và xác định cấu trúc CO1........................................................52
3.1.2.1. Chiết xuất, tinh chế...............................................................................................................52
3.1.2.2. Xác định cấu trúc, nhận dạng chất CO1 đã tinh chế........................................56
3.2. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP
CHUẨN.........................................................................................................................................................59
3.2.1. Nguyên liệu darutosid để thiết lập chuẩn gốc định lượng................................59
3.2.1.1. Xây dựng phương pháp xác định độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập
chuẩn darutosid.........................................................................................................................................59
3.2.1.2. Tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu darutosid để thiết lập chuẩn định
lượng................................................................................................................................................................68
3.2.2. Nguyên liệu CO1 để thiết lập chuẩn gốc định lượng..........................................70
3.2.2.1. Xây dựng phương pháp xác định độ tinh khiết của nguyên liệu CO1 . 70
3.2.2.2. Tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu CO1 để thiết lập chuẩn định
lượng................................................................................................................................................................78
3.3. THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN.................................................................................................80
3.3.1. Kiểm tra chất lượng, đóng lọ và đánh giá đồng nhất q trình đóng gói 80
3.3.2. Xác định giá trị ấn định với chất chuẩn gốc định lượng....................................81
3.2.2.1 Xác định độ tinh khiết sắc ký..........................................................................................81
3.2.2.2. Xác định tạp chất bay hơi.................................................................................................84
3.2.2.3. Xác định tạp chất vô cơ.....................................................................................................85
3.2.2.4. Giá trị ấn định và độ không đảm bảo đo.................................................................85
3.3.3. Theo dõi độ ổn định của các chất chuẩn thiết lập được.....................................86
3.3.3.1. Chất chuẩn darutosid...........................................................................................................87
3.3.3.2. Chất chuẩn CO1.....................................................................................................................88
3.4. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CHẤT ĐÁNH
DẤU TRONG DƯỢC LIỆU HY THIÊM, NỤ VỐI VÀ LÁ VỐI............................89
3.4.1. Xây dựng và thẩm định quy trình định tính định lượng đồng thời kirenol
và darutosid trong Hy thiêm bằng HPLC..................................................................................89
3.4.1.1. Xây dựng quy trình chuẩn bị mẫu...............................................................................89
3.4.1.2. Thẩm định quy trình định tính, định lượng đồng thời kirenol và darutosid
bằng HPLC..................................................................................................................................................90
3.4.1.3. Khảo sát hàm lượng kirenol và darutosid trong Hy thiêm.........................100
3.4.2. Xây dựng và thẩm định quy trình định tính định lượng CO1 trong nụ Vối
và lá Vối bằng HPLC.........................................................................................................................100
3.4.2.1. Xây dựng quy trình chuẩn bị mẫu............................................................................100
3.4.2.2. Thẩm định quy trình định tính, định lượng CO1 bằng HPLC.................102
3.4.2.3. Khảo sát hàm lượng CO1 trong nụ Vối và lá Vối..........................................109
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN..............................................................................................................111
4.1. VỀ CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ CÁC CHẤT ĐỂ LÀM NGUYÊN LIỆU
THIẾT LẬP CHUẨN........................................................................................................................111
4.1.1. Lựa chọn hợp chất trong cây Vối và cây Hy thiêm cần phân lập..............111
4.1.1.1. Lựa chọn hợp chất trong cây Hy thiêm.................................................................111
4.1.1.2. Lựa chọn hợp chất trong cây Vối..............................................................................112
4.1.2. Về chiết xuất và tinh chế các chất................................................................................113
4.1.3. Về xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng..............................................................................115
4.2. VỀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN. 116
4.2.1. Định tính, xác định cấu trúc chất chuẩn gốc..........................................................116
4.2.2. Xác định độ tinh khiết của chất chuẩn gốc định lượng....................................116
4.2.2.1. Xác định tạp chất bay hơi..............................................................................................117
4.2.2.2. Xác định tạp chất vô cơ...................................................................................................117
4.2.2.3. Xác định tạp chất hữu cơ...............................................................................................118
4.3. VỀ THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN.....................................................................................121
4.3.1. Đóng lọ và đánh giá đồng nhất......................................................................................121
4.3.1.1. Đóng lọ......................................................................................................................................121
4.3.1.2. Đánh giá đồng nhất............................................................................................................122
4.3.2. Xác định giá trị ấn định......................................................................................................123
4.3.3. Theo dõi độ ổn định..............................................................................................................125
4.4. VỀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CHẤT
ĐÁNH DẤU TRONG DƯỢC LIỆU NỤ VỐI, LÁ VỐI VÀ HY THIÊM.......126
4.4.1. Định tính, định lượng đồng thời kirenol, darutosid trong Hy thiêm bằng
HPLC............................................................................................................................................................126
4.4.2. Định tính, định lượng CO1 trong nụ Vối và lá Vối bằng HPLC...............128
4.5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN.........................................................129
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................................................131
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
AOAC
Tên tiếng Anh
Association of Official
Analytical Chemists
Tên tiếng Việt
Hiệp hội các nhà phân tích hóa học
ASEAN Association of South East
Asian Nations
Hiệp hội các quốc gia Đơng Nam Á
CO1
2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy3′,5′-dimethylchalcone
2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′dimethylchalcon
CRS
Chemical Reference Standard
Chất chuẩn hóa học
DAD
Diode Array Detector
Đầu dò dãy diod quang
DĐVN
Dược điển Việt Nam
DMSO
Dimethyl sulfoxide
Dimethyl sulfoxid
DSC
Differential Scanning
Calorimetry
Phương pháp quét nhiệt vi sai
EP
European Pharmacopoeia
Dược điển Châu Âu
ESI-MS Electrospray Ionisation Mass
Spectrum
Khối phổ ion hóa tia điện
GACP
Good Agricultural and
Collection Practices
Thực hành tốt trồng trọt và thu hái
GC
Gas Chromatography
Sắc ký khí
GMP
Good manufacturing practice
Thực hành sản xuất tốt
GTAĐ
Giá trị ấn định
HL
Hàm lượng
HPLC
High-Performance Liquid
Chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
HR-LC- High Resolution Liquid
ESI-MS Chromatography Electrospray
Ionisation Mass Spectrum
Sắc ký lỏng khối phổ ion hóa tia
điện phân giải cao
ICH
International Conference on
Harmonisation
Hội nghị quốc tế về hòa hợp
Int’P
International Pharmacopeia
Dược điển Quốc tế
IR
Infrared spectroscopy
Quang phổ hồng ngoại
ISO
International Standard
Organization
Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế
KL
Khối lượng
KHCN
Khoa học và Công nghệ
KNV
Kiểm nghiệm viên
KTCL
Kiểm tra chất lượng
LOD
Limit of Detection
Giới hạn phát hiện
LOQ
Limit of Quantitation
Giới hạn định lượng
NIST
National Institute of Standard
and Technology
Viện Quốc gia về Tiêu chuẩn và
Công nghệ Hoa Kỳ
NSX
Nhà sản xuất
PCRS
Primary Chemical Reference
Standard
PHPLC
Preparative High-Performance Sắc ký lỏng điều chế
Liquid Chromatography
PTN
Chất chuẩn hóa học gốc
Phịng thí nghiệm
RS
Reference Substance
Chất chuẩn đối chiếu
RSD
Relative Standard Deviation
Độ lệch chuẩn tương đối
SCRS
Secondary Chemical
Reference Standard
Chất chuẩn hóa học thứ cấp
S/N
Signal/Noise
Tín hiệu/Nhiễu đường nền
Spic
Diện tích pic
TCCL
Tiêu chuẩn chất lượng
TCLQ
Tạp chất liên quan
TGA
Thermogravimetric Analysis
Phân tích nhiệt trọng lượng
TLC
Thin Layer Chromatography
Sắc ký lớp mỏng
TKSK
USP
Tinh khiết sắc ký
United State Pharmacopeia
Dược điển Mỹ
UV-VIS Ultravioliet – Visible
Spectrophotometer
Quang phổ tử ngoại – khả kiến
WHO
Tổ chức Y tế Thế giới
World Health Organization
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1
Vị trí phân loại của chi Sigesbeckia
5
Bảng 1.2
Một số hợp chất phân lập từ Hy thiêm
9
Bảng 1.3
Vị trí phân loại của chi Cleistocalyx
13
Bảng 1.4
Một số hợp chất phân lập từ Vối
17
Bảng 2.1
Mẫu Dược liệu Hy thiêm dùng trong nghiên cứu
32
Bảng 2.2
Mẫu Dược liệu nụ Vối và lá Vối dùng trong nghiên cứu
33
Bảng 3.1
Dữ liệu phổ H-NMR (600 MHz) và
1
13
C-NMR (150 MHz)
51
của chất darutosid và tài liệu tham khảo
Bảng 3.2
1
13
58
60
Bảng 3.4
Dữ liệu phổ H-NMR (500 MHz) và C-NMR (125 MHz)
của chất CO1 và tài liệu tham khảo
Khảo sát phương pháp HPLC xác định TCLQ trong nguyên
liệu darutosid
Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống với pic darutosid
Bảng 3.5
Kết quả tiêm lặp lại dung dịch LOD và LOQ của darutosid
64
Bảng 3.6
Khoảng tuyến tính darutosid
65
Bảng 3.7
Độ lặp lại dung dịch darutosid
66
Bảng 3.8
Độ chính xác trung gian dung dịch darutosid trên KNV 2
66
Bảng 3.9
Tổng hợp độ chính xác trung gian dung dịch darutosid
67
Bảng 3.10
Khảo sát phương pháp xác định TCLQ trong nguyên liệu CO1
70
Bảng 3.11
Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống với pic CO1
74
Bảng 3.12
Kết quả tiêm lặp lại dung dịch LOD và LOQ của CO1
74
Bảng 3.13
Khoảng tuyến tính CO1
75
Bảng 3.14
Độ lặp lại dung dịch CO1
76
Bảng 3.15
Độ chính xác trung gian dung dịch CO1 trên KNV 2
76
Bảng 3.16
Tổng hợp độ chính xác trung gian dung dịch CO1
77
Bảng 3.17
Kết quả đánh giá đồng nhất trong q trình đóng gói
80
Bảng 3.18
Kết quả đánh giá hàm lượng TKSK chất chuẩn darutosid
82
Bảng 3.19
Kết quả đánh giá hàm lượng TKSK chất chuẩn CO1
83
Bảng 3.3
63
Bảng 3.20 Tổng hợp hàm lượng TKSK chất chuẩn darutosid và CO1
Bảng 3.21 Hàm lượng tạp chất bay hơi trong chất chuẩn CO1 và
84
85
darutosid
Bảng 3.22 Hàm lượng tạp chất vô cơ trong chất chuẩn CO1 và
85
darutosid
Bảng 3.23 Theo dõi độ ổn định chất chuẩn darutosid
87
Bảng 3.24 Theo dõi độ ổn định chất chuẩn CO1
88
Bảng 3.25 Kết quả đánh giá phương pháp chiết Hy thiêm
89
Bảng 3.26 Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống với pic kirenol
93
Bảng 3.27 Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống với pic darutosid
94
Bảng 3.28 Khoảng tuyến tính kirenol và darutosid
94
Bảng 3.29 Kết quả đánh giá độ đúng với kirenol
96
Bảng 3.30 Kết quả đánh giá độ đúng với darutosid
96
Bảng 3.31 Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu Hy thiêm
97
Bảng 3.32 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian trên mẫu Hy thiêm
98
Bảng 3.33 Độ lặp lại của diện tích pic kirenol trong dung dịch LOD,
99
LOQ
Bảng 3.34 Độ lặp lại của diện tích pic darutosid trong dung dịch LOD,
99
LOQ
Bảng 3.35 Hàm lượng kirenol và darutosid trong Hy thiêm
100
Bảng 3.36 Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống với pic CO1
104
Bảng 3.37 Khoảng tuyến tính với CO1
105
Bảng 3.38 Kết quả đánh giá độ đúng với mẫu thử nụ Vối
106
Bảng 3.39 Kết quả đánh giá độ đúng với mẫu thử lá Vối
107
Bảng 3.40 Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu nụ Vối và lá Vối
107
Bảng 3.41
Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian trên mẫu nụ Vối
108
Bảng 3.42
và lá Vối
Kết quả thẩm định giá trị LOD, LOQ trên mẫu nụ Vối và lá
109
Vối
Bảng 3.43 Hàm lượng CO1 trong các mẫu nụ Vối và lá Vối
109
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1
Hình ảnh về cây Hy thiêm
6
Hình 1.2
Một số ent-pimarane diterpenoid trong Hy thiêm
8
Hình 1.3
Một số ent-kaurant diterpenoid trong Hy thiêm
9
Hình 1.4
Hình ảnh về cây Vối
14
Hình 1.5
Cấu trúc hóa học các chất 1-7 của Vối
15
Hình 1.6
Cấu trúc hóa học các chất 8-21 của Vối
16
Hình 1.7
Cấu trúc hóa học chất 22 của Vối
16
Hình 1.8
Sơ đồ quá trình thiết lập chất chuẩn
23
Hình 2.1
Sơ đồ tóm tắt nội dung nghiên cứu của Luận án
35
Hình 3.1
Sơ đồ chiết xuất cao ethyl acetat từ Hy thiêm
47
Hình 3.2
Sơ đồ tinh chế darutosid
48
Hình 3.3
Phổ UV-Vis của dung dịch darutosid trong methanol
49
Hình 3.4
Phổ hồng ngoại của darutosid
50
Hình 3.5
Phổ HR-LC-ESI-MS của darutosid
50
Hình 3.6
Cơng thức cấu tạo của darutosid
52
Hình 3.7
53
Hình 3.8
Sơ đồ chiết xuất, phân lập 2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy3′,5′-dimethylchalcon từ nụ Vối
Sắc ký đồ HPLC phân đoạn CO1
Hình 3.9
HPLC điều chế phân lập CO1
55
Hình 3.10
Kiểm tra độ tinh khiết của CO1 bằng DSC
56
Hình 3.11
56
Hình 3.12
Phổ UV-Vis của dung dịch hợp chất CO1 trong
methanol
Phổ hồng ngoại của hợp chất CO1
Hình 3.13
Phổ MS của hợp chất CO1
57
Hình 3.14
Cơng thức cấu tạo của chất CO1 (2′,4′-dihydroxy-6′methoxy-3′,5′-dimethylchalcon)
SKĐ khảo sát điều kiện HPLC trên nguyên liệu
darutosid để thiết lập chuẩn
SKĐ thẩm định độ đặc hiệu phép thử TCLQ trong
darutosid
Phổ UV-Vis của darutosid và các tạp chất liên quan
59
Hình 3.15
Hình 3.16
Hình 3.17
54
57
61
62
63
Hình 3.18 Đường chuẩn của darutosid
Hình 3.19 SKĐ khảo sát điều kiện HPLC xác định TCLQ trong
nguyên liệu CO1
Hình 3.20 SKĐ xác định TCLQ trong nguyên liệu CO1
65
71
Hình 3.21 Phổ UV-Vis của CO1 và các tạp chất liên quan
72
Hình 3.22
73
SKĐ thẩm định độ đặc hiệu phép thử TCLQ trong CO1
71
Hình 3.23 Đường chuẩn của CO1
75
Hình 3.24 Các chất chuẩn đã thiết lập được
86
Hình 3.25
90
SKĐ khảo sát phương pháp chuẩn bị mẫu thử Hy thiêm
Hình 3.26 Chồng phổ UV-Vis và tinh khiết của pic kirenol
92
Hình 3.27 Chồng phổ UV-Vis và tinh khiết của pic darutosid
92
Hình 3.28 SKĐ thẩm định độ đặc hiệu dung dịch thử Hy thiêm
93
Hình 3.29
Định lượng kirenol trong Hy thiêm - Đường chuẩn
95
Hình 3.30
Định lượng darutosid trong Hy thiêm - Đường chuẩn
95
Hình 3.31 SKĐ thẩm định đặc hiệu các dung dịch thử nụ Vối và
lá Vối
Hình 3.32 Định lượng CO1 trong Vối – Đường chuẩn
104
105
ĐẶT VẤN ĐỀ
Dược liệu đóng vai trị quan trọng trong việc chăm sóc sức khỏe con người.
Tổ chức y tế thế giới (WHO) ước tính khoảng 80% dân số trên thế giới hiện nay
có sử dụng dược liệu trong chăm sóc sức khỏe, đặc biệt ở các nước cịn khó
khăn, các vùng khó tiếp cận với nền y học hiện đại [103]. Những thập kỷ gần
đây xu thế con người quay trở lại sử dụng thuốc có nguồn gốc thảo dược ngày
càng phổ biến làm tăng đáng kể nhu cầu về dược liệu trên toàn thế giới. Theo
thống kê của Tổ chức Y tế thế giới năm 1999 có 65 quốc gia thừa nhận và quản
lý lưu hành dược liệu và thuốc từ dược liệu thì con số này đã tăng lên là 116
quốc gia vào năm 2012 và 124 nước vào năm 2018. Do đó, thị trường dược liệu
đã phát triển tồn cầu và điều này địi hỏi các quốc gia phải chú ý đến vấn đề
đảm bảo chất lượng, an toàn, hiệu quả đối với dược liệu và thuốc từ dược liệu.
Một trong những mục tiêu trong “Chiến lược hành động của Tổ chức Y tế thế
giới với thuốc cổ truyền giai đoạn 2014 - 2023” là “Tăng cường đảm bảo chất
lượng, an toàn, sử dụng hợp lý, hiệu quả thuốc cổ truyền” [89].
Tại Việt Nam, “Chiến lược quốc gia phát triển ngành Dược Việt Nam giai
đoạn đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030” theo quyết định số 68/QĐ-TTg
ngày 10/01/2014 của Thủ tướng chính phủ nêu rõ mục tiêu thuốc sản xuất trong
nước chiếm 80% tổng giá trị thuốc tiêu thụ trong năm, trong đó thuốc từ dược
liệu chiếm 30% [23]. Quyết định số 1976/QĐ-TTg ngày 30/10/2013 của Thủ
tướng chính phủ “Phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm
2020 và định hướng đến năm 2030” đã chỉ ra một trong những giải pháp để nâng
cao chất lượng thuốc từ dược liệu là tăng dần tỷ lệ nguyên liệu (cao chiết, tinh
dầu, bột dược liệu) được tiêu chuẩn hóa trong các nhà máy sản xuất thuốc theo
nguyên tắc, tiêu chuẩn GMP-WHO, đến năm 2030 năm đạt 100% nguyên liệu
được tiêu chuẩn hóa [22].
Hy thiêm Siegesbeckia orientalis (L.) thuộc họ Cúc - Asteraceae là một dược
liệu được nhân dân ta sử dụng lâu đời trong các bài thuốc y học cổ truyền, đã được
chứng minh có tác dụng điều trị các bệnh phong thấp, bán thân bất toại, đau nhức
các khớp xương, chữa các bệnh phong, bệnh hoa liễu, chữa suy nhược thần kinh,
mất ngủ và cao huyết áp. Hy thiêm cũng được xác định là một trong 24 dược liệu
có tiềm năng có thể khai thác tự nhiên [22]. Dược điển Trung Quốc [67] và Tiêu
1
chuẩn Hồng Kông về dược liệu [42] đều yêu cầu định lượng chất đánh dấu kirenol
trong Hy thiêm. Tại Việt Nam, một số nghiên cứu cho thấy, Hy thiêm trồng ở một
số vùng của Việt Nam không chứa hoặc chứa ít kirenol, trong khi chứa một lượng
đáng kể darutosid một diterpenoid được chứng minh có tác dụng tương đương
kirenol trong chống viêm, làm lành vết thương [24], [25], [26], [98].
Vối Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry thuộc họ Sim –
Myrtaceae được coi là một vị thuốc quý. Từ lâu nhân dân ta đã biết dùng nụ vối
với cách chế biến đơn giản tạo thành loại trà nấu hay hãm lấy nước uống hàng
ngày vừa có tác dụng thanh nhiệt vừa có tác dụng kiện tỳ, tiêu thực, hạ đường
huyết. Một số nghiên cứu chỉ ra 2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′dimethylchalcon (CO1) là thành phần flavonoid chính trong Vối [29], [37], [93].
Hợp chất CO1 được chứng minh có tác dụng chống viêm [43], [97], [99], tác
dụng phục hồi tế bào gan [86], tác dụng làm giảm hấp thu glucose trên tế bào cơ
và tế bào tạo mỡ nuôi cấy [62].
Hy thiêm, nụ Vối và lá Vối đều là các dược liệu được sử dụng lâu đời ở Việt
Nam. Các dược liệu này đều đã được đưa vào DĐVN V. Tuy nhiên các chuyên
luận trong DĐVN V cịn đơn giản, chưa có định tính, định lượng các chất đánh dấu
như xu hướng chung trong kiểm tra chất lượng dược liệu. Xuất phát từ thực tế đó
luận án “Nghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu
để góp phần hồn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt
Nam” đã được thực hiện với một số mục tiêu nghiên cứu như sau:
%0%ô%3%%0%%0%%173%38%38%%0%
đ
%0%àả
Ãáạ
ằẳẵắ
ặầẩ
ẫấậè
ẻẽéẹ
ềểễếệ
ìỉ
ĩíịò
ỏõóọ
ồỡổỗốộ
ờởỡớợù
ủ Chit
xut, phõn lp, tinh ch t dc liu
Hy Thiờm hợp chất darutosid, từ Vối hợp chất CO1 đủ tinh khiết và đủ khối
lượng để thiết lập chất chuẩn gốc.
%0%ô%3%%0%%0%%173%38%38%%0%
đ
%0%àả
Ãáạ
ằẳẵắ
ặầẩ
ẫấậè
ẻẽéẹ
ềểễếệ
ìỉ
ĩíịò
ỏõóọ
ồỡổỗốộ
ờởỡớợù
ủ Xõy
dng tiờu chun cht lng cỏc nguyờn
liu thit lp cht chun darutosid v CO1 tinh ch c.
%0%ô%3%%0%%0%%173%38%38%%0%
đ
%0%àả
Ãáạ
ằẳẵắ
ặầẩ
ẫấậè
ẻẽéẹ
ềểễếệ
ìỉ
ĩíịò
ỏõóọ
ồỡổỗốộ
ờởỡớợù
ủ Thit lp chất chuẩn gốc darutosid và CO1
%0%ô%3%%0%%0%%173%38%38%%0%
đ
%0%àả
Ãáạ
ằẳẵắ
ặầẩ
ẫấậè
ẻẽéẹ
ềểễếệ
ìỉ
ĩíịò
ỏõóọ
ồỡổỗốộ
ờởỡớợù
ủ ng
dng cht chun thit lp c xõy
dng quy trỡnh định tính, định lượng đồng thời darutosid và kirenol trong dược
liệu Hy thiêm; định tính, định lượng CO1 trong dược liệu nụ Vối, lá Vối.
2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. VAI TRÒ CỦA CHẤT ĐỐI CHIẾU TRONG KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU
1.1.1. Sự cần thiết phải có chất đối chiếu trong kiểm nghiệm dược liệu
Tiêu chuẩn hóa chất lượng dược liệu nhằm mục đích đảm bảo chất lượng
dược liệu được sử dụng làm thuốc, đảm bảo an tồn và hiệu quả điều trị. Để tiêu
chuẩn hóa chất lượng dược liệu thì ngồi các chỉ tiêu về cảm quan, định tính
bằng soi bột, vi phẫu, phản ứng hóa học, cịn cần có các chỉ tiêu định tính đảm
bảo tính đặc hiệu hơn, định lượng được hoạt chất, chất đánh dấu trong dược liệu.
Vì vậy, việc nghiên cứu chiết xuất, phân lập, tinh chế các hoạt chất, chất đánh
dấu từ dược liệu nhằm tiêu chuẩn hóa chất lượng dược liệu là xu thế chung trong
đảm bảo chất lượng dược liệu trên thế giới.
Châu Âu là cái nôi của thuốc hóa dược, tuy nhiên Dược điển Châu Âu cũng
rất chú trọng trong xây dựng các chuyên luận dược liệu. Dược điển Châu Âu 10
(EP 10) có 214 chuyên luận dược liệu, trong đó có 208 chuyên luận bắt buộc phải
sử dụng chất đánh dấu trong định tính, định lượng, 116 chuyên luận sử dụng các
phương pháp phân tích đặc hiệu như HPLC, GC để định lượng chất đánh dấu [44].
Dược điển Nhật 17 (xuất bản năm 2016), bản tiếng Anh có 143 chuyên
luận dược liệu. Trong đó 38 chuyên luận sử dụng chất đánh dấu trong định tính,
định lượng [56]. Dược điển Nhật 18 (xuất bản năm 2021), bản tiếng Anh có 145
chuyên luận dược liệu. Trong đó số chuyên luận sử dụng chất đánh dấu trong
định tính, định lượng tăng lên 66 chuyên luận [57].
Dược điển Trung Quốc 2015, bản tiếng Anh có 583 chuyên luận dược liệu.
Trong đó 332 chuyên luận sử dụng phương pháp HPLC, GC định lượng chất
đánh dấu [67].
Tiêu chuẩn Hồng Kông về dược liệu (từ tập 1- tập 10, xuất bản năm 2015 –
2020) có 323 chuyên luận dược liệu. Trong đó 310 chuyên luận định lượng chất
đánh dấu bằng HPLC, GC [42].
DĐVN IV có hiệu lực năm 2010 có 264 chuyên luận dược liệu. Có 26
chuyên luận (chiếm 10%) bắt buộc sử dụng chất đánh dấu trong định tính, định
lượng. Trong đó chỉ có 07 chuyên luận (chiếm 3%) định lượng chất đánh dấu
bằng HPLC/GC [7].
DĐVN V (có hiệu lực từ năm 2018) có 372 chuyên luận về dược liệu và thuốc
từ dược liệu tăng 58 chuyên luận so với DĐVN IV. Trong đó có 310 chuyên
3
